帶有標(biāo)記基因的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體及構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種帶有標(biāo)記基因的Tet?on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體及構(gòu)建方法，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明構(gòu)建了成本低而高效的載體系統(tǒng)及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因方法來(lái)建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，并通過可控誘導(dǎo)目的外源基因過表達(dá)來(lái)觀察該基因在多能干細(xì)胞向造血分化過程中可能發(fā)揮的效應(yīng)和功能。本發(fā)明中的載體也能夠很好的應(yīng)用于其他細(xì)胞或模式動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因操作，以簡(jiǎn)化遺傳研究的方法。
【專利說(shuō)明】
帶有標(biāo)巧基因的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種帶有標(biāo)記基因的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載 體及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有的基因過表達(dá)載體主要有慢病毒載體，還原病毒載體，類腺病毒載體，轉(zhuǎn)座子 載體和非整合質(zhì)粒等。從建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的角度來(lái)看，整合載體是最適合于轉(zhuǎn)基因 方法研究基因功能的。目前最有效的整合載體是慢病毒載體和轉(zhuǎn)座子載體PiggyBac。
[0003] 慢病毒載體最大的優(yōu)點(diǎn)是侵染效率和整合效率高，足夠高的滴度條件下幾乎可W 使全部目標(biāo)細(xì)胞受到轉(zhuǎn)染，包括一些很難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞型。但它的缺點(diǎn)也是很明顯：
[0004] (1)首先它有物種特異性，受制于受體特異性，一般而言只能轉(zhuǎn)染人類細(xì)胞；即使 經(jīng)過基因改造，其應(yīng)用的范圍一般也不超過哺乳動(dòng)物，應(yīng)用面有限；
[0005] (2)載體本身體積太大而載體容量小，不能滿足很多分子遺傳學(xué)操作的需要；
[0006] (3)包裝困難且花費(fèi)高昂，往往針對(duì)特定基因的包裝十分艱難甚至不可能，導(dǎo)致研 究方法的不可預(yù)見性，運(yùn)是慢病毒載體的一個(gè)致命弱點(diǎn)；
[0007] (5)慢病毒載體整合到基因組W后很容易被基因沉默，其基因表達(dá)強(qiáng)度和持續(xù)性 往往較弱并且只在少數(shù)細(xì)胞群中有表達(dá)。
[000引基于轉(zhuǎn)座子原理的載體系統(tǒng)，包括PiggyBac,Sleeping Beauty等等，其中效率最 高的是PiggyBac載體。WSBI公司生產(chǎn)的PB系列載體為例，作為基于PiggyBac的表達(dá)載體， 具有如下的顯著優(yōu)點(diǎn)：
[0009] (1)沒有物種和細(xì)胞型的限制，可W轉(zhuǎn)染幾乎所有的模式生物和細(xì)胞類型；
[0010] (2)可W用脂質(zhì)體、憐酸巧沉淀法或電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化各種細(xì)胞，也可W注射受精 卵，一般轉(zhuǎn)染效率都很高；
[0011] (3)無(wú)需包裝步驟，省時(shí)省力，而且?guī)缀蹩蒞成功表達(dá)各種類型序列的表達(dá)框，基 本沒有序列特異性的問題，最大程度降低了研究進(jìn)度的不可預(yù)見性，比慢病毒系統(tǒng)大大節(jié) 省了時(shí)間，精力和花費(fèi)；
[0012] (4)由于PB系列載體都含有特定的隔離子（insulator)保護(hù)，表達(dá)框不易被失活而 且表達(dá)持續(xù)而穩(wěn)定，任何時(shí)期和任何類型細(xì)胞里都可W成功表達(dá)；
[0013] (5)載體容積很大，插入片段可W達(dá)到1業(yè)bW上，可W滿足目前絕大多數(shù)分子遺傳 學(xué)研究的需要，也為后續(xù)衍生載體的開發(fā)提供了巨大空間；
[0014] (6)載體體積相對(duì)較小，易于分子克隆操作，載體的重組變異可能性要小于病毒載 體。
[0015] (7)該系統(tǒng)配套的轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體經(jīng)過人源化改造，是目前重組效率最高的 PiggyBac轉(zhuǎn)座酶，配套使用整合效率很高。
[0016] 但它的缺點(diǎn)在于該載體沒有現(xiàn)成的適合我們需要的商品化Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)， 重新改造載體工作量又相當(dāng)大；
[0017] 本發(fā)明中的造血分化研究是從人類多能干細(xì)胞化PSC)開始向造血分化的，由于該 類細(xì)胞具有極其強(qiáng)烈的對(duì)于外源基因和載體表達(dá)的沉默特性，成為最難構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系 的細(xì)胞種類。同時(shí)hPSC對(duì)慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)非?？咕芎兔舾校瑯O易導(dǎo)致基因沉默和細(xì)胞死亡W 及分化，難W有效應(yīng)用已經(jīng)極為成熟的慢病毒體系來(lái)實(shí)現(xiàn)基因的功能研究。而從hPSC向造 血分化過程中，會(huì)出現(xiàn)很多種細(xì)胞型，需要在各個(gè)不同的細(xì)胞型和發(fā)育時(shí)期實(shí)現(xiàn)基因的高 效持續(xù)過表達(dá)，運(yùn)些都對(duì)載體系統(tǒng)提出了極為苛刻的要求。為了實(shí)現(xiàn)我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，并?chuàng) 造出兼具各自優(yōu)點(diǎn)的載體系統(tǒng)，必須對(duì)其進(jìn)行徹底的改造，來(lái)實(shí)現(xiàn)與滿足在研究中的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明所要解決的問題在于克服上述不足之處，提供一種帶有標(biāo)記基因的Tet-on 誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體及構(gòu)建方法。
