新型sars免疫原性組合物的制作方法
【專利摘要】本公開(kāi)的實(shí)施方案涉及用于治療或預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)的免疫原性組合物和方法。所述組合物和方法涉及SARS?CoV纖突蛋白(spike protein)的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)的部分。至少在特定情況下，利用RBD的部分的突變形式，諸如RBD的去糖基化突變體。
【專利說(shuō)明】
新型SARS免疫原性組合物
[0001 ]本申請(qǐng)要求2013年11月26日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/909,145(其通過(guò) 引用整體并入本文)的優(yōu)先權(quán)。
[0002] 關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開(kāi)發(fā)的聲明
[0003] 本發(fā)明是在由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的R01AI098775下由政府資助完成的。政 府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本公開(kāi)的領(lǐng)域至少設(shè)及W下領(lǐng)域:細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)、生物 化學(xué)、疫苗學(xué)和醫(yī)學(xué)。
【背景技術(shù)】
[0005] 2002年在中國(guó)南方的廣東省出現(xiàn)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)最終擴(kuò)散至五大 洲，其中其造成8，000例呼吸道感染和800例死亡(Du等，2009)。SARS冠狀病毒(SARS-CoV)在 2003年被鑒定為SARS的病原體(Peiris等，2003;Zhong等，2003)，隨后與其它具有潛在生物 防衛(wèi)重要性的高度傳染因子一起被美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)的國(guó)家變態(tài)反應(yīng)和傳染病研 究所(NIAID)定義為C類病原體(Jiang等，2012)。
[0006] 由于2002-03年的SARS大流行的爆發(fā)性，因此已進(jìn)行了密集的工作來(lái)開(kāi)發(fā)SARS對(duì) 抗措施，包括疫苗(Du等，2009)?？蓪⒎€(wěn)定且有效的SARS-CoV疫苗膽存起來(lái)作為國(guó)家或全球 公共衛(wèi)生應(yīng)急準(zhǔn)備工作的一部分(Jiang等，2012)。最初的努力集中在開(kāi)發(fā)通常通過(guò)化學(xué)試 劑或福照滅活并且W明抓為佐劑的全病毒疫苗(Du等，2009)。然而，在實(shí)驗(yàn)室小鼠中，已觀 察到，此類疫苗引發(fā)嗜酸性免疫增強(qiáng)病理學(xué)，證據(jù)是化2-關(guān)聯(lián)肺泡損傷(Per Iman等，2005; Balles等，2011)。先前，接種的兒童中的免疫增強(qiáng)病理學(xué)使類似開(kāi)發(fā)滅活的呼吸道合胞病 毒(RSV)疫苗的努力脫離正常進(jìn)程(化Stilow等，2007)。
[0007] 作為替代方法，已開(kāi)發(fā)了由SARS-CoV纖突（S)蛋白（spike protein)組成的原型亞 單位疫苗(Du等，2009)。與HIV甜160和流感血凝素一樣，SARS-CoV S蛋白為I類病毒融合蛋 白，并且，同樣地，其為宿主中和抗體的主要目標(biāo)(Du等，2009; Jiang等，2012)。先前綜述了 開(kāi)發(fā)遺傳工程化SARS-CoV S蛋白疫苗的努力(Du等，2009)。簡(jiǎn)言之，W明抓為佐劑的桿狀病 毒表達(dá)的重組蛋白和含S-蛋白質(zhì)粒的委內(nèi)瑞拉馬腦炎載體均顯示在利用活的SARS-CoV攻 擊的BALB/c小鼠中引發(fā)保護(hù)作用(Du等，2009;Tseng等，2012)，但發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表 達(dá)的一些S蛋白構(gòu)建體引起抗體介導(dǎo)的增效作用Qa皿e等，2012)。
[000引作為對(duì)全長(zhǎng)S蛋白的代替者，其含有殘基318-510的193個(gè)氨基酸(aa)的最小受體 結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBDKRBD193)被鑒定并且經(jīng)發(fā)現(xiàn)在體外結(jié)合其假定的人受體跨膜血管緊張素 轉(zhuǎn)化酶2(ACE2) (Wong等，2004)。另外，已證明分別在哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì) 胞(CHO)-Kl的培養(yǎng)物上清液中表達(dá)的重組蛋白R(shí)BD193及相關(guān)構(gòu)建體RBD219(殘基318-536) 在接種的小鼠中引發(fā)中和抗體和保護(hù)性免疫(Du等，2009; Du等，2012)。此外，RBD還可吸收 和除去利用全SARS-CoV或表達(dá)S蛋白構(gòu)建體的痘苗病毒免疫的小鼠、猴和兔的抗血清中的 大部分中和抗體(化en等，2005)。
[0009]本公開(kāi)通過(guò)提供SARS免疫原性組合物為本領(lǐng)域中的長(zhǎng)期需要提供了解決方案，所 述SARS免疫原性組合物不引發(fā)嗜酸性免疫病理學(xué)或抗體介導(dǎo)的疾病增效作用W及不引起 有害的免疫應(yīng)答，同時(shí)相較于其它SARS疫苗誘導(dǎo)強(qiáng)效的交叉中和抗體應(yīng)答。
[001日]發(fā)明概述
[0011] 本公開(kāi)的實(shí)施方案設(shè)及與嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)的治療或預(yù)防相關(guān)的方法 和/或組合物，所述治療或預(yù)防包括例如SARS的一種或多種癥狀的嚴(yán)重度的完全預(yù)防或減 輕或一種或多種癥狀的發(fā)作的延遲。在具體的方面，存在用于SARS的治療或預(yù)防的與SARS- CoV纖突蛋白相關(guān)的方法和/或組合物。在某些實(shí)施方案中，SARS-CoV纖突蛋白的受體結(jié)合 結(jié)構(gòu)域(RBD)(所述R抓來(lái)自纖突蛋白的亞單位I(Sl))與SARS的治療或預(yù)防相關(guān)。在具體的 實(shí)施方案中，存在用于SARS的治療或預(yù)防的與SARS CoV纖突蛋白的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的 RBD相關(guān)的方法和/或組合物。在具體的情況中，所述R抓修飾包括R抓序列的一個(gè)或多個(gè)糖 基化位點(diǎn)的缺失和/或突變。在某些方面，所述R抓經(jīng)修飾的組合物缺乏一個(gè)或多個(gè)天冬酷 胺-連接的糖基化位點(diǎn)，諸如、例如，通過(guò)除去第一天冬酷胺(R抓219-N1，R抓193-N1)(諸如 通過(guò)取代或物理去除)或通過(guò)在一些情況下，除了缺失第一天冬酷胺W外，取代或除去兩個(gè) 剩余的天冬酷胺之一或兩者(R抓219-N3，RBD193-N3)。在一些情況下，經(jīng)修飾的R抓組合物 可具有氨基酸取代、缺失、倒轉(zhuǎn)等。在具體的實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的R抓組合物具有除在 糖基化位點(diǎn)外的修飾。一些實(shí)施方案包括被修飾來(lái)包括在正常條件下被糖基化的氨基酸的 缺失的RBD。本公開(kāi)的一些方面設(shè)及被修飾來(lái)包括天冬酷胺對(duì)另一種氨基酸（例如，諸如絲 氨酸或天冬氨酸）的取代的RBD。某些情況包括在給定的R抓蛋白分子中的不止一個(gè)氨基酸 上(例如，包括在不止一個(gè)天冬酷胺上）的修飾。在具體實(shí)施方案中，所述組合物是分離的、 重組的、合成的和/或未在自然界中發(fā)現(xiàn)的。
[0012] 在具體實(shí)施方案中，一種或多種免疫原性組合物和/或方法被用于個(gè)體W預(yù)防 SARS或延遲SARS的發(fā)作和/或減輕SARS的至少一種癥狀的嚴(yán)重度。
[0013] 本公開(kāi)的實(shí)施方案包括包含SARS-CoV纖突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的SARS免疫原 性組合物(諸如疫苗）的開(kāi)發(fā)。所述疫苗或免疫原性組合物可包含一種或多種佐劑。在具體 情況下，可W例如將所述疫苗或免疫原性組合物作為重組蛋白在酵母或哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中表 達(dá)。
[0014] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，去糖基化的SARS-CoV纖突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的酵母 表達(dá)的重組蛋白用作SARS免疫原性組合物或疫苗。
[0015] 在具體情況下，存在RBD193和RBD219重組蛋白及其表達(dá)，W及它們的去糖基化形 式。在具體實(shí)施方案中，在酵母己斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的示例性系統(tǒng)中產(chǎn)生所 述重組蛋白。突變體之一，特別是其中RBD219的N-I位置上的N-連接的糖基化天冬酷胺已經(jīng) 缺失的RBD219-N1，可作為重組蛋白表達(dá)W及W高得率純化，并且維持其與哺乳動(dòng)物表達(dá)的 RBD193相似或甚至更好的功能性和抗原性。R抓219-N1(諸如與基于明抓的佐劑組合）引發(fā) 高滴度的針對(duì)SARS-CoV假病毒和活病毒的中和抗體。因此，例如，該分子對(duì)于作為重組SARS 免疫原性組合物(諸如疫苗)的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)的放大工藝是有用的。
[0016] 在本發(fā)明的具體方面，待通過(guò)本公開(kāi)的方法和/或組合物解決的感染是由SARS相 關(guān)病毒或SAES相關(guān)病毒(諸如中東呼吸綜合征(MERS)的遺傳上相關(guān)的病毒）引起的感染。在 一些情況下，所述感染是可W為或可W不為SARS的冠狀病毒。
[0017]在具體實(shí)施方案中，本公開(kāi)的一種或多種免疫原性組合物和/或方法被用于個(gè)體 W治療或預(yù)防MERS或延遲MERS的發(fā)作和/或減輕MERS的至少一種癥狀的嚴(yán)重度。
[001引在一些情況下，可能暴露于SARS或SARS相關(guān)感染，或SARS或SARS相關(guān)生物武器的 個(gè)體可處于任何年齡，包括例如兒童、老年人、軍隊(duì)成員或衛(wèi)生保健工作者。所述個(gè)體可W 在或可能已經(jīng)存在于已知具有患有SARS的個(gè)體的地理區(qū)域或易于使個(gè)體患SARS的地理區(qū) 域。
[0019] 在本公開(kāi)的實(shí)施方案中，存在一種分離的組合物，其包含嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠 狀病毒(SARS-CoV)蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(R抓），其中所述結(jié)構(gòu)域缺乏至少一個(gè)糖基化位 點(diǎn)或在至少一個(gè)在正常條件下被糖基化的位點(diǎn)上去糖基化。在一些情況下，所述結(jié)構(gòu)域被 包含在全長(zhǎng)SARS CoV纖突蛋白內(nèi)，而在其它情況下，所述結(jié)構(gòu)域是SARS-CoV纖突蛋白的片 段。在具體實(shí)施方案中，所述片段包含SARS CoV纖突蛋白的氨基酸殘基275-575、300-550、 310-525或318-510,或所述片段包含SARS CoV纖突蛋白的氨基酸殘基275-575、300-550、 310-540或318-536。在具體實(shí)施方案中，所述片段的長(zhǎng)度為至少190個(gè)氨基酸或所述片段的 長(zhǎng)度為至少210個(gè)氨基酸。
[0020] 在本公開(kāi)的具體方面，所述糖基化位點(diǎn)為N-糖基化位點(diǎn)。所述N-糖基化位點(diǎn)可W 為天冬酷胺位點(diǎn)。所述位點(diǎn)可位于SARS-CoV纖突蛋白的氨基酸318上的天冬酷胺上、SARS- CoV纖突蛋白的氨基酸330上的天冬酷胺上或SARS-CoV纖突蛋白的蛋白的氨基酸347上的天 冬酷胺上。在具體實(shí)施方案中，所述位點(diǎn)在于選自SARS-CoV纖突蛋白的氨基酸318、氨基酸 330或氨基酸347的一個(gè)或多個(gè)天冬酷胺上。在具體情況下，所述片段包含SARS CoV纖突蛋 白的氨基酸殘基318-536,并且所述位點(diǎn)位于SARS-CoV纖突蛋白的氨基酸318上的天冬酷胺 上。在一些情況下，所述位點(diǎn)包含氨基酸缺失或氨基酸取代(諸如針對(duì)絲氨酸或丙氨酸的取 代)。
[0021 ]本公開(kāi)的任何組合物可被包含在藥學(xué)上可接受的媒介物中。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，存在預(yù)防或延遲個(gè)體的SARS的發(fā)作或減輕SARS的至少一種癥 狀的方法，其包括向個(gè)體提供有效量的本公開(kāi)的任何組合物的步驟。在具體方面，向個(gè)體提 供組合物一次或不止一次?？呻S后在第一提供步驟后的數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年內(nèi)向個(gè)體提供組 合物。在一些情況下，個(gè)體表現(xiàn)SARS的一種或多種癥狀，不存在SARS的任何癥狀，或已暴露 于SARS。在某些方面，所述個(gè)體已與患有SARS的個(gè)體接觸。在具體方面，所述個(gè)體是兒童、老 年人、暴露于生物武器或處于其風(fēng)險(xiǎn)中，或?yàn)樾l(wèi)生保健工作者。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，存在預(yù)防或延遲個(gè)體的MERS的發(fā)作或減輕MERS的至少一種癥 狀的方法，其包括向個(gè)體提供有效量的本公開(kāi)的任何組合物的步驟。在具體方面，向個(gè)體提 供組合物一次或不止一次?？稍诘谝惶峁┎襟E后的數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年內(nèi)向個(gè)體提供所述組 合物。在一些情況下，個(gè)體表現(xiàn)MERS的一種或多種癥狀，不存在MERS的任何癥狀，或已暴露 于MERS。在某些方面，所述個(gè)體已與患有MERS的個(gè)體接觸。在具體方面，所述個(gè)體是兒童、老 年人、暴露于生物武器或處于其風(fēng)險(xiǎn)中，或?yàn)樾l(wèi)生保健工作者。
[0024] 附圖簡(jiǎn)述
[0025] 圖1.不同SAR-CoV S-R抓蛋白表達(dá)構(gòu)建體的示意圖。R抓193-WT和RBD219-WT二者 均含有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，包括N-I、N-13和N-40。缺失或突變的N-糖基化位點(diǎn)分別用橫穿氨 基酸的線(例如，N-I)或斜體字(例如，S-13和A-40)來(lái)突出顯示。
[00%] 圖2.不同SAR-CoV R抓蛋白構(gòu)建體在酵母中的表達(dá)譜。在用甲醇誘導(dǎo)后RBD193和 RBD219的野生型(WT)和不同的去糖基化蛋白在己斯德畢赤酵母X-33中的表達(dá)通過(guò)如下方 法來(lái)檢測(cè)：（A)SDS-PAGE和(B)利用抗-RBD mAb 33G4(0.2iig/ml)的免疫印跡。每一個(gè)泳道加 載有IOiil誘導(dǎo)的培養(yǎng)物(未純化的）D(C)酵母表達(dá)的重組RBD193-WT上的N-連接的聚糖可通 過(guò)膚-N-糖巧酶F(PNGase F)消化完全除去。泳道1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志，泳道2:R抓193-表達(dá) 培養(yǎng)物（1化1)，泳道3:PNGase F消化的RBD193。
[0027] 圖3.通過(guò)免疫印跡檢測(cè)RBD193-WT蛋白在酵母中的表達(dá)。W不同抑(泳道1:分子量 標(biāo)志物、泳道2:抑5.2;泳道3:抑6.0;泳道4:pH7.5;和泳道5:抑8.0)和不同量的去垢劑 (泳道6:pH 6.0w/0.01%血pigen和泳道7:抑6.0w/0.05%Empigen)在己斯德畢赤酵母培 養(yǎng)物中誘導(dǎo)RBD193-WT。將培養(yǎng)基中的表達(dá)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF上并用0.化g/ml的抗-RBD mAb 33G4探測(cè)。
[002引圖4.酵母表達(dá)的RBD蛋白的SDS-PAGE和免疫印跡分析。進(jìn)行化g純化的RBD 193-N1 (A)、RBD193-N3(B)、RBD219-WT(C)和 RBD219-NUD)的 SDS-PAGE(SDS，左圖）和免疫印跡(WB， 右圖）分析。利用0.化g/ml的抗-RBD mAb 33G4探測(cè)免疫印跡。
