一種快速檢測人13號、18號、21號、x和y染色體數(shù)目的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種快速檢測人13號、18號、21號、X和Y染色體數(shù)目的試劑盒，包括擴增檢測試劑，該擴增檢測試劑包括：1條熒光標記的通用擴增引物和13對重復序列擴增引物中的至少一對，各有3對重復序列引物分別用于檢測21號、18號和13號染色體的數(shù)目，有4對重復序列引物用于檢測X或Y染色體的數(shù)目。每對重復序列引物均能同時擴增位于不同兩條染色體上的目標序列和參考序列，目標序列和參考序列是位于目標染色體和參考染色體兩條染色體上的兩個相似序列，通過目標序列和參考序列擴增量的比值能有效檢測出目標序列所在染色體的數(shù)量。采用該試劑盒檢測可在單個反應管中同時檢測13號、18號、21號、X和Y染色體數(shù)目，結果準確。
【專利說明】
-種快速檢測人13號、18號、21號、X和Y染色體數(shù)目的試劑盒
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及醫(yī)學檢測技術領域，具體設及一種快速檢測人13號、18號、21號、X和Y 染色體數(shù)目的試劑盒.
【背景技術】
[0002] 染色體病主要是因染色體的數(shù)目或結構異常引起的疾病，臨床上常會引起流產(chǎn)、 死胎、早夭、先天性智力低下、發(fā)育滯后、多發(fā)崎形及性發(fā)育不全等疾病的發(fā)生。目前，此類 疾病仍無理想的治療方法，因此，及早進行產(chǎn)前診斷W選擇性的終止妊娠是預防該類疾病 發(fā)生的關鍵。
[0003] 羊水細胞培養(yǎng)和染色體核型分析是實現(xiàn)染色體病產(chǎn)前診斷的經(jīng)典方法 (Caspersson T,Zech LJohansson C,et 曰I.Identific曰tion of human chromosomes by DNA-binding fluorescent agents[J] .Qiromosoma,1970,30(2) :215-227.),但是，該方法 存在費時(一般要兩周W上）、容易培養(yǎng)失敗W及不能檢測較小的染色體結構崎變等缺點。 巧光原位雜交(FISH)技術應用于產(chǎn)前快速診斷，無需進行細胞培養(yǎng)，24小時內(nèi)就可得出檢 驗結果（Ho SSY,Chua C,Gole L, et al. Same-day prenatal diagnosis of common chromosomal aneuploidies using microfluidics-fIuorescence in situ hyb;ridization[J] .Prenatal Dia即osis,2012,32(4) :321-328.等）；但是，由于該技術操 作繁瑣并且要求具有良好的技術專業(yè)性，使得該技術不能大量的進行臨床標本的應用。因 此，需要建立更加快速而有效的產(chǎn)前診斷方法來彌補W上方法的一些缺陷和不足。
[0004] 隨著分子生物學的發(fā)展，目前已出現(xiàn)了幾種快速分子診斷非整倍體的方法。STR- QF-PCR方法是目前應用最廣的一種方法，該方法能實現(xiàn)非整倍體的檢測，該方法設及的文 章 （Atef SH,Hafez S,Helmy S,et al.QF-PCR as a Rapid Technique for Routine Prenatal Diagnosis of Fetal Aneuploidies[J].Pediatric Research,2011,70:412- 412.)和專利（公開號為 103614361A、101838689A、103555849A、101407843、103074416A的發(fā) 明專利）的研究相對較多，但是該技術的主要缺點是診斷需要依靠多態(tài)性位點，而多態(tài)性位 點可能在某一人群能較好的進行診斷，但因為種族的差異可能會出現(xiàn)在其它人群中無法進 診斷的t青況（Mann K,Dona邑hue C,Fox SP,et al. Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy[J] .Eur J Hum Genet, 2004,12:907-915.);并且， 基于STR的QF-PCR需要多種巧光標記，受STR多態(tài)性分子標記的限制，每條染色體需要檢測 多個位點才能滿足檢測的要求，如果檢測位點少，那么就可能出現(xiàn)不能檢測的情況;而如果 檢測位點多，那么需要的引物也越多，因此，針對不同的染色體往往需要多管PCR才能進行 診斷，從而也影響了其使用的方便性和操作的簡便性。多重連接探針擴增(MLPA)技術最開 始應用于基因拷貝數(shù)的變化，后來應用于非整倍體疾病的診斷（Slater皿，Bruno DL，Ren H,et al.Rapid,high throughput prenatal detection of aneuploidy using a novel quantitative method(MLPA)[J]. Journal of medical genetics ,2003,40(12):907- 912.)，由于該技術需要雜交過夜、連接W及產(chǎn)物的后續(xù)毛細管電泳分析等步驟，不僅對DNA 樣本的質(zhì)量要求高，而且實驗的后續(xù)分析也需要?？诘能浖虼?，也存在操作繁瑣，條件 苛刻，技術要求高等不足(Willis AS,Veyver I,Eng CM.Multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA)and prenatal diagnosis[J].Prenat Diagn,2012;32:315- 320.) O
[0005] 在本發(fā)明人的前期研究中，基本實現(xiàn)了常見染色體非整倍體的檢測，相關的研究 已經(jīng)在SCI雜志上發(fā)表化ong X，Li L，Sun L，F(xiàn)u K，Long J，Weng X，Ye X，Liu X，Wang B, Yan S,Ye H,Fan Z.Rapid diagnosis of aneuploidy using segmental duplication quanti1:ative fluorescent PCR[J].Plos One,2014,9(3) :e88932.)。但是，前期的研究還 存在著一些缺陷或不足，前期的研究中每管只能檢測染色體的一個位點，位點相對較少，易 造成假陰性或假陽性情況的發(fā)生；另一方面，前期的研究也沒有開發(fā)出一條公共的擴增引 物，因此，每對重復序列均需要單獨進行巧光標記，從而造成檢測成本的增加，優(yōu)化的難度 的也增加;再者，由于前期單管檢測的位點少，因此，需要多管同時檢測，從而容易造成實驗 的繁瑣W及操作上的錯誤。綜上所述，前期的研究主要還存在檢測位點少，巧光標記過多， 不能實現(xiàn)單管檢測等缺點。
