利用rs4680多態(tài)性檢測(cè)氯氮平和利培酮用藥效果的試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種基因技術(shù)領(lǐng)域的利用rs4680多態(tài)性檢測(cè)氯氮平和利培酮用藥效果的試劑盒。本發(fā)明涉及一種分離的含單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO:1所示，所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)位于第854位，rs4680為G→A。本發(fā)明涉及一種檢測(cè)前述核苷酸的方法，包括如下步驟：步驟一，檢測(cè)如SEQ ID NO：1所示序列的第854位的核苷酸；步驟二，采用Taqman?MGB分型方法，檢測(cè)第854位否存在單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明為研究我國(guó)人群中COMT基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為臨床用藥個(gè)體化提供理論基礎(chǔ),同時(shí)也為基于藥物基因組學(xué)理念的新藥研發(fā)提供指導(dǎo)依據(jù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
利用rs4680多態(tài)性檢測(cè)氯氮平和利培酬用藥效果的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利用rs4680多態(tài)性檢測(cè)氯氮平和利培酬 用藥效果的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 氯氮平（Clozapine)化學(xué)名為8-氯-11-(4-甲基-1-贓嗦基）-甜-二苯并[b，e] [1， 4]二氮雜卓，分子式Cl細(xì)19C1N4。氯氮平是國(guó)內(nèi)最普遍的治療精神疾病的藥物，不僅對(duì)精神 病陽(yáng)性癥狀有效，對(duì)陰性癥狀也有一定效果。適用于急性與慢性精神分裂癥的各個(gè)亞型，對(duì) 幻覺(jué)妄想型、青春型效果好。也可W減輕與精神分裂癥有關(guān)的情感癥狀(如:抑郁、負(fù)罪感、 焦慮）。利培酬(Risperidone)化學(xué)名為3-[2-[4-(6-氣-1,2-苯并異嗯挫-3-基)-1-贓晚]乙 基]-6，7，8，9-四氨-2-甲基-4H-化晚并[1，2-a]喀晚-4-酬，分子式為C23肥7FN402，是苯異 惡挫的衍生物，抑A批準(zhǔn)的第二代抗精神病藥物。它是一種多己胺括抗劑，有抗血清素、抗腎 上腺、抗組胺的功能，能與多種受體結(jié)合產(chǎn)生括抗或者反向激動(dòng)作用。大腦邊緣系統(tǒng)中多己 胺D2受體的阻斷能改善精神分裂癥的陽(yáng)性癥狀，包括幻覺(jué)、妄想、語(yǔ)言和行為障礙。在臨床 中，氯氮平/利培酬的藥效和藥物副作用有明顯的個(gè)體差異，原因是其代謝受到遺傳因素及 環(huán)境因素的影響，但遺傳因素是最主要的原因。因此開(kāi)發(fā)更多的與氯氮平/利培酬代謝相關(guān) 的分子標(biāo)記物從而對(duì)患者實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療是非常有必要的。
[0003] COMTKatechol-〇-methyltransferase)基因位于人類(lèi)第22號(hào)染色體qll. 21上，在 不同的細(xì)胞中被翻譯成不同長(zhǎng)度的蛋白。在大腦的神經(jīng)細(xì)胞中，COMT基因表達(dá)為膜結(jié)合的 兒茶酪-0-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白；大腦中的兒茶酪-0-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白主要分布在前額葉皮質(zhì) 區(qū)，它可W保證神經(jīng)遞質(zhì)如多己胺等在一個(gè)穩(wěn)定的水平上。在肝、腎及血液等器官中表達(dá)為 可溶性的兒茶酪-0-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白，它可W催化甲基從S-腺巧甲硫氨酸轉(zhuǎn)移到兒茶酪胺 上，此類(lèi)物質(zhì)包括神經(jīng)遞質(zhì)多己胺、腎上腺素、去甲腎上腺素等。COMT基因在代謝治療高血 壓、哮喘、帕金森疾病的兒茶酪藥物方面起著重要的作用。研究表明，COMT基因第四外顯子 rs4680Vall58Met突變(G 一 A)導(dǎo)致COMT酶第158位點(diǎn)的鄉(xiāng)氨酸(化1)被替換成蛋氨酸(Met)。 Met突變的熱穩(wěn)定性低，而COMT酶的高或低活性取決于其熱穩(wěn)定性。因此，與Val純合子相 比，Met純合子使COMT酶活性下降3~4倍，因此在代謝抗精神疾病藥物時(shí)存在個(gè)體差異。由 于氯氮平與多己胺、5-徑色胺等多種神經(jīng)遞質(zhì)受體均有相互作用，因此尋找氯氮平代謝與 COMT基因多態(tài)性的關(guān)系是現(xiàn)有技術(shù)急需解決的難題。對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的檢索，未發(fā)現(xiàn)有本發(fā)明 的COMT基因第四號(hào)外顯子SNP rs4680為氯氮平分子標(biāo)記物的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種利用rs4680多態(tài)性檢測(cè)氯氮平 和利培酬用藥效果的試劑盒。本發(fā)明為研究我國(guó)人群中COMT基因多態(tài)性與臨床用藥安全的 關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為臨床用藥個(gè)體化提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為基于藥物基因組學(xué)理念的新 藥研發(fā)提供指導(dǎo)依據(jù)。