[0029] 圖5.酵母表達(dá)的R抓蛋白的抗原性。為了檢測(cè)抗原性，，使用特異于SARS-CoV R抓 的構(gòu)象表位的HiAb和免疫印跡。將0.化g/ml的mAb 35B5(Conf IV)、33G4(Conf V)、24服 (Conf I)和31化2(Conf II)用于所述測(cè)試。蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志(Marker)示于左邊。
[0030] 圖6.利用R抓特異性mAb通過(guò)化ISA檢測(cè)酵母表達(dá)的R抓蛋白的反應(yīng)性。分別地W 2.2iig/ml (A)或0.25iig/ml (B)測(cè)試特異于SARS-CoV R抓的構(gòu)象表位（24冊(cè)（Conf I)、19B2 (VI)、35B5(Conf IV)、33G4(Conf V)、31H12(Conf II))和線性表位（17朋）的mAb。包括293T 細(xì)胞(RBD193-WT)中表達(dá)的野生型SARS-CoV R抓蛋白化U等，2009)作為陽(yáng)性對(duì)照。(A)和(B) 中的數(shù)據(jù)表達(dá)為一式二個(gè)孔的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。
[0031] 圖7. SARS-CoV RBD蛋白和與細(xì)胞結(jié)合的ACE2 (ACE2/293T細(xì)胞)或SACE2的結(jié)合。使 用山羊抗-ACE2mAb(0.2iig/ml)或抗SARS-CoV的RBD的mAb(33G4,化g/ml)通過(guò)免疫印跡檢測(cè) R抓蛋白（20iig/每一種）與ACE2/293T細(xì)胞(A)或SACE2(20iig) (B-C)的結(jié)合。包括含有中東呼 吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)的R抓的重組蛋白（Du等，2011)作為陰性對(duì)照(對(duì)照）。
[0032] 圖8.通過(guò)ELISA檢測(cè)接種的小鼠血清中的SARS-CoV RBD-特異性IgG抗體。將最后 一次接種后10天收集的血清用于測(cè)試。將明抓佐劑+PBS用作對(duì)照。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為每組5只小鼠 的幾何平均滴度(GMT) "P值表示不同接種組之間的顯著差異。
[0033] 圖9.檢測(cè)接種的小鼠的血清中抗假型化的和活的SARS-Co V感染的中和抗體。將在 最后一次接種后10天收集的血清用于測(cè)試。將明抓佐劑+PBS用作對(duì)照。(A)針對(duì)SARS假病毒 的中和抗體的滴度。數(shù)據(jù)表達(dá)為50%中和抗體滴度(NTSO)W及呈現(xiàn)為每組5只小鼠的平均 值± SD。（ B)針對(duì)活的SARS-CoV感染的中和抗體的滴度。中和抗體滴度表達(dá)為在至少50 %的 孔中完全阻止病毒誘導(dǎo)的C陽(yáng)的血清最高稀釋的倒數(shù)(NT50)，并且呈現(xiàn)為每組5只小鼠的平 均值±SD"P值表示不同接種組之間的顯著差異。
[0034] 發(fā)明詳述
[0035] 按照長(zhǎng)期專利法公約，詞語(yǔ)"一個(gè)/種(a)"和"一個(gè)/種(an)"，當(dāng)用于本說(shuō)明書(shū)時(shí)與 包含、包括權(quán)利要求的該詞語(yǔ)一致，意指"一個(gè)/種或多個(gè)/種"。一些實(shí)施例可由本公開(kāi)的一 個(gè)或多個(gè)要素、方法步驟和/或方法組成或基本上由其組成?？深A(yù)期的是，相對(duì)于本文中的 公開(kāi)的實(shí)施方案中描述的任何其它方法或組合物，可執(zhí)行本文所述的任何方法或組合物并 且仍然獲得類似或相似的結(jié)果，而不背離主題的精神和范圍。
[0036] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"有效量"被定義為預(yù)防SARS感染或SARS相關(guān)感染或延遲或改 善SARS或SARS相關(guān)疾病的至少一種癥狀的發(fā)作所需的化合物的量。例如，在SARS或SARS相 關(guān)疾病的治療或預(yù)防中，改善或抑制至少一種癥狀的發(fā)展或延遲至少一種癥狀的發(fā)作或減 輕其嚴(yán)重度的化合物將是有效的。在實(shí)施方案中，有效量的化合物不是治愈疾病所需的但 會(huì)提供疾病的治療或預(yù)防。
[0037] I.-般實(shí)施方案
[0038] 2002年在中國(guó)南方的廣東省出現(xiàn)嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)并最終在世界范圍 內(nèi)造成8,000例呼吸道感染和800例死亡。其為C類病原體，從而需要用于預(yù)防將來(lái)大范圍流 行和用于生物防衛(wèi)準(zhǔn)備的疫苗的開(kāi)發(fā)。先前的研究已顯示，由SARS-CoV纖突蛋白的受體結(jié) 合結(jié)構(gòu)域(RBD)組成的SARS候選疫苗可在接種的動(dòng)物中誘導(dǎo)強(qiáng)效中和抗體和抗SARS-CoV攻 擊的保護(hù)作用。然而，在先前的研究中重組R抓的表達(dá)是昂貴的并且不可擴(kuò)展，或含有非必 需的標(biāo)簽或融合物。
[0039] 迫切需要用于預(yù)防由SARS冠狀病毒（SARS-CoV)引起的嚴(yán)重急性呼吸綜合征 (SARS)的將來(lái)大范圍流行和用于生物防衛(wèi)準(zhǔn)備的疫苗的開(kāi)發(fā)，并且所述開(kāi)發(fā)包括在本文 中。先前的研究已顯示，具有SARS-CoV纖突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)的候選SARS疫苗抗 原可在接種的動(dòng)物中誘導(dǎo)強(qiáng)效中和抗體應(yīng)答W及抗SARS-CoV攻擊的保護(hù)作用。為了優(yōu)化用 于R抓疫苗候選者的放大生產(chǎn)的表達(dá)條件，認(rèn)為運(yùn)可通過(guò)除去R抓蛋白中的糖基化位點(diǎn)來(lái)實(shí) 現(xiàn)。在本公開(kāi)中，構(gòu)建了作為實(shí)例的兩個(gè)R抓蛋白變體：1)R抓193-WT(193-aa，殘基318-510) 及其去糖基化形式（R抓 193-NUR抓 193-N2、R抓 193-N3);2)RBD219-WT(219-aa,殘基 318- 536)及其去糖基化形式(R抓219-NURBD219-N2和RBD219-N3)。作為實(shí)例，可將構(gòu)建體在酵 母中表達(dá)為重組蛋白。使用明抓作為佐劑，在小鼠中比較運(yùn)些構(gòu)建體的純化的重組蛋白的 抗原性、功能性和免疫原性。RBD219-N1顯示更高的表達(dá)產(chǎn)率，并且維持其抗原性和功能性。 更重要的是，相較于 RBD193-WT、RBD193-N1、RBD193-N3或RBD219-WT，RBD219-N1，在免疫的 小鼠中誘導(dǎo)顯著更強(qiáng)的R抓特異性抗體應(yīng)答和更高水平的中和抗體。因此，R抓219-N1作為 最佳SARS免疫原性組合物(諸如疫苗)是有用的。
[0040] II.SARS
[0041] 被提供W本發(fā)明的組合物和/或方法的個(gè)體可W是已知患有SARS，可W是懷疑患 有SARS，可W是已知已被暴露于SARS，或可W是被懷疑已被暴露于SARS的個(gè)體。
[0042] 如果個(gè)體已感染了 SARS，則第一癥狀通常是至少38°C(100.4°C)或更高的發(fā)熱。早 期癥狀持續(xù)約2-10天并包括泛流感樣癥狀，包括例如畏寒/僵直、肌痛、頭痛、腹瀉、咽喉痛、 流涕、全身不適、肌肉疼痛等。隨后可發(fā)展成干咳、呼吸短促和/或上呼吸道感染。血液中的 淋己細(xì)胞計(jì)數(shù)通常下降，并且血小板計(jì)數(shù)也可W是低的。血清乳酸脫氨酶化DH)和肌酢憐酸 激酶(CPK)水平可升高?？墒箓€(gè)體經(jīng)歷體格檢查、胸部X射線和/或皿CT掃描作為診斷的一部 分。在具體實(shí)施方案中，SARS的診斷是本公開(kāi)的方法中的任選或必需步驟。
[0043] 受到嚴(yán)重影響的患有SARS的人發(fā)展被稱為成人呼吸窘迫綜合征(ARD或A畑S)的呼 吸衰竭的潛在致命形式。在此類情況下，病毒攻擊人體中除肺外的器官，從而造成例如腎衰 竭、屯、包的炎癥（屯、包炎）、因凝血系統(tǒng)的破壞而產(chǎn)生的嚴(yán)重全身性出血（彌散性血管內(nèi)凝 血）、減少的白細(xì)胞計(jì)數(shù)(淋己細(xì)胞減少癥），動(dòng)脈的炎癥(血管炎)或帶有腹瀉的腸炎。
[0044] 在本發(fā)明的一些方法中，使個(gè)體經(jīng)歷鑒定他們是否患有SARS的步驟。SARS-CoV可 使用例如酶聯(lián)免疫測(cè)定化LISA)(對(duì)于其抗體)或逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)現(xiàn)聯(lián)(對(duì)于 其遺傳物質(zhì))來(lái)檢測(cè)。測(cè)試的實(shí)例包括對(duì)呼吸道分泌物或血液進(jìn)行的那些測(cè)試。
[0045] 當(dāng)他們有適當(dāng)?shù)陌Y狀和/或其在實(shí)驗(yàn)中從事SARS-CoV的工作或其最近已暴露于感 染的人或哺乳動(dòng)物時(shí)，可測(cè)試個(gè)體的SARS。
[0046] III.中東呼吸綜合征(MERS)
[0047] 被提供W本發(fā)明的組合物和/或方法的個(gè)體可W是已知患有MERS，可W是懷疑患 有MERS，可W是已知已被暴露于MERS，或可W是被懷疑已被暴露于MERS的個(gè)體。
[004引MERS是在2012年于Saudi Arabia被首先報(bào)導(dǎo)的病毒性呼吸系統(tǒng)疾病。它由被稱為 MERS-CoV(也稱為EMC/2012化CoV-EMC/2012))的冠狀病毒引起。大多數(shù)已被確認(rèn)患有MERS- CoV感染的人發(fā)展出嚴(yán)重的急性呼吸系統(tǒng)疾病。他們有發(fā)熱、咳嗽W及呼吸短促，并且運(yùn)些 人的約半數(shù)死亡。
[0049] 在本發(fā)明的一些方法中，使個(gè)體經(jīng)歷鑒定他們是否患有MERS的步驟。測(cè)試的實(shí)例 包括對(duì)呼吸道分泌物或血液進(jìn)行的那些測(cè)試，諸如針對(duì)MERS抗原的測(cè)試。
[0050] 當(dāng)他們有適當(dāng)?shù)陌Y狀和/或其在實(shí)驗(yàn)中從事MERS的工作或其最近已暴露于感染的 人或哺乳動(dòng)物時(shí)，或當(dāng)個(gè)體在或已在其中個(gè)體患有MERS或易于患有MERS的地理位置中時(shí)， 可測(cè)試個(gè)體的MERS。在具體實(shí)施方案中，MERS的診斷是在本公開(kāi)的方法中的任選或必需的 步驟。
[0051 ] IV.蛋白質(zhì)疫苗和免疫原性組合物
[0052]在本公開(kāi)的實(shí)施方案中，組合物在細(xì)胞、組織或動(dòng)物(例如，人）中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的 免疫應(yīng)答。如本文中所用，"抗原組合物"（其或者可被稱為"免疫原性組合物"）可包含抗原 (例如，蛋白質(zhì)、膚或多膚)或抗原的經(jīng)修飾的形式。在具體實(shí)施方案中，抗原組合物包含或 編碼SARS CoV纖突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其突變形式(包括其去糖基化的形式）的全部 或部分。在某些實(shí)施方案中，免疫原性組合物或疫苗包含至少一種佐劑。在其它實(shí)施方案 中，抗原組合物存在于包含另外的免疫刺激劑或編碼運(yùn)樣的免疫刺激劑的核酸的混合物 中。免疫刺激劑包括但不限于另外的抗原、免疫調(diào)節(jié)劑、抗原呈遞細(xì)胞或佐劑。在其它實(shí)施 方案中，一種或多種另外的試劑W任意組合共價(jià)鍵合至所述抗原或免疫刺激劑。在某些實(shí) 施方案中，抗原組合物被綴合至HLA錯(cuò)定基序氨基酸或包含HLA錯(cuò)定基序氨基酸。
[0化3]沈Q ID N0:1 提供SARS-CoV-R抓-193(318-510aa)的核酸序列，SEQ ID N0:2提供 其氨基酸序列。沈0 10^:3提供5435-(：〇￥-1^0-219(318-536曰曰）的核酸序列，569 10^:4 提供其氨基酸序列。全長(zhǎng)SARS-CoV纖突蛋白的實(shí)例WDQ407820.1存在于GenBank⑥中，其 序列通過(guò)引用整體并入本文。
[0054] 在某些實(shí)施方案中，抗原組合物或免疫功能等效物在動(dòng)物（包括人）中誘導(dǎo)抗- SARS體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中用作有效疫苗。本發(fā)明設(shè)想了用于主動(dòng)和被動(dòng)免疫 實(shí)施方案的一種或多種抗原組合物或疫苗。
[0055] 本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物可在其蛋白質(zhì)組分的組成上變化。應(yīng)當(dāng)理解的 是，本文所述的各種組合物還可包含附加組分。例如，可在脂質(zhì)或脂質(zhì)體中包含一種或多種 疫苗或免疫原性組合物的組分。在另一個(gè)非限制性實(shí)例中，疫苗或免疫原性組合物可包含 一種或多種佐劑?？赏ㄟ^(guò)本文公開(kāi)的任何方法或如本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)應(yīng)當(dāng)知曉 的，制備和/或施用本公開(kāi)的疫苗或免疫原性組合物及其各種組分。
[0056] 應(yīng)當(dāng)理解的是，可通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)眾所周知的方法產(chǎn)生免疫原性組合物，所述方法 包括但不限于通過(guò)固相合成進(jìn)行化學(xué)合成和通過(guò)HPLC從化學(xué)反應(yīng)的其它產(chǎn)物純化出來(lái)，或 通過(guò)在體外翻譯系統(tǒng)中或在活細(xì)胞中（包括，例如，在酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或 桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞中）表達(dá)編碼包含本發(fā)明的抗原的膚或多膚的核酸序列（例如，DNA序 列)進(jìn)行生產(chǎn)?？煞蛛x和充分純化抗原組合物W除去一種或多種不想要的小分子量分子和/ 或?qū)⑵淅鋬龈稍颳更容易配制入所期望的媒介物。還應(yīng)理解的是，在抗原組合物組分諸如 疫苗中產(chǎn)生的氨基酸添加、缺失、突變、化學(xué)修飾等優(yōu)選地將不顯著干擾表位序列的抗體識(shí) 別。
[0057] 對(duì)應(yīng)于SARS-CoV纖突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇的膚或多 膚的長(zhǎng)度通常為10-20個(gè)氨基酸殘基，并且可含有不止一個(gè)膚決定簇或至多約30-50個(gè)殘基 左右?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法合成膚序列，所述方法是諸如、例如，使用自 動(dòng)化膚合成儀(諸如可從Applied Biosystems(Foster City ,CA)獲得的自動(dòng)化膚合成儀） 的膚合成。在具體實(shí)施方案中，全長(zhǎng)膚為SARS-CoV纖突蛋白的193-aa的片段或219-aa的片 段。
[0058] 還可例如通過(guò)重組方法制備更長(zhǎng)的膚或多膚。在某些實(shí)施方案中，可使用編碼本 文所述的抗原組合物和/或組分的核酸，例如，來(lái)在體外或體內(nèi)產(chǎn)生抗原組合物，W用于本 發(fā)明的各種組合物和方法。例如，在某些實(shí)施方案中，將編碼抗原的核酸包含在例如重組細(xì) 胞中的載體中。可表達(dá)所述核酸W產(chǎn)生包含抗原序列的膚或多膚?？蓮募?xì)胞分泌所述膚或 多膚，或其被包含作為細(xì)胞的部分或被包含在細(xì)胞內(nèi)。
[0059] A.免疫功能等效物
[0060] 由于可在本公開(kāi)內(nèi)容的抗原組合物的結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生修飾和變化，并且仍然獲得具有 類似特征或另外的所需特征的分子，因此此類免疫功能等效物也包括在本發(fā)明內(nèi)。