[0006] 鑒于前期檢測體系的不足，本發(fā)明人重新篩選并驗證了一系列新的重復序列分子 標記，通過一系列新的分子標記序列設計并合成了相應的擴增引物，經(jīng)過長期的優(yōu)化，使1 條通用引物和13對重復序列引物能在同一個PCR反應體系中擴增，并擴增出26個不同片段 大小的巧光標記產(chǎn)物。通過不同片段大小的重復序列的擴增量的巧光比值，即可判斷出所 檢測目標染色體的拷貝數(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種快速檢測人13號、18號、21號、X和Y染色體數(shù) 目的試劑盒。該試劑盒可W在單個反應管中實現(xiàn)人13號、18號、21號、X和Y染色體數(shù)目的快 速檢測，且檢測結果準確、可靠、特異性強。
[0008] 本發(fā)明所述的快速檢測人13號、18號、21號、X和Y染色體數(shù)目的試劑盒，包括擴增 檢測試劑，該擴增檢測試劑包括：
[0009] -、下述(1)-(13)中的至少一個引物對：
[0010] (1)同時擴增13號染色體特異重復序列C虹13-1與6號染色體特異重復序列C虹6的 引物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:2所示；
[0011] (2)同時擴增13號染色體特異重復序列C虹13-2與5號染色體特異重復序列Ch巧-1 的引物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:4所示；
[0012] (3)同時擴增13號染色體特異重復序列C虹13-3與9號染色體特異重復序列chr9-l 的引物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:6所示；
[OOU] (4)同時擴增18號染色體特異重復序列C虹18-1與8號染色體特異重復序列C虹8的 引物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:8所示；
[0014] (5)同時擴增18號染色體特異重復序列C虹18-2與19號染色體特異重復序列C虹19 的引物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:32和SEQ ID NO: 10所示；
[0015] (6)同時擴增18號染色體特異重復序列C虹18-3與5號染色體特異重復序列Ch巧-2 的引物對，其堿基序列分別如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO: 12所示；
[0016] (7)同時擴增21號染色體特異重復序列C虹21-1與2號染色體特異重復序列C虹2的 引物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:34和SEQ ID NO: 14所示；
[0017] (8)同時擴增21號染色體特異重復序列C虹21-2與9號染色體特異重復序列chr9-2 的引物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO: 16所示；
[0018] (9)同時擴增21號染色體特異重復序列C虹21-3與15號染色體特異重復序列C虹15 的引物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:36和SEQ ID NO: 18所示；
[0019] (10)同時擴增巧染色體特異重復序列Chrl與Y染色體特異重復序列Ch巧-1的引 物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:20所示；
[0020] (11)同時擴增X染色體特異重復序列Ch巧-1與Y染色體特異重復序列Ch巧-2的引 物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:22所示；
[0021] (12)同時擴增16號染色體特異重復序列Chrie與X染色體特異重復序列Ch巧-2的 引物對，其堿基序列分別如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:24所示；
[0022] (13)同時擴增3號染色體特異重復序列chr3與X染色體特異重復序列Ch巧-3的引 物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:26所示；
[0023] 二、通用引物：同時擴增上述（1)-(13)中所有重復序列的通用引物，其序列如SEQ ID NO:27所示。
[0024] 本發(fā)明技術方案中，每一對引物均可W同時擴增不同兩條染色體上的不同片段大 小的特異重復序列，每對引物可W單獨使用，也可W任意兩對W上組合使用。當試劑盒包括 上述（1)-(13)中全部的引物對時，可W實現(xiàn)在單個反應管中實現(xiàn)人13號、18號、21號、X和Y 染色體數(shù)目的快速檢測，還可實現(xiàn)對具有兩個檢測位點的5號和9號染色體的非整倍體進行 檢測，并能實現(xiàn)對只有一個檢測位點的1號、2號、3號、6號、8號、15號、16號及19號染色體的 非整倍體進行篩查。
[0025] 本發(fā)明技術方案中，所設及的各重復序列及其公開擴增引物如下述表1所示：
[0026] 表1:
[00271
[C
[0029]上述表1中的"重復序列編號"是指在本試劑盒或反應體系中給予重復序列的編 號，同時，也是其在毛細管電泳中的片段大小排列順序；"重復序列所在染色體"是指重復序 列(實際是兩條堿基相似度非常高的序列)分別定位于哪兩條染色體；"重復序列的位點"是 本試劑盒給予的檢測序列位點的名字或代碼；"公共擴增引物"是指本試劑盒中擴增對應重 復序列所用到的公共擴增引物。W重復序列I(SDl)為例：SDl為13號染色體與6號染色體的 重復序列（分別如圖1曰、圖Ib所示）；兩條染色體上的重復序列分別為SD1-13(NC_ 000013.11:45533516-45533710)和 SD1-6(NC_000006.11:66803785-66803976);試劑盒選 擇了重復序列SD1-13和SD1-6上的chrl3-l和chr6兩段DNA序列作為PCR擴增的目標檢測序 列；引物56〇10^:1和56〇10^:2為重復序列中的證^3-1和油扣序列的公共擴增引物 (如圖Ic所示）。
[0030] 本發(fā)明技術方案中，所述堿基序列SEQ ID NO:28至堿基序列SEQ ID NO:40,分別 是由通用引物與相應重復序列的公共擴增引物中的上游引物相連形成加尾而獲得，具體如 下：
[0031] (1)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID N0:1相連接，得到通用引物加尾的序列 為沈Q ID NO:28的引物序列；
[0032] (2)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID N0:3相連接，得到通用引物加尾的序列 為沈Q ID NO:29的引物序列；
