用于治療糖原貯積病的腺相關(guān)病毒載體的制作方法
【專利摘要】本公開內(nèi)容描述了用于治療糖原貯積病，特別是Ia型糖原貯積病的基因療法應(yīng)用的改進的腺相關(guān)病毒(AAV)載體。描述了重組核酸分子、載體和重組AAV，其包含G6PC啟動子/增強子、合成內(nèi)含子、G6PC編碼序列(例如野生型或密碼子優(yōu)化的G6PC編碼序列)，以及位于G6PC啟動子/增強子和內(nèi)含子之間以及內(nèi)含子和G6PC編碼序列之間的填充核酸序列。本文公開的重組AAV表現(xiàn)出高效的肝轉(zhuǎn)導(dǎo)并且能夠糾正GSD?Ia的動物模型中的代謝異常。
【專利說明】用于治療糖原膽積病的腺相關(guān)病毒載體
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年11月26日提交的美國臨時申請No.61/908,861的優(yōu)先權(quán)，其通 過引用的方式全文納入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開內(nèi)容設(shè)及用于治療糖原膽積病，特別是Ia型糖原膽積病的基因療法載體。
【背景技術(shù)】
[0004] Ia型糖原膽積病(GSD-Ia或馮吉爾克病(von Gierke disease) ,MIM232200)是由 葡萄糖-6-憐酸酶a(G6化se-a)的缺陷造成的，運是一種主要在肝臟、腎和腸中表達的酶 (化OU et al.,化t Rev Endocrinol 6:676-688,2010)。由G6PC基因編碼的G6化se-a是通 過九個跨膜螺旋錯定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)化R)中的疏水性蛋白質(zhì)(化OU et al.,化t Rev化docrinol 6:676-688,2010)。運種酶在糖原分解和糖異生的最后步驟中催化葡萄糖-6-憐酸(G6P)水 解成葡萄糖和憐酸。受GSD-Ia影響的患者不能維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)，并且具有空腹低血糖、生長 遲緩、肝腫大、腎肥大、高脂血癥、高尿酸血癥和乳酸血癥（lactic academia)(畑OU et al.,Nat Rev Elndocrinol 6:676-688,2010)。
[0005] 當前沒有GSD-Ia的治愈法。低血糖癥可W使用食療控制(Greene et al.，N Engl J Med 294:423-425,1976;Chen et al.，N Engl J Med 310:171-175,1984)，其能夠使患 者獲得接近正常的生成和青春期發(fā)育。但是，較長期的臨床并發(fā)癥及其背后的病理過程依 然未被糾正。一種最顯著的慢性風(fēng)險是肝細胞腺癌化CA),其在70-80%的超過25歲的GSD-I 患者中出現(xiàn)（化OU et al.,Nat Rev Elndocrinol 6:676-688,2010;Lab;rune et al.,J Pediatr Gastroenterol Nutr 24:276-279,1997；Rake et al.,Eur J Pediatr 161 (5啡911):520-534,2002)。650-1曰患者中的肥4是小的多發(fā)性并且無包膜的，并發(fā)癥包括局 部受壓（local compression)和瘤內(nèi)出血。在10%的GSD-Ia患者中，肥A經(jīng)歷惡性轉(zhuǎn)化成肝 細胞癌化CC)(Qiou et al.,化t Rev Endoc;rinol6:676-688,2010;Rake et al.,Eu;r J Pediatr 161(增刊I) :S20-S：M，2002;Franco et al.，J Inherit Metab Dis 28:153-162， 2005)O