[0019]解決W上技術(shù)問題的一種帶有標(biāo)記基因的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的PiggyBac重組載 體，其特征在于:核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0020] 所述重組載體包括源于pTRIPZ的Tet-on順式表達(dá)元件和反式表達(dá)元件，W實(shí)現(xiàn)成 功的誘導(dǎo)過表達(dá);所述載體還包含源于PB513B-1的PiggyBac載體骨架、標(biāo)記基因GFP及T2A 序列，W實(shí)現(xiàn)高效的基因整合和方便分子克隆。
[0021 ] 所述化t-〇n順式表達(dá)元件包括TRE調(diào)控區(qū)域和CMV mini Promoter序列。
[0022] 所述Tet-on反式表達(dá)元件包括hUbC啟動(dòng)子、tTA3 CDS、內(nèi)部核糖體插入位點(diǎn) (IRES)元件、嚷嶺霉素(Puromycin)抗性基因W及猴空泡病毒(SV 40化olyA。
[0023] 所述PiggyBac載體骨架包括邊界與整合元件、隔離子、細(xì)菌克隆抗性篩選基因和 復(fù)制原點(diǎn)，等。
[0024] 本發(fā)明中構(gòu)建具有帶有標(biāo)記基因的成熟的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體，并利用 PiggyBac載體骨架將其插入人類多能干細(xì)胞的基因組，構(gòu)建能夠持續(xù)高效而無(wú)滲漏性的外 源基因誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0025] 本發(fā)明中一種帶有標(biāo)記基因的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體的構(gòu)建方法，包括如 下步驟：
[0026] 步驟一：設(shè)計(jì)5 ' 引物GFP-5 ' -XhoI和3 ' 引物T2A-3 ' -SwaI，WPB513B-1 載體為模板， PCR擴(kuò)增出GFP-T2A CDS片段，XhoI和MluI雙酶切后切膠回收；pTRIPZ的一個(gè)衍生載體 pHBTetOE-puro-Gatal，也經(jīng)過趾O巧日MluI雙酶切后切膠回收；插入片段和載體片段WT4 DNA連接酶連接；將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a ;并進(jìn)行酶切鑒定與基因序列的測(cè) 定，構(gòu)建成抑BTet0E-GFP-T2A-C載體；
[0027] 步驟二：設(shè)計(jì)5' 引物Tet-〇n-5'-PB-LVX和3' 引物Tet-〇n-3'-PB PCR擴(kuò)增出2.化b 長(zhǎng)的Tet-on相關(guān)元件，3 '用T4 PNK憐酸化，5 '引入XbaI位點(diǎn)，XbaI酶切后切膠純化;PB513B- 1經(jīng)過SpeI和化al雙酶切后切膠回收;插入片段和載體片段WT4 DNA連接酶連接;將連接后 的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞D冊(cè)a;并進(jìn)行酶切鑒定與基因序列的測(cè)定，構(gòu)建成PB-Tet-on-OE載 體。
[0028] 所述步驟一中，引物為：
[0029] 5'引物GFP-5'-XhoI:
[0030] 5 ' TTTCCCCTCGAGCCACCATGGAGAGCGACG 3 '；
[0031] 3'引物124-3'-5訊曰1:
[0032] 日'TTTCCCACGCGTGGCGCGCCGAATTCTTTGGGATTTMATGGGCCGGGATTCTCCTCCA 3'。
[0033] 所述步驟二中，引物為：
[0034] 5 ' 引物I'et-on-S ' -PB-LVX: 5 ' CGAGGTTCTAGACGAGTTTACTCCC 3 ' ；
[0035] 3 ' 引物I'et-on-S ' -PB: 5 ' ATTGTTCCAGACGCGAACTCAGG 3 '。
[0036] 所述步驟一中，擴(kuò)增程序?yàn)?98°C預(yù)變性1111111，98。(：變性1〇3,58。(：退火3〇3,72。(：延 伸 1111111，35個(gè)循環(huán)后72°(：1〇111111，4°(：保存。
[0037] 所述步驟二中，擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性1111111;94。(：變性153,60。(：退火3〇3,68。(：延 伸5min，32個(gè)循環(huán)后72°C10min，4°C保存。
[0038] 本發(fā)明中還有根據(jù)重組載體而得的基于人類抓NX化基因誘導(dǎo)過表達(dá)載體PB-Tet- on-GFP-T2A-hRunx 化。
[0039] 本發(fā)明所述載體在構(gòu)建能誘導(dǎo)過表達(dá)RUNXlb的人類多能干細(xì)胞系W及該基因功 能研究中的應(yīng)用。
[0040] 本發(fā)明的有益效果為：
[0041] 該載體的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0042] (1)保持了PTRIPZ絕大多數(shù)Tet-on順反式元件，因此也就繼承了其主要的優(yōu)點(diǎn)，能 夠在幾乎所有生物和細(xì)胞型中正常表達(dá)并避免滲漏表達(dá)。同時(shí)避免了慢病毒載體的很多缺 點(diǎn)，如容易沉默，物種和細(xì)胞型限制，W及轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒可能帶來(lái)的細(xì)胞毒性和免疫反應(yīng)。
[0043] (2)保持了PiggyBac載體，特別是PB513B-1的基因組整合特性，包括經(jīng)過改進(jìn)的整 合序列和人源化轉(zhuǎn)座酶，整合效率高，且可W用多種轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作。
[0044] (3)增大了Tet-on系統(tǒng)插入片段的范圍，即使是很大基因片段的插入，也不影響載 體的轉(zhuǎn)染、整合和正常過表達(dá);而同樣的操作在pTRIPZ衍生載體中會(huì)使載體長(zhǎng)度超過病毒 包裝的極限，導(dǎo)致包裝效率極低甚至不能包裝。利用PiggyBac載體骨架使得運(yùn)個(gè)載體具有 很大的改造潛力，日后可W在運(yùn)個(gè)載體上插入更多的元件，具有更多的功能。
[0045] (4)從PB513B-1引入隔離子元件（Insulator)保護(hù)Tet-on元件在插入任何物種或 細(xì)胞型的基因組的任何部位或者在細(xì)胞不同發(fā)育階段都能正常過表達(dá)，大大提高了過表達(dá) 的效率和載體的有效作用時(shí)空點(diǎn)。
[0046] (5)該載體不僅可W在人類多能干細(xì)胞中有效使用，也能很好的應(yīng)用于其他任何 生物體或不同的細(xì)胞系，其可移植性非常出色。構(gòu)建一個(gè)成功的載體，就能迅速應(yīng)用于其他 的模式生物或細(xì)胞系的轉(zhuǎn)基因操作，可W大大加速基因功能的研究進(jìn)程。
[0047] (6)由于引進(jìn)了一個(gè)與目的基因共表達(dá)但又獨(dú)自定位的GFP基因（green fluorescence protein)，使得在不影響目的基因功能定位的前提下，提供了一個(gè)監(jiān)測(cè)其時(shí) 空表達(dá)的精確方式，使研究者能夠用流式分析技術(shù)和其他免疫巧光技術(shù)準(zhǔn)確分析和追蹤目 的基因正常表達(dá)的細(xì)胞，使其生物學(xué)效應(yīng)不被其他未整合或基因沉默的細(xì)胞所淹沒。運(yùn)是 目前絕大多數(shù)PiggyBac類型載體系統(tǒng)中所沒有的，特別適合于沉默效應(yīng)明顯的研究系統(tǒng) 中。
