一種快速抑制龍眼胚性愈傷組織中目標基因表達的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種快速抑制龍眼胚性愈傷組織細胞中目標基因表達的方法。本發(fā)明根據(jù)目標mRNA全長序列設計合成數(shù)個靶點寡核苷酸siRNA序列，利用懸浮細胞培養(yǎng)體系，通過細胞轉染劑Lipofectamine 2000 reagent介導法導入龍眼胚性愈傷組織細胞中，從而實現(xiàn)特異性抑制目標mRNA表達。該方法具有操作簡單、抑制效果顯著、無需載體構等優(yōu)點，避免了現(xiàn)有方法由于依賴農(nóng)桿菌介導的轉基因技術而實驗周期長，費時費力的缺點，本發(fā)明提供了一種快速高效的新技術手段，為龍眼偏性愈傷組織中目標基因的功能研究奠定了重要基礎。
【專利說明】
一種快速抑制龍眼胚性愈傷組織中目標基因表達的方法
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種快速抑制龍眼胚性愈傷組織細胞中目標基因表達的方法。
【背景技術】
[0002]胚胎發(fā)育的好壞是植物能否正常生長的關鍵，尤其在果樹等經(jīng)濟作物生產(chǎn)過程中，胚胎發(fā)育能夠影響果實的產(chǎn)量和品質。然而，胚胎發(fā)育早期研究存在取樣困難，材料一致性差，發(fā)育同步化水平低等不利因素，對其研究往往存在較大難度。而植物體細胞胚胎發(fā)生(體胚發(fā)生)通過人為同步化調控發(fā)育進程，是研究植物早期胚胎發(fā)生理想的替代系統(tǒng)。而植物的生長發(fā)育、生物學性狀以及遺傳特征等從根本上主要通過基因的轉錄翻譯實現(xiàn)調控，因此對植物體胚發(fā)生過程中基因進行研究對于揭示目標基因的調控功能，甚至進行植物遺傳改良均有重要意義。
[0003]目前，植物基因表達調控研究主要通過已知基因序列構建表達載體進行遺傳轉化、瞬時表達或亞細胞定位等。在擬南芥、水稻和小麥等植物中，已經(jīng)有關于體胚發(fā)生過程中基因功能驗證的相關報道，而在其他多種植物中，由于其胚性愈傷組織的特殊性，其基因遺傳轉化存在諸多難度，例如，龍眼屬于頑拗型植物，且其胚性胚性愈傷組織為內起源性，采用傳統(tǒng)遺傳轉化手段無法實現(xiàn)，因此主要通過轉化模式生物進行研究，而由于物種本身的差異性，這種功能分析存在較多局限性。鑒于此，尋找新的方法解決這一難題成為后續(xù)開展研究的關鍵。
[0004]近年來，采用反義脫氧寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotides，0DNs)進行目標基因抑制表達從而實現(xiàn)基因功能研究已在部分植物中進行報道，例如大麥葉片、煙草花粉管以及水稻細胞等(Sun et al, 2005 ； Yang et al, 2006 ； Sun et al, 2007 ；Liao etal，2013;Dinc et al，2011)。在這些研究基礎上，我們提出通過細胞轉染劑介導ODNs導入龍眼胚性愈傷組織中進行目標mRNA抑制表達，從而實現(xiàn)龍眼體胚發(fā)生過程中相關基因的調控功能驗證。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明針對目前龍眼等植物胚性愈傷組織目標基因功能研究的技術空白，提供了一種快速高效抑制龍眼胚性愈傷組織細胞中目標基因表達的方法。
[0006]—種快速抑制龍眼胚性愈傷組織中目標基因表達的方法，通過以下步驟實現(xiàn):增殖并篩選生長狀態(tài)良好、細胞活力旺盛的龍眼胚性愈傷組織懸浮細胞系，隨后通過GenBank數(shù)據(jù)庫搜索并下載相應物種目標基因全長序列，設計并合成靶點SiRNA寡核苷酸，采用細胞轉染劑介導寡核苷酸轉入龍眼胚性愈傷組織細胞中，24 h處理后通過定量檢測胚性愈傷組織中目標基因的表達水平。
[0007]所述的龍眼胚性愈傷組織為細胞懸浮培養(yǎng)獲得的質地松散、生長狀態(tài)良好且細胞活力旺盛的龍眼胚性愈傷組織細胞系。
[0008]根據(jù)目標基因全長序列設計并合成數(shù)個靶點siRNA寡核苷酸，通過24h處理采用基因定量表達方法篩選靶點s iRNA。
[0009]采用小型胚性愈傷組織細胞培養(yǎng)容器，在添加靶點siRNA的基礎上加入胚性愈傷組織細胞液體培養(yǎng)基(MS+2，4-D 1.0 mg/L)至終體積500yL，25 °C、115rpm/min條件下處理時間為24h。
[0010]該方法按以下步驟實施:
一、根據(jù)目標基因全長cDNA序列設計并合成數(shù)個靶點siRNA寡核苷酸；
二、采用液體懸浮培養(yǎng)方式增殖和篩選生長狀態(tài)良好、細胞活力旺盛的龍眼胚性愈傷組織;三、在小型細胞培養(yǎng)容器中加入33yL細胞轉染劑、1.ΟμΜ靶點siRNA寡核苷酸和0.15 g龍眼胚性愈傷組織細胞；