[0006] 已經(jīng)在GSD-Ia的動物模型中進行了使用攜帶G6化se-a的重組腺相關(guān)病毒(AAV)的 基因療法研究;運些研究已表現(xiàn)出了效力，并且沒毒性(化OU and Mansfield,Exped Opin Bi OI Ther 11:1011 -1024，2011中的綜述）。之前使用GSD-Ia的小鼠模型的研究已經(jīng)表明， 在G6PC 5'側(cè)翼區(qū)的核巧酸-298至+128的CBA啟動子/CMV增強子(Ghosh et al. ,Gene Ther 13:321-329,2006)、犬G6PC啟動子化oeberl et al. ,Gene Ilier 13:1281-1289,2006)或人 G6PC啟動子的指導(dǎo)下表達G6化se-a的重組AAV將G6化se-a轉(zhuǎn)基因遞送到肝臟并且實現(xiàn)了對 運種疾病的長期糾正。但是，盡管運些研究很有希望，但是均沒有能夠完全糾正肝G6化se-a 缺陷的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本文提供了可在用于治療糖原膽積病，尤其是GSD-Ia的基因療法應(yīng)用中使用的重 組核酸分子、腺相關(guān)病毒(AAV)載體和重組AAV。
[000引在一些實施方案中，重組核酸分子包含G6PC啟動子/增強子、合成內(nèi)含子和G6PC編 碼區(qū)，后者任選地被密碼子優(yōu)化用于在人細胞中表達。重組核酸分子還包含位于G6PC啟動 子/增強子和內(nèi)含子之間，W及內(nèi)含子和G6PC編碼序列之間的填充核酸序列。在一些特定的 非限制性實例中，重組核酸分子包含SEQ ID NO: 1的核巧酸182-4441或SEQ ID N0:3的核巧 酸182-4441。
[0009] 在一些實施方案中，重組核酸分子還包含5^和y反向末端重復(fù)(ITR)序列。在一些 實例中，重組媽蟻核酸分子包含SEQ ID NO: 1的核巧酸17-4819或SEQ ID N0:3的核巧酸17- 4819。在其他實施方案中，重組核酸分子包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3的完整載體核酸 序列。
[0010] 本文還提供了包含本文公開的重組核酸分子的載體。在一些實施方案中，載體是 AAV載體，例如AAV8載體。本文還提供了包含本文公開的重組核酸分子或載體的分離的宿主 細胞。例如，分離的宿主細胞可W是適合于AAV增殖的細胞。
[0011] 本文還提供了包含本文公開的重組核酸分子的重組AAV(rAAV)。本公開內(nèi)容還提 供了包含rAAV的組合物。
[0012] 本文還提供了治療被診斷為患有糖原膽積病的受試者的方法，包括選擇患有Ia型 糖原膽積病(GSD-Ia)的受試者并且給予所述受試者治療有效量的本文公開的rAAV或者包 含rAAV的組合物。
[0013] 通過參考附圖進行的W下發(fā)明詳述，本發(fā)明上述的和其他的目的、特征和優(yōu)點將 變得更明顯。
【附圖說明】
[0014] 圖1A-1B是示出了 AAV-G陽輸注的G6pc-/-小鼠的表型分析結(jié)果的圖表。（圖1A)示出 了用1.2 X IQiiyg/小鼠的AAV-G陽輸注的雌性G6pc-/-小鼠及其雌性G化C+/VG6PC+/-同窩出生 仔（Iittermate)的體重。在圖上方示出了輸注時的年齡（2天、2周或4周）。（O)，G6pc+/+/ G6pc+/-小鼠；（參），AAV-GPE輸注的G6pc-/-小鼠。（圖IB)示出了輸注AAV-G陽的小鼠的血糖、 膽固醇、甘油S醋、尿酸和乳酸水平。由于每組中各自代謝物的相似性，示出的數(shù)據(jù)為6-24 周齡的合并數(shù)據(jù)。在2天齡(n = 36)、2周齡(n = 24)或4周齡(n = 9)時向（+/+&+/-)、G6pc+/7 G6pc+/-，（ -/-)、G化C-/-，或（-/-G陽）、G6pc-/-小鼠輸注AAV-G陽。數(shù)據(jù)表示為平均值± SEM。*p 〈0.05，**p<0.005d
[001引圖2A-2B是示出了在24小時禁食后野生型和AAV-GPE處理的G6pc-/-小鼠中肝 G6化se-a活性和mRNA表達的圖表。向7只2周、11只4周、1只15周（*)和1只30周（**)齡的 G6pc-/-小鼠輸注不同劑量的AAV-GPE;當小鼠為70-90周齡時評估G6化se-a活性和mRNA表 達。（圖2A)示出了所指出周齡(W)時的肝G6化se-a活性?；谂c野生型活性相比的小鼠 G6化se-a活性，將小鼠分組為低(AAV-L)、中（AAV-M)和高（AAV-H)。（圖2BMAV-GPE處理的 G6pc-/-小鼠中肝G6化se-amRNA表達及其與G6化se-a活性的關(guān)系。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。 在圖2B中，卸<0.05，**p<0.005。