[0048] 本發(fā)明構(gòu)建了成本低而高效的載體系統(tǒng)及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因方法來(lái)建立轉(zhuǎn)基因細(xì) 胞系，并通過可控誘導(dǎo)目的外源基因過表達(dá)來(lái)觀察該基因在多能干細(xì)胞向造血分化過程中 可能發(fā)揮的效應(yīng)和功能。本發(fā)明中的重組載體也能夠很好的應(yīng)用于其他細(xì)胞型或模式動(dòng)物 的轉(zhuǎn)基因操作，W簡(jiǎn)化遺傳研究的方法。
[0049] 化t-on過表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)：
[0050] 只需化g/ml多西環(huán)素(Doxycycline)即可進(jìn)行強(qiáng)度很高的過表達(dá)，表達(dá)時(shí)間也很 持久，而如此低濃度的誘導(dǎo)劑對(duì)于宿主細(xì)胞的毒性很低，減低了研究的背景，也利于迅速打 開和關(guān)閉目的基因的過表達(dá)，有利于研究精度的提高；
[0051] 沒有添加 Doxycycline時(shí)無(wú)滲漏型表達(dá)，屬于嚴(yán)謹(jǐn)控制的誘導(dǎo)表達(dá)體系，有助于減 少對(duì)宿主細(xì)胞的毒性和降低表達(dá)背景，提高研究的精度和可信度；
[0052] 目標(biāo)基因的啟動(dòng)子是CMV，反式激活因子的啟動(dòng)子是P郵C，都沒有物種和細(xì)胞型的 表達(dá)特異性，適應(yīng)面很廣。
[0053] 由于順式表達(dá)元件和反式調(diào)控元件都在一個(gè)載體上，單個(gè)載體發(fā)生整合即能使 Tet-on系統(tǒng)有效運(yùn)作，大大提高了獲得良好轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和成功誘導(dǎo)表達(dá)的機(jī)率。
[0054] 本發(fā)明不僅適合于在轉(zhuǎn)基因多能干細(xì)胞向造血分化過程研究中，也試用其他細(xì)胞 及動(dòng)物模型的相關(guān)轉(zhuǎn)基因和誘導(dǎo)過表達(dá)研究。
【附圖說(shuō)明】
[0化5]圖1為本發(fā)明中的帶有GFP標(biāo)記基因的成熟Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)系統(tǒng)PB-Tet-on-OE 的質(zhì)粒示意圖。
[0056]圖 2-1，2-2 為轉(zhuǎn)染了PB-Tet-on-OE 和 PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb的人類多能干 細(xì)胞化1)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的巧光圖
[0057]圖3為本發(fā)明中qPCR法鑒定過表達(dá)水平結(jié)果圖
[005引圖4-1為本發(fā)明中Western Blot法在蛋白水平鑒定過表達(dá)結(jié)果圖，圖4-1中（A為 Runxl特異性抗體檢測(cè)的Western Blot結(jié)果，B為GAPDH特異性抗體檢測(cè)的Western Blot結(jié) 果，Al，B1為DOX未誘導(dǎo)的PB-Tet-0n-GFP-T2A-hRunx化hESC總蛋白抽提樣品，A2，B2為DOX 誘導(dǎo)過表達(dá)的PB-Tet-0n-GFP-T2A-hRunx化hESC總蛋白抽提樣品，[,PageRuler預(yù)染蛋白 Ladder，D0X誘導(dǎo)過表達(dá)樣品檢測(cè)到一個(gè)52. Skd的主帶，與人類RUNX化蛋白的分子量吻合； 還有一個(gè)79. Skd的次帶，是未被蛋白酶切開的人類Runxlb蛋白與GFP蛋白連接在一起的全 長(zhǎng)膚段）
[0059] 圖4-2中A圖為GFP特異性引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，B圖為hRurudb特異性引物擴(kuò) 增口0?產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果；41，81:^?8-1日1-〇11-6。？-124-11咖^化1165〔旨日11〇1111〇0臟為模板，^ GFP或hRunx化特異性引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;A2，B2:WPB-Tet-on-0EhESCgenomicDNA為模 板，WGFP或hRunx化特異性引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;A3，WPB-Tet-on-OE質(zhì)粒DNA為模板，WGFP 特異性引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；B3，WPB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb質(zhì)粒DNA為模板，WhRurudb 特異性引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;Ml:肥B化b ladder,M2:肥B IOObp ladder)
[0060] 圖5-1,5-2為本發(fā)明中流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果圖
[0061 ]圖6-1，6-2為轉(zhuǎn)基因1165(：系向^胚層分化的巧光檢測(cè)圖
[0062] 圖 7-l，7-2為轉(zhuǎn)基因hESC系PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunx化（編號(hào)96)和PB-Tet-on- 0E(編號(hào)53)多能性的巧光檢測(cè)圖
[0063] 圖8-1到圖8-7為轉(zhuǎn)基因hESC系向造血分化過程D4的重要造血分化相關(guān)基因qPCR 檢測(cè)圖，比較有無(wú)hRUNX化過表達(dá)對(duì)于運(yùn)些基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響
【具體實(shí)施方式】
[0064] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)描述，其中的分子 克隆步驟參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》相關(guān)章節(jié)進(jìn)行，試劑盒試劑等相關(guān)材料均為市售商品， 具體如下：
[0065] 本發(fā)明中W下實(shí)施例中所用pTRIPZ及其衍生載體購(gòu)自漢恒公司，PB513B-1載體購(gòu) 自SBI公司；限制性內(nèi)切酶及DNA修飾酶購(gòu)自肥B公司；
[0066] hESCs細(xì)胞系Hl由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于2011年9月提供； mAGM-S3取自小鼠的AGM區(qū)，自1998年在本實(shí)驗(yàn)室維持并保持穩(wěn)定高效的造血能力；