[0005] 本發(fā)明是通過(guò)W下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，
[0006] 第一方面，本發(fā)明提供一種分離的含單核巧酸多態(tài)性位點(diǎn)的核巧酸，所述核巧酸 的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述單核巧酸多態(tài)性位點(diǎn)位于第854位，rs4680為G一A。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供一種所述的核巧酸在制備檢測(cè)氯氮平和利培酬用藥效果的 試劑盒中的用途。
[000引第S方面，本發(fā)明提供一種分離的核巧酸，所述核巧酸的序列如SEQ ID NO: 1所 示，且第854位為G。
[0009]第四方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)氯氮平和利培酬用藥效果的試劑盒，所述試劑盒 包括:根據(jù)如SEQ ID N0:1所示序列的第854位的上下游設(shè)計(jì)的引物對(duì)，探針。
[0010]優(yōu)選地，所述引物對(duì)為：
[0011] 正向引物5 ' -TCACCAGGGGCGAGGCTCA-3 '
[0012] 反向引物5' -ACAGCCGGCCCTTTTTCCA-3'。
[0013] 優(yōu)選地，所述探針為：
[0014] 正向 5 ' -FM-TCGCTGGCGTGAAGGACA-NFQ-MGB-3 '
[0015] 反向5 ' -VIC-TCGCTGGCATGAAGGACA-NFQ-MGB-3 '。
[0016] 第五方面，本發(fā)明提供一種所述的試劑盒的非診斷目的使用方法，包括如下步驟： [0017] 步驟一，提取樣品DNA;
[0018]步驟二，利用所述引物進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0019] 步驟立，采用I^qman-MGB分型方法，結(jié)合探針，檢測(cè)樣品中是否存在如沈Q ID NO: 1所示的單核巧酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4680。
[0020] 優(yōu)選地，步驟S包括如下步驟:采用AB 口 700巧光定量PCR儀，對(duì)所取樣品的位點(diǎn) rs4680進(jìn)行分型，檢測(cè)第854位是否存在單核巧酸多態(tài)性。
[0021] 優(yōu)選地，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為50-150bp。
[0022] 優(yōu)選地，所述引物的長(zhǎng)度為15-2化P。
[0023] 優(yōu)選地，所述擴(kuò)增的具體條件如下:反應(yīng)體系總體積為化1，其中： 2 XMaster Mix 2. 5W. 40XTaqma'ng:en〇ty'pe'assay I.'2白'Al', DNA模板 5-10:雌，
[0024] IOpM沈Q巧1 斯.沒(méi) 0.:泌1， IOpM SEQ ID No. 4 0. 2曲， 雙蒸水 補(bǔ)足至5ul;
[0025] PCR 反應(yīng)條件：94°C2mins;40X(94°C30s;58°C30s，72°C30s)72°C10mins。
[0026] 第六方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)如權(quán)利要求1所述核巧酸的SNP位點(diǎn)的引物 對(duì)，所述引物對(duì)為：
[0027] 正向引物5 ' -TCACCAGGGGCGAGGCTCA-3 '
[0028] 反向引物5 ' -ACAGCCGGCCCTTTTTCCA-3 '。
[0029] 第屯方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)如權(quán)利要求1所述核巧酸的SNP位點(diǎn)的探針， 所述探針為：
[0030] 正向 5 ' -FAM-TCGCTGGCGTGAAGGACA-NFQ-MGB-3 '
[0031] 反向5 ' -VIC-TCGCTGGCATGAAGGACA-NFQ-MGB-3 '。
[0032] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:本發(fā)明為研究我國(guó)人群中COMT基 因多態(tài)性與臨床用藥安全的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為臨床用藥個(gè)體化提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為 基于藥物基因組學(xué)理念的新藥研發(fā)提供指導(dǎo)依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常照常規(guī)條件， 例如Sambrook等人的分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York = Cold Spring化rbor LaboratoiT Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。
[0034] 本發(fā)明設(shè)及COMT基因第四號(hào)外顯子SNP rs4680的單核巧酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，同 時(shí)設(shè)及相關(guān)的分離核酸W及引物。本發(fā)明通過(guò)關(guān)聯(lián)分析意外發(fā)現(xiàn)了COMT基因（ID: 1312)第 四號(hào)外顯子SNP rs4680能夠作為氯氮平和利培酬的分子標(biāo)記物，該COMT基因第四號(hào)外顯子 的序列如SEQ ID NO: 1所示，其中第854位(對(duì)應(yīng)COMT基因序列的第22008位)存在單核巧酸 多態(tài)性，即SNP rs4680。本發(fā)明針對(duì)該SNP rs4680設(shè)計(jì)了相關(guān)的引物對(duì)和探針。