[0016] 圖3A-3C是示出了 70至90周齡時的經(jīng)AAV-GPE處理的G6p(T/-小鼠的表型分析結(jié)果 的圖表。（圖3A)血糖、膽固醇、甘油S醋、尿酸和乳酸水平。（圖3B)體重、體長和BMIJ，雌性； M，雄性。（圖3C)肝重量。處理指示為：（+/+)，野生型小鼠；（-/-AAV)，用不同劑量AAV-GPE輸 注的G6pc-/-小鼠。AAV-L(n = 6)、AAV-M(n = 9)和AAV-H(n = 5)分別是表達3-9% (低，L)、22- 63%(中，1)和81-128%(高記）的正常肝66化36-日活性的44￥-6陽處理的66口(：-/-小鼠。數(shù)據(jù) 表示為平均值± SEM。卸<0.05，**p<0.005。
[0017] 圖4A-4C是示出了空腹血糖和葡糖耐量譜的圖表。（圖4A)70至90周齡時的野生型 和經(jīng)AAV-G陽處理的G6pc-/-小鼠的空腹血糖譜。（圖4B)6-8周齡時的未經(jīng)處理的G6pc-/-小鼠 的空腹血糖譜。（圖4C)70至90周齡時的野生型和經(jīng)AAV-GPE處理的G6pc^^h鼠的葡糖耐量 譜。將野生型或AAV-GPE輸注的G6P C鼠禁食6小時，腹膜內(nèi)注射2mg/g右旋糖 (dextrose),然后每30分鐘通過尾靜脈采集血樣。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEMe(+/+)，野生型 小鼠；（-/-)，未處理的G6pc-/-小鼠。AAV-L(n = 6)、AAV-M(n = 9)和AAV-H(n = 5)分別是表達 3-9%、22-63%和81-129%的正常肝G6I^se-a活性的AAV-G陽處理的G6pc-/-小鼠。
[001引圖5A-5C是示出了禁食24小時后70至90周齡的野生型和經(jīng)AAV-GPE處理的G6pc-/- 小鼠的血膜島素 W及SREBP-Ic和葡萄糖激酶的肝臟mRNA水平的圖表。（圖5A)空腹血膜島素 水平及其與動物體重的關(guān)系。（圖5B)通過實時RT-PCR的SREBP-Ic mRNA的定量。（圖5C)葡萄 糖激酶mRNA的定量W及空腹血膜島素與肝葡萄糖激酶mRNA水平的關(guān)系。（+/+，0)，野生型 小鼠 （n = 20) ; (-/-AAV，參）AAV-GPE處理的G6pc-/-小鼠 （n = 20)。數(shù)據(jù)表示為平均值± SEM。*沖<0.005。
[0019] 圖6A-6D是示出了 12周齡的野生型、rAAV-GPE處理的和rAAV-miGPE處理的G6pc-/- 小鼠中的生化分析結(jié)果的圖表。rAAV-GPE和rAAV-miGPE分別是在2864bp的人G6PC啟動子/ 增強子(G陽)和382bp的最小人G6PC啟動子/增強子(miGPE)的指導(dǎo)下表達人G6化Se的rAAV 載體。（圖6A)肝微粒體G6化se-a活性及其與載體基因組拷貝數(shù)的關(guān)系。（圖6B)生長曲線。 (圖6C)BMI值。（圖6D)血糖水平。GPE-高，高劑量rAAV-GPE處理的（O) ;miGPE-高，高劑量 rAAV-miGPE處理的（參）；GPE-低，低劑量rAAV-GPE處理的（□) ;miGPE-低，低劑量rAAV- miGPE處理的（ )G帥C-/-小鼠；（+/+)，野生型（▼)小鼠。數(shù)據(jù)表示為平均值± SEMd^< 0.05〇
[0020] 圖7A-7C是示出了 12周齡野生型、rAAV-G陽處理的和rAAV-miGPE處理的G6pc-/-小 鼠中的表型分析結(jié)果的圖表。（圖7A)肝重量。（圖7B)肝糖原含量。（圖7C)肝甘油S醋含量。 GPE-高（n = 6)，高劑量rAAV-G陽處理的；miG陽-高（n = 6)，高劑量rAAV-miGPE處理的；GW- 低（n = 6 )，低劑量rAAV-GPE處理的；miG陽-低（n = 6 )，低劑量rAAV-miGPE處理的G6pc-/-小 鼠；（+/+)，野生型小鼠。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。沖<0.05。