[0067] 其中，試劑：BSA美國(guó)Sigma A9418，IMDM培養(yǎng)基美國(guó)GIBCO 12440053，DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Sigma D5796，F(xiàn)12培養(yǎng)液美國(guó)GIBCO 21700-075，KSR美國(guó)Gibco N10828-028，mTeSRl STEMCE化 05850，Y-27632(ROCK抑制劑）MERCK 688000,改良型a-MEM美國(guó)Hyclone 細(xì)3〇265.〇18，非必需氨基酸（肥44)美國(guó)6化。〇〇7796，0-琉基乙醇51旨111曰，〇.25%1'巧93111/ EDTA G化CO 25200056,胎牛血清(FBS)Hyclone 0078，bFGF WAKO 060-04543,血管內(nèi)皮細(xì) 胞生長(zhǎng)因子(VEGF)WAKO 229-01313，心谷氨酷胺Gibco 25030081，青霉素/鏈霉素Gibco 15070063，May-Giemsa染液德國(guó)MERCK,臺(tái)吩藍(lán)（Tiypan Blue stain)G;Lbco公司，抗壞血酸 (Ascorbic acid)Sigma公司，轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin)Sigma公司，Mahigel 抓公司；實(shí)時(shí) 巧光定量PCR試劑盒Roche FastS^d Universal SYBR Green Master(R0X)04913914001， 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Bio-rad iScript TM Cdna Synthesis Kit 170-8891。
[006引實(shí)施例1
[0069] 一種帶有標(biāo)記基因的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體，核巧酸序列如SEQ ID NO. I 所示。
[0070] 構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0071] 步驟一：設(shè)計(jì)5' 引物GFP-5'-XhoI和3' 引物T2A-3'-SwaI，WPB513B-1 載體（SBI公 司）為模板，PCR擴(kuò)增出GFP-T2A CDS片段，XhoI和MluI雙酶切后切膠回收;pTRWZ的一個(gè)衍 生載體P皿TetOE-puro-Gatal (漢恒公司），也經(jīng)過化〇1和MluI雙酶切后切膠回收;插入片段 和載體片段WT4 DNA連接酶連接;將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a ;并進(jìn)行酶切鑒定 與基因序列的測(cè)定，構(gòu)建成抑BTet0E-GFP-T2A-C載體；
[0072] 步驟二：設(shè)計(jì)5' 引物Tet-〇n-5'-PB-LVX和3' 引物Tet-〇n-3'-PBPCR擴(kuò)增出2.化b長(zhǎng) 的Tet-on相關(guān)元件，3 '用T4 PNK憐酸化，5 '引入XbaI位點(diǎn)，XbaI酶切后切膠純化;PB513B-1 經(jīng)過SpeI和化al雙酶切后切膠回收;插入片段和載體片段WT4 DNA連接酶連接;將連接后 的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞D冊(cè)a;并進(jìn)行酶切鑒定與基因序列的測(cè)定，構(gòu)建成PB-Tet-on-OE載 體。
[0073] 所述步驟一中，引物為：
[0074] 5 ' 引物GFP-5 ' -XhoI: 5 ' TTTCCCCTCGAGCCAC CATGGAGAGCGACG 3 ' ； 3 ' 引物124-3'- SwaI:5 ' TTTCCCACGCGTGGCGCGCCGAATTCTTTGGGATTTAAATGGGCCGGGATTCTCCTCCA 3 '。
[0075] 所述步驟一中，擴(kuò)增程序?yàn)?98°C預(yù)變性lmin，98°C變性10s，58°C復(fù)性30s，72°C延 伸 1111111，35個(gè)循環(huán)后72°(：1〇111111，4°(：保存。
[0076] 步驟一中反應(yīng)體系如下表1:
[0077]表1 [007引
[0079] 所述步驟二中，引物為：
[0080] 5'引物16*-〇11-5'斗8-1^￥乂：5乂64661'1'押464〔6461'7^(：1'〔0：3'；3'引物161-〇11- 3'-PB:5'ATTGTT CCAGACGCGAACTCAGG 3'。
[0081 ] 所述步驟二中，擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性lmin;94°C變性153,60°(：復(fù)性3〇3,68°(：延 伸5min，32個(gè)循環(huán)后72°C10min，4°C保存。
[0082] 步驟二中反應(yīng)體系如下表2:
[0083] 表 2 「OORAl LUU狀」 買砸例2
[0086] 其它內(nèi)容如實(shí)施例1中的內(nèi)容，本發(fā)明中重組載體包括源于pTRIPZ的Tet-on順式 表達(dá)元件和反式表達(dá)元件，W實(shí)現(xiàn)成功的誘導(dǎo)過表達(dá);所述載體還包含源于PiggyBac載體 骨架，W實(shí)現(xiàn)高效的基因整合和方便分子克隆。
[0087] !"61:-011順式表達(dá)元件包括TRE調(diào)控區(qū)域和CMV mini Promotor序列。
[008引 Tet-on反式表達(dá)元件包括WJbC啟動(dòng)子、tTA3 CDSJRES元件、Puromycin抗性基因 W及SV 40 化lyA。
[0089] PiggyBac載體骨架包括邊界與整合元件、隔離子、細(xì)菌克隆抗性篩選基因和復(fù)制 原點(diǎn)，等。
[0090] 本發(fā)明中構(gòu)建具有帶有標(biāo)記基因的成熟的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)載體，并利用 PiggyBac載體骨架將其插入人類多能干細(xì)胞的基因組，構(gòu)建能夠持續(xù)高效而無(wú)滲漏性的外 源基因誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[00川試驗(yàn)例：
[0092] 本發(fā)明中的試驗(yàn)例W人類RUNX化誘導(dǎo)過表達(dá)的多能干細(xì)胞系為例：
[0093] 基于人類RUNXb基因誘導(dǎo)過表達(dá)載體PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化的構(gòu)建：
[0094] 1，如圖1所示，該載體WPB-Tet-on-OE質(zhì)粒為出發(fā)質(zhì)粒。設(shè)計(jì)引物Runxla,b-5'- ATG(5'ATGCGTATCCCCGTAGATGCCAG 3'）和Runxlb，c-3'coding(5' TTTAAAGCGGCCGCGAATTCATTAATAGGGCCTCCACACGGCCTCCTC 3 '）（該序列不引入多余的氨基酸 序列到hRUNX化），并WpcDNA3-Rurudb質(zhì)粒上的人類Rurudb CDS為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)， 獲得5'端含有ATG起始密碼子和3'端攜帶有EcoRI酶切位點(diǎn)的人類Runxlb編碼區(qū)序列 (1359bp)。利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物后用T4PNK進(jìn)行末端憐酸化并用EcoRI酶 切，PB-Tet-on-OE質(zhì)粒進(jìn)行SwaI和EcoRI雙酶切并切膠回收，WT4DNA連接酶連接。將連接后 的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞D冊(cè)a,并進(jìn)行酶切鑒定與基因序列的測(cè)定。