[0061] 例如，某些氨基酸可取代膚、多膚或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的其它氨基酸而無(wú)與結(jié)構(gòu)諸如、 例如，抗體的抗原結(jié)合區(qū)、底物分子或受體上的結(jié)合位點(diǎn)、DNA結(jié)合位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)的相互結(jié)合 能力的可察覺(jué)的丟失。由于膚、多膚或蛋白的相互作用能力和性質(zhì)確定其生物學(xué)(例如，免 疫學(xué))功能活性，因此可在氨基酸序列(或者，當(dāng)然，其內(nèi)在的DNA編碼序列）中產(chǎn)生某些氨基 酸序列取代，但仍然獲得具有類似(括抗)性質(zhì)的膚或多膚。因此本發(fā)明人設(shè)想，可在抗原組 合物(諸如、例如SARS Co-V R抓膚或多膚）的序列中產(chǎn)生各種變化而無(wú)生物學(xué)效用或活性 的可察覺(jué)的丟失。在具體情況下，突變或缺失R抓的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，并且在具體的 實(shí)施方案中還存在一個(gè)或多個(gè)相較于對(duì)應(yīng)的野生型序列被修飾的其它氨基酸。
[0062] 如本文中所用，"氨基分子"是指任意氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模擬物，運(yùn)對(duì) 于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。在某些實(shí)施方案中，抗原組合物的殘基包含為連續(xù) 的無(wú)任何非氨基分子中斷氨基分子殘基的序列的氨基分子。在其它實(shí)施方案中，序列可包 含一個(gè)或多個(gè)非氨基分子部分。在具體實(shí)施方案中，抗原組合物的殘基的序列可被一個(gè)或 多個(gè)非氨基分子部分中斷。
[0063] 因此，抗原組合物，特別是本文公開(kāi)的序列的免疫功能等效物，可包括包含天然合 成的蛋白質(zhì)中的20種常見(jiàn)氨基酸的至少一種，或至少一個(gè)修飾氨基酸或特殊氨基酸的氨基 分子序列。
[0064] 在免疫功能等效物方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解，定義中固有的是運(yùn)樣的概念， 即存在對(duì)可在分子的確定部分內(nèi)產(chǎn)生并且仍然導(dǎo)致具有可接受的水平的等同免疫活性的 變化的數(shù)目的限制。免疫功能等效物的膚或多膚因而本文中被定義為其中某些而非大多數(shù) 或全部氨基酸可被取代的那些膚或多膚。
[0065] 具體地，就長(zhǎng)度更短的膚而言，可W預(yù)期的是，應(yīng)當(dāng)在給定的膚內(nèi)產(chǎn)生更少的氨基 酸取代。更長(zhǎng)的多膚可有中間數(shù)目的變化。全長(zhǎng)蛋白質(zhì)將對(duì)更大數(shù)目的變化具有最大耐受 性。當(dāng)然，可根據(jù)本發(fā)明容易地產(chǎn)生和使用多種具有不同取代的不同的多膚/膚。
[0066] 還應(yīng)充分理解的是，當(dāng)某些殘基(例如，結(jié)合區(qū)或活性部位中的殘基)被證明對(duì)于 蛋白質(zhì)或膚的免疫或結(jié)構(gòu)性質(zhì)特別重要時(shí)，可能通常不交換此類殘基。運(yùn)在本發(fā)明中是重 要的考慮，其中應(yīng)仔細(xì)考慮抗原位點(diǎn)的變化，隨后測(cè)試其W確保免疫功能(例如，抗原性)的 維持，其中免疫功能的維持是所希望的。W運(yùn)種方式，功能等效物在本文中被定義為維持顯 著量的其天然免疫活性的那些膚或多膚。
[0067] 氨基酸取代通常基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如，它們的疏水性、親水 性、電荷、大小等。氨基酸側(cè)鏈取代基的大小、形狀和類型的分析表明，精氨酸、賴氨酸和組 氨酸均為帶正電荷的殘基;丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸均具有相似的大??；而苯丙氨酸、色氨 酸和酪氨酸均具有大致相似的形狀。因此，基于運(yùn)些考慮，精氨酸、賴氨酸和組氨酸；丙氨 酸、甘氨酸和絲氨酸；W及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸在本文中被定義為免疫功能等效物。
[0068] 為了實(shí)現(xiàn)更大量的變化，可考慮氨基酸的親水指數(shù)。每一個(gè)氨基酸基于其疏水性 和電荷特征已被賦予親水指數(shù)，運(yùn)些親水指數(shù)是:異亮氨酸(+4.5);鄉(xiāng)氨酸(+4.2);亮氨酸 (+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半脫氨酸/脫氨酸(+2.5);甲硫氨酸( + 1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨 酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組 氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酷胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酷胺(-3.5);賴氨酸(- 3.9);和精氨酸(-4.5)。
[0069] 本領(lǐng)域通常理解氨基酸親水指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)、多膚或膚的相互作用生物功能中 的重要性化^e&Doolittle，1982,其通過(guò)引用并入本文）。已知，某些氨基酸可W取代具有 相似親水指數(shù)或評(píng)分的其它氨基酸并且仍然保留相似的生物活性。在基于親水指數(shù)產(chǎn)生變 化中，其親水指數(shù)在±2W內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，在±1內(nèi)的那些氨基酸的取代是特 別優(yōu)選的，在±0.5內(nèi)的那些氨基酸的取代是甚至更特別優(yōu)選的。
[0070] 在本領(lǐng)域中還應(yīng)理解的是，可基于親水性有效地產(chǎn)生相似氨基酸的取代，特別是 在由此產(chǎn)生的免疫功能等效多膚或膚旨在用于免疫學(xué)實(shí)施方案中（如在本發(fā)明的某些實(shí)施 方案中）的情況下。美國(guó)專利4,554，101(其通過(guò)引用并入本文)指出蛋白質(zhì)的最大局部平均 親水性(如受其相鄰氨基酸的親水性控制的）與其免疫原性和抗原性（即與蛋白質(zhì)的免疫性 質(zhì))相關(guān)。
[0071] 如美國(guó)專利4,554,101中所詳述的，W下親水性值已被賦予氨基酸殘基:精氨酸(+ 3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);絲氨酸(+0.3);天冬酷胺(+ 0.2);谷氨酷胺(+0.2);甘氨酸(0);蘇氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5±1);丙氨酸(-0.5);組氨 酸(-0.5);半脫氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);鄉(xiāng)氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(- 1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。
[0072] 在基于相似的親水性值產(chǎn)生變化中，其親水性值在±2內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選 的，其親水性值在± 1內(nèi)的那些氨基酸的取代是特別優(yōu)選的，W及其親水性值在±0.5內(nèi)的 那些氨基酸的取代是甚至更特別優(yōu)選的。
[0073] 許多科學(xué)出版物也已致力于從氨基酸序列的分析預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)和鑒定表位 (Chou&Fasman，1974a，b;1978a，b，1979)。如果需要，運(yùn)些出版物的任何出版物可用于補(bǔ)充 美國(guó)專利4,554,101的教導(dǎo)。
[0074] 此外，計(jì)算機(jī)程序目前可用于協(xié)助預(yù)測(cè)一種或多種蛋白質(zhì)、多膚或膚的抗原部分 和表位核屯、區(qū)。實(shí)例包括基于Jameson-Wolf分析(Jameson&Wolf, 1988 ;Wolf等，1988)的那 些程序、程序PepPlot? (Brut lag等，1990; Weinberger等，1985) W及用于蛋白質(zhì)S級(jí)結(jié)構(gòu) 預(yù)測(cè)其它新程序(Fetrow&Bryant，1993)。能夠進(jìn)行此類分析的另一種商購(gòu)可得的軟件程序 是 MacVectordBI,化W 化 ven, CT)。
[0075] 在其它實(shí)施方案中，可通過(guò)經(jīng)驗(yàn)方法鑒定膚或多膚的主要抗原決定簇，其中在重 組宿主中表達(dá)編碼膚或多膚的的核酸的部分，并測(cè)試所得的膚或多膚的引發(fā)免疫應(yīng)答的能 力。例如，可將PCR?用于制備一系列缺乏連續(xù)較長(zhǎng)的氨基酸序列的C-末端的片段的膚或多 膚。測(cè)定運(yùn)些膚或多膚的每一種的免疫活性W鑒定為免疫顯性的那些片段或結(jié)構(gòu)域。然后， 其中在每一重復(fù)(iteration)中僅去除少數(shù)氨基酸的進(jìn)一步的研究允許膚或多膚的抗原決 定簇的位置得到更精確地確定。
[0076] 用于確定膚或多膚的主要抗原決定簇的另一種方法是SPOTS?系統(tǒng)（Genosys Biotechnologies, IncIlie Woodlands,TX)。在該方法中，在纖維素膜上合成重疊膚，在合 成和去保護(hù)后，使用多克隆或單克隆抗體進(jìn)行篩選。最初鑒定的膚或多膚的抗原決定簇可 通過(guò)進(jìn)行具有較大重疊的較小膚的隨后合成W及最終替代在沿免疫反應(yīng)性序列的每一個(gè) 位置上的個(gè)別氨基酸來(lái)進(jìn)一步定位。
[0077] -旦完成一個(gè)或多個(gè)此類分析，就可制備含有至少一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇的基本 特性的抗原組合物，諸如例如膚或多膚。隨后將抗原組合物用于產(chǎn)生針對(duì)所述組合物，和優(yōu) 選所述抗原決定簇的抗血清。
[0078] 雖然論述集中在從氨基酸變化產(chǎn)生的功能上等效的多膚，但應(yīng)理解的是，運(yùn)些變 化可通過(guò)編碼DNA的改變來(lái)實(shí)現(xiàn);還應(yīng)考慮的是遺傳密碼具有簡(jiǎn)并性W及兩個(gè)或更多個(gè)密 碼子可編碼同一氨基酸。還可構(gòu)建編碼運(yùn)些抗原組合物的核酸，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook 等，1987)，例如使用PCR?克隆法將其插入一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體。
[0079] 除了本文所描述的膚基化合物，本發(fā)明還設(shè)想了可配制其它立體化學(xué)上類似的化 合物W模擬膚或多膚的結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵部分，或W與例如抗體發(fā)生特異性相互作用?？蒞 W與 本發(fā)明的膚或多膚相同的方式使用此類化合物(可被稱為膚模擬物），其因而也是免疫功能 等效物。
[0080] 在Johnson等（1993)中描述了模擬蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的某些模擬物。使用膚模 擬物背后的內(nèi)在原理是，蛋白質(zhì)的膚主鏈存在來(lái)主要W諸如有助于分子相互作用(諸如抗 體和抗原的分子相互作用）的方式對(duì)氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行定向。因此，膚模擬物被設(shè)計(jì)來(lái)允許與 天然分子類似的分子相互作用。
[0081 ] B.抗原誘變
[0082] 在具體實(shí)施方案中，為了諸如、例如增強(qiáng)其免疫原性或產(chǎn)生或鑒定免疫功能等效 序列的目的而突變抗原組合物。誘變的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)來(lái)說(shuō)是眾所周知的（Sambrook 等，1987)。
[0083] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"寡核巧酸定點(diǎn)誘變法"是指模板依賴性方法和載體介導(dǎo)的增 殖，其導(dǎo)致特定核酸分子的濃度相對(duì)于其初始濃度的增加，或?qū)е驴蓹z測(cè)信號(hào)的濃度的增 加，諸如擴(kuò)增。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"寡核巧酸定向誘變方法"旨在指牽設(shè)引物分子的模板依 賴性延伸的方法。術(shù)語(yǔ)模板依賴性方法是指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸 鏈的序列由眾所周知的互補(bǔ)堿基配對(duì)法則指定(例如參見(jiàn)Watson, 1987)。通常地，載體介導(dǎo) 的方法牽設(shè)核酸片段至DNA或RNA載體的引入、載體的克隆擴(kuò)增W及擴(kuò)增的核酸片段的回 收。此類方法的實(shí)例由美國(guó)專利4,237,224(其明確地通過(guò)引用整體并入本文)提供。
[0084] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用位點(diǎn)專一誘變。位點(diǎn)專一誘變是用于通過(guò)基礎(chǔ)DNA的特異 性誘變制備抗原組合物的技術(shù)。一般地，位點(diǎn)專一誘變技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。該技 術(shù)還提供了通過(guò)向DNA中引入一個(gè)或多個(gè)核巧酸序列變化，結(jié)合一個(gè)或多個(gè)上述考慮來(lái)制 備和測(cè)試序列變體的便捷能力。位點(diǎn)專一誘變?cè)试S通過(guò)使用特定寡核巧酸序列來(lái)產(chǎn)生突變 體，所述寡核巧酸序列編碼所需突變的DNA序列W及充足數(shù)量的相鄰核巧酸，W提供具有充 足大小和序列復(fù)雜度的引物序列來(lái)在待突變的位置的兩側(cè)上形成穩(wěn)定的雙鏈體。通常情況 下，在待改變的位置的兩側(cè)上具有約10個(gè)至約25個(gè)或更多個(gè)殘基的長(zhǎng)度為約17個(gè)至約75個(gè) 核巧酸的引物是優(yōu)選的，而在待改變的位置的兩側(cè)上具有約5個(gè)至10個(gè)殘基的長(zhǎng)度約17至 約25個(gè)核巧酸的引物是更優(yōu)選的。
[0085] -般地，通過(guò)首先獲得單鏈載體，或使在其序列內(nèi)包含編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列 的雙鏈載體的兩條鏈解鏈來(lái)進(jìn)行位點(diǎn)專一誘變。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)技術(shù)人員應(yīng)理解的 是，該技術(shù)通常使用W單鏈和雙鏈兩種形式存在的隧菌體載體。用于位點(diǎn)專一誘變的典型 載體包括諸如M13隧菌體的載體。運(yùn)些隧菌體載體是商購(gòu)可得的，并且它們的使用對(duì)于本領(lǐng) 域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)一般是眾所周知的。雙鏈質(zhì)粒也被常規(guī)地用于位點(diǎn)專一誘變，運(yùn)消除了將 目的基因從隧菌體轉(zhuǎn)移至質(zhì)粒的步驟。
[0086] 隨后將該誘變引物與單鏈DNA制劑退火，并將其經(jīng)歷DNA聚合酶(諸如、例如，大腸 桿菌化.COli)聚合酶I Klenow片段），W完成攜帶突變的鏈的合成。因此，形成其中一條鏈 編碼原始非突變序列并且第二鏈攜帶所需突變的異源雙鏈體。隨后將該異源雙鏈載體用于 轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞(諸如大腸桿菌細(xì)胞），并選擇包含攜帶突變的序列排列的重組載體的克 隆。
[0087] 或者，可將一對(duì)引物與雙鏈載體的兩條分開(kāi)的鏈退火，W在PCR?反應(yīng)中同時(shí)合成 具有所需突變的兩條對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)鏈。已設(shè)計(jì)了富集包含誘變寡核巧酸的克隆的遺傳選擇方 案化unkel等，1987)?；蛘撸蓪⒕哂猩藤?gòu)可得的熱穩(wěn)定性酶饋如化q聚合酶）的PCR?的用 途用于將誘變寡核巧酸引物滲入擴(kuò)增的DNA片段，隨后可將所述擴(kuò)增的DNA片段克隆入適當(dāng) 的克隆載體或表達(dá)載體(Tomic等，1990;化ender等，1995)。還可將除了熱穩(wěn)定性聚合酶W 外還使用熱穩(wěn)定性連接酶的PCR?用于將憐酸化的誘變寡核巧酸滲入擴(kuò)增的DNA片段，隨后 可將所述擴(kuò)增的DNA片段克隆入適當(dāng)?shù)目寺≥d體或表達(dá)載體(Michael 1994)。
[0088] 將使用位點(diǎn)定誘變進(jìn)行制備選定基因的序列變體作為產(chǎn)生潛在有用的種類的方 法提供，并且運(yùn)不意味著是限制性的，因?yàn)榇嬖谄渲锌色@得基因的序列變體的其它方式。例 如，可用誘變劑(諸如徑胺)處理編碼所需基因的重組載體W獲得序列變體。