[0021] 圖8A-8C是示出了 12周齡的野生型、rAAV-G陽處理的和rAAV-miG陽處理的G6pc-/- 小鼠的空腹血糖和葡糖耐量譜的圖表。（圖8A)空腹血糖譜。（圖8B)24禁食小時之后的血糖 水平。（圖8C)葡糖耐量譜。G陽-高(n = 6)，高劑量rAAV-G陽處理的（O); miGPE-高(n = 6)，高 劑量rAAV-miGPE處理的（參）；GPE-低（n = 6)，低劑量rAAV-GTO處理的（□ );miGPE-低（n = 6)，低劑量rAAV-miGPE處理的（^)669(3-/-小鼠；（+/+)，野生型（▼)小鼠。數(shù)據(jù)表示為平均 值 ± SEM。沖 <0.05，*沖 <0.005。
[0022] 圖9是犬(569 10^:10)和人(569 10^:4)66口曰36蛋白序列的比對。
[0023] 圖10是示出了人、小鼠、大鼠和犬G6化Se-的氨基酸序列差異的表。
[0024] 圖11是示出了用rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的GSD-Ia小鼠中的肝G6化Se活性的圖表。用rAAV8載體 (IQi3VgAg)轉(zhuǎn)導(dǎo)GSD-Ia小鼠，所述載體在GPE啟動子/增強子的指導(dǎo)下表達天然或密碼子優(yōu) 化レodon-optimized，co)的人G6F^ase。12周齡小鼠中的肝G6F^ase活性為165.4±18.2nmol/ min/m邑。
[00巧]圖12是示出了 12周齡野生型(+/+)和rAAV處理的GSD-Ia小鼠中的肝重量的圖表。 [00%] 圖13A和13B分別是示出了野生型（O)和rAAV8-G陽-CO-GSPase處理的GSD-Ia(參） 小鼠中的葡糖耐量和空腹血糖譜的圖表。
[0027] 序列表
[00%]使用37C.F.R. 1.822中定義的核巧酸堿基的標準字母縮寫和氨基酸的=字母代碼 示出了所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列。僅示出了每個核酸序列的一條鏈，但是應(yīng) 理解通過參考示出的鏈而包含了互補鏈。序列表W2014年11月112日創(chuàng)建的39.6邸的ASCII 文本文件提交，其通過引用的方式納入本文。在所附序列表中：
[00巧]SEQ ID NO: 1是UFlI-G陽-G6PC質(zhì)粒的核巧酸序列，所述質(zhì)粒包含W下特征：
[0030] 口 R-核巧酸 17-163
[0031] G6PC啟動子/增強子-核巧酸182-3045
[0032] 填充序列-核巧酸3051-3184
[0033] 內(nèi)含子-核巧酸3185-3321
[0034] 填充序列-核巧酸3322-3367
[0035] G6PC編碼序列-核巧酸3368-4441
[0036] 口 R-核巧酸4674-4819
[0037] SEQ ID ^:2是冊11-1(29-66?(：質(zhì)粒的核巧酸序列，所述質(zhì)粒包含^下特征：
[003引 口 R-核巧酸 17-163
[0039] 6PC啟動子/增強子-核巧酸182-3045
[0040] 內(nèi)含子-核巧酸3052-3188
[0041 ] G6PC編碼序列-核巧酸3202-4275
[0042] 口 R-核巧酸4508-4653
[0043] SEQ ID NO:3是UFlI-G陽-CO-G6PC質(zhì)粒的核巧酸序列，所述質(zhì)粒包含W下特征：
[0044] 口 R-核巧酸 17-163
[0045] 6PC啟動子/增強子-核巧酸182-3045
[0046] 填充序列-核巧酸3051-3184
[0047] 內(nèi)含子-核巧酸3185-3321
[004引填充序列-核巧酸3322-3367 [0049] G6PC編碼序列-核巧酸3368-4441 [0化0] 口 R-核巧酸4674-4819
[0化1]沈Q ID NO:4是人G6PC蛋白的氨基酸序列。
[0化2] SEQ ID NO:5-8是引物序列。
[0化3] SEQ ID NO:9是犬G6PC的核巧酸序列。