[00巧]2,基于Hl的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化及其載體對(duì)照PB-Tet-on- OE的建系過程：
[0096] (1)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的制備：將含有質(zhì)粒 PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb和 PB-Tet-on-OE的 D冊(cè)a菌株的凍存菌液在含有Amp的固體LB培養(yǎng)基平皿中劃線接種，37°C過夜培養(yǎng)獲得單個(gè) 菌落。挑單個(gè)菌落到3ml的Amp-LB液體培養(yǎng)基中37 °C 28化pm培養(yǎng)8小時(shí)后，1/500接種到含有 Amp的100mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C280rpm過夜培養(yǎng)。利用化reLink? HiPure Plasmid Midiprep Kitdnvi化Ogen,cat:K2100-05)制備質(zhì)粒，并利用分光光度法測(cè)定0D260/280及 核酸濃度，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0097] (2)人類多能干細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)與傳代
[0098] 本研究中使用的基礎(chǔ)細(xì)胞系為人類胚胎干細(xì)胞系Hl，培養(yǎng)條件為商品化的mTeSRl 培養(yǎng)基(Stem cell公司）37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞成長(zhǎng)匯合至80%后，WD-PBS 洗涂細(xì)胞一次，再W專口的商品化酶Re 1 eSR(Stem Ce 11，cat: 05872)37°C消化5分鐘。再W mTeSR培養(yǎng)基將細(xì)胞團(tuán)吹成適當(dāng)小片，Wl: 3的比例分裝到Matrigel (Invitrogen ,cat: A1413301)打底的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0099] (3)多能干細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染和抗性篩選
[0100] 按1:3的培養(yǎng)面積比接種Hl細(xì)胞到Ma化igel打底的24孔板中并培養(yǎng)1-2天，當(dāng)hESC 克隆達(dá)到適當(dāng)大小時(shí)，加入脂質(zhì)體與質(zhì)粒的混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體方法如下:在第一個(gè)無(wú)菌 的 0.6ml eppendo;rf 管添加SOul 〇pti-MEM@ Medium ,然后加入0.5]ig轉(zhuǎn)座子載體 transposon(PB-Tet-on-GFP-T2A-hRunxlb或PB-Tet-on-0E)與轉(zhuǎn)座子輔助載體 transposase(PB200A-l ,SBI公司）的混合物，其mol比為1:3，再加入化 1 LP3000? Reagent， 混合均勻；在第二個(gè)無(wú)菌的0.6ml eppendoW管添加50]ilOpti-MEM及:Medium,然后加入 0.75]il Lipol'ccUiminc貨3000 Reagent，混合均勻；最后將兩個(gè)管中的成分迅速混勻后室溫 解育5min，然后加入到相應(yīng)的含有50化1 mTeSRl培養(yǎng)基的24孔板的孔中，混合均勻后37°C、 5%C02的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2天，其中第二天添加25化1 mTeSRl培養(yǎng)基;保留一個(gè)孔為不加 任何DNA的轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照。之后吸去上清，添加新鮮的50化1 mTeSRl培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2-3 天，每天換液;最后換成含有化g/ml Puromycin的mTeSRl培養(yǎng)基，每天換液，直至所有沒有 被轉(zhuǎn)染的hESC被殺死而具有化romycin抗性的克隆長(zhǎng)到足夠大又不互相融合的時(shí)候，挑取 5-10個(gè)狀態(tài)最好而較大的克隆到Ma1:;rigeI打底的96孔板中用含有Ijig/ml Puromycin的 mTeSRl繼續(xù)培養(yǎng)。待其生長(zhǎng)匯合之后連續(xù)傳代，從96孔板到48孔板，再到24孔板，最后傳到 35-mm培養(yǎng)皿中。運(yùn)之后再用不含化romycin的mTeSRl培養(yǎng)基繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。最后當(dāng)hESC生 長(zhǎng)匯合后每35-mm培養(yǎng)皿用ReleSR解離后重懸于含有20%DMS0的mTeSRl培養(yǎng)基中并分裝到 2個(gè)凍存管中，先放到室溫的凍存盒（Nelgene,Oyo 1 °Cfreezing Container ,cat: 5100- 0001)中，在-80°C低溫冰箱中降溫過夜，然后轉(zhuǎn)移到液氮罐中永久保存。
[0101] 3,轉(zhuǎn)染 PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb和 PB-Tet-on-OE 的 Hl 細(xì)胞系的轉(zhuǎn)基因和誘導(dǎo) 過表達(dá)鑒定：
[0102] (1)轉(zhuǎn)基因整合鑒定：培養(yǎng)于35-mm培養(yǎng)皿的轉(zhuǎn)基因Hl細(xì)胞系用QIAamp Blood Mini Kit (Qiagen ,cat :51104)提取基因組 DNA，然后用Runxla，b-5'-ATG/Runxlb，c-3' coding^相應(yīng)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增人類RUNX化CDS及GFP CDS序列，Wl %瓊脂糖 膠IxTAE電泳系統(tǒng)檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小，證實(shí)其符合預(yù)期大小。
[0103] (2)qPCR進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)