[0089] 此外，一個(gè)特別有用的誘變技術(shù)是丙氨酸掃描誘變，其中可用氨基酸丙氨酸單個(gè) 地取代許多殘基，W使得可測(cè)定失去的側(cè)鏈相互作用的影響，同時(shí)使蛋白質(zhì)構(gòu)象的大規(guī)模 擾動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)降至最低（化nnin曲am等，1989)。
[0090] C.脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染
[0091] 在本發(fā)明其它實(shí)施方案中，可將一種或多種疫苗或免疫原性組合物的組分包埋在 脂質(zhì)復(fù)合物(諸如、例如脂質(zhì)體）中。脂質(zhì)體是特征在于憐脂雙層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)的囊泡 結(jié)構(gòu)。多層脂質(zhì)體具有多個(gè)由水性介質(zhì)分開(kāi)的多個(gè)脂質(zhì)層。當(dāng)將憐脂懸浮于過(guò)量的水性溶 液中時(shí)它們自發(fā)地形成。脂質(zhì)組分在形成封閉的結(jié)構(gòu)之前經(jīng)歷自動(dòng)重排，并且包埋水W及 溶解在脂雙層之間的溶質(zhì)(Ghosh和Bachhawat, 1991)。
[0092] D.疫苗或免疫原性組合物組分的純化
[0093] 在任何情況下，可將疫苗組分(例如，抗原膚或多膚)從化學(xué)合成試劑、細(xì)胞或細(xì)胞 組分中分離和/或純化出來(lái)。在產(chǎn)生疫苗或免疫原性組合物組分的方法中，通過(guò)本文所述或 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的任何適當(dāng)技術(shù)(例如，Sambrook等，1987)來(lái)實(shí)現(xiàn)純 化。不存在總是W其最純的狀態(tài)提供本發(fā)明的抗原組合物或其它疫苗組合物的一般要求。 實(shí)際上，可W預(yù)期的是，相對(duì)于其天然狀態(tài)不十分純的疫苗或免疫原性組合物組分(然而其 在所需的化合物上被富集)將在某些實(shí)施方案(諸如、例如蛋白質(zhì)產(chǎn)物的總回收）中或在維 持所表達(dá)的蛋白質(zhì)的活性中具有效用。然而，可W預(yù)期的是，無(wú)活性的產(chǎn)物在某些實(shí)施方案 中（諸如、例如在通過(guò)抗體產(chǎn)生測(cè)定抗原性中）也具有效用。
[0094] 本發(fā)明還提供了純化的，和在某些實(shí)施方案中，基本上純化的疫苗或免疫原性組 合物組分。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"純化的疫苗組分"或"純化的免疫原性組合物組分"旨在指 至少一種各自的疫苗或免疫原性組合物組分(例如，可從細(xì)胞分離的蛋白質(zhì)組合物），其中 相對(duì)于其天然可獲得的狀態(tài)，例如相對(duì)于其在細(xì)胞提取物或化學(xué)合成的試劑中的純度，將 所述組分純化至任何程度。在其中所述疫苗組分是蛋白質(zhì)組合物的某些方面，純化的疫苗 組分也指與其天然存于其中的環(huán)境分離的野生型或突變型蛋白質(zhì)、多膚或膚。
[00%]當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)"基本上純化的"時(shí)，運(yùn)將是指其中特定的化合物(例如，蛋白質(zhì)、多膚 或膚)形成組合物的主要組分，諸如構(gòu)成該組合物中約50%或更多的化合物。在優(yōu)選的實(shí)施 方案中，基本上純化的疫苗組分將構(gòu)成組合物中超過(guò)約60 %、約70 %、約80 %、約90 %、約 95%、約99%或甚至更多的化合物。
[0096] 在某些實(shí)施方案中，可將疫苗或免疫原性組合物組分純化至均質(zhì)化omogeneity)。 如應(yīng)用于本發(fā)明中的，"純化至均質(zhì)"意味著該疫苗組分具有其中所述化合物基本上不含其 它化學(xué)物質(zhì)、生物分子或細(xì)胞的純度水平。例如，純化的膚、多膚或蛋白質(zhì)通常是充分不含 其它蛋白質(zhì)組分，W使得可成功地進(jìn)行降解測(cè)序。根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，用于定量疫苗組分的純 化程度的各種方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。運(yùn)些方法包括，例如，測(cè)定級(jí)分的特 定蛋白質(zhì)活性(例如，抗原性），或通過(guò)凝膠電泳評(píng)估級(jí)分內(nèi)的多膚的數(shù)量。
[0097] 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的適合用于化學(xué)、生物分子或生物學(xué)純化的 各種技術(shù)，可適用于制備本發(fā)明的疫苗組分。運(yùn)些技術(shù)包括，例如，利用硫酸錠、PEG、抗體等 或通過(guò)加熱變性的沉淀，隨后離屯、;分級(jí)分離、色譜法，包括但不限于，分配色譜(例如，紙色 譜、薄層色譜(TLC)、氣-液色譜和凝膠色譜）、氣相色譜、高效液相色譜、親和色譜、超臨界流 色譜、離子交換、凝膠過(guò)濾、反相、徑基憐灰石、凝集素親和；等電聚焦和凝膠電泳（參見(jiàn)例 如，Sambrook 等 1989;和 Fre if elder ,Physical Biochemishy，第二版，第238-246頁(yè)，其通 過(guò)引用并入本文）。
[0098] 鑒于許多DNA和蛋白質(zhì)是已知的（參見(jiàn)例如，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中屯、的 GenBank⑩和GenPept⑩數(shù)據(jù)庫(kù)），或可使用本文所述的方法來(lái)進(jìn)行鑒定和擴(kuò)增，因此現(xiàn) 可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于重組表達(dá)的核酸或蛋白質(zhì)序列的任何純化方法。在某些 方面，可在聚丙締酷胺凝膠上和/或利用氯化飽離屯、梯度，或通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知 的任何其它裝置(參見(jiàn)例如，Sambrook等，1989,其通過(guò)引用并入本文)純化核酸。在其它方 面，可通過(guò)將序列重組表達(dá)為融合蛋白來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的純化。此類純化方法在本領(lǐng)域 中是常規(guī)的。運(yùn)通過(guò)如下方面來(lái)舉例說(shuō)明：產(chǎn)生特定的蛋白質(zhì)-谷脫甘膚S轉(zhuǎn)移酶融合蛋白， 在大腸桿菌中表達(dá)，和在谷脫甘膚-瓊脂糖上使用親和色譜分離至均質(zhì)或在蛋白質(zhì)的N-末 端或C-末端上產(chǎn)生多組氨酸標(biāo)簽，W及隨后使用Ni-親和色譜進(jìn)行純化。在具體的方面，細(xì) 胞或疫苗的其它組分可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)純化。流式細(xì)胞術(shù)牽設(shè)液體樣品中細(xì)胞或其它顆 粒的分離，并且在本領(lǐng)域中眾所周知的（參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)3,826,364、4,284,412、4， 989,977、4,498,766、5,478,722、4,857,451、4,774，189、4,767,206、4,714,682、5，160,974 和4,661，913)。本文所述的運(yùn)些技術(shù)的任何技術(shù)和運(yùn)些技術(shù)的組合W及本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的任何其它技術(shù)，可用于純化和/或測(cè)定各種化學(xué)品、蛋白質(zhì)化合物、核酸、可包含本發(fā)明 的疫苗的細(xì)胞材料和/或細(xì)胞的純度。如在本領(lǐng)域中一般已知的，據(jù)信可改變進(jìn)行各種純化 步驟的順序，或可W省略某些步驟，并且仍然產(chǎn)生用于制備基本上純化的抗原或其它疫苗 組分的合適方法。
[0099] E:另外的疫苗組分
[0100] 可W設(shè)想，可將本發(fā)明的抗原組合物與一種或多種另外的組分組合W形成更有效 的組合物或疫苗。另外的組分的非限制性實(shí)例包括、例如一或多種刺激針對(duì)本發(fā)明的抗原 組合物和/或另外的組分的免疫應(yīng)答的抗原、免疫調(diào)節(jié)劑或佐劑。
[0101] 1.免疫調(diào)節(jié)劑
[0102] 例如，可W設(shè)想，可W將免疫調(diào)節(jié)劑包含在疫苗中W增強(qiáng)細(xì)胞的應(yīng)答或患者的（例 如動(dòng)物的）應(yīng)答?？蒞例如將免疫調(diào)節(jié)劑作為純化的蛋白質(zhì)、編碼免疫調(diào)節(jié)劑的核酸和/或 表達(dá)免疫調(diào)節(jié)劑的細(xì)胞包含在疫苗組合物中。W下各節(jié)列出了感興趣的免疫調(diào)節(jié)劑的非限 制性實(shí)例，并且可W設(shè)想免疫調(diào)節(jié)劑的各種組合可用于某些實(shí)施方案(例如，細(xì)胞因子和趨 化因子）。
[0103] 白細(xì)胞介素、細(xì)胞因子、編碼白細(xì)胞介素或細(xì)胞因子的核酸和/或表達(dá)此類化合物 的細(xì)胞被設(shè)想為可能的疫苗組分。白細(xì)胞介素和細(xì)胞因子，包括但不限于白介素-1(化-1)、 比-2、化-3、比-4、化-5、比-6、化-7、化-8、比-9、化-10、化-11、化-12、化-13、化-14、化-15、 IL-18、e-干擾素、a-干擾素、丫-干擾素、血管抑素、血小板應(yīng)答蛋白、內(nèi)皮抑制蛋白、61- CSF、G-CSF、M-CSF、METH-I、METH-2、腫瘤壞死因子、TG 邱、LT 及其組合。
[0104] 趨化因子、編碼趨化因子的核酸和/或表達(dá)此類趨化因子的細(xì)胞可用作疫苗組分。 趨化因子通常充當(dāng)化學(xué)引誘物來(lái)招募免疫效應(yīng)細(xì)胞至趨化因子表達(dá)的部位?？赡苡欣氖?表達(dá)與例如細(xì)胞因子編碼序列組合的特定趨化因子編碼序列，W增強(qiáng)其它免疫系統(tǒng)組分至 治療部位的招募。此類趨化因子包括，例如34腫65、1〔4。、11?1-〇、11?1-0、1?-1〇及其組合。 本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的是，還已知某些細(xì)胞因子具有趨化作用，并且也可在術(shù)語(yǔ)趨化 因子下進(jìn)行分類。
[0105] 在某些實(shí)施方案中，可將抗原組合物化學(xué)偶聯(lián)于載體或與免疫原性載體膚或多膚 (例如，抗原-載體融合膚或多膚)重組表達(dá)，W增強(qiáng)免疫反應(yīng)。示例性和優(yōu)選的免疫原性載 體氨基酸序列包括乙型肝炎表面抗原、鑰匙孔血藍(lán)蛋白化LH)和牛血清白蛋白（BSA)。其它 白蛋白諸如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可被用作免疫原性載體蛋白。用 于將多膚或膚綴合于免疫原性載體蛋白的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，包括，例如戊二 醒、間-馬來(lái)酷亞胺基苯甲酯-N-徑基班巧酷亞胺醋、碳二亞胺和雙-重氮化聯(lián)苯胺。
[0106] 可W期望共施用生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(BRM)，其經(jīng)顯示上調(diào)T細(xì)胞免疫或下調(diào)抑制性細(xì) 胞的活性。此類BRM包括、但不限于甲臘咪脈(CIM;1200mg/d)(Smith/Kline，PA);低劑量的 環(huán)憐酷胺(CYP; 300mg/m2) (Johnson/Mead，NJ)，或編碼牽設(shè)一個(gè)或多個(gè)免疫輔助功能的蛋 白質(zhì)諸如B-7的基因。
[0107] 2.佐劑
[0108] 免疫操作方案已經(jīng)使用佐劑來(lái)刺激應(yīng)答多年，并且此類佐劑本身是本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員所眾所周知的。一些佐劑影響其中呈遞抗原的方式。例如，當(dāng)通過(guò)明抓沉淀蛋白質(zhì)抗 原時(shí)，免疫應(yīng)答得到增加?？乖娜榛惭娱L(zhǎng)抗原呈遞的持續(xù)時(shí)間。
[0109] 在一個(gè)方面，佐劑作用通過(guò)使用試劑(諸如明抓KW約0.05%至約0.1%的憐酸鹽 緩沖鹽水中的溶液使用）來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蛘?，將抗原制成用作約0.25%溶液的糖的合成聚合物 (C'arbopol?)的混合物。還可通過(guò)分別用在約70°C至約10 rc的范圍內(nèi)變化的溫度熱處理 30秒至2分鐘的時(shí)間在疫苗中聚集抗原來(lái)發(fā)揮佐劑作用。還可使用通過(guò)用胃蛋白酶處理 (Fab)的針對(duì)白蛋白的抗體再活化進(jìn)行的聚集、與細(xì)菌細(xì)胞（諸如微小隱抱子蟲(chóng) (C.parvum))、革蘭陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素或脂多糖組分的混合、于生理學(xué)上可接受的油媒介物 (諸如二縮甘露醇單油酸醋（Aracel A))中的乳化，或利用用作封閉替代物（block substitute)的20%全氣化碳(FhlOSOl-DA愈)的溶液的乳化。
[0110] -些佐劑，例如，獲自細(xì)菌的某些有機(jī)分子，作用于宿主而非抗原。一個(gè)實(shí)例為胞 壁酷二膚(N-乙酷胞壁酷-k丙氨酷-D-異谷氨酷胺[MD門(mén)）、細(xì)菌膚聚糖。對(duì)于大多數(shù)佐劑而 言，MDP的作用還不完全清楚。MDP刺激巨隧細(xì)胞，但似乎也直接刺激B細(xì)胞。因此，佐劑的作 用不是抗原特異性的。然而，如果將它們與純化的抗原一起施用，它們可被用于選擇性地促 進(jìn)針對(duì)抗原的應(yīng)答。
[0111] 佐劑已被實(shí)驗(yàn)性用于促進(jìn)針對(duì)未知抗原的免疫的廣義增強(qiáng)（例如，美國(guó)專利4， 877,611)。在某些實(shí)施方案中，血藍(lán)蛋白和血赤薛素化emoeirthrin)也可用于本發(fā)明中。鑰 匙孔血藍(lán)蛋白化LH)的使用在某些實(shí)施方案中是優(yōu)選的，盡管可使用其它軟體動(dòng)物和節(jié)肢 動(dòng)物的血藍(lán)蛋白和血赤薛素。
[0112] 也可使用各種多糖佐劑。例如，已描述了對(duì)小鼠的抗體應(yīng)答使用各種肺炎球菌多 糖佐劑(Yin等，1989)。應(yīng)當(dāng)如所指示的(Yin等，1989)，使用產(chǎn)生最佳應(yīng)答或W其它方式不 產(chǎn)生抑制的劑量。多糖的多胺種類是特別優(yōu)選的，諸如殼多糖和殼聚糖，包括脫乙酷殼多 糖。
[0113] 另一組佐劑是胞壁酷二膚(MDP，N-乙酷胞壁酷-k丙氨酷-D-異谷氨酷胺)組的細(xì) 菌膚聚糖。還可考慮胞壁酷二膚的衍生物，諸如氨基酸衍生物蘇氨酷-MDP和脂肪酸衍生物 MTPPEo
[0114] 美國(guó)專利4,950,645描述了針對(duì)在從憐脂酷膽堿和憐脂酷甘油形成的人工脂質(zhì)體 中的使用所描述的胞壁酷二膚的親脂性二糖膚衍生物。它在活化人單核細(xì)胞和破壞腫 瘤細(xì)胞中是有效的，但在一般高劑量中是無(wú)毒的。美國(guó)專利4，950,645和PCT專利申請(qǐng)WO 91/16347的化合物被考慮與本發(fā)明的細(xì)胞載體和其它實(shí)施方案一起使用。
[0115] 考慮用于本發(fā)明中的另一種佐劑是BCG。還可將BCG(卡介苗，分枝桿菌的減毒菌 株)和BCG細(xì)胞壁骨架(CWS)與或不與海藻糖二霉菌酸醋一起在本發(fā)明中用作佐劑。海藻糖 二霉菌酸醋可單獨(dú)使用。已顯示在小鼠中海藻糖二霉菌酸醋施用與增強(qiáng)的對(duì)流感病毒感染 的抗性相關(guān)(Azuma等，1988)?？扇缑绹?guó)專利4,579,945所述，制備海藻糖二霉菌酸醋。
[0116] BCG因其免疫刺激性質(zhì)而為重要的臨床工具。BCG用于刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，激活天 然殺傷細(xì)胞和增加造血干細(xì)胞的增殖。BCG的細(xì)胞壁提取物已被證明具有優(yōu)異的免疫佐劑 活性。用于分枝桿菌的分子遺傳學(xué)工具和方法已提供了將外來(lái)基因引入BCG的工具(Jacobs 等，1987; Snapper等，1988 ;Husson等，1990 ;Ma;rtin等，1990)。