[00削 （3)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID N0:5相連接，得到通用引物加尾的序列 為沈Q ID NO:30的引物序列；
[0034] (4)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID N0:7相連接，得到通用引物加尾的序列 為沈Q ID NO:31的引物序列；
[00對 （5)將通用引物(SEQ ID NO:27)與SEQ ID N0:9相連接，得到通用引物加尾的序列 為沈Q ID NO:32的引物序列；
[0036] (6)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID NO: 11相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:33的引物序列；
[0037] (7)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID NO: 13相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:34的引物序列；
[0038] (8)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID NO: 15相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:35的引物序列；
[0039] (9)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID NO: 17相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:36的引物序列；
[0040] (10)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID NO: 19相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:37的引物序列；
[0041 ] (11)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID N0:21相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:38的引物序列；
[0042] (12)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID N0:23相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:39的引物序列；
[0043] (13)將通用引物(SEQ ID N0:27)與SEQ ID N0:25相連接，得到通用引物加尾的序 列為SEQ ID NO:40的引物序列。
[0044] 本發(fā)明技術方案中，所述的通用引物需要進行巧光標記W得到巧光標記的通用引 物，將所述通用引物與重復序列的公共擴增引物中的一條相連形成加尾，那么，單條巧光標 記的通用引物就能同時擴增13對重復序列，擴增出26個帶巧光標記的PCR擴增產(chǎn)物。具體在 巧光標記時，可W應用市面上各種常見的巧光標記對其進行標記，本申請中，優(yōu)選采用6- FAM巧光標記于5 '端，其中巧光基團FAM指簇基巧光素。
[0045] 本發(fā)明試劑盒用于檢測21-S體、18-S體、13-S體和性染色體數(shù)目異常的原理如 下:本發(fā)明所述的試劑盒通過在染色體間特異重復序列(兩個相似序列）的兩端完全相同的 DNA序列部位設計一對共同的擴增引物(如圖Ic所示），避免了不同引物擴增不同序列產(chǎn)生 的相互干擾或其它條件的干擾，從而保證了兩個序列（即為一個重復序列)擴增效率的一致 性。將重復序列的其中一條公共擴增引物與通用引物相連接一起合成，那么擴增后的重復 序列產(chǎn)物就帶上了巧光標記，再根據(jù)巧光信號的高度計算重復序列間的峰值比例，即通過 定量重復序列間的巧光比值判斷兩條染色體之間拷貝數(shù)的變化。對于常染色體，正常樣本 的重復序列的相對定量比值為2:2,即比值為1;而S體樣本的比值為3:2,即比值為1.5(如 后續(xù)表3所示）；對于性染色體的判斷，利用常染色體與X染色體進行比較，利用常染色體與X 染色體進行比較，X染色體與Y染色體進行比較，W判斷染色體的數(shù)目（如后續(xù)表4所示）。
[0046] 具體地，13號、18號、21號、X和Y染色體拷貝數(shù)根據(jù)重復序列間擴增產(chǎn)物的巧光值 的比例來計算，分別如下：
[0047] (1)13號染色體拷貝數(shù)的計算是根據(jù)油43-1與(：虹6擴增產(chǎn)物的巧光比值、油"3- 2與C虹5-1擴增產(chǎn)物的巧光比值W及C虹13-3與C虹9-1擴增產(chǎn)物的巧光比值；
[004引（2)18號染色體拷貝數(shù)的計算是根據(jù)ChrlS-I與C虹8擴增產(chǎn)物的巧光比值、ChrlS- 2與C虹19擴增產(chǎn)物的巧光比值W及C虹18-3與C虹5-2擴增產(chǎn)物的巧光比值；
[0049] (3)21號染色體拷貝數(shù)的計算是根據(jù)chr21-l與C虹2擴增產(chǎn)物的巧光比值、chr21- 2與C虹9-2擴增產(chǎn)物的巧光比值W及C虹21-3與C虹15擴增產(chǎn)物的巧光比值；
[0050] (4)Y染色體拷貝數(shù)的計算是根據(jù)Chrl與Ch巧-1擴增產(chǎn)物的巧光比值W及Ch^-I 與C虹Y-2擴增產(chǎn)物的巧光比值；
[0051 ] (5)X染色體拷貝數(shù)的計算是根據(jù)Ch巧-1與Ch巧-2擴增產(chǎn)物的巧光比值、Chrie與 C虹X-2擴增產(chǎn)物的巧光比值W及C虹3與C虹X-3擴增產(chǎn)物的巧光比值。
[0052] 進一步的，本發(fā)明提供的試劑盒中還包括有分子量內(nèi)標，采用巧光染料標記分子 量內(nèi)標，包括 75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490、500 等 14 個片段長 度，使用時加入電泳混合液與待測樣本一起電泳，用于檢測等位基因的片段長度。
[0053] 本發(fā)明試劑盒中所設及的引物均是來源于所篩選出的染色體間特異的重復序列， 特異重復序列的開發(fā)是研究成果的關鍵，試劑盒所開發(fā)的重復序列主要有：
[0化4] 13號染色體與6號染色體間的重復序列分別為SDl-13(NC_000013.11:45533516- 45533710) 和 SDl-6(NC_000006.11:66803785-66803976);
[0化日]13號染色體與5號染色體間的重復序列分別為SD2-13(NC_000013.11:103445949- 10：M46146) 和 SD2-5(NC_000005.9:127445772-127445571);