[0054] SEQ ID NO :10是犬G6PC的氨基酸序列。
【具體實施方式】 [005引 I.縮寫 [0056] AAV 腺相關(guān)病毒 [0057] BMI 體重指數(shù) [005引 CBA 雞0-激動蛋白
[0059] CMV 巨細胞病毒
[0060] ELISA酶聯(lián)免疫吸附測定 [0061 ] G6P 葡萄糖-6-憐酸
[0062] G6PC 葡萄糖-6-憐酸酶，催化亞基
[0063] G6PT 葡萄糖-6-憐酸轉(zhuǎn)運蛋白
[0064] G陽 G6PC啟動子/增強子
[0(?日]GSD 糖原膽積病
[0066] H&E 蘇木精和曙紅
[0067] HCA 肝細胞腺瘤
[006引肥C 肝細胞癌
[0069] ITR 反向末端重復(fù)
[0070] ORF 開放閱讀框
[0071] rAAV 重組 AAV
[0072] Vg 病毒基因組
[0073] VP 病毒顆粒
[0074] II.術(shù)語和方法
[0075] 除非另有說明，否則技術(shù)術(shù)語是根據(jù)常規(guī)用法使用。分子生物學(xué)中常見術(shù)語的定 義可W在W下中找到：Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Press出版，1994 (ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew et al.(編輯），1^6 Encyclopedia of Molecular Bio logy ,Blackwel I Science Ltd.出版，1994( ISBNO-632-02182-9) ; W及 Robert A.Meyers(編車茸），Molecular Biology and Biotechnology : a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
[0076] 為了便于理解本公開內(nèi)容的各個實施方案，提供了特定術(shù)語的W下解釋：
[0077] 腺相關(guān)病毒(AAV):感染人和其他一些靈長類物種的小的復(fù)制缺陷性無包膜病毒。 已知AAV不造成疾病并且引起非常輕微的免疫應(yīng)答。使用AAV的基因療法載體可W感染分裂 細胞和靜止期細胞，并且可W保持染色體外狀態(tài)而不整合到宿主細胞的基因組中。運些特 征使得AAV成為用于基因療法的有吸引力的病毒載體。目前有11種確認的AAV血清型(AAV1- 11)。
[0078] 給藥/給予：通過有效的途徑向受試者提供或給予藥劑，例如治療劑（例如，重組 AAV)。示例性給藥途徑包括但不限于注射(例如，皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和靜脈內(nèi)）、口 月良、導(dǎo)管內(nèi)、舌下、直腸、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、陰道和吸入途徑。
[0079] 密碼子優(yōu)化的："密碼子優(yōu)化的"核酸是指已經(jīng)被改變W使得密碼子最適于特定系 統(tǒng)(例如，特定物種或物種的組）中的表達的核酸序列。例如，核酸序列可W優(yōu)化用于在哺乳 動物細胞或特定哺乳動物物種(例如人細胞）中表達。密碼子優(yōu)化不改變所編碼蛋白質(zhì)的氨 基酸序列。
[0080]增強子:通過提高啟動子的活性來提高轉(zhuǎn)錄速率的核酸序列。
[0081 ] G6PC:位于人染色體17q21中的編碼葡萄糖-6-憐酸酶a(G6Pase-a)的基因。 G6化se-a是357個氨基酸的疏水蛋白質(zhì)，具有將其錯定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的9個螺旋（Chou et al.，化t Rev化docrinol 6:676-688,2010)。66化36-日蛋白質(zhì)在糖異生和糖原分解的最終 步驟催化葡萄糖-6-憐酸水解成葡萄糖和憐酸，是葡萄糖穩(wěn)態(tài)中的重要酶。G6PC基因中的突 變造成Ia型糖原膽積病(GSD-Ia),運是一種與肝臟和腎中的糖原和脂肪積累相關(guān)的W嚴重 空腹低血糖為特征的代謝障礙。