[0117] 活的BCG是全球范圍內(nèi)用于預(yù)防結(jié)核病的有效且安全的疫苗。BCG和其它分枝桿菌 是高度有效的佐劑，并且已廣泛研究了針對(duì)分枝桿菌的免疫應(yīng)答。鑒于近20億人的免疫， BCG在人中具有長(zhǎng)期安全使用記錄化uelmo，1982;Lotte等，1984)。它是可在出生時(shí)給予的 少數(shù)疫苗之一，其僅使用單次劑量就可產(chǎn)生長(zhǎng)期免疫應(yīng)答，并且存在具有BCG接種的經(jīng)驗(yàn)的 全球分布網(wǎng)絡(luò)。示例性BCG疫苗是市售的TI仁E?BCG(0;rganon Inc. ,West 0range,NJ)。 [011引兩親和表面活性劑例如皂巧及衍生物諸如QS21 (Cambridge Biotech)，形成又一 組與本發(fā)明的免疫原一起使用的佐劑。也可使用非離子型嵌段共聚物表面活性劑 (Rabinovich等，1994;Hunter等，1991)。寡核巧酸是另一組有用的佐劑（Yamamoto等， 1988)。如il A和香茹多糖（Ientinen)是可用于本發(fā)明的某些實(shí)施方案的其它佐劑。
[0119] -組優(yōu)選用于本發(fā)明的佐劑是脫毒的內(nèi)毒素，諸如美國(guó)專利4,866,034的精制的 脫毒內(nèi)毒素。運(yùn)些精制的脫毒內(nèi)毒素在哺乳動(dòng)物中有效產(chǎn)生佐劑應(yīng)答。當(dāng)然，可將所述脫毒 內(nèi)毒素與其它佐劑組合來(lái)制備包含多佐劑的細(xì)胞。例如，特別地設(shè)想了脫毒內(nèi)毒素與海藻 糖二霉菌酸醋的組合，如美國(guó)專利4,435,386中所描述的。還設(shè)想了脫毒內(nèi)毒素與海藻糖二 霉菌酸醋和內(nèi)毒素糖脂的組合（美國(guó)專利4，505,899)，運(yùn)正如脫毒內(nèi)毒素與細(xì)胞壁骨架 (CWS)或CWS與海藻糖二霉菌酸醋的組合，如美國(guó)專利4，436，727、4，436，728和4，505，900中 所描述的。還預(yù)期僅CWS與海藻糖二霉菌酸醋的組合(無(wú)脫毒內(nèi)毒素)是有用的，如美國(guó)專利 4,520,019中所描述的。
[0120] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)想了多種佐劑可用于細(xì)胞的膜，從而導(dǎo)致改善的免 疫原性組合物。通常地，唯一的要求是所述佐劑能夠滲入所討論細(xì)胞的細(xì)胞膜，與其物理締 合，或綴合于其。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解可按照本發(fā)明綴合于細(xì)胞疫苗的不同類型的佐劑， 運(yùn)些佐劑包括烷基溶血憐脂(ALP) ;BCG;和生物素飽括生物素化的衍生物)等。特別地設(shè)想 來(lái)使用的某些佐劑是來(lái)自革蘭氏細(xì)胞的憐壁酸。運(yùn)些佐劑包括脂憐壁酸化TA)、核糖醇憐壁 酸(RTA)和甘油憐壁酸(GTA)。也可結(jié)合本發(fā)明使用它們的合成對(duì)應(yīng)物的活性形式(Takada 等，1995曰）。
[0121] 各種佐劑，甚至通常不用于人的那些佐劑，仍然可W用于動(dòng)物，其中，例如，人們希 望產(chǎn)生抗體或隨后獲得活化的T細(xì)胞?？捎勺魟┗蚣?xì)胞造成的毒性或其它有害作用(例如如 可使用未福照的腫瘤細(xì)胞發(fā)生的)與此類情況無(wú)關(guān)。
[0122] -組優(yōu)選用于本發(fā)明的一些實(shí)施方案的佐劑是可由核酸(例如，DNA或RNA)編碼的 那些佐劑。設(shè)想了可在編碼抗原的核酸(例如，表達(dá)載體）中，或在單獨(dú)的載體或其它構(gòu)建體 中編碼此類佐劑?？蒞直接遞送運(yùn)些編碼佐劑的核酸，諸如例如利用脂質(zhì)或脂質(zhì)體。
[0123] 3.賦形劑、鹽和輔助物質(zhì)
[0124] 可將本發(fā)明的抗原組合物與一種或多種另外的組分(例如，賦形劑、鹽等)混合，所 述另外的組分是藥學(xué)上可接受的并且與至少一種活性成分(例如，抗原）相容的。合適的賦 形劑是、例如水、鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇及其組合。
[0125] 可將本發(fā)明的抗原組合物配制為中性或鹽形式的疫苗。藥學(xué)上可接受的鹽，包括 酸加成鹽(與膚的游離氨基形成的)和與無(wú)機(jī)酸諸如、例如鹽酸或憐酸，或有機(jī)酸諸如乙酸、 草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的那些酸加成鹽。與游離簇基形成的鹽也可從無(wú)機(jī)堿諸如、例 如氨氧化鋼、氨氧化鐘、氨氧化錠、氨氧化巧或氨氧化鐵，和有機(jī)堿諸如異丙胺、=甲胺、2- 乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡及其組合衍生而來(lái)。
[0126] 此外，如果需要，抗原組合物可包含少量的一種或多種輔助物質(zhì)(諸如潤(rùn)濕劑或乳 化劑、pH緩沖劑等），其增強(qiáng)了抗原組合物或疫苗的效力。
[0127] F.疫苗和免疫原性組合物制劑
[0128] 在產(chǎn)生、合成和/或純化后，可將抗原或其它疫苗組分制備為用于給個(gè)體施用的疫 苗或免疫原性組合物。疫苗的制備在本領(lǐng)域中是眾所周知的，如由美國(guó)專利號(hào)4,608,251、 4,601，903、4,599,231、4,599,230和4,596,792(均通過(guò)引用并入本文)舉例說(shuō)明的。根據(jù)本 公開(kāi)內(nèi)容，此類方法可用于制備包含含有SARS-CoV的特定R抓作為活性成分的抗原組合物 的疫苗。在具體的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的組合物制備為藥學(xué)上可接受的疫苗。
[0129] 本發(fā)明的藥物疫苗或免疫原性組合物包含有效量的溶解或分散在藥學(xué)上可接受 的載體中的SARS-CoV的一種或多種特定的RBD。短語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的或藥理學(xué)上可接受 的"是指當(dāng)向動(dòng)物諸如、例如人在適當(dāng)?shù)那闆r下施用時(shí)不產(chǎn)生有害的、變應(yīng)性或其它不良反 應(yīng)的分子實(shí)體。根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，包含SARS-CoV的至少一個(gè)R抓的藥物組合物的制備對(duì)于本 領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的，如由Remington'S Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company, 1990(通過(guò)引用并入本文)舉例說(shuō)明的。此外，對(duì)于動(dòng)物(例如，人)施用， 應(yīng)當(dāng)理解的是，制劑應(yīng)當(dāng)滿足如由FDA生物標(biāo)準(zhǔn)辦公室所要求的無(wú)菌、致熱原性、一般安全 性和純度標(biāo)準(zhǔn)。
[0130] 如本文中所用的，"藥學(xué)上可接受的載體"包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、 表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗菌劑、抗真菌劑）、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、 藥物、藥物穩(wěn)定劑、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、染料等物質(zhì)及其組合， 如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知曉的（參見(jiàn)，例如，Remington ' S Pharmaceutical Sciences，第 18版，Mack Printing Company, 1990,第1289-1329頁(yè)，其通過(guò)引用并入本文）。取決于W固 體、液體還是氣溶膠形式施用其W及對(duì)于諸如注射的此類施用途徑其是否必需是無(wú)菌的， SARS-CoV的經(jīng)修飾的R抓可包含不同類型的載體。除非任何常規(guī)載體與活性成分不相容，否 則設(shè)想其在治療或藥物組合物中的使用。
[0131] 在任何情況下，所述組合物可包含各種抗氧化劑來(lái)延緩一種或多種組分的氧化。 另外，可利用防腐劑(諸如各種抗菌劑和抗真菌劑），包括但不限于對(duì)徑基苯甲酸醋（例如， 對(duì)徑基苯甲酸甲醋、對(duì)徑基苯甲酸丙醋）、氯下醇、苯酪、山梨酸、硫柳隸或其組合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì) 微生物作用的預(yù)防。
[0132] 可將SARS-CoV的經(jīng)修飾的R抓配制成游離堿性形式、中性形式或鹽形式的組合物。 藥學(xué)上可接受的鹽，包括酸加成鹽，例如與蛋白質(zhì)組合物的游離氨基形成的那些酸加成鹽， 或與無(wú)機(jī)酸諸如例如鹽酸或憐酸，或與有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的酸加成 鹽。與游離簇基形成的鹽也可從無(wú)機(jī)堿諸如例如，氨氧化鋼、氨氧化鐘、氨氧化錠、氨氧化巧 或氨氧化鐵;或有機(jī)堿如異丙胺、=甲胺、組氨酸或普魯卡因衍生而來(lái)。
[0133] 在其中組合物W液體形式存在的實(shí)施方案中，載體可W是溶劑或分散介質(zhì)，其包 含但不限于，水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等）、脂質(zhì)（例如，甘油= 醋、植物油、脂質(zhì)體)及其組合。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可W例如通過(guò)使用包衣，諸如卵憐脂;通過(guò)維 持所需粒度(通過(guò)在載體諸如、例如在液體多元醇或脂質(zhì)中分散）；通過(guò)使用表面活性劑諸 如、例如徑丙基纖維素;或此類方法的組合來(lái)維持。在許多情況下，優(yōu)選地包含等滲劑諸如、 例如，糖、氯化鋼或其組合。
[0134] 在其它實(shí)施方案中，可在本公開(kāi)中使用滴眼劑、鼻用溶液或噴霧劑、氣霧劑或吸入 劑。此類組合物通常被設(shè)計(jì)來(lái)與祀組織類型相容。在非限制性實(shí)例中，鼻用溶液通常是被設(shè) 計(jì)來(lái)W滴劑或噴霧劑向鼻腔施用的水溶液。制備鼻用溶液，W使得它們?cè)谠S多方面與鼻分 泌物相似，W使正常的纖毛作用得W保持。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，水性鼻用溶液通常是 等滲的或略微被緩沖W維持約5.5至約6.5的抑。另外，如果需要，可在制劑中包含抗微生物 防腐劑(與用于眼用制劑、藥物的那些防腐劑類似)或適當(dāng)?shù)乃幬锓€(wěn)定劑。例如，各種商業(yè)鼻 用制劑是已知的，并且包括藥物諸如抗生素或抗組胺藥。
[0135] 在某些實(shí)施方案中，制備SARS-CoV的R抓W用于通過(guò)運(yùn)樣的途徑如口服攝取進(jìn)行 施用。在運(yùn)些實(shí)施方案中，固體組合物可包含，例如溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊(例 如，硬或軟殼明膠膠囊）、緩釋制劑、口含組合物、錠劑、馳劑、懸浮液、糖漿、薄糖片(wafer) 或其組合。可將口服組合物與飲食的食物直接合并。用于口服施用的優(yōu)選載體包含惰性稀 釋劑、可吸收的可食用載體或其組合。在本發(fā)明的其它方面，可將所述口腔組合物制備為糖 漿或馳劑。糖漿或馳劑，可包含例如至少一種活性劑、甜味劑、防腐劑、調(diào)味劑、染料、防腐劑 或其組合。
[0136] 在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，口服組合物可包含一種或多種粘合劑、賦形劑、崩解劑、 潤(rùn)滑劑、調(diào)味劑及其組合。在某些實(shí)施方案中，組合物可包含W下物質(zhì)的一種或多種:粘合 劑，諸如、例如，黃著膠、阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠或其組合;賦形劑，諸如、例如，憐酸氨巧、 甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸儀、糖精鋼、纖維素、碳酸儀或其組合;崩解劑，諸如、例如，玉米 淀粉、馬鈴馨淀粉、海藻酸或其組合;潤(rùn)滑劑，諸如、例如，硬脂酸儀;甜味劑，諸如、例如，薦 糖、乳糖、糖精或其組合;調(diào)味劑，諸如、例如薄荷、冬青油、樓桃調(diào)味劑、澄子調(diào)味劑等或前 述物質(zhì)的組合。當(dāng)劑量單位形式是膠囊時(shí)，除了上述類型的材料W外，其可含有載體諸如液 體載體。各種其它材料可作為包衣存在或W其它方式改變劑量單位的物理形式。例如，可用 蟲(chóng)膠，糖或兩者對(duì)片劑、丸劑或膠囊進(jìn)行包衣。
[0137] 適合于其它施用模式的另外的制劑包括栓劑。栓劑是通常含有藥物的具有不同重 量和形狀的固體劑型，用于插入直腸、陰道或尿道。在插入后，栓劑軟化、烙化或溶化在腔液 中。一般地，對(duì)于栓劑，傳統(tǒng)載體可包括、例如聚亞烷基二醇、甘油=酸醋或其組合。在某些 實(shí)施方案中，栓劑可從含有例如在約0.5%至約10%、優(yōu)選約I %至約2%的范圍內(nèi)的活性成 分的混合物形成。
[0138] 無(wú)菌注射液通過(guò)將活性化合物W所需量與（視需要)各種上述例舉的其它的成分 一同滲入適當(dāng)?shù)娜軇又M(jìn)行過(guò)濾滅菌來(lái)制備。通常，分散體通過(guò)將各種滅菌的活性成分 滲入含有基本分散介質(zhì)和/或其它成分的無(wú)菌媒介物來(lái)制備。在用于無(wú)菌注射液、混懸液或 乳劑的制備的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥或冷凍干燥技術(shù)，所述技術(shù) 產(chǎn)生活性成分加上來(lái)自其先前無(wú)菌過(guò)濾的液體介質(zhì)的任何另外的所需成分的粉劑。必要 時(shí)，應(yīng)當(dāng)對(duì)所述液體介質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)鼐彌_，并且在注射之前先用足夠的鹽水或葡萄糖使液 體稀釋劑等滲。還設(shè)想了用于直接注射的高度濃縮的組合物的制備，其中設(shè)想將DMSO用作 溶劑來(lái)導(dǎo)致非?？焖俚臐B透，從而將高濃度的活性劑遞送至小區(qū)域。
[0139] 所述組合物在生產(chǎn)和膽存條件下必須是穩(wěn)定的，并且保持抗微生物諸如細(xì)菌和真 菌的污染作用。應(yīng)當(dāng)理解的是，應(yīng)當(dāng)在安全水平將內(nèi)毒素污染保持在最低限度，例如，低于 0.5ng/mg蛋白質(zhì)。
[0140] 在具體實(shí)施方案中，可注射組合物的延長(zhǎng)吸收可通過(guò)在組合物中使用延遲吸收的 試劑(諸如、例如單硬脂酸侶、明膠或其組合)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0141] G.疫苗或免疫原性組合的施用
[0142] 疫苗或免疫原性組合物的施用方式可廣泛變化。用于疫苗或免疫原性組合物的施 用的任何常規(guī)方法是適用的。例如，疫苗可通過(guò)如下途徑常規(guī)地施用：靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈 內(nèi)、腹膜內(nèi)、病灶內(nèi)、煩內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、瘤 內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、囊泡內(nèi)（intravesicularlly)、經(jīng)粘膜、屯、包內(nèi)、口服、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、 局部(topically)、在眼滴劑中、局部(locally)、使用氣霧劑、注射、輸注、連續(xù)輸注、直接局 部灌注浸浴祀細(xì)胞、經(jīng)導(dǎo)管、經(jīng)灌洗、在霜?jiǎng)┥?日111日）中、在脂質(zhì)組合物(例如、脂質(zhì)體）中，或 通過(guò)其它方法或前述已為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知曉的方法的任意組合（參見(jiàn)，例如， Remington's Pharmaceutical Sciences，第18片反，Mack Printing Company, 1990，其通過(guò) 引用并入本文）。
[0143] 考慮到例如因素，諸如患者的體重和年齡、待治療的疾病的類型、病況的嚴(yán)重度、 先前或當(dāng)前的治療干預(yù)、施用方式等，患者的接種或免疫原性組合物遞送安排和劑量可根 據(jù)患者基本情況而變化，運(yùn)可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)容易地確定。