[0104] 培養(yǎng)于24孔板的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中加入化g/ml DoxycyclineW誘導(dǎo)GFP及RUNX化過表 達(dá)，10小時(shí)及24小時(shí)后用倒置巧光顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照(如圖2-1，2-2)。用Trizol試劑抽 提0〇巧巧(31;[]16誘導(dǎo)24小時(shí)或未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系總1?酷并用15(31'1口1了^。0臟87]1化6313 Kit (Bio-Rad，cat: 170-8891)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, WRunxlb/c-EX7B-F( 5 ' TCTGCAGAACTTT CCAGTCG 3'）和Runx化/c-EX8-R(5'GTCGGGGAGTAGGTGAAGG 3'）作為檢測(cè)引物，^640口護(hù) EX7-F(5'GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 3'）和GADPH-EX8-R巧'ACCACCCTGTTGCTGTA GCCAA 3'） 作為內(nèi)參引物，用I^astStart Universal SYBR Green Master kit(Roche,cat: 04913850001)在巧光定量PCR儀(Bio-rad Q5)上進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量檢測(cè)，W確定誘導(dǎo)表達(dá) 的hRUNX化含量上升的倍數(shù)。
[01 05] qPCR法鑒定過表達(dá)水平結(jié)果如圖3，PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化（編號(hào)為MF96)的 hESC在Doxycycline誘導(dǎo)（D0X+)或不誘導(dǎo)（D0X-)條件下RUNX化表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平比較，前者 是后者的大約37倍。
[0106] (3)Western Blot進(jìn)行蛋白水平的檢測(cè)
[0107] 在培養(yǎng)于35-mm培養(yǎng)皿的轉(zhuǎn)基因多能干細(xì)胞中加入化g/ml DoxycyclineW誘導(dǎo) hRUNX化過表達(dá)，然后用0.5mM抓TA將其消化成單細(xì)胞并重懸于D-PBS，離屯、沉淀W后用500 iil RIPA(含有ImM PMSF和Roche的Ix蛋白酶抑制劑)重懸，冰浴30min并震蕩促使其裂解，最 后12000X g 4°C5min沉淀不溶組分，上清按50山分裝并凍存于-80C。用BCA法與標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn) 行比較蛋白樣品濃度，并W此為根據(jù)調(diào)整上樣樣品的蛋白總量一致。用標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE(10% 分離膠/5%濃縮膠)在Tis-甘氨酸緩沖電泳體系中分離蛋白樣品，然后轉(zhuǎn)至PVGF膜上，用鼠 抗人Runxl-抗（DW71,SC-IOl 146 ,Santa cruz公司）或鼠抗人GAPDH-抗（內(nèi)參對(duì)照，KC- 5G4,Kang化en公司）結(jié)合目標(biāo)，然后用Goat Anti-Mouse IgG HfcL(HRP)Preadsorbed二抗 (ab97040，Abcom公司）結(jié)合一抗，最后用Amersham? E化? Prime蛋白印跡試劑（RPN2232， GE Healthcare)顯色，用Image如ant LAS 4000 mini拍照記錄結(jié)果（如圖4-1，圖4-2)。
[0108] DOX誘導(dǎo)過表達(dá)樣品檢測(cè)到一個(gè)52. Skd的主帶，與人類Runx化蛋白的分子量吻合； 還有一個(gè)79. Skd的次帶，應(yīng)該是未被蛋白酶切開的人類Runxlb蛋白與GFP蛋白連接在一起 的全長(zhǎng)膚段，而對(duì)照未誘導(dǎo)樣品沒有明顯條帶。
[0109] 4,轉(zhuǎn)染 PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb和 PB-Tet-on-OE 的 Hl 細(xì)胞系的多能性和向 S 胚層分化能力鑒定
[0110] (1)轉(zhuǎn)基因多能干細(xì)胞系的多能性檢測(cè)
[0111] 轉(zhuǎn)基因人類多能干細(xì)胞系PB-Tet-on-OE和PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb的克隆細(xì) 胞團(tuán)在0.1%化itonX-100通透后，分別與相應(yīng)的人類多能干細(xì)胞特征性抗體(SSEA4、TRA- l、0ct4和化nog-抗)結(jié)合，再與相應(yīng)的帶切3或FITC巧光標(biāo)記的二抗結(jié)合，最后用核DNA染 料DAPI染色，在巧光顯微鏡下進(jìn)行巧光檢測(cè)，如圖7-1，7-2。
[0112] 檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明W上兩個(gè)細(xì)胞系都具有正常的人類多能干細(xì)胞特征性基因表達(dá)，可 W進(jìn)一步用于向造血分化的研究。
[0113] (2)轉(zhuǎn)基因多能干細(xì)胞系向S胚層分化能力的檢測(cè)
[0114] 轉(zhuǎn)基因人類多能干細(xì)胞系PB-Tet-on-OE和PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb的克隆細(xì) 胞團(tuán)在 Human Pluripotent Stem Cell Functional Identification Kit(C027 ,R&D Systems公司）的誘導(dǎo)下分別向內(nèi)胚層，中胚層和外胚層分化。在化iton X-IOO通透后,分別 與相應(yīng)的特征抗體(S0X17 ,Brachyury和0TX2-抗)結(jié)合，再與相應(yīng)的帶切3巧光標(biāo)記的二抗 結(jié)合，最后用核DNA染料DAPI染色，在巧光顯微鏡下進(jìn)行巧光檢測(cè)，如圖6-1，6-2。
[0115] 檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明W上兩個(gè)細(xì)胞系都具有正常的向=胚層分化的能力，可W進(jìn)一步用 于向造血分化的研究。
[0116] 5,共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)hRUNX化過表達(dá)對(duì)于人類多能干細(xì)胞向造血分化過程的效應(yīng)。
[0117] (1)轉(zhuǎn)基因hESCs(PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化和 PB-Tet-on-OE)維持未分化培養(yǎng) 采用無(wú)基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法，根據(jù)W上描述的方法進(jìn)行培養(yǎng)和傳代；
[0118] (2)mAGM-S3基質(zhì)細(xì)胞的準(zhǔn)備