四、再往小型細胞培養(yǎng)容器中加入胚性愈傷組織細胞液體培養(yǎng)基MS+2，4-D 1.0 mg/L至終體積500yL，，25°C、115rpm/min條件下處理時間為24h，通過定量表達檢測篩選抑制效果最佳處理體系。
[0011]本發(fā)明經(jīng)過多次試驗重復發(fā)現(xiàn)，采用本方法可以在不影響龍眼胚性愈傷組織生長的情況下高效進行目標基因抑制表達，實現(xiàn)龍眼胚性愈傷組織及體胚發(fā)生過程中目標基因功能研究。
[0012]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下:
1.本發(fā)明操作簡便，作用效果顯著，且試驗周期短，避免了傳統(tǒng)方法試驗繁瑣、費時費力的缺點、省去了載體構建等步驟。
[0013]2.本發(fā)明采用細胞脂質體型轉染試劑Lipofectamin2000介導目標基因革巴點siRNA寡核苷酸導入龍眼胚性愈傷組織細胞，而不受品系或物種種類局限，應用范圍廣，為不同物種胚性愈傷組織或體胚發(fā)生過程中目標基因功能研究提供方法。
[0014]3.本發(fā)明試驗效率高，處理24h后目標基因表達量降為原來的一半。
【附圖說明】
[0015]圖1是以仍Γυ為例，33yL轉染劑介導下，分別添加Ι.ΟμΜ革巴點siRNA609和siRNA751和SiRNAlOOO處理24h后，龍眼胚性胚性愈傷組織中仍TTTW抑制表達情況。所用胚性愈傷組織為‘紅核子’龍眼幼胚中誘導獲得。
[0016]圖2是33yL轉染劑介導下，不同濃度siRNA751處理24h后，龍眼胚性胚性愈傷組織中仞77仍抑制表達情況。
【具體實施方式】
[0017]一下結合具體實施例和附圖進一步對本發(fā)明進行詳細說明，但具體實施例并不在任何意義上構成對本發(fā)明保護范圍的限制。
[0018]具體實施步驟如下:
I)龍眼仞77?靶點SiRNA寡核苷酸設計及合成
從GenBank數(shù)據(jù)庫中查找并獲取龍眼仍77?全長cDNA，驗證無誤后送上海吉瑪制藥技術有限公司合成3個相應靶點siRNA寡核苷酸，并采用高效液相色譜進行純化。靶點s iRNA序列分別為siRNA609: CCAAGUCCUUUGUCAAUUUTT ;siRNA751: CCAUUGGAUUAGCUGCUUUTT和siRNAlOOO:GCUAAAGGCUACCCUCCUUTT。
[0019]2)龍眼胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)和篩選
將龍眼胚性愈傷組織接種到液體懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-2代，篩選質地松散，色澤鮮艷且生長狀態(tài)良好的懸浮培養(yǎng)細胞系。
[0020]3)龍眼仞77仍靶點siRNA篩選
挑選生長良好的龍眼胚性愈傷組織，置于經(jīng)高壓滅菌的濾紙上去除多余的液體培養(yǎng)基。隨后取2個經(jīng)高壓滅菌的1.5mL離心管，分別加入細胞轉染劑(Lipofectamine 2000reagent，購自Invitrogen)33yL和胚性愈傷組織液體培養(yǎng)基92yL，混勾后形成混合液，室溫下靜置5min。取25yL不同靶點siRNA寡核苷酸siRNA609、siRNA751和siRNAlOOO分別加入3個經(jīng)高壓滅菌的1mL三角瓶中，再分別加入10yL胚性愈傷組織液體培養(yǎng)基，混勻后將上述混合液加入到該三角瓶中，進一步重復混勻靜置20min。隨后加入0.15g龍眼胚性愈傷組織，并再次加入胚性愈傷組織液體培養(yǎng)基至500yL ο相同方法設置ck對照組。25 °C，115rpm/min，黑暗條件下處理24h。
[0021 ] 4)龍眼仞77仍靶點siRNA濃度篩選
根據(jù)上述方法篩選獲得的抑制效果最佳的siRNA，設置不同濃度梯度進行最優(yōu)添加濃度優(yōu)化，濃度梯度分別為1.ΟμΜ、2.5μΜ和5.ΟμΜ采用步驟3)中方法進行處理。
[0022]5)龍眼胚性愈傷組織總RNA提取
(I)試驗所需要的10yL、200yL和ImL槍頭以及1.5毫升離心管均為無RNA酶耗材，且使用前均采用高壓鍋進行121°C、1lKPa處理20min;提RNA所用研缽采用工業(yè)酒精灼燒，室溫下冷卻備用。
[0023](2)超低溫冰箱中快速取出處理后的胚性愈傷組織，于研缽中采用液氮研磨成勻漿，轉移至1.5mL專用離心管中，加ImL Tripure細胞裂解液，顛倒混勻后靜置5min。
[0024](3)加200yL氯仿，劇烈震蕩15s后靜置1min;臺式高速冷凍離心機4°C，12000rpm/min離心15min，吸取上清液轉移到新離心管中。
[0025](4)加入500yL異丙醇，顛倒混勻后靜置1min;臺式高速冷凍離心機4°C，12000rpm/min離心15min，隨后去除上清液。