[0144] 可W用與劑量制劑相容的方式和W如將在治療上是有效的和具有免疫原性的運(yùn) 樣的量施用疫苗或免疫原性組合物。例如，肌內(nèi)途徑在具有體內(nèi)短半衰期的毒素的情況下 可W是優(yōu)選的。待施用的量取決于待治療的受試者，包括，例如，個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的 能力和所需保護(hù)的程度。疫苗的劑量將取決于施用途徑，并將根據(jù)宿主的大小而變化。需要 被施用的活性成分的精確量取決于醫(yī)師的判斷。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物可包含、例 如至少約0.1 %的活性化合物。在其它實(shí)施方案中，所述活性化合物可包含約2%與約75% 之間、或約25%至約60%之間的單位重量，例如W及可從其中導(dǎo)出的任何范圍內(nèi)的單位重 量。然而，合適的劑量范圍可每接種具有、例如數(shù)百微克活性成分的量級(jí)。在其它非限制性 的實(shí)例中，劑量還可W每接種包含約1微克Ag/體重、約5微克Ag/體重、約10微克/kg/體 重、約50微克Ag/體重、約100微克Ag/體重、約200微克Ag/體重、約350微克Ag/體重、約 500微克Ag/體重、約1毫克Ag/體重、約5毫克Ag/體重、約10毫克Ag/體重、約50毫克Ag/ 體重、約100毫克Ag/體重、約200毫克Ag/體重、約350毫克Ag/體重、約500毫克Ag/體重 至約lOOOmg/kg/體重或更多，和可從其中導(dǎo)出的任何范圍。在來(lái)自本文所列的數(shù)目的可導(dǎo) 出范圍的非限制性實(shí)例中，可基于上述數(shù)目施用約5mg/kg/體重至約lOOmg/kg/體重、約5微 克Ag/體重至約500毫克/千克/體重等的范圍。用于初始施用和加強(qiáng)施用(例如，接種)的合 適的方案也是可變的，但W初始施用接著隨后的接種或其它施用為代表。
[0145] 在許多情況下，將期望具有疫苗或免疫原性組合物的多次施用，通常不超過(guò)6次接 種，例如，通常不超過(guò)4次接種和在一些情況下一次或多次，通常至少約3次接種。接種的間 隔可W是2至12周的間隔，更常見(jiàn)地3至5周的間隔，但本文中涵蓋較長(zhǎng)的間隔?？善谕鸚l至 5年、通常3年的間隔進(jìn)行的周期性加強(qiáng)來(lái)維持抗體的保護(hù)水平。
[0146] 在免疫的過(guò)程之后，可針對(duì)上清液抗原進(jìn)行抗體測(cè)定。所述測(cè)定可通過(guò)用常規(guī)標(biāo) 記物諸如放射性核素、酶、巧光等標(biāo)記來(lái)進(jìn)行。運(yùn)些技術(shù)是眾所周知的，并且可見(jiàn)于說(shuō)明運(yùn) 些類型的測(cè)定的各種專利(諸如美國(guó)專利號(hào)3,791，932、4，174,384和3,949,064)中?？蛇M(jìn)行 其它免疫測(cè)定，并且在免疫后可進(jìn)行免受用SARS-CoV的R抓的攻擊的保護(hù)的測(cè)定。
[0147] V.本公開(kāi)的試劑盒
[0148] 可將本文所述的任何組合物包含在試劑盒中。在非限制性實(shí)例中，可將經(jīng)修飾的 SARS-CoV纖突蛋白的RBD組合物包含在試劑盒中。在非限制性實(shí)例，可將包含經(jīng)修飾的 SARS-CoV纖突蛋白的R抓組合物的免疫原性組合物包含在試劑盒中。在非限制性實(shí)例，可將 包含經(jīng)修飾的SARS-CoV纖突蛋白的R抓組合物包括去糖基化的疫苗包含在試劑盒中。
[0149] 可W在水性介質(zhì)中或W凍干形式包裝試劑盒的組分。試劑盒的容器裝置通常會(huì)包 括至少一個(gè)可在其中放入組分(并且優(yōu)選適當(dāng)?shù)氐确值模┬∑?、試管、燒瓶、瓶子、注射器?其它容器裝置。當(dāng)在試劑盒中存在不止一種組分時(shí)，所述試劑盒通常還會(huì)含有可在其中單 獨(dú)放置額外組分的第二、第=或其它額外的容器。然而，可將組分的各種組合包含在一個(gè)小 瓶中。本發(fā)明的試劑盒通常還會(huì)包括用于W密閉約束的方式含有組合物和任何其它試劑容 器的裝置W便商業(yè)銷售。此類容器可包括可在其中保留所需小瓶的注塑或吹塑成型的塑料 容器。
[0150] 試劑盒的組分可W作為干粉提供。當(dāng)作為干粉提供試劑盒的試劑和/或組分時(shí)，可 通過(guò)添加合適的溶劑將干粉進(jìn)行重構(gòu)?？稍O(shè)想的是，還可在另一容器裝置中提供溶劑。所述 試劑盒可包含用于含有無(wú)菌、藥學(xué)上可接受的緩沖液和/或其它稀釋劑的容器裝置。
[0151 ]不論容器的數(shù)目和/或類型，本發(fā)明的試劑盒還可包含用于幫助最終組合物在動(dòng) 物體內(nèi)的注射/施用和/或放置的器械，和/或與所述器械一起被包裝。此類器械可W是注射 器、移液管、綴子和/或任何此類醫(yī)療批準(zhǔn)的遞送載體。在一些情況下，存在一個(gè)或更多鑒定 來(lái)自個(gè)體的樣品中存在SARS的裝置。 實(shí)施例
[0152] W下實(shí)施例被包括來(lái)示范本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的 是，W下實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實(shí)踐中充分發(fā)揮作用的技 術(shù)，因此可被認(rèn)為構(gòu)成了用于其實(shí)施的優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)當(dāng)理解的是，可在公開(kāi)的特定實(shí)施方案中產(chǎn)生許多變化，但仍然獲得相似或類似的結(jié)果 而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
[0153] 實(shí)施列I
[0154] 示例性材料和方法
[0K5] 在己斯德畢赤酵母中克隆和表達(dá)RBD
[0156] 基于酵母密碼子的使用偏愛(ài)對(duì)編碼SARS-CoV RBD的193-aa(RBD193,殘基318- 510)和 219-aa(RBD219,殘基 318-536)的 DNA 進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并由GenScript(Piscataway, NJ)合成所述DNA，隨后使用EcoRI/Xbal限制性位點(diǎn)將其亞克隆入畢赤酵母分泌表達(dá)載體 口口1〔2日4(1醇1化〇邑611，6^11(1131日11(1，^)。使用載體側(cè)接引物日-因子和3'4(^-1通過(guò)雙鏈測(cè) 序確認(rèn)重組質(zhì)粒的正確插入序列和閱讀框。隨后通過(guò)電穿孔將所述重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入己 斯德畢赤酵母X-33。在30°C利用0.5%的甲醇誘導(dǎo)重組RBD193和RBD219的表達(dá)，進(jìn)行72小 時(shí)，并且如先前所述，選擇最高表達(dá)克隆W產(chǎn)生20 %甘油中的種子原液。
[0157] 因?yàn)榻湍钢斜磉_(dá)的RBD193/R抓219-野生型(WT)的高糖基化可造成產(chǎn)率和重復(fù)再 現(xiàn)性問(wèn)題，因此除去或突變R抓序列中負(fù)責(zé)N-糖基化的3個(gè)天冬酷胺W產(chǎn)生如下的去糖基化 形式:Nl:第一Asn(N-1)(第一N-糖基化位點(diǎn)）的缺失;N2:除了Nl缺失W外的第二N-糖基化 Asn(N-13)至Ser的突變;和N3:除Nl和N2缺失/突變W外的第SN-糖基化的N-40至Ala的突 變（圖1)。利用在實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的抗-R抓單克隆抗體(mAb)33G4(Goud等，2004)，通過(guò)SDS-PAGE 和免疫印跡確認(rèn)重組RBD193-WT和RBD219-WT的表達(dá)和糖基化水平W及它們的去糖基化形 式。
[0158] 糖巧酶測(cè)定
[0159] 為了確定表達(dá)的重組RBD193-WT是否被糖基化，利用膚-N-糖巧酶F(PNGase F) (New England Biolabs(肥B), Ipswich,MA)消化酵母表達(dá)的RBD193-WT。簡(jiǎn)言之，將IOiil用 0.5%甲醇誘導(dǎo)(進(jìn)行72小時(shí)）的RBD193-WT/pPICZaA/己斯德畢赤酵母培養(yǎng)物與化1變性緩 沖液(肥B)在1.5ml管中混合，并于100°C下變性10分鐘。隨后在管中添加化1的G7緩沖液、 1的10 % NP40 (均隨PNGase F-起）、化1的N-PNGase F和扣1的去離子水。隨后將混合物在37 °C溫育1小時(shí)。通過(guò)SDS-PAGE，隨后使用抗-RBD mAb 33G4通過(guò)免疫印跡確認(rèn)聚糖的去除。
[0160] 通過(guò)抑和去垢劑優(yōu)化誘導(dǎo)條件
[0161] 將RBD193-WT/pPICZaA/己斯德畢赤酵母X-33的種子在22虹pm、30 °C下于5ml緩沖 甘油-復(fù)合培養(yǎng)基(Buffered Glycero]_-complex Medi皿，BMGY)中生長(zhǎng)過(guò)夜直至0D600達(dá)到 2-6。在IOml含有0.5%的甲醇的具有5.2、6.0、7.5和8.0的不同pH的緩沖甲醇-復(fù)合培養(yǎng)基 (BMMY)(起始0D600 = 1.0)中誘導(dǎo)重組RBD193-WT的表達(dá)。將EMPIGEN愈BB去垢劑W 0.Ol %和0.05%的終濃度添加至培養(yǎng)物(pH 6.0)中，W確定所述去垢劑是否能夠破壞表達(dá) 的重組蛋白的任何可能的聚集。使誘導(dǎo)持續(xù)72小時(shí)。使用抗-RBD mAb 33G4通過(guò)免疫印跡鑒 定不同培養(yǎng)基中的表達(dá)的重組RBD193的表達(dá)、產(chǎn)率和完整性。
[0162] 發(fā)酵和純化
[0163] 為了放大在酵母中重組RBD的表達(dá)，如先前所述(Du等，2009)，在化發(fā)酵中發(fā)酵 pPICZaA/己斯德畢赤酵母 X33 中的 RBD193-N1、RBD193-N3、RBD219-WT 和 RBD219-N1 的構(gòu)建 體。簡(jiǎn)言之，將每一個(gè)構(gòu)建體的種子原液用于接種IL的緩沖最小甘油(Buffered Minimal Glycerol，BMG)培養(yǎng)基，并在W225rpm搖動(dòng)的條件下于37°C培養(yǎng)過(guò)夜，直至0D600達(dá)到~ 10.0。將1 IOml的該培養(yǎng)物用于在含有3.5ml/L的PTMl微量元素和3.5ml/L的0.02%的d-生 物素的發(fā)酵罐中接種2.化的無(wú)菌BSM。在30°C起始發(fā)酵，并且將初始抑設(shè)置在5.0。將空氣和 攬拌調(diào)整至維持30%的溶解氧(DO)。在分批階段過(guò)程中耗盡甘油后(DO峰值），在6至8小時(shí) 的時(shí)間上W〇.8ml/L/h至lOml/L/h累入甲醇，使用14%氨氧化錠將抑調(diào)整至6.0,并在26°C 維持誘導(dǎo)75小時(shí)。發(fā)酵后，通過(guò)在4°CW7,00化pm離屯、30分鐘收獲培養(yǎng)物，并將其通過(guò) 0.22pm的瓶頂過(guò)濾單元進(jìn)行過(guò)濾。通過(guò)SDS-PAGE和光密度法測(cè)定重組R抓在發(fā)酵培養(yǎng)物中 的表達(dá)產(chǎn)率。為了純化RBD193N1、R抓219-WT和RBD219-N1，用2份30mM IYis和3M硫酸錠(pH 8.0)稀釋1份發(fā)酵上清液，隨后W1.5ml/min的流速將其加載至HiTrap Butyl Sepharose HP,然后用30mM化is和2M硫酸錠洗涂，W除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。用始于2M的硫酸錠梯度洗 脫結(jié)合的R抓蛋白。將含有祀蛋白的級(jí)分合并在一起，將其濃縮，并用Toyopearl HW55S尺寸 排阻柱進(jìn)一步純化W消除剩余污染物。為了純化RBD193-N3,使用陰離子交換Q Sepharose 化柱對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)物上清液進(jìn)行色譜分離。收集流穿物，將其濃縮，并與其它R抓蛋白一樣，利 用Toyopearl HW55S尺寸排阻柱進(jìn)一步純化。使用在實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)發(fā)的抗-RBD mAb 33G4、 35B5、24冊(cè)和31H12(Goud等，2004)通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡確認(rèn)重組RBD的純度。
[0164] 動(dòng)物
[01化]將4至6周齡雌性BALB/c小鼠用于研究，將其置于紐約血液中屯、的動(dòng)物設(shè)施中。按 照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的護(hù)理和使用的推薦進(jìn)行動(dòng)物研究。動(dòng)物操作方案得 到紐約血液中屯、的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(許可號(hào)：194.14)。
[0166] 小鼠接種和血清收集
[0167] 如先前所述，通過(guò)一些改進(jìn)(Du等，2009; Du等，2010; Du等，2009 )，進(jìn)行免疫操作方 案。簡(jiǎn)言之，用侶膠2%(氨氧化侶凝膠，在下文中稱為明抓)佐劑（Invi voGen，San Di ego， California)配制的酵母表達(dá)的重組RBD蛋白（R抓 193-N1、RBD193-N3、RBD219-N1 或RBD219- WT)皮下（S . C.)免疫小鼠（20蛇/小鼠）。將表達(dá)SARS-CoV R抓蛋白（R抓193-WT)的哺乳動(dòng)物 細(xì)胞293T (Du等，2009)和PBS分別用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。W 21天的間隔用相同的明抓配制的 免疫原（1化g/小鼠）加強(qiáng)免疫小鼠2次。在免疫之前和在每一次接種之后10天收集小鼠血 清，W測(cè)量體液IgG抗體應(yīng)答和中和抗體。
[016 引 ELISA
[0169] ELISA用于驗(yàn)證酵母表達(dá)的SARS-CoV R抓蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)發(fā)的邸0特異性mAb的 構(gòu)象(Goud等，2004)。簡(jiǎn)言之，在4°C下分別用每一種酵母表達(dá)的RBD蛋白（Uig/ml)預(yù)包被96 孔化ISA板過(guò)夜，并在37 °C用2 %脫脂乳封閉2小時(shí)。將一系列構(gòu)象依賴性mAb(包括24H8 (Conf I)、31H12(Conf II)、35B5(Conf IV)、33G4(Conf V)、19B2(Conf VI))和線性依賴性 mAb 17H9(Goud等，2004)添加至板，并于37°C溫育I小時(shí)，隨后進(jìn)行4次洗涂。將結(jié)合的抗體 與綴合辣根過(guò)氧化物酶化RP)的抗-小鼠IgGd :3,000, Invitrogen)在37°C反應(yīng)1小時(shí)。在4 次洗涂后，將底物3,3/，5,5/-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(Zymed)添加至板，并通過(guò)添加IN出S化終 止反應(yīng)。利用化ISA酶標(biāo)儀(Tecan，San Jose，CA)測(cè)量450nm處的吸光度(A450)。
[0170] 另外，還使用具有一些改進(jìn)的先前描述的操作方案(Du等，2009;Du等，2010;Du等， 2009)通過(guò)化ISA測(cè)量所收集的小鼠血清中的多克隆抗體對(duì)表達(dá)的R抓的反應(yīng)性。簡(jiǎn)言之，在 4°C下分別用酵母表達(dá)的RBD219-WT蛋白（liig/ml)預(yù)包被96孔化ISA板過(guò)夜，隨后添加系列 稀釋的小鼠血清。通過(guò)使用綴合有皿P的抗-小鼠IgGd :2,000)，隨后進(jìn)行如上所述的相同 操作方案檢測(cè)結(jié)合的IgG抗體。
[0171 ] 拉下（puU-down)結(jié)合測(cè)定
[0172] 使用具有一些改進(jìn)的先前描述的操作方案(Du等，2013;Du等，2013)通過(guò)拉下測(cè)定 進(jìn)行酵母表達(dá)的重組SARS-CoV R抓蛋白對(duì)與細(xì)胞結(jié)合的受體ACE2或可溶性ACE2(SACE2) (R&D Systems ,Minneapolis ,MN)的結(jié)合。簡(jiǎn)言之，分別用重組SARS-CoV R抓蛋白加上17朋 線性mAMGoud等，2004) W及蛋白A和G(針對(duì)與細(xì)胞結(jié)合的ACE2)或Ni-NTA親和柱（針對(duì) SACE2)溫育表達(dá)ACE2的293T細(xì)胞(ACE2/293T)的裂解物或SACE2。在于4°C旋轉(zhuǎn)過(guò)夜后，通過(guò) 離屯、除去混合物的上清液。在用PBS洗涂3次后，將具有結(jié)合蛋白的沉淀物煮沸10分鐘，并如 下所述將上清液經(jīng)歷SDS-PAGE和免疫印跡。
[0173] SDS-PAGE和免疫印跡