[0119] 復(fù)蘇液氮凍存的mAGM-S3細(xì)胞株于明膠包被的IOOmrn培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為含有5% 胎牛血清的MEM ALPHA M孤(S冊(cè)0265.Ol ,Hyclone公司），37°C，5%C02培養(yǎng)至細(xì)胞完全匯合 之后，用0.05%膜酶消化重懸，用冰的D-PBS和培養(yǎng)基終止消化，傳代至明膠包被的12孔板 中，輕柔搖勻，37°C5%C02培養(yǎng)1-2天。當(dāng)細(xì)胞融合度不低于90%時(shí)（約2 X 105細(xì)胞/孔），13 Gray X射線福照處理后再換新鮮mAGM-S3細(xì)胞培養(yǎng)基備用。
[0120] (3化ESCs與mAGM-S3共培養(yǎng)產(chǎn)生造血干/祖細(xì)胞并誘導(dǎo)hRUNX化過表達(dá)
[0121] 用2(K)化槍頭槍尖在顯微鏡下將轉(zhuǎn)基因hESCs未分化集落劃分成0.5-1 X IO3細(xì)胞 的小集落片，W35個(gè)集落/12孔板每孔（約2 X 105hESCs/孔）的密度接種集落于福照過的 mAGM-S3細(xì)胞上，加1.5ml hESCs未分化細(xì)胞維持液，輕柔搖勻，37°C5%C〇2培養(yǎng)3天，然后換 成造血誘導(dǎo)分化液（IMDM 515ml，去補(bǔ)體化FBS 60ml(終濃度10%)，肥AA 5111^心谷氨酷胺 10ml，50mg/ml AA 60化1，轉(zhuǎn)鐵蛋白40山，VEGF 10yg，2-ME扣1)再培養(yǎng)14天(從運(yùn)一天開始 計(jì)算開關(guān)W后的天數(shù)，記為DX)，并從DO開始加或不加Doxycycline來(lái)比較有無(wú)hRUNX化過表 達(dá)對(duì)于造血分化的影響，每天換液(D6W后根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)情況可一天換液2次），至D14將產(chǎn) 生大量造血干/祖細(xì)胞，收集細(xì)胞備用。
[0122] (4)流式分析
[0123] 共培養(yǎng)開關(guān)后14天(D14)的共培養(yǎng)細(xì)胞用D-PBS洗涂2遍，用槍頭刺破造血克隆后 用0.25%1'巧93111/邸14 37°(：處理5-7111111，冰0斗85及含血清培養(yǎng)液終止膜酶作用，用11111槍 頭反復(fù)吹打直至無(wú)大細(xì)胞團(tuán)塊凝集，收集到離屯、管中，13(K)rpm室溫離屯、5min，棄上清，重懸 于SM buffer(含有2%FBS的D-PBS)，70皿濾膜過濾。大約每0.5ml加入普通兔血清5-lOul混 勻，置于冰上封閉20分鐘，阻斷抗體抗原非特異性結(jié)合位點(diǎn)，再加入特異性抗體(CD34-APC、 CD45-PE各化1)，震蕩混勻，冰上避光反應(yīng)20-30min，lml SM buffer洗涂1次，400xg室溫離 屯、5min，棄上清，SM buffer液20化1重懸于流式上樣管中，用抓化nt〇n流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢 測(cè)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用FlowjolO軟件進(jìn)行分析。
[0124] 分別針對(duì)GFP+和GFP-兩個(gè)亞群進(jìn)行CD34+/CD45+細(xì)胞群統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)于DOX誘 導(dǎo)過表達(dá)的PB-Tet-on-OE而言，GFP+和GFP-兩個(gè)亞群中CD34+/CD45+是接近的；但在DOX誘 導(dǎo)過表達(dá)的PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRurudb hES cell line中，CD34+/CD45+細(xì)胞群的含量在 GFP-中比GFP+要高出10倍W上。由于人類Rurudb基因和GFP是共表達(dá)的，W上檢測(cè)結(jié)果很清 楚的表明Rurudb的過表達(dá)對(duì)于CD34+/CD45+細(xì)胞群的產(chǎn)生具有強(qiáng)烈的抑制作用。（如圖5-1， 圖 5-2)
[0125] (5)qPCR分析造血分化早期hRUNXlB過表達(dá)對(duì)于造血分化相關(guān)基因表達(dá)的影響（如 圖8-巧Ij圖8-7)
[0126] A，總RNA 抽提
[0127] 用W上的方法來(lái)培養(yǎng)和獲得PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化和PB-Tet-on-OE開關(guān)后 D4的共培養(yǎng)細(xì)胞，400xg室溫離屯、5min，棄上清，采用化izol提取總RNA，凍存于-80°C儲(chǔ)存， 實(shí)時(shí)巧光定量PCR方法檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)；
[012引 B，逆轉(zhuǎn)錄cDNA
[01巧]逆轉(zhuǎn)錄20]iL反應(yīng)體系：
[0130]
[0131] 反應(yīng)程序：251：5111111;421：3〇111111;851：5111111;4°(：保存。獲得的。0魁樣本分裝后-80 °C儲(chǔ)存；
[0132] C，qPCR 分析
[0135] GAPDH(管家基因）引物序列：[0136] GADPH-EX7-F 5'GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 3'
[0133] WF'astStart Universal SYBR Green Master kit(cat:04913850001 ,Roche)進(jìn) 如 T A祐^ 歷"c 玄I1、
[0134]
[0137] GADPH-EX8-R 5'ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA 3'
[013引 Gatal引物序列：
[0139] Gatal-E^-F5'CACGACACTGTGGCGGAGAAAT3'
[0140] Gatal-Ex6-R 日'TTCCAGATGCCTTGCGGTTTCG 3'
[0141] GATA3引物序列：
[0142] GATA3-EXN1-F 5'GCGAGACAGAGCGAGCAA 3'
[0143] GATA-3-EXN2-R 5'ACTGGGTACGGCAGAATAAAA 3'
[0144] LMO巧I物序列：
[0145] LM02-EX2-F 5'GCGCCTCTACTACAAACTGGGC 3'
[0146] LM02-EX3-R 5，CTCATAGGCACGAATCCGCTTG 3，
[0147] PC畑I巧I物序列：
[0148] PCDH12-EX3-F 5，GACCTCTCTGTGAAGCAACTGC 3，
[0149] PCDH12-EX4-R 5'CACATTGTCACGGTAGTTGGTGG 3'
[0150] Runxla 引物序列：
[0151] Runxla-Ex6-F 5'ACAGCCATGAGGGTCAGC 3'
[0152] Runxla-Ex7A-R 5'ATCTCCAGGGTGCTGTGTCT 3'
[0153] SPIl引物序列：
[0154] SPI1-EX2-F 5'GACACGGATCTATACCAACGCC 3'
[0155] SPI1-EX3-R 5'CCGTGAAGTTGTTCTCGGCGAA 3'
[0156] vWF引物序列：
[01 巧]VWF-EX27-F 5'CCTTGAATCCCAGTGACCCTGA 3'