[0化6] 13號染色體與9號染色體間的重復序列分別為SD3-13(NC_000013.11:19056785- l9063757) 和 SD3-9(NC_000009.11:96398139-96391197);
[0化7] 18號染色體與8號染色體間的重復序列分別為SD4-18(NC_000018.10:55302603- 55302903) 和 SD4-8(NC_000008.11:74166980-74166674);
[0化引 18號染色體與19號染色體間的重復序列分別為SD5-18(NC_000018.10:3456352- ：M58411) 和SD5-19(NC_000019.9:466405:34-46640620);
[0化9] 18號染色體與5號染色體間的重復序列分別為SD6-18(NC_000018.10:43887609- 43888143) 和 SD6-5(NC_000005.9:74906109-74906672);
[0060] 21號染色體與2號染色體間的重復序列分別為SDT-SUNLOOOOSl.giAAeTSSSS- AAeTTgeS) 和 SD7-2(NC_000002.11:86371055-86406746);
[0061 ] 21號染色體與9號染色體間的重復序列分別為SD8-21(NC_000021.9:20174376- 20175408)和SD8-9(NC_000009.11:115391095-115392117);
[0062] 21號染色體與15號染色體間的重復序列分別為SDg-SUNLOOOOSl.gaAOSSSSO- iAOAATgg) 和 SD9-15(NC_000015.9:46532227-46541458);
[0063] 1號染色體與Y染色體間的重復序列分別為SDlO-I (202371840-202414823)和 SD10-Y(NC_000024.10：26328480-26365418)；
[0064] X染色體與Y染色體間的重復序列分別為SD11-X(NC_000023.11: 11335972- 11339369)和SD11-Y(NC_000024.9:6701615-6704983);
[00化]16號染色體與X染色體間的重復序列分別為SD12-16(NC_000016.9:69151913- 69154553) 和 SD12-X(NC_000023.11:44633469-44636065);
[0066] 3號染色體與X染色體間的重復序列分別為SD13-3(NC_000003.11:25797003- 25799031) 和 SD13-X(NC_000023.11:78129748-78131776) 。
[0067] 本發(fā)明技術方案中所述的重復序列是指不同的兩條染色體上的兩個大部分堿基 序列相同的兩個DNA序列，在一些文獻中，也稱為相似序列或同源基因或同源序列等。
[0068] 本發(fā)明所述的試劑盒還包括一些現(xiàn)有試劑盒中常規(guī)且必須的組分，如陽性對照模 板、陰性對照模板、緩沖液、酶液、dNTP、Mg2+等。
[0069] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明所述試劑盒可實現(xiàn)單管快速檢測21號、18號、13號、X和Y 染色體數(shù)目，同時，由于采用通過巧光標記的引物進行巧光標記擴增，一條巧光標記的引物 就能實現(xiàn)所有26個擴增產(chǎn)物的巧光標記，從而大大節(jié)約了檢測成本;另一方面，本發(fā)明所述 試劑盒基于重復片段的SD-QF-PCR技術既具有STR-QF-PCR方法的簡便性和批量處理能力， 也具有MLPA技術的基于非多態(tài)性檢測的優(yōu)勢。因此，本發(fā)明所述試劑盒具有快速、簡便、準 確、可批量化、應用廣泛、成本低廉等諸多優(yōu)點。
【附圖說明】
[0070] 圖1為6號染色體和13號染色體間的重復序列的位點及引物信息；其中，（a)為6號 染色體上的特異重復序列chr6在6號染色體上的位置，（b)為13號染色體上的特異重復序列 chrl3-l在13號染色體上的位置；（C)為6號染色體上的特異重復序列chr6和13號染色體上 的特異重復序列chrl3-l，W及根據(jù)序列設計的公共擴增引物；
[0071] 圖2為質(zhì)控品（正常樣本)的重復序列的擴增產(chǎn)物電泳圖譜；
[0072] 圖3為13-=體綜合征羊水標本的擴增產(chǎn)物電泳圖譜；
[0073] 圖4為18-=體綜合征羊水標本的擴增產(chǎn)物電泳圖譜；
[0074] 圖5為21-=體綜合征羊水標本的擴增產(chǎn)物電泳圖譜；
[0075] 圖6為Kl inef e 1 ter綜合征(47，XXY)羊水標本的擴增產(chǎn)物電泳圖譜；
[0076] 圖7為化rner綜合征(45，X)羊水標本的擴增產(chǎn)物電泳圖譜；
[0077] 圖8為超雄綜合征(47，XYY)羊水標本的擴增產(chǎn)物電泳圖譜。
【具體實施方式】
[0078] 下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳述，W更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，但 本發(fā)明并不限于W下實施例。
[0079] 實施例1:采用本發(fā)明所述試劑盒對正常標本、待測13- =體標本、待測18- =體標 本、待測21-=體標本、待測47，XXY標本、待測45，X標本、待測47，XYY標本進行檢測。
[0080] 1、重復序列的比對查詢
[0081 ] 通過NCBI的Blast功能，對不同染色體上的序列進行比對，在其中找出目標染色體 和參考序列染色體上兩條染色體特異的重復序列，并通過設計不同的引物對重復序列的特 異性進行驗證，最后篩查出的重復序列如下：
[0082] (1)13號染色體與6號染色體間的重復序列分別為SD1-13(NC_000013. 11 : 45533516-45533710)和SD1-6(NC_000006.11:66803785-66803976);
[008；3] (2)13號染色體與5號染色體間的重復序列分別為SD2-13(NC_000013. 11 : 10：3445949-10：3446146)和SD2-5(NC_000005.9:127445772-127445571);
[0084] (3)13號染色體與9號染色體間的重復序列分別為SD3-13(NC_000013. 11 : 19056785-19063757)和SD3-9(NC_000009.11:96398139-96391197);
[0085] (4)18號染色體與8號染色體間的重復序列分別為SD4-18(NC_000018.10: 55302603-55302903)和SD4-8(NC_000008.11:74166980-74166674);
[0086] (5)18號染色體與19號染色體間的重復序列分別為SD5-18(NC_000018.10: :3456352-:3458411)和SD5-19(NC_000019.9:466405:34-46640620);