[0035] 本發(fā)明采用化qman-MGB探針技術(shù)對(duì)COMT基因的第四號(hào)外顯子SNP位點(diǎn)及其頻率分 布情況進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)COMT基因的第四號(hào)外顯子第22008位G^A多態(tài)性，即其所編碼的蛋 白質(zhì)序列中第158位氨基酸V [化1] ^ M [Met]多態(tài)。
[0036] 具體而言，本發(fā)明在COMT基因第四號(hào)外顯子上的SNP rs4680上下游設(shè)計(jì)Taqman- MGB引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度50-150bp;在上下游引物之間設(shè)計(jì)Taqman-MGB探針，探針長(zhǎng)15- 2加 P;然后用AB口700巧光定量PCR儀對(duì)所取樣品COMT基因 SNP位點(diǎn)rs4680進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn) COMT基因第四號(hào)外顯子SNP(即第22008位G一A多態(tài)性）。
【申請(qǐng)人】發(fā)現(xiàn)，該SNP導(dǎo)致第158位氨 基酸由￥ [?al] [Met]。由于運(yùn)是不同性質(zhì)氨基酸的置換，因此會(huì)導(dǎo)致COMT基因所編 碼的蛋白活性發(fā)生改變。
[0037] 本發(fā)明有大量的分析技術(shù)可用于檢測(cè)COMT基因第四號(hào)外顯子中所述位點(diǎn)是否存 在單核巧酸多態(tài)性;運(yùn)些技術(shù)包括(但并不限于）：DNA測(cè)序、雜交測(cè)序;酶促錯(cuò)配切割、異源 雙鏈分析、點(diǎn)雜交、寡核巧酸陣列(DNA忍片）、Mini-sequencing、分子信標(biāo)等，變性高效液相 色譜法(畑PLC)。本發(fā)明的檢測(cè)方法被用于評(píng)估個(gè)體COMT基因第四號(hào)外顯子SNPrs4680多態(tài) 性與氯氮平和利培酬代謝的關(guān)系。用于本發(fā)明的測(cè)試樣品沒(méi)有特別限制，對(duì)于檢測(cè)SNP而 言，可W是從分離的血液、組織等樣品中抽提出的DNA或mRNA;對(duì)于COMT基因第四號(hào)外顯子 活性而言，可W任何含有COMT基因第四號(hào)外顯子的樣品，如分離的血液等。
[003引所述的"分離出的或純化的"是指在基因組DNA水平上，利用引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增每個(gè)多 態(tài)性位點(diǎn)的基因序列和利用純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行提純。
[0039] W下是對(duì)本發(fā)明方案的具體實(shí)施過(guò)程：
[0040] 本實(shí)施例采用的樣品（具體為血液樣品）來(lái)自上海市精神衛(wèi)生中屯、的995個(gè)精神分 裂癥患者，年齡18-60歲；全體參與者均由患者及家屬在正式的知情同意書(shū)上同意簽字。本 實(shí)施例設(shè)及的COMT基因第四號(hào)外顯子的CDNA序列見(jiàn)SEQ ID NO: 1，其所編碼的氨基酸序列 列于SEQ ID NO:2;COMT基因第四號(hào)外顯子的基因組序列可W從GenBank中獲得。
[0041] 引物設(shè)計(jì)信息：
[0042] 采用Primer 5.0軟件，WGenBank數(shù)據(jù)庫(kù)COMT基因（ID:1312)第四號(hào)外顯子W及外 顯子與內(nèi)含子接合部位序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)引物，由Invitrogen公司合成。
[00創(chuàng)引物信息，擴(kuò)增COMT基因第四號(hào)外顯子SNP位點(diǎn)的DNA序列引物信息：
[0044] 正向引物5'-TCACCAGGGGCGAGGCTCA-3'（沈D ID N0:3)
[0045] 反向引物5'-ACAGCCGGCCCTTTTTCCA-3'（沈D ID N0:4)。
[0046] I^qman-MGB 探針
[0047] 正向5'斗施-1'〔6口'66〔61644664〔4(5邸10備：5)-肥9-168-3'
[004引 反向5'-￥101'〔6口'66〔41644664〔4(5邸10備：6)-肥9-168-3'。
[0049] PCR擴(kuò)增條件：（體系各項(xiàng)試劑由ABI公司提供，也可W從公開(kāi)的渠道獲得）
[(K)加]反應(yīng)體系總體積為化1，其中； 2 X Master' Mix' 2.5)4， 40XTaqraan genotype assay 1.25M4， DNA模板 5-巧峭，
[0化1 ] IOpM S明 ID No. 3 0. 2W, IOpM SEQ ID No. 4 0. 2W， 雙蒸氷 補(bǔ)足至日拍；
[0052] PCR 反應(yīng)條件：94°C2mins;40X(94°C30s;58°C30s，72°C30s)72°C10mins。