[0174] 使用具有一些改進(jìn)的先前所述的操作方案(Du等，2011 ;Du等，2008;Du等，2008)進(jìn) 行SDS-PAGE和免疫印跡。簡(jiǎn)言之，將拉下的蛋白質(zhì)經(jīng)歷SDS-PAGE，隨后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素 膜，在4°C用具有0.05 % Tween-20的PBS(PBST)中的5 %脫脂乳封閉過(guò)夜，隨后在室溫下用山 羊抗-ACE2mAb(liig/ml)和HRP-標(biāo)記的抗-山羊IgGd : 1，000，R&D Systems)相繼溫育 1 小時(shí)。 利用E化免疫印跡底物試劑（GE 胎al thcare , Piscataway,NJ)和Amersham Hyperf i lm(GE Healthcare)使信號(hào)可視化。
[0175] 假病毒中和測(cè)定
[0176] 使用如先前所述的具有一些改進(jìn)的假病毒中和測(cè)定(Du等，2009; Du等，2009)測(cè)量 重組R抓免疫的小鼠血清的中和抗體滴度。簡(jiǎn)言之，使用憐酸巧法，用編碼SARS-CoV S蛋白 的質(zhì)粒和編碼Env-缺陷型表達(dá)巧光素酶的HIV-I基因組的質(zhì)粒(P化4-3. Iuc.RE)共轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)收獲培養(yǎng)物上清液，將其用于表達(dá)SARS-CoV受體ACE2的293T細(xì)胞 (ACE2/293T)的單循環(huán)感染。將細(xì)胞^10^孔接種在96孔培養(yǎng)板中，并在37°C溫育4-6小時(shí) W形成單層。將系列2倍稀釋的小鼠血清與SARS-CoV假病毒在37°C混合1小時(shí)，隨后轉(zhuǎn)移至 單層細(xì)胞。在溫育72小時(shí)后，通過(guò)Ul化a 384照度計(jì)(Tecan)測(cè)量相對(duì)巧光酶活性。計(jì)算SARS 假病毒中和并將其表達(dá)為50 %中和抗體滴度(NT50)。
[0177] 基于活病毒的中和測(cè)定
[0178] 使用具有一些改進(jìn)的如先前所述的基于活病毒的中和測(cè)定化e等，2004;化等， 2005)進(jìn)一步測(cè)量重組RBD免疫的小鼠血清的中和滴度。簡(jiǎn)言之，將系列2倍稀釋的小鼠血清 在37°C與~100個(gè)感染性SARS-CoV混合，進(jìn)行1小時(shí)，隨后W-式二份將其添加至單層Vero E6細(xì)胞。每天觀察每一個(gè)孔中的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，并在感染后第3天進(jìn)行記錄。將中和滴 度報(bào)告為在至少50%的孔中完全阻止CPE的血清的最高稀釋度的倒數(shù)(NT50)。
[0179] 實(shí)施例2
[0180] 重組R抓在己斯德畢赤酵母中的表達(dá)
[0181] 將RBD193和RBD219(WT、N1、N2和N3)的不同構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入己斯德畢赤酵母X-33,并 在IOml管中用0.5%甲醇誘導(dǎo)來(lái)自每個(gè)轉(zhuǎn)化的20個(gè)克隆的重組蛋白表達(dá)。在誘導(dǎo)72小時(shí)后， 通過(guò)SDS-PAGE考馬斯染色的凝膠和利用抗-RBD mAb 33G4的免疫印跡觀察不同構(gòu)建體的具 有不同大小的重組RBD。重組R抓的表觀分子量(M.W.)比基于序列預(yù)期的分子量更高，并且 觀察到高度M.W.拖尾(smear),尤其是在野生型(WT)構(gòu)建體中（在R抓193和RBD219二者中）， 運(yùn)表明重組RBD-WT被糖基化或是聚集的（圖2A和2B)。通過(guò)用N-糖巧酶PNGase F消化蛋白質(zhì) 來(lái)確認(rèn)RBD193-WT的糖基化程度。消化后，高度M. W.拖尾消失，R抓193-WT的大小返回至預(yù)期 的M. W. (23W)a)(圖2C)。該測(cè)定還確認(rèn)了高度M. W.拖尾來(lái)自酵母表達(dá)的R抓的高度糖基化， 而非來(lái)自聚集。當(dāng)N-連接的糖基化位點(diǎn)缺失或突變(N1、N2和N3)時(shí)，酵母表達(dá)的R抓的糖基 化的進(jìn)一步證據(jù)得到確認(rèn)；重組R抓的糖基化程度和表觀M.W.二者均相應(yīng)地下降（圖2A和 2B)。運(yùn)些具有去糖基化形式的構(gòu)建體允許在放大生產(chǎn)和質(zhì)量控制測(cè)試過(guò)程中進(jìn)行精確和 可重現(xiàn)的控制。值得注意的是，當(dāng)N-連接的糖基化位點(diǎn)缺失/突變時(shí)，也觀察到重組R抓的表 達(dá)產(chǎn)率依次降低(產(chǎn)率水平:WT〉N1〉N2〉N3;圖2A和2B)。運(yùn)表明在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)考慮 表達(dá)產(chǎn)率與糖基化水平之間的可行的平衡。
[0182] 實(shí)施例3
[0183] 表達(dá)條件的優(yōu)化:抑和去垢劑
[0184] 為了使重組R抓在己斯德畢赤酵母X33中的表達(dá)產(chǎn)率最大化和使可能的聚集最小 化，將RBD193-WT用作原型來(lái)使用具有不同pH和/或不同Empigen去垢劑濃度的培養(yǎng)基測(cè)試 優(yōu)化的誘導(dǎo)條件。基于利用抗-R抓mAb 33G4的免疫印跡，用于RBD193表達(dá)的最佳pH為pH 6.0。在具有抑5.0的培養(yǎng)物中沒(méi)有祀蛋白表達(dá)，并且在具有高于6.0的抑的培養(yǎng)基中看到 甚至更少的RBD193表達(dá)。Empigen去垢劑(0.0 l %或0.05 % )的添加未提高表達(dá)產(chǎn)率或改變 表達(dá)的RBD的模式，運(yùn)表明聚集不影響表達(dá)的RBD193-WT(圖3)。
[01化]實(shí)施例4
[0186] R抓構(gòu)建體的發(fā)酵和純化
[0187] 當(dāng)甲醇誘導(dǎo)超過(guò)48小時(shí)的時(shí)候，作為表達(dá)的RBD193-WT對(duì)酵母細(xì)胞的毒性的可能 結(jié)果，R抓193-WT酵母構(gòu)建體停止生長(zhǎng)。因此，選擇4種其它構(gòu)建體(包括不同的去糖基化形 式(RBD193-N1、RBD193-N3、RBD219-WT和RBD219-N1))用于化規(guī)模的發(fā)酵，W獲得重組蛋白 用于免疫原性和效力的比較。在化發(fā)酵后，通過(guò)Butyl HP和尺寸排阻色譜(SEC)從發(fā)酵的培 養(yǎng)物純化重組R抓193-N1、RBD219-WT和RBD219-N1，W及通過(guò)在Q S巧harose化上進(jìn)行負(fù)性 捕獲、隨后進(jìn)行沈C來(lái)純化重組RBD193-N3。
[018引如通過(guò)SDS-PAGE考馬斯染色的凝膠和利用抗-R抓mAb 33G4的免疫印跡顯示的， 使用疏水相互作用（Butyl HP)色譜和隨后的尺寸排阻柱從發(fā)酵培養(yǎng)物純化RBD193-N1、 RBD219-WT和RBD219-N1的初步努力得到95 %的純化的蛋白質(zhì)（圖4)。此外，可利用該兩步純 化法高效去除高度糖基化的R抓和宿主蛋白質(zhì)污染物，從而可靠地得到純且可溶的產(chǎn)物。與 使用其它表達(dá)系統(tǒng)(Du等，2009;Du等，2010;Du等，2009)的另外的表達(dá)的R抓蛋白不同，運(yùn)些 酵母表達(dá)的R抓不含任何6X化S標(biāo)簽或其它標(biāo)簽融合蛋白，從而允許將來(lái)用于人使用的放 大生產(chǎn)。
[0189] 實(shí)施例5
[0190] 酵母表達(dá)的SARS-COV的R抓的抗原性分析
[0191] 為了確認(rèn)所選擇的純化的RBD構(gòu)建體（RBD193-N1、RBD193-N3、RBD219-WT和 RBD219-N1)是否與哺乳動(dòng)物細(xì)胞(293T)表達(dá)的RBD共有相同的抗原性或抗原表位，已知所 述哺乳動(dòng)物細(xì)胞(293T)表達(dá)的R抓可引發(fā)中和抗體的產(chǎn)生(Du等，2009;Du等，2010)，針對(duì)4 種構(gòu)象抗-RBD mAb(包括24冊(cè)（Conf I)、31H12(Conf II)、35B5(Conf IV)和33G4(Conf V)) 進(jìn)行免疫印跡（圖5)。值得注意的是，mAb 33G4強(qiáng)烈地識(shí)別所有R抓構(gòu)建體，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞 表達(dá)的R抓的識(shí)別模式類似，而24冊(cè)僅微弱地識(shí)別它們。此外，當(dāng)增加膠片曝光時(shí)間時(shí)，所有 酵母表達(dá)的RBD219構(gòu)建體可被4種特異性mAb更強(qiáng)烈地識(shí)別，運(yùn)與RBD193構(gòu)建體（Du等， 2009;Du等，2010)相反，并與先前的結(jié)果一致。該證據(jù)鏈強(qiáng)烈地表明野生型和去糖基化構(gòu)建 體表現(xiàn)出相似的抗原性。
[0192] 為了進(jìn)一步驗(yàn)證運(yùn)些R抓蛋白的抗原性，利用5種構(gòu)象抗-R抓mAb(24H8、3IHl2、 35B5、33G4和 19B2(Conf VI))和一種線性抗-R抓 mAb(17朋KGoud等，2004)進(jìn)行化ISA。如 圖6A中所示，雖然所有酵母表達(dá)的RBD (liig/ml)均與抗-RBD mAb (2.2iig/ml)反應(yīng)，但 RBD219-WT和RBD219-N1表現(xiàn)出對(duì)所有測(cè)試的mAb的最強(qiáng)的結(jié)合。RBD193-N3與Conf IV mAb 35B5、Conf VI mAb 19B2和線性mAb 17朋的反應(yīng)性比另外的野生型和突變型R抓的反應(yīng)性 低得多。mAb濃度下降至0.25iig/ml沒(méi)有顯著影響RBD219-N1或RBD219-WT對(duì)所有5種構(gòu)象mAb 的結(jié)合，然而它們對(duì)線性抗-RBD mAb 17H9的反應(yīng)性被顯著降低（圖6B)。運(yùn)些數(shù)據(jù)表明去糖 基化的R抓219-N1蛋白，與RBD219-WT-樣，盡管Nl糖基化位點(diǎn)缺失，能夠維持構(gòu)象和抗原 性。
[0193] 實(shí)施例6
[0194] 酵母表達(dá)的R抓蛋白的功能性
[01 M]基于運(yùn)些蛋白結(jié)合W與細(xì)胞結(jié)合的形式或可溶性形式(SACE2)存在的ACE2 (SARS- CoV的受體）的能力進(jìn)一步確認(rèn)酵母表達(dá)的R抓蛋白的功能性。為了建立運(yùn)些蛋白和與細(xì)胞 結(jié)合的ACE2的結(jié)合，首先將測(cè)試蛋白（20iig/每一種）在線性抗-RBD mAb 17H9(Goud等， 2004)和蛋白A及G珠存在的情況下與ACE2/293T細(xì)胞混合，隨后使用特異性針對(duì)ACE2的抗體 進(jìn)行免疫印跡。如圖7A中顯示的，在用各自的R抓蛋白拉下所有細(xì)胞裂解物中觀察到一條對(duì) 應(yīng)于ACE2的大小的清晰條帶;所有R抓蛋白均與ACE2-特異性mAb強(qiáng)烈反應(yīng)，但是RBD193-N3 混合物顯示更弱的反應(yīng)。運(yùn)些結(jié)果表明酵母表達(dá)的R抓蛋白能夠高效地結(jié)合細(xì)胞表面受體 ACE2。如所預(yù)期的，沒(méi)有條帶（結(jié)合)與對(duì)照蛋白（MERS-CoV RBD) -致（圖7A)。
[0196] 通過(guò)在Ni-NTA珠存在的情況下將等濃度的R抓蛋白與SACE2(含有6 X化S標(biāo)簽)混 合，隨后如上進(jìn)行免疫印跡來(lái)進(jìn)一步檢測(cè)R抓蛋白與SACE2的結(jié)合。如圖7B-C中顯示的，在拉 下樣品中顯示兩條對(duì)應(yīng)于SACE2和各自的R抓蛋白的大小的清晰條帶，而在僅含有SACE2或 RBD蛋白的樣品中只顯示一條對(duì)應(yīng)于SACE2或各自R抓蛋白的大小的條帶，其全部與分別針 對(duì)ACE2或SARS-CoV RBD(33G4)的抗體強(qiáng)烈反應(yīng)。然而，在含有MERS-CoV的RBD蛋白加上 SACE2的對(duì)照中，或僅含SACE2的對(duì)照中只顯示一條對(duì)應(yīng)于SACE2的大小的條帶（圖7B-C)。運(yùn) 些結(jié)果確認(rèn)了運(yùn)些酵母表達(dá)的R抓與SARS-CoV的受體ACE2的特異性結(jié)合，從而表明所有具 有或不具有突變的RBD蛋白維持足夠的功能性。
[0197] 實(shí)施例7
[0198] 酵母表達(dá)的SARS-COV的R抓引發(fā)強(qiáng)勁的全身性體液免疫應(yīng)答
[0199] 為了比較酵母表達(dá)的R抓蛋白的免疫原性，使用運(yùn)些蛋白免疫小鼠，并分析最后一 次接種后10天收集的小鼠血清中的IgG抗體應(yīng)答。如圖8中所示，所有酵母表達(dá)的RBD蛋白均 能夠誘導(dǎo)強(qiáng)的針對(duì)RBD219-WT的I gG抗體應(yīng)答。具體地，R抓219-N1誘導(dǎo)比針對(duì)其它R抓蛋白 (包括 RBD193-WT、RBD193-Nl、RBD193-N3和RBD219-WT)顯著更高的針對(duì)RBD219-WT的IgG抗 體應(yīng)答，分別具有1.4 X 106(RBD219-N1 )、3.5 X 10日(RBD193-WT)、1.8 X 10日(RBD193-N1)、1.9 X105(RBD193-N3)和1.8X105(RBD219-WT)的幾何平均滴度。通過(guò)比較，SARS-CoVRBD193- WT誘導(dǎo)分別比針對(duì)RBD193-NURBD193-N3和RBD219-WT顯著更高的針對(duì)RBD219-WT的IgG抗 體應(yīng)答。在SARS-CoV RBD193-NURBD193-N3或R抓219-WT之間未觀察到顯著差異。利用明抓 加上PBS免疫的對(duì)照小鼠只顯示本底抗體應(yīng)答（圖8)。運(yùn)些結(jié)果表明RBD219-N1表現(xiàn)出最高 的免疫原性，運(yùn)進(jìn)而在接種的小鼠中引發(fā)最強(qiáng)的RBD特異性抗體應(yīng)答。
[0200] 實(shí)施例8
[0201] 酵母表達(dá)的SARS-COV R抓蛋白在接種的小鼠中誘導(dǎo)可比較的針對(duì)SARS-COV的中 和抗體的滴度
[0202] 為了比較酵母表達(dá)的SARS-CoV R抓蛋白引發(fā)中和抗體的能力，使用基于SARS假病 毒的中和測(cè)定測(cè)試在最后一次接種后10天從接種的小鼠收集的血清。如圖9A中所示，利用 RBD193-WT、RBD219-WT或RBD219-N1的免疫一致地引發(fā)強(qiáng)效中和抗體應(yīng)答，其中和抗體滴度 分別為約4X104，運(yùn)顯著強(qiáng)于由RBD193-N1或RBD193-N3誘導(dǎo)的中和抗體滴度，其中和抗體 滴度分別為4.3 X IO3和1.4 X 104。如所預(yù)期的，明抓佐劑加上PBS對(duì)照未誘導(dǎo)針對(duì)SARS假病 毒的中和抗體應(yīng)答(圖9A)。
[0203] 為了進(jìn)一步確認(rèn)誘導(dǎo)的中和抗體的功能性，隨后進(jìn)行基于活的SARS-CoV的中和測(cè) 定。如圖9B中所示，利用RBD219-N1的免疫導(dǎo)致比由RBD193-WT、RBD193-N1、RBD193-N3或甚 至RBD219-WT引發(fā)的針對(duì)活的SARS-CoV感染的中和抗體應(yīng)答的滴度顯著更高的所述滴度， 中和抗體滴度分別達(dá)到4.5X103(RBD219-N1)、2.3X103(RBD193-WT)、2.5X102(RBD193- Nl)、1.6 X 103(RBD193-N3)和2.2 X 103(RBD219-WT)。雖然在RBD193-WT組與RBD219-WT組之 間未看到顯著差異，但由RBD193-N巧日RBD193-N3誘導(dǎo)的針對(duì)活的SARS-Co V感染的中和抗體 的滴度顯著低于由RBD193-WT誘導(dǎo)的滴度，從而表明RBD193中的Nl糖基化位點(diǎn)(RBD193-N1) 的缺失和/或第二和第S糖基化位點(diǎn)（R抓193-N3)的突變可能已影響酵母表達(dá)的RBD193蛋 白中的中和表位的構(gòu)象。類似地，明抓對(duì)照組沒(méi)有誘導(dǎo)針對(duì)活的SARS-CoV的中和抗體（圖 9B)。上述數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)R在被測(cè)試的R抓蛋白當(dāng)中BD219-N1具有最強(qiáng)的免疫原性，所述測(cè) 試在接種的動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)活的SARS-CoV的強(qiáng)效中和抗體應(yīng)答。
[0204] 實(shí)施例9
[0205] 某些實(shí)施方案的意義