[0087] (6)18號染色體與5號染色體間的重復序列分別為SD6-18(NC_000018.10: 43887609-43888143)和SD6-5(NC_000005.9:74906109-74906672);
[008引 （7)21號染色體與2號染色體間的重復序列分別為SD7-21(NC_000021.9: 44675538-44677965)和SD7-2(NC_000002.11:86371055-86406746);
[0089] (8)21號染色體與9號染色體間的重復序列分別為SD8-21(NC_000021.9: 20174376-20175408)和SD8-9(NC_000009.11:115391095-115392117);
[0090] (9)21號染色體與15號染色體間的重復序列分別為SD9-21(NC_000021.9: 14035550-14044799)和SD9-15(NC_000015.9:46532227-46541458);
[0091] (10)1號染色體與Y染色體間的重復序列分別為SDlO-I (202371840-202414823)和 SD10-Y(NC_000024.10：26328480-26365418)；
[0092] (11 )X染色體與Y染色體間的重復序列分別為SDl 1-X(NC_000023.11:11335972- 11339369)和SD11-Y(NC_000024.9:6701615-6704983);
[009引 （12)16號染色體與X染色體間的重復序列分別為SD12-16(NC_000016.9: 69151913-69154553)和SD12-X(NC_000023.11:44633469-44636065);
[0094] a3)3號染色體與X染色體間的重復序列分別為SD13-3(NC_000003.11:25797003- 25799031)和SD13-X(NC_000023.11:78129748-78131776)。
[00巧]2、試劑盒的組成：
[0096] 2.1通用引物的設計
[0097] 通過NCBI的Blast功能，設計一條長度為20bp，與人類或其它動物DNA序列沒有同 源性的一段DNA片段作為通用引物，通用引物序列具體如下所示。采用6-FAM巧光標記于5' 端，即得通用巧光標記引物。
[009引 TYYW:5'-TGCACGCTGACGACTGGTAC-3'（SEQ ID N0:27)。
[0099] 2.2試劑盒重復序列的擴增引物
[0100] 本發(fā)明所述的快速檢測人13號、18號、21號、X和Y染色體數(shù)目的試劑盒，根據(jù)篩選 選出了 13個重復序列，設計、合成并驗證了一系列的引物，最后，試劑盒成功優(yōu)化出了 13對 擴增引物。每對擴增引物中有一條采用通用引物連接加尾，W便能用巧光標記的通用引物 對13個重復序列進行同時擴增，擴增出帶有巧光標記的擴增產(chǎn)物，W便后續(xù)毛細管電泳分 析檢測。
[0101] (1)檢測13號染色體數(shù)目的引物：
[0102] 本發(fā)明總共篩選出了 3個重復序列用于檢測13號染色體的數(shù)目，分別是SDl (chrl3-l 和 C虹6)、SD2(chrl3-2 和 Ch 巧-1)和 SD3(chrl3-3 和 chr9-l)用于檢測 13 號染色體 的數(shù)目：
[0103] SDUc虹13-1和C虹6)的擴增引物為：
[0104] 5'-CCTGATCCAGTGACTGCTCTC-3'（SEQ ID N0:1);
[0105] 5'-GCAAGATGAAGGGGATGTCCA-3'（沈Q ID N0:2);
[0106] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對SDl上游引物進行加尾連接：
[0107] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACCCTGATCCAGTGACTGCTCTC-3'（沈Q ID NO：28)；
[010引 SD2(c虹13-2和C虹9-1)的擴增引物為：
[0109] 5'-CTTTTTGGGATTTCTACTGCAATCT-3'（SEQ ID N0:3);
[0110] 5'-TGCAAGATAGTGCAGCCTGG-3'（沈Q ID N0:4);
[0111] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對SD2上游引物進行加尾連接：
[0112] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACCTTTTTGGGATTTCTACTGCAATCT-3'（沈Q ID NO：29)；
[0113] SD3(c虹13-3和C虹5-1)的擴增引物為：
[0114] 5'-GGCCAAAATCAGCTCAAGGG-3'（沈Q ID N0:5);
[0115] 5'-GGGCTGCTCAGGGTTCC-3'（沈Q ID N0:6);
[0116] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對SD3上游引物進行加尾連接：
[0117] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACGGCCAAAATCAGCTCAAGGG-3'（沈Q ID NO：30)；
[011引序列C虹6和chrl3-l在染色體的定位分別如圖1 (a)、圖1 (b)中所示，重復序列的具 體堿基序列W及相應的引物設計如圖1 (C )所示。
[0119] (2)檢測18號染色體數(shù)目的引物：
[0120] 本發(fā)明總共篩選出了 3個重復序列用于檢測18號染色體的數(shù)目，分別是SD4 (chrlS-l和C虹8)、SD5khrl8-2和C虹19)和SD6(chrl8-3和C虹5-2)用于檢測18號染色體的 數(shù)目：
[0121] SD4(c虹18-1和C虹8)的擴增引物為：
[0122] 5'-TGCTGGATATATGAAACTCAGACC-3'（沈Q ID N0:7);
[0123] 5'-TCATGCCTGGTCATTTGGGT-3'（SEQ ID N0:8);
[0124] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對SD4上游引物進行加尾連接：
[012引 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACTGCTGGATATATGAAACTCAGACC-3'（沈Q ID NO:31);
[0126] SD5(c虹18-2和C虹19)的擴增引物為：
[0127] 5'-GGGCCAAACCCAACCCT-3'（沈Q ID N0:9);
[012引 5，-ATATCTGTGTTTTGTCCCACACC-3,（沈Q ID N0:10);