[0053] 上述PCR反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，置于A(yíng)B口700巧光定量PCR儀中，可W讀出各個(gè)樣品 中COMT基因第四號(hào)外顯子SNPrS4680多態(tài)性；比較發(fā)現(xiàn)COMT基因第四號(hào)外顯子SNP有多態(tài)性 (即第22008位G一A)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該SNP導(dǎo)致第158位氨基酸由V [Val] [Met];關(guān)聯(lián)分 析發(fā)現(xiàn)COMT基因第四號(hào)外顯子SNPrs4680的G基因型與A基因型患者用氯氮平治療前后的P 值為0.024(見(jiàn)表1)，用利培酬治療前后的P值為0.028(見(jiàn)表2)，兩種藥物治療前后都有顯著 的個(gè)體差異。
[0054] 本發(fā)明為研究我國(guó)人群中COMT基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為 臨床用藥個(gè)體化提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為基于藥物基因組學(xué)理念的新藥研發(fā)提供指導(dǎo)依 據(jù)。
[0055] W上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，運(yùn)并不影 響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
[0化6] 表1
[0化7]
[
[
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離的含單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)位于第854位，rs4680為G-A。2. -種如權(quán)利要求1所述的核苷酸在制備檢測(cè)氯氮平和利培酮用藥效果的試劑盒中的 用途。3. -種分離的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID N0:1所示，且第854位 為G〇4. 一種檢測(cè)氯氮平和利培酮用藥效果的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:根據(jù)如 SEQ ID NO: 1所示序列的第854位的上下游設(shè)計(jì)的引物對(duì)，探針。5. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述引物對(duì)為： 正向引物5 ' -TCACCAGGGGCGAGGCTCA-3 ' 反向引物5 ' -ACAGCCGGCCCTTTTTCCA-3 '。6. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述探針為： 正向 5 ' -FAM-TCGCTGGCGTGAAGGACA-NFQ-MGB-3 ' 反向5 '-VIC-TCGCTGGCATGAAGGACA-NFQ-MGB-3 '。7. -種如權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)所述的試劑盒的非診斷目的使用方法，其特征在于，包 括如下步驟： 步驟一，提取樣品DNA; 步驟二，利用所述引物進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物； 步驟三，采用Taqman-MGB分型方法，結(jié)合探針，檢測(cè)樣品中是否存在如SEQ ID N0:1所 示的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4680。8. 如權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征是，步驟三包括如下步驟:采用ABI7700熒光定 量PCR儀，對(duì)所取樣品的位點(diǎn)rs4680進(jìn)行分型，檢測(cè)第854位是否存在單核苷酸多態(tài)性。9. 如權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征是，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為50-150bp。10. 如權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征是，所述引物的長(zhǎng)度為15-25bp。11. 如權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征是，步驟二中，所述擴(kuò)增的具體條件如下：反 應(yīng)體系總體積為5μ1，其中： 2. Mas t er Mix 2、，5W.，： 40. Taqraan genotype assay 1, 25M1? DNA 模板 5-l〇ng， lOpM SEQ; IB No. 3 Q. 2μ1, Ι?ρΜ SEQ ID No. 4 0. 2μ1， 雙蒸水 補(bǔ)足至.5ul PCR反應(yīng)條件：94 °C 2mins; 40 X (94 °C 30s; 58 °C 30s，72 °C 30s) 72 °C lOmins。12. -種用于檢測(cè)如權(quán)利要求1所述核苷酸的SNP位點(diǎn)的引物對(duì)，其特征在于，所述引物 對(duì)為： 正向引物5 ' -TCACCAGGGGCGAGGCTCA-3 ' 反向引物5 ' -ACAGCCGGCCCTTTTTCCA-3 '。13.-種用于檢測(cè)如權(quán)利要求1所述核苷酸的SNP位點(diǎn)的探針，其特征在于，所述探針 為： 正向 5 ' -FAM-TCGCTGGCGTGAAGGACA-NFQ-MGB-3 ' 反向5 '-VIC-TCGCTGGCATGAAGGACA-NFQ-MGB-3 '。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105925679SQ201610297945
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年5月6日
【發(fā)明人】秦勝營(yíng), 周偉, 徐青青, 施燁, 賀林
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)