[0206] SARS-CoV S蛋白的R抓含有多個(gè)構(gòu)象依賴性表位，所述表位誘導(dǎo)強(qiáng)效的針對(duì)廣譜 SARS-CoV菌株的的中和抗體應(yīng)答，從而用作用于開(kāi)發(fā)SARS疫苗的重要祀(Goud等，2004;化 等，2006;化nt等，2002;Dean，1999)。先前已證明，含有與化標(biāo)簽融合的R抓結(jié)構(gòu)域的193個(gè) 氨基酸的重組蛋白（RBD193-Fc)在接種的動(dòng)物中誘導(dǎo)高度強(qiáng)效的中和抗體應(yīng)答和保護(hù)性免 疫化U等，2009;Du等，2010DU等，2009)。為了消除可能由運(yùn)些候選疫苗中的Fc片段誘導(dǎo)的潛 在有害作用，在不同表達(dá)系統(tǒng)(包括哺乳動(dòng)物293T和邸O-Kl細(xì)胞、Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞和大腸桿菌） 中陸續(xù)表達(dá)幾種無(wú)Fc標(biāo)簽的R抓蛋白。已顯示運(yùn)些不具有化標(biāo)簽的R抓蛋白中的大部分仍然 可在接種的動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)SARS-CoV攻擊的強(qiáng)中和抗體應(yīng)答和保護(hù)(Du等，2009;Du等， 2010DU等，2009)。運(yùn)些發(fā)現(xiàn)表明所述R抓蛋白本身可引發(fā)強(qiáng)效中和抗體應(yīng)答和保護(hù)動(dòng)物W 及在具體實(shí)施方案中還保護(hù)人免受SARS-CoV感染。
[0207] SARS-CoV S-R抓(殘基318-510)在N-I、N-13和N-40位置上含有N-連接的糖基化位 點(diǎn)(Wong等，2004)。雖然具有高度糖基化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的R抓蛋白誘導(dǎo)顯著的中和活 性，但大腸桿菌表達(dá)的無(wú)聚糖的RBD蛋白能夠與R抓特異性的構(gòu)象依賴性mAb反應(yīng)，W及還能 夠在接種的動(dòng)物中誘導(dǎo)顯著的中和抗體應(yīng)答化U等，2009)，運(yùn)表明當(dāng)用作候選疫苗時(shí)，無(wú)聚 糖的重組R抓蛋白可W仍然維持其基本抗原性和免疫原性。
[0208] 甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母己斯德畢赤酵母因其W下能力已被廣泛用于異源蛋白表達(dá)（W用 于制藥和疫苗應(yīng)用）：1)在不存在動(dòng)物來(lái)源的生長(zhǎng)因子的確定成分培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量蛋白； 和2) W低成本提供容易的放大化e等，2005;化化ata等，1985)。作為真核表達(dá)系統(tǒng)，酵母能 夠進(jìn)行許多翻譯后修飾，諸如蛋白水解加工、折疊、二硫鍵形成和糖基化，運(yùn)可W是所表達(dá) 的蛋白的功能所必需的。然而，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞不同，己斯德畢赤酵母頻繁地將單糖添加至 所表達(dá)的蛋白W變成高糖基化化OPkins等，2011)。存在于高糖基化的聚糖中的殘基的程度 和鍵聯(lián)可取決于酵母菌株和細(xì)胞培養(yǎng)條件而變化化i等，2005)，作為后果，運(yùn)引起關(guān)于表達(dá) 產(chǎn)率、同種的產(chǎn)物的重現(xiàn)性和質(zhì)量控制的關(guān)注(Prabakaran等，2006)。由于運(yùn)些關(guān)注，除去 或突變R抓序列中負(fù)責(zé)N-糖基化的3個(gè)天冬酷胺W產(chǎn)生去糖基化的R抓形式。
[0209] 在本公開(kāi)中，通過(guò)突變或缺失對(duì)應(yīng)糖基化位點(diǎn)上的殘基來(lái)表達(dá)具有不同長(zhǎng)度 (RBD193-WT和RBD219-WT)的兩種野生型380^及它們的去糖基化突變體（1?80193-^、 RBD193-N2、RBD193-N3;RBD219-N1、RBD219-N2、RBD219-N3)(圖1)。隨后比較它們的抗原性、 功能性和免疫原性。SDS-PAGE分析顯示酵母表達(dá)的R抓193-WT和RBD219-WT二者均呈拖尾遷 移，表觀分子量高于其計(jì)算的M.W.，運(yùn)表明運(yùn)些重組Rm)-WT被高度糖基化或是聚集的（圖 2B)。在用N-糖巧酶PNGase F消化RBD193-WT后，所述高M(jìn).W.拖尾消失，并且RBD193-WT的大 小返回至預(yù)期的M.W.(圖2C)，運(yùn)確認(rèn)了高M(jìn).W.拖尾來(lái)自酵母表達(dá)的R抓的過(guò)度糖基化而非 任何聚集。當(dāng)缺失或突變RBD193-WT和RBD219-WT中的N-連接的糖基化位點(diǎn)中的一些位點(diǎn) (NI、N2和N3)時(shí)，重組R抓的表觀M. W.相應(yīng)地減小（圖2B)。因此，運(yùn)些去糖基化突變體已允許 我們?cè)诜糯笊a(chǎn)和質(zhì)量控制測(cè)試過(guò)程中精確且可重現(xiàn)地控制表達(dá)過(guò)程。值得注意的是，具 有缺失或突變的N-連接的糖基化位點(diǎn)的重組R抓的表達(dá)產(chǎn)率相較于它們的對(duì)應(yīng)的野生型 RBD的表達(dá)產(chǎn)率得W減少（圖2B);因此，運(yùn)指出了對(duì)在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)率與糖基 化水平之間的可行的平衡的需要。
[0210] 重要的是，當(dāng)與野生型形式相比較時(shí)，RBD219-N1表現(xiàn)出較低的糖基化水平而無(wú)明 顯受損的表達(dá)產(chǎn)率（圖2B)。在兩步純化(包括疏水相互作用(Butyl HP)色譜和尺寸排阻柱） 后，大多數(shù)糖基化種類和宿主蛋白質(zhì)污染物被除去（圖3和4)。因此，重組RBD219-N1蛋白被 選擇用于進(jìn)一步評(píng)估。通過(guò)使用兩個(gè)單獨(dú)的方法:免疫印跡（圖5)和化ISA(圖6) ,RBD219-N1 被構(gòu)象抗-RBD mAb高度識(shí)別(Goud等，2004;Dean, 1999)，運(yùn)進(jìn)一步驗(yàn)證了該去糖基化蛋白 維持其抗原性等于野生型蛋白的抗原性的能力。此外，與野生型R抓一樣，R抓219-N1和與細(xì) 胞結(jié)合的受體ACE2W及可溶性受體ACE2充分結(jié)合(圖7)，進(jìn)一步確認(rèn)該酵母表達(dá)的RBD突變 體維持其功能性。
[0211] 比較R抓219-N1與野生型R抓和一些其它去糖基化蛋白的免疫原性，R抓219-N1相 較于野生型RBD、RBD219-WT和RBD193-WTW及另外的去糖基化蛋白（諸如RBD193-N1和 RBD193-N3)似乎誘導(dǎo)顯著更高的SARS-CoV R抓特異性IgG抗體應(yīng)答;R抓193-N1和RBD193- N3表現(xiàn)出比RBD193-WT相對(duì)更低的抗原性和免疫原性（圖6、8和9)。在所有測(cè)試的酵母表達(dá) 的R抓當(dāng)中，RBD219-N1引發(fā)最高滴度的針對(duì)假型化的SARS-CoV和活的SARS-CoV感染的中和 抗體（圖9)。在具體實(shí)施方案中，RBD219-N1的N-I糖基化位點(diǎn)的缺失可能已暴露了R抓中的 中和表位，從而導(dǎo)致中和抗體應(yīng)答的更好誘導(dǎo)。在埃博拉病毒中觀察到類似的現(xiàn)象。埃博拉 病毒糖蛋白亞單位I(GPl)上的兩個(gè)N-連接的位點(diǎn)的突變導(dǎo)致增強(qiáng)的免疫原性，運(yùn)可能是通 過(guò)暴露GPl上的保護(hù)性抗體表位導(dǎo)致的(Za化artcho址等，2007)。
[0212]在體內(nèi)就其功效、保護(hù)動(dòng)物免受SARS-CoV攻擊進(jìn)一步評(píng)估RBD219-N1候選疫苗。根 據(jù)先前的經(jīng)驗(yàn)，預(yù)期可誘導(dǎo)NT50〉1，000的針對(duì)活的SARS-CoV的中和抗體滴度的基于R抓的 候選疫苗可W完全保護(hù)動(dòng)物免受病毒感染化U等，2009; Du等，2009)。本數(shù)據(jù)顯示由RBD219- Nl在接種的小鼠中誘導(dǎo)的針對(duì)活的SARS-CoV的中和抗體的滴度〉2，000 (圖9B )，運(yùn)顯示了其 高效地保護(hù)免疫的動(dòng)物免受SARS-CoV攻擊的前景。
[0213]總之，酵母表達(dá)的無(wú)任何額外標(biāo)簽但具有一個(gè)缺失的糖基化位點(diǎn)的RBD(RBD219- Nl)可表現(xiàn)出更低的糖基化水平和更高的表達(dá)產(chǎn)率，誘導(dǎo)的更強(qiáng)的R抓特異性抗體應(yīng)答和更 強(qiáng)效的針對(duì)假型化和活的SARS-CoV二者的中和抗體，從而指出其在人中用作針對(duì)SARS-CoV 的有效且安全的亞單位疫苗的用途。
[0214] 實(shí)施例10
[0215] 發(fā)酵過(guò)程的實(shí)例
[0216] 如下描述用于來(lái)自SARS-CoV纖突蛋白的R抓組合物的實(shí)例的上游和下游處理的方 法的實(shí)例：
[0217] 上游處理-發(fā)酵：
[0218] 用克隆RBD219-Nl/pPICZaA/己斯德畢赤酵母X33接種500ml BMG中的培養(yǎng)物，并在 30°C ,225巧m下溫育18-24小時(shí)。
[0219] 此后，將過(guò)夜培養(yǎng)物用于接種發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基。發(fā)酵始于3(TC并將初始pH設(shè)置 在5.0。調(diào)整空氣和攬拌W維持30%的DO。在分批階段過(guò)程中耗盡甘油后(DO峰值），使培養(yǎng) 物饑餓1小時(shí)(無(wú)進(jìn)料）。在1小時(shí)饑餓的過(guò)程中，將溫度從30°C變化成25°C，并使pH從5.0升 高至6.5。在pH和溫度斜線變化后，起始甲醇誘導(dǎo)。對(duì)于誘導(dǎo)的頭6個(gè)小時(shí)(第0小時(shí)至第6小 時(shí)），使甲醇進(jìn)料速度從Iml/L/hr升高至1 Iml/L/hr。在6小時(shí)的斜線變化后，將甲醇進(jìn)料速 度維持在llml/L/hr持續(xù)18小時(shí)（第6小時(shí)至第24小時(shí)），在18小時(shí)的llmL/L/hr的穩(wěn)定流速 后，再次使甲醇流速在6小時(shí)內(nèi)（第24小時(shí)至第30小時(shí))從1 ImL/L/虹升至13mL/L/虹，并將其 在13mL/L/hr維持另外18小時(shí)（第30小時(shí)至第48小時(shí)）；最后，在18小時(shí)的13mL/L/hr的穩(wěn)定 流速后，使流帶在6小時(shí)內(nèi)（從第48小時(shí)至第54小時(shí))從13mL/L/hr升至15mL/L/hr，并將其在 15mL/L/虹維持運(yùn)行的剩余時(shí)間。
[0220] 發(fā)酵后，通過(guò)將培養(yǎng)物無(wú)菌累入無(wú)菌收獲容器來(lái)收獲培養(yǎng)物。通過(guò)在4°C下使用 JLA 8.1000轉(zhuǎn)子W7000巧m(~12，500xg)離屯、30分鐘來(lái)除去細(xì)胞。使用0.22um瓶頂過(guò)濾單 元過(guò)濾上清液，將過(guò)濾的上清液轉(zhuǎn)移至IL PETG瓶中并保存直至純化。
[0扣。下游處理-純化：
[0222] 將發(fā)酵上清液濃縮3-4倍。將氨氧化侶和硫酸錠添加在濃縮的發(fā)酵上清液中W將 其抑和導(dǎo)電性分別調(diào)整至約8.0±5和220±1〇1113八111。
[0223] 在進(jìn)行pH和導(dǎo)電性調(diào)整后，將濃縮的發(fā)酵上清液通過(guò)0.22um過(guò)濾，隨后加載至 Butyl冊(cè)柱上，結(jié)合條件為30mM Tris，2M硫酸錠（AS)，pH8.0。用2個(gè)柱體積（CV)的30mM Tris，2M AS，p冊(cè).0洗涂柱子W除去柱中未結(jié)合的蛋白質(zhì)，隨后利用30mM Tris，0.7M AS,抑 8.0進(jìn)行1OV的第一步洗脫，W除去結(jié)合的污染物，最終利用30mM化i S，pH 8.0進(jìn)行1OCV的 第二步洗脫W獲得洗脫混合物(pool)。
[0224] 將洗脫混合物進(jìn)一步濃縮40±10倍，W及將其加載至Superdex75尺寸排阻柱上W 除去剩余的污染物。
[0225] 為了表征RBD219-N1和建立化學(xué)穩(wěn)定性，可利用一種或多種蛋白質(zhì)特異性測(cè)定：
[0226]
[0227] 參考文獻(xiàn)
[0228] 本說(shuō)明書(shū)中提及的所有專利和出版物指明本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員的水平。 所有專利和出版物通過(guò)引用并入本文，其引用程度就如同每一個(gè)別的出版物被明確地和單 獨(dú)地通過(guò)引用并入。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離的組合物，其包含嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)纖突蛋白的受 體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)，其中所述結(jié)構(gòu)域缺乏至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)或在至少一個(gè)在正常條件 下被糖基化的位點(diǎn)上被去糖基化。2. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述結(jié)構(gòu)域被包含在全長(zhǎng)SARS CoV纖突蛋白內(nèi)。3. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述結(jié)構(gòu)域是所述SARS-CoV纖突蛋白的片段。4. 權(quán)利要求3的組合物，其中所述片段包含所述SARS CoV纖突蛋白的氨基酸殘基318-510〇5. 權(quán)利要求3的組合物，其中所述片段包含所述SARS CoV纖突蛋白的氨基酸殘基318-536〇6. 權(quán)利要求3的組合物，其中所述片段的長(zhǎng)度為至少190個(gè)氨基酸。7. 權(quán)利要求3的組合物，其中所述片段的長(zhǎng)度為至少210個(gè)氨基酸。8. 權(quán)利要求1或3的組合物，其中所述糖基化位點(diǎn)為N-糖基化位點(diǎn)。9. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述N-糖基化位點(diǎn)為天冬酰胺位點(diǎn)。 I 〇.權(quán)利要求1或3的組合物，其中所述位點(diǎn)在所述SARS-Co V纖突蛋白的氨基酸318上的 天冬酰胺上。11. 權(quán)利要求1或3的組合物，其中所述位點(diǎn)在所述SARS-CoV纖突蛋白的氨基酸330上的 天冬酰胺上。12. 權(quán)利要求1或3的組合物，其中所述位點(diǎn)在所述SARS-Co V纖突蛋白的氨基酸347上的 天冬酰胺上。13. 權(quán)利要求1或3的組合物，其中所述位點(diǎn)在選自所述SARS-CoV纖突蛋白的氨基酸 318、氨基酸330、氨基酸347及其組合的一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺上。14. 權(quán)利要求1或3的組合物，其中所述片段包含所述SARS CoV纖突蛋白的氨基酸殘基 318-536并且所述位點(diǎn)在所述SARS-Co V纖突蛋白的氨基酸318上的天冬酰胺上。15. 權(quán)利要求1或3的組合物，其中所述位點(diǎn)包含氨基酸缺失。16. 權(quán)利要求1或3的組合物，其中所述位點(diǎn)包含氨基酸取代。17. 權(quán)利要求15的組合物，其中所述氨基酸取代是至絲氨酸或丙氨酸的取代。18. 前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的組合物，其被包含在藥學(xué)上可接受的媒介物中。19. 一種預(yù)防或延遲個(gè)體的SARS發(fā)作或減輕個(gè)體的SARS的至少一種癥狀的方法，其包 括向所述個(gè)體提供有效量的權(quán)利要求1-17的組合物的任一種的步驟。20. 權(quán)利要求18的方法，其中向所述個(gè)體提供所述組合物一次。21. 權(quán)利要求18的方法，其中不止一次向所述個(gè)體提供所述組合物。22. 權(quán)利要求18的方法，其中隨后在第一提供步驟的數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年內(nèi)向所述個(gè)體提 供所述組合物。23. 權(quán)利要求18的方法，其中所述個(gè)體表現(xiàn)出SARS的一種或多種癥狀。24. 權(quán)利要求18的方法，其中所述個(gè)體缺乏SARS的任何癥狀。25. 權(quán)利要求18的方法，其中所述個(gè)體已被暴露于SARS。26. 權(quán)利要求18的方法，其中所述個(gè)體已與患有SARS的個(gè)體接觸。27. 權(quán)利要求18的方法，其中所述個(gè)體是兒童、老年人，暴露于生物武器或處于其風(fēng)險(xiǎn) 中，是軍隊(duì)的成員，或是衛(wèi)生保健工作者。
【文檔編號(hào)】C07K14/00GK105934441SQ201480073988
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2014年11月21日
【發(fā)明人】P·J·霍特茲, M·E·博塔茲, 詹斌, 陳文祥, S·查格
【申請(qǐng)人】貝勒醫(yī)學(xué)院