[0082] 糖原膽積病(GSD):肌肉、肝臟W及其他組織中糖原合成或分解過程中的缺陷造成 的一類疾病。GSD可W是遺傳性的或獲得性的。遺傳性GSD是由參與運些過程的新陳代謝的 任何先天缺陷造成。目前有11種確認的糖原膽積病(GSD I、II、III、IV、V、VI、VII、IX、XI、 XH和XIII型KGSD-I由兩種常染色體隱形疾病GSD-Ia和GSD-Ib組成（畑OU et al. ,Nat Rev Endocrinol 6:676-688,2010) sGSD-Ia由葡萄糖-6-憐酸酶a的缺陷造成。葡萄糖-6-憐 酸轉(zhuǎn)運蛋白（G6PT)的缺陷是GSD-Ib的原因。
[0083] Ia型糖原膽積病(GSD-Ia):也稱為馮吉爾克病，GSD-Ia是最常見的糖原膽積病，活 產(chǎn)兒中發(fā)病率為約l/l〇〇,〇〇〇DGSD-Ia是由酶葡萄糖-6-憐酸酶a(G6化se-a)的缺陷造成的 遺傳病。G6Pase-a的缺陷損害肝臟由糖原和由糖異生產(chǎn)生游離葡萄糖的能力?；加蠫SD-Ia 的患者不能維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)并且具有空腹低血糖、生長遲緩、肝腫大、腎肥大、高脂血癥、高 尿酸血癥和乳酸血癥（Chou et al.，化t Rev化docrinol 6:676-688,2010)。目前沒有用 于GSD-Ia的治愈方法。
[0084] 內(nèi)含子:基因中不包含蛋白質(zhì)的編碼信息的一段DNA。內(nèi)含子在信使RNA翻譯之前 被移除。
[0085] 反向末端重復(fù)（ITR):有效復(fù)制所需的腺相關(guān)病毒基因組中的對稱核酸序列。ITR 序列位于AAV DNA基因組的每一端。ITR充當病毒DNA合成的復(fù)制起點，并且是產(chǎn)生AAV整合 型載體的必要的順式元件。
[0086] 分離的："分離的"生物組分(例如，核酸分子、蛋白質(zhì)、病毒或細胞）已經(jīng)被從其中 所述組分天然存在的生物體的細胞或組織中或者生物體本身中的其他生物組分(例如其他 染色體和染色體外DNA和RNA、蛋白質(zhì)和細胞）中基本上分離或純化。已經(jīng)"分離"的核酸分子 和蛋白質(zhì)包括通過標準純化方法純化的那些。該術(shù)語還包括通過在宿主細胞中重組表達制 備的核酸分子和蛋白質(zhì)，W及化學(xué)合成的核酸分子和蛋白質(zhì)。
[0087] 可操作地連接：當?shù)谝缓怂嵝蛄信c第二核酸序列被放置為具有功能關(guān)系時，第一 核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達，貝U 啟動子與編碼序列可操作地連接。通常，可操作地連接的DNA序列是連續(xù)的，并且當有必要 連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)時，其在相同閱讀框中。
[0088] 可藥用載體：本公開內(nèi)容中可W使用的可藥用載體（溶劑（vehicle))是常規(guī)的。 Remington's Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton, PA，15th Edition(1975)描述了適合一種或更多種治療性化合物、分子或試劑的藥物遞送 的組合物和制劑。
[0089] 通常，載體的性質(zhì)取決于所使用的特定給藥方式。例如，胃腸外制劑通常包含可注 射流體，其包括藥學(xué)和生理學(xué)上可接受的流體，例如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、水性右旋 糖、甘油等作為溶劑。對于固體組合物(例如，粉末劑、丸劑、片劑或膠囊劑形式），可W包含 常規(guī)無毒固體載體，例如藥物級甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸儀。除了生物學(xué)中性載體外，待 給予的藥物組合物還可W包含少量無毒輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑和pH緩沖 劑等，例如醋酸鋼或脫水山梨糖醇單月桂酸醋.