[0129] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對SD5上游引物進行加尾連接：
[0130] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACGGGCCAAACCCAACCCT-3'（沈Q ID NO：32)；
[0131] SD6(c虹18-3和C虹5-2)的擴增引物為：
[0132] 5'-TGCTGTAGAGCAAGGTGAGT-3'（SEQ ID N0:11);
[0133] 5'-CAGCCTCACTTAATTCTGAGGT-3'（SEQ ID N0:12);
[0134] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對SD6上游引物進行加尾連接：
[01 巧]5'-TGCACGCTGACGACTGGTACTGCTGTAGAGCAAGGTGAGT-3'（沈Q ID NO:33);
[0136] (3)檢測21號染色體數(shù)目的引物：
[0137] 本發(fā)明總共篩選出了 3個重復序列用于檢測21號染色體的數(shù)目，分別是SD7 (chr21-l 和 C虹2)、SD8(chr21-2 和 chr9-2)和 SD9(chr21-3 和 C虹 15)用于檢測 21 號染色體的 數(shù)目：
[013引 SD7(c虹21-1和C虹2)的擴增引物為：
[0139] 5'-AGCTCCAGATCACCATGCTC-3'（SEQ ID N0:13);
[0140] 5'-AAAACTGGCCCGAAGGGTAG-3'（沈Q ID N0:14);
[0141] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對SD7上游引物進行加尾連接：
[0142] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACAGCTCCAGATCACCATGCTC-3'（SEQ ID NO:34);
[0143] SD8(c虹21-2和C虹9-2)的擴增引物為：
[0144] 5'-AGGCAAACATTATACACACAATGG-3'（沈Q ID N0:15);
[0145] 5'-TCTGCTGCCTGTCAATATTTGT-3'（SEQ ID N0:16);
[0146] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對SD8上游引物進行加尾連接：
[0147] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACAGGCAAACATTATACACACAATGG-3'（沈Q ID NO:35);
[014引 SD9(c虹21-3和C虹15)的擴增引物為：
[0149] 5'-TCCACAGAATCTGAAGGCTCC-3'（沈Q ID N0:17);
[01 加]5'-TACTTTAATTAGCTGACAGCATGTG-3'（沈Q ID N0:18);
[0151] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對SD9上游引物進行加尾連接：
[0152] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACTCCACAGAATCTGAAGGCTCC-3'（沈Q ID NO：36)
[0153] (4)檢測X和Y染色體數(shù)目的引物：
[0154] 本發(fā)明總共篩選出了 4個重復序列用于檢測性染色體的數(shù)目，分別是SD10(chrl和 C 虹 Y-l)、SDll(chri(-巧日ch巧-2)、SD12(c虹16和c虹X-2)和SD13(chr巧日c虹X-3)用于檢測X 和Y染色體的數(shù)目：
[0巧5] SD10(c虹1和C虹Y-1)的擴增引物為：
[0K6] 5'-GGTTGTGCTAAAAACACTCTTTGC-3'（SEQ ID N0:19);
[0157] 5'-TCTGGAATGTGGCTGCTGT-3'（SEQ ID N0:20);
[015引采用通用引物(SEQ ID N0:27)對SDlO上游引物進行加尾連接：
[0159] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACGGTTGTGCTAAAAACACTCTTTGC-3'（SEQ ID NO:37);
[0160] SDlUc虹X-I和C虹Y-2)的擴增引物為：
[0161] 5'-ACTGTCTAGACAATCACCCCA-3'（沈Q ID N0:21);
[0162] 5'-AAAAGTATGATCCAGCTACTACAGA-3'（沈Q ID N0:22);
[0163] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對SDll上游引物進行加尾連接：
[0164] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACACTGTCTAGACAATCACCCCA-3'（沈Q ID NO:38);
[01化]SD12(c虹16和C虹X-2)的擴增引物為：
[0166] 5'-AGTAAGAAACAATGGGCAGAAAGC-3'(SEQ ID NO：23)；
[0167] 5'-TTTCCCTCCAGGACCACCTT-3'（沈Q ID N0:24);
[016引采用通用引物(SEQ ID N0:27)對SD12上游引物進行加尾連接：
[01~]5'-TGCACGCTGACGACTGGTACAGTAAGAAACAATGGGCAGAAAGC-3'（沈Q ID NO：39)；
[0170] SD13(c虹3和C虹X-3)的擴增引物為：
[0171] 5'-GGTTTTGCCTAGGTCCAGTG-3'（沈Q ID N0:25);
[0172] 5'-CCTGGTAATACAGCTCAGTGTCA-3'（沈Q ID N0:26);
[0173] 采用通用引物(SEQ ID N0:27)對SD13上游引物進行加尾連接：
[0174] 5'-TGCACGCTGACGACTGGTACGGTTTTGCCTAGGTCCAGTG-3'（沈Q ID NO：40)；
[0175] 2.3其它組成成分：
[0176] Hotstar-Taq酶，緩沖液，dATP、dTTP、dCTP和dGTPW及Mg2+均購自北京康為世紀生 物科技有限公司。
[0177] 3、PCR反應體系的配制：
[0178] 按下述表2配制PCR反應體系：
[01巧]表2: (ml表示mmol/L，]iM表示皿ol/L)
[0180]
[01811
[0182」PCR反應體系為50uL。
[0183] 4、樣本的來源及處理
[0184] 樣本來源于經(jīng)傳統(tǒng)的染色體核型分析方法確定核型的DNA樣本，DNA樣本采用實驗 室常規(guī)DNA提取方法進行提取，W雙蒸水稀釋至20ngAiL，并于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0185] 5、PCR擴增程序：