[0026](5)加入75%乙醇800yL，臺式高速冷凍離心機4°C，8000rpm/min離心2min，去除上清液。
[0027](6)風干沉淀，加入無RNA酶雙蒸水50yL溶解沉淀。
[0028](7)采用1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳檢測胚性愈傷組織RNA的純度，并通過超微量紫外光分光光度計測定RNA的濃度。
[0029]6) cDNA逆轉錄
采用TaKaRa DRR037A PrimerscriptTM RT Reagent Kit進行仞77?定量cDNA逆轉錄，具體操作步驟如下:
總RNA 500ng；
5X PrimeScript ? Buffer 2 uL；
PrimerScript Rt Enzyme Mix 0.5 uL；
Oligo dT Primer(50uM) 0.5 uL；
Random 6 mers(10uM) 0.5uL； RNase-Free ddH20補足至終體積10 yL。隨后低速離心混勻，置于37°C水浴鍋中溫浴15m i η后迅速注意到8 5 °C水浴鍋中水浴5 s。
[0030]例77仍表達水平qPCR檢測
根據(jù)DlTIRl全長cDNA序列qPCR引物，送北京六合華大基因科技股份有限公司合成。隨后采用LightCycler480和SYBR ? Prumix EX TaqTMII試劑盒進行qPCR分析，內參基因為DlFSD、DlEFlamDlEif4a，反應體系和反應程序如下:qPCR反應體系:
SYBR 10yL；
Forward Primer (引物序列:TGAGTAGGCAGAGAGTGTTCGT)0.8yL ；
Reverse PrimerC 引物序列:GTGGGACCAAGTTGAAATCAG) 0.8yL；
模板IyL;
RNase-Free ddifeO 8.4 yL。
[0031]PCR反應程序:
95 °C, 30s；
95°C，5s，TM，15s，72°C，1s，重復該步驟40個循環(huán)；
95°C，5s，60°C，60s，97°C;
50。。，30s ο
[0032]每個樣品進行3次重復，并采用excel進行相對表達量分析。
[0033]采用上述步驟進行龍眼胚性胚性愈傷組織中例TTTW抑制表達試驗，處理24h后，篩選獲得抑制效果最佳的為靶點siRNA751，表達量降為對照組的3/5(圖l);siRNA751濃度優(yōu)化處理后，/WTT仍表達量不到原來1/2(圖2);該方法過抑制效果明顯。
[0034]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一種快速抑制龍眼胚性愈傷組織中目標基因表達的方法，其特征在于:所述方法為:增殖并篩選生長狀態(tài)良好、細胞活力旺盛的龍眼胚性愈傷組織懸浮細胞系，隨后通過GenBank數(shù)據(jù)庫搜索并下載相應物種目標基因全長序列，設計并合成靶點SiRNA寡核苷酸，采用細胞轉染劑介導寡核苷酸轉入龍眼胚性愈傷組織細胞中，24 h處理后通過定量檢測胚性愈傷組織中目標基因的表達水平。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的靶點SiRNA寡核苷酸序列為siRNA609:CCAAGUCCUUUGUCAAUUUTT;SsiRNA751:CCAUUGGAUUAGCUGCUUUTT;SsiRNAlOOO:GCUAAAGGCUACCCUCCUUTT。3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的龍眼胚性愈傷組織為細胞懸浮培養(yǎng)獲得的質地松散、生長狀態(tài)良好且細胞活力旺盛的龍眼胚性愈傷組織細胞系。4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:采用小型胚性愈傷組織細胞培養(yǎng)容器，加入33yL細胞轉染劑、1.ΟμΜ勒點siRNA寡核苷酸和0.15 g龍眼胚性愈傷組織細胞。5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于:在添加靶點SiRNA的基礎上加入胚性愈傷組織細胞液體培養(yǎng)基至終體積500yL，并于25 °C、115rpm/min條件下處理時間為24h。6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于:所述的液體培養(yǎng)基為MS+2，4-D1.0 mg/L。
【文檔編號】C12N15/87GK105925614SQ201610342710
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】林玉玲, 賴瑞聯(lián), 賴鐘雄, 程春振, 劉生財, 陳裕坤, 張梓浩
【申請人】福建農(nóng)林大學