[0090] 預(yù)防、治療或改善疾?。?預(yù)防"疾病（例如GSD-Ia)是指抑制疾病的全面發(fā)生。"治 療"是指在疾病開始發(fā)生后改善疾病或病理病癥的體征或癥狀的治療性介入。"改善"是指 降低疾病的體征或癥狀的數(shù)目或嚴重性。
[0091] 啟動子:指導(dǎo)/引起核酸(例如，基因）的轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。啟動子包括轉(zhuǎn)錄起始位點 附近的必要核酸序列。通常，啟動子位于其轉(zhuǎn)錄的基因附近。啟動子還任選地包括遠端增強 子或阻遏物元件，其可W位于距轉(zhuǎn)錄起始位點數(shù)千個堿基對遠。
[0092] 純化的：術(shù)語"純化的"并不需要絕對純度;相反地，其旨在作為相對術(shù)語。因此，例 如，純化的多膚、蛋白質(zhì)、病毒或其他活性化合物是全部或部分地從天然相關(guān)的蛋白質(zhì)和其 他污染物中分離得那些。在某些實施方案中，術(shù)語"基本上純化的"是指已從細胞、細胞培養(yǎng) 基或其他粗制品中分離并且經(jīng)過分級分離W除去初始制品的多種組分(如蛋白質(zhì)、細胞碎 片W及其他組分)的膚、蛋白質(zhì)、病毒或其他活性化合物。
[0093] 重組:重組核酸分子是指運樣的核酸分子，其具有非天然存在的序列，或者具有通 過兩個序列片段的人為組合(否則地話，其將是分開的）制備的序列。運種人為組合可W通 過化學(xué)合成或者通過分離的核酸分子片段的人為操作(如通過基因工程技術(shù))實現(xiàn)。
[0094] 同樣地，重組病毒是包含非天然存在的序列或通過至少兩個不同來源的序列的人 為組合制備的序列的病毒。術(shù)語"重組"還包括僅通過天然核酸分子、蛋白質(zhì)或病毒的一部 分的添加、置換或缺失改變的核酸、蛋白質(zhì)和病毒。本文使用的"重組AAV"是指其中包裝有 重組核酸分子(例如，編碼G6化se-a的重組核酸分子)的AAV顆粒。
[00M]序列同一性:兩個或更多個核酸序列之間或者兩個或更多個氨基酸序列之間的同 一性或相似性是根據(jù)序列之間的同一性或相似性表示。序列同一性可W根據(jù)百分比同一性 巧慢;百分比越高，序列越相同。序列相似性可W根據(jù)百分比相似性測量(考慮保守性氨基 酸置換）；百分比越高，序列越相似。當使用標準方法比對時，核酸或氨基酸序列的同源物或 直系同源物具有相對高的序列同一性/相似性程度。與來自相關(guān)性更遠的物種(例如，人和 線蟲(C.elegans)序列）相比，當直系同源蛋白質(zhì)或cDNA來自更緊密相關(guān)的物種(例如，人和 小鼠序列）時，運種同源性更顯著。
[0096]用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域中公知的。W下描述了多種程序和比對算法： Smith&Waterman，Adv.Appl.Ma化.2:482,1981;Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48:443， 1970；Pearson&Lipman,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 85:2444，1988;Higgins&Sharp,Gene， 73:237-44，1988;化容容;[113&511過巧，〔六8108 5:151-3，1989;Corpet et al.，Nuc.Acids 民es.16:10881-90，1988;Huang et al.Computer Appls. in the Biosciences 8,155-65， 1992;?及Pearson et al.，Meth.Mol.Bio.24:307-31，1994.Altschul et al.， J.Mol.Biol. 215:403-10,1990給出了序列比對方法和同源性計算的詳細考慮。