[0186] PCR反應所用儀器為普通的PCR儀。PCR反應程序為:95°C預變性10min;95°C15sec， 6〇1：3〇36(3,72°(：1111111，30個循環(huán);在72°(：延伸3〇111111;最后于15°(：保溫備用。
[0187] 6、毛細管電泳分析:將IuL PCR產(chǎn)物與23uL甲酯胺和IuL分子量標準品（Applied Biosystems)混合。該混合物在95°C下變性3分鐘，并放置在冰上，W防止重新退火，直到進 一步分析。使用P〇p4凝膠(ABI)在ABUlSOxI遺傳分析儀(Applied Biosystems)進行電泳分 析。對PCR產(chǎn)物進行分離，采用GeneMapper ID軟件V3.2(Applied Biosystems)進行數(shù)據(jù)分 析。分別統(tǒng)計SD-QF-PCR和染色體核型分析檢測結果，并進行比對分析。
[0188] 7、結果檢測與分析：
[0189] 當樣本為正常標本時，21號、18號和13號染色體序列與參考染色體序列間的重復 序列(相似序列）的擴增量比值為2:2,即1:1的比值關系(檢測結果見圖2);而當目標染色體 為S體時，其比值關系則為3:2,即為1.5:1的關系(檢測結果見圖3、圖4、圖5)。21號、18號和 13號染色體的數(shù)目與檢測比值的關系見表3。
[0190] 表3:
[0191]
[0192] 當樣本為正常男性標本時，X:Y=1:1，常染色體:性染色體(X或Y)為2:1的比值關 系；當樣本為正常女性標本時，Y = O,常染色體:X染色體為2:2的比值關系（檢測結果見圖 2)。
[0193] 當樣本為47，XXY樣本時，X: Y= 2:1;常染色體:Y染色體為2:1的比值關系；常染色 體:X染色體為2:2的比值關系(檢測結果見圖6)。
[0194] 當樣本為45，X樣本時，Y = O;常染色體:X染色體為2:1的比值關系(檢測結果見圖 7)。
[0195] 當樣本為47 ,XYY樣本時，X: Y= 1: 2;常染色體:Y染色體為2: 2的比值關系；常染色 體:X染色體為2:1的比值關系(檢測結果見圖8)。
[0196] X與Y染色體的數(shù)目與檢測的比值關系見表4。
[0197] 表4: 「ni〇Rl
L〇199」實驗結果顯示，試劑盆的檢測體系能非帯有效檢測出21號，18號，13號，X和Y染色 體的數(shù)目，與傳統(tǒng)的染色體核型分析判斷的結果一致，因此，本發(fā)明所述試劑盒能用于臨床 標本的檢測。
[0200] 實施例2:用實施例1所述試劑盒、方法、步驟等對臨床標本進行檢測
[0201] 采用試劑盒對33例正常標本，12例21-S體標本，3例13-S體標本，6例18-S體標 本，3例45，X樣本，2例47 ,XXY樣本，1例47 ,XYY樣本進行檢測，所有樣本均來源自經(jīng)傳統(tǒng)的染 色體核型分析方法確定核型的DNA樣本。
[0202] 通過21號染色體與2號，9號和15號染色體間的重復序列的巧光比值判斷21號染色 體的拷貝數(shù)。
[0203] 通過18號染色體與8號，19號和5號染色體間的重復序列的巧光比值判斷18號染色 體的拷貝數(shù)。
[0204] 通過13號染色體與6號，5號，9號染色體間的重復序列的巧光比值判斷13號染色體 的拷貝數(shù)。
[0205] 通過X染色體與3號，16號和Y染色體間的重復序列的巧光比值判斷X染色體的拷貝 數(shù)。
[0206] 通過Y染色體與1號和X染色體間的重復序列的巧光比值判斷Y染色體的拷貝數(shù)。
[0207] 21號，18號和13號染色體的檢測結果見表5。
[0208] 表5:13號、18號和21號染色體目標序列與參考序列間巧光比值結果及分析
[0209]
[0210]
[0211] X和Y染色體的檢測結果見表6。
[0212] 表6:X和Y染色體目標序列與參考序列間巧光比值結果及分析
[0215]
[0216] 實驗結果表明，試劑盒可實現(xiàn)單管多重定量巧光PC財夾速、準確和穩(wěn)定的檢測出13 號、18號、21號、X和Y染色體的數(shù)目，檢測結果與傳統(tǒng)的染色體核型分析方法一致，準確率為 100%，結果可讀性好，分析、檢測過程簡單、高效。
【主權項】
1. 一種快速檢測人13號、18號、21號、X和Y染色體數(shù)目的試劑盒，包括擴增檢測試劑，其 特征在于:所述的擴增檢測試劑包括： 一、 下述(1)-(13)中的至少一個引物對： (1) 同時擴增13號染色體特異重復序列chrl3-l與6號染色體特異重復序列chr6的引物 對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:2所示； (2) 同時擴增13號染色體特異重復序列chrl3-2與5號染色體特異重復序列chr5-l的引 物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:4所示； (3) 同時擴增13號染色體特異重復序列chrl3-3與9號染色體特異重復序列chr9-l的引 物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:6所示； (4) 同時擴增18號染色體特異重復序列chrl8-l與8號染色體特異重復序列chr8的引物 對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:8所示； (5) 同時擴增18號染色體特異重復序列chrl8-2與19號染色體特異重復序列chrl9的引 物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:32和SEQ ID NO: 10所示； (6) 同時擴增18號染色體特異重復序列chrl8-3與5號染色體特異重復序列chr5-2的引 物對，其堿基序列分別如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO: 12所示； (7) 同時擴增21號染色體特異重復序列chr21-l與2號染色體特異重復序列chr2的引物 對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:34和SEQ ID NO: 14所示； (8) 同時擴增21號染色體特異重復序列chr21-2與9號染色體特異重復序列chr9-2的引 物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO: 16所示； (9) 同時擴增21號染色體特異重復序列chr21-3與15號染色體特異重復序列chrl5的引 物對，它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:36和SEQ ID NO: 18所示； (10) 同時擴增1號染色體特異重復序列chrl與Y染色體特異重復序列chrY-1的引物對， 它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:20所示； (11) 同時擴增X染色體特異重復序列chrX-1與Y染色體特異重復序列chrY-2的引物對， 它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:22所示； (12) 同時擴增16號染色體特異重復序列chrl6與X染色體特異重復序列chrX-2的引物 對，其堿基序列分別如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:24所示； (13) 同時擴增3號染色體特異重復序列chr3與X染色體特異重復序列chrX-3的引物對， 它們的堿基序列分別如SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:26所示； 二、 通用引物：同時擴增上述（1)-(13)中所有重復序列的通用引物，其序列如SEQ ID NO :27所示。