[0158] VWF-EX28-R 5'GGTTCCGAGATGTCCTCCACAT 3'
[0159] 如圖8-巧^圖8-7結(jié)果顯示，包括GATA1，GATA3，LM02，PCDH12(VE-CAD)，抓NXla (Runxl的另一種重要剪切體），SPIl，vWF等造血相關(guān)重要基因，相比PB-Tet-on-OE(編號(hào) MF53)，在PB-Tet-〇n-GFP-T2A-hRunx化（編號(hào)MF96)過表達(dá)的D4共培養(yǎng)細(xì)胞中被大幅下調(diào)， 運(yùn)可能是其向造血分化被抑制的直接原因。
[0160] W下試驗(yàn)例中主要溶液的配制如下：
[0161] (1)人源化ESC培養(yǎng)基配制
[0162] ml'eSRTMlBasal Medium 400mL
[0163] ml'eSRTMl 放 Supplement IOOmL
[0164] 共500ml，混勻，置于4°C冰箱備用。
[0165] (2)AGM培養(yǎng)液配制
[0166] Q-MEM SOOmL
[0167] FBS(去補(bǔ)體化） 25mL
[0168] 共525ml，混勻，0.22皿濾器過濾，置于4°C冰箱備用。
[0169] (3化ESC未分化細(xì)胞維持液配制
[0170]
[0171]
[0172]
[0173]
[0174] ... 。
[01巧]共590ml，混勻，0.22皿濾器過濾，置于4。(：冰箱備用。
[0176] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 帶有標(biāo)記基因的Tet-On誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述帶有標(biāo)記基因的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體，其特征 在于:所述重組載體包括源于PTRIPZ的Tet-on順式表達(dá)元件和反式表達(dá)元件，還包括源于 PB513B-1的PiggyBac載體骨架、標(biāo)記基因 GFP及T2A序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的所述帶有標(biāo)記基因的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體，其特征 在于:所述Tet-on順式表達(dá)元件包括TRE調(diào)控區(qū)域和CMV mini Promoter序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的所述帶有標(biāo)記基因的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體，其特征 在于:所述Tet-on反式表達(dá)元件包括hUbC啟動(dòng)子、tTA3 Q)S、IRES元件、Puromycin抗性基因 以及SV 40 PolyA。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的所述帶有標(biāo)記基因的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體，其特征 在于:所述PiggyBac載體骨架包括邊界與整合元件、隔離子、細(xì)菌克隆抗性篩選基因和復(fù)制 原點(diǎn)。6. -種帶有標(biāo)記基因的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于:包括 如下步驟： 步驟一： 設(shè)計(jì)5 '引物GFP-5 ' -XhoI和3 '引物T2A-3 ' -SwaI，以13B-1載體為模板，PCR擴(kuò)增出 GFP-T2A CDS片段，XhoI和MluI雙酶切后切膠回收;pTRIPZ的一個(gè)衍生載體pHBTetOE-puro-Gatal，也經(jīng)過XhoI和MluI雙酶切后切膠回收；插入片段和載體片段以T4 DNA連接酶連 接;將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a;并進(jìn)行酶切鑒定與基因序列的測(cè)定，構(gòu)建成 pHBTetOE-GFP-T2A-C 載體； 步驟二： 設(shè)計(jì)5' 引物Tet-〇n-5'-PB-LVX和3' 引物Tet-〇n-3'-PB PCR擴(kuò)增出2.7kb長(zhǎng)的Tet-on相 關(guān)元件，3 '用T4 PNK磷酸化，5 '引入XbaI位點(diǎn)，XbaI酶切后切膠純化;PB513B-1經(jīng)過SpeI和 HpaI雙酶切后切膠回收;插入片段和載體片段以T4 DNA連接酶連接;將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細(xì)胞DH5a;并進(jìn)行酶切鑒定與基因序列的測(cè)定，構(gòu)建成PB-Tet-on-OE載體。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種帶有標(biāo)記基因的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體的構(gòu)建方 法，其特征在于:所述步驟一中，引物為： 5'引物 GFP-5'-XhoI: 5'TTTCCCCTCGAGCCACCATGGAGAGCGACG 3'； 3'引物 T2A-3'-SwaI : 5. TTTCCCACGCGTGGCGCGCCGAATTCTTTGGGATTTMATGGGCCGGGATTCTCCTC CA 3 '。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種帶有標(biāo)記基因的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體的構(gòu)建方 法，其特征在于:所述步驟二中，引物為： 5 ' 引物Tet-on-5 ' -PB-LVX: 5 ' CGAGGTTCTAGACGAGTTTACTCCC 3 ' ； 3 ' 引物丁〇卜〇11-3'-PB:5' ATTGTTCCAGACGCGAACTCAGG 3'。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種帶有標(biāo)記基因的Tet-on誘導(dǎo)過表達(dá)的重組載體的構(gòu)建方 法，其特征在于：所述步驟一中，擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 °C預(yù)變性Imin，98 °C變性IOs，58 °C退火 30s，72°C 延伸 lmin，35 個(gè)循環(huán)后 72°C 10min，4°C 保存； 所述步驟二中，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 °C預(yù)變性Imin ; 94 °C變性15s，60 °C退火30s，68 °C 延伸5 min, 32個(gè)循環(huán)后72°C 10 min，4°C保存。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK105925609SQ201610552748
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年7月14日
【發(fā)明人】陳波, 馬峰, 周涯
【申請(qǐng)人】中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所