2. 根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述堿基序列SEQ ID N0:28至堿基序列 SEQ ID N0:40,分別是由通用引物與相應重復序列的公共擴增引物中的上游引物相連形成 加尾而獲得，各重復序列及其公開擴增引物如下述表1所示： 表1:3. 根據(jù)權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述的通用引物采用熒光標記于5 ' 端。4. 根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，其特征在于:所述的通用引物采用6-FAM熒光標記于 5'端。5. 根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：13號、18號、21號、X和Y染色體拷貝數(shù)根 據(jù)重復序列間擴增產(chǎn)物的熒光值的比例來計算，具體如下： (1) 13號染色體拷貝數(shù)的計算是根據(jù)chrl3-l與chr6擴增產(chǎn)物的熒光比值、chrl3-2與 chr5-l擴增產(chǎn)物的熒光比值以及chrl3-3與chr9-l擴增產(chǎn)物的熒光比值； (2) 18號染色體拷貝數(shù)的計算是根據(jù)(：1^18-1與(31^8擴增產(chǎn)物的熒光比值、(31^18-2與 chrl9擴增產(chǎn)物的熒光比值以及chrl8-3與chr5-2擴增產(chǎn)物的熒光比值； (3) 21號染色體拷貝數(shù)的計算是根據(jù)chr21-l與chr2擴增產(chǎn)物的熒光比值、chr21-2與 chr9-2擴增產(chǎn)物的熒光比值以及chr21-3與chrl5擴增產(chǎn)物的熒光比值； (4) Y染色體拷貝數(shù)的計算是根據(jù)chrl與chrY-Ι擴增產(chǎn)物的熒光比值以及chrX-Ι與 chrY-2擴增產(chǎn)物的熒光比值； (5) X染色體拷貝數(shù)的計算是根據(jù)chrX-Ι與chrY-2擴增產(chǎn)物的熒光比值、chrl6與chrX-2擴增產(chǎn)物的熒光比值以及chr3與chrX-3擴增產(chǎn)物的熒光比值。6. 根據(jù)權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:該試劑盒可實現(xiàn)對13號、18號、21號、 X和Y染色體的檢測，還可實現(xiàn)對具有兩個檢測位點的5號和9號染色體的非整倍體進行檢 測，并能實現(xiàn)對只有一個檢測位點的1號、2號、3號、6號、8號、15號、16號及19號染色體的非 整倍體進行篩查。7. 根據(jù)權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:試劑盒中的重復序列的公共擴增引 物來源于以下重復序列： (1) 13號染色體與6號染色體間的重復序列分別為SD1-13即 以及 SDl-6SPNC_000006.11:66803785-66803976; (2) 13號染色體與5號染色體間的重復序列分別為SD2-13即NC_000013.11:103445949-103446146 以及 SD2-5S 卩NC_000005 · 9:127445772-127445571; (3) 13號染色體與9號染色體間的重復序列分別為503-13即％_000013.11:19056785-19063757 以及 SD3-9BPNC_000009.11:96398139-96391197; (4) 18號染色體與8號染色體間的重復序列分別為SD4-18即NC_000018.10:55302603-55302903 以及 SD4-8S 卩NC_000008.11:74166980-74166674; (5) 18號染色體與19號染色體間的重復序列分別為SD5-18即NC_000018.10:3456352-3458411 以及 SD5-19 即NC_000019 · 9:46640534-46640620; (6) 18號染色體與5號染色體間的重復序列分別為506-18即％_000018.10:43887609-43888143 以及 SD6-5S 卩NC_000005 · 9:74906109-74906672; (7) 21號染色體與2號染色體間的重復序列分別為SD7-21即 以及 SD7-2SPNC_000002.11:86371055-86406746; (8) 21號染色體與9號染色體間的重復序列分別為SD8-21即NCJiOOOSl.gdOnASTe-SOnSAOS 以及 SD8-9BPNC_000009.11:115391095-115392117; (9) 21號染色體與15號染色體間的重復序列分別為SD9-21即 和 SD9-15 即 NC_000015 · 9:46532227-46541458; (10) 1號染色體與Y染色體間的重復序列分別為SD10-1即202371840-202414823以及 SD10-Y即NC_000024·10:26328480-26365418; (11 )X染色體與Y染色體間的重復序列分別為SD11-X即NC_000023.11:11335972-11339369 以及 SD11-Y 即NC_000024.9:6701615-6704983; (12)16號染色體與乂染色體間的重復序列分別為5012-168卩叱_000016.9:69151913_ 69154553 以及 SD12-X 即NC_000023.11:44633469-44636065; (13 )3號染色體與X染色體間的重復序列分別為SD13-3即NC_000003.11:25797003-25799031 以及 SD13-X 即NC_000023 · 11:78129748-78131776。
【文檔編號】C12N15/11GK105925691SQ201610320884
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】孫雷
【申請人】孫雷