[0097] NCBI 基本局部比對檢索工具（BLAST)(Altschuletal.，J.Mol.Biol.215:403- 10，1990)可W從多個來源獲得，包括國家生物信息中屯、(NCBI)和網(wǎng)上，其用于結(jié)合序列分 析程序blas1:p、blastn、blastx、tblastn和tblastx使用。額外的信息可W在NCBI網(wǎng)址上找 到。
[0098] 血清型:通過抗原的特征組區(qū)分的一類密切相關(guān)的微生物(例如，病毒）。
[0099] 填充序列:較大核酸分子(例如，載體）中包含的核巧酸序列，其通常用于在兩個核 酸特征之間（例如啟動子和編碼序列之間）產(chǎn)生所需的間隔，或者延長核酸分子W使其具有 所需長度。填充序列不包含蛋白質(zhì)編碼信息，可W是未知的/合成來源并且/或者與較大核 酸分子內(nèi)的其他核酸序列不相關(guān)。
[0100] 受試者:活的多細胞脊椎動物生物體，包括人和非人哺乳動物的類別。
[0101 ]合成:通過人工手段在實驗室產(chǎn)生，例如合成核酸可W在實驗室化學(xué)合成。
[0102] 治療有效量:足W在用試劑治療的受試者或者細胞中取得所需效果的特定藥物或 治療試劑(例如重組AAV)的量。試劑的有效量取決于多種因素，包括但不限于被治療的受試 者或細胞，W及治療性組合物的給藥方式。
[0103] 載體:載體是允許插入外源核酸而不破壞載體在宿主細胞中復(fù)制和/或整合的能 力的核酸分子。載體可W包含允許其在宿主細胞中復(fù)制的核酸序列，例如復(fù)制起點。載體還 可W包含一種或更多種選擇性標記基因和其他遺傳元件。表達載體是包含必要的調(diào)控序列 W允許插入的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。在本文的一些實施方案中，載體是AAV載體。
[0104] 除非另有說明，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員所通常理解的含義相同的含義。除非上下文另外明確說明，單數(shù)術(shù)語"一"、 "一個"和"所述"包括復(fù)數(shù)指示物。"包含A或護意指包含A、或者B，或者A和B。還應(yīng)理解的是， 對于核酸或多膚給出的所有堿基大小或氨基酸大小，W及所有分子重量或分子質(zhì)量值是近 似的，并且被提供用于描述。盡管在本公開內(nèi)容的實踐或測試中可W使用與本文所述的那 些方法和材料相似或相同的方法和材料，但是W下描述了合適的方法和材料。本文提到的 所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻均通過引用的方式全文納入本文。在矛盾的情 況下，W本說明書(包括術(shù)語的解釋)為準。此外，材料、方法和實例僅為示例性的，而不是旨 在限制。
[0105] III.多個實施方案的概述
[0106] 本文提供了可在用于治療糖原膽積病(尤其是GSD-Ia)的基因療法應(yīng)用中使用的 重組核酸分子、AAV載體和重組AAV。
[0107] 所述重組核酸分子包含G6PC啟動子/增強子(GPE)、合成內(nèi)含子和G6PC編碼區(qū)。所 述G6PC編碼區(qū)任選地被密碼子優(yōu)化用于在人細胞中表達。所述重組核酸分子還包含位于 G6PC啟動子/增強子和內(nèi)含子之間，W及內(nèi)含子和G6PC編碼序列之間的填充核酸序列。當被 包含在AAV載體中時，所述重組核酸分子還可W包含5/和y反向末端重復(fù)(ITR)序列。
[010引本文公開了，具有G6PC啟動子/增強子的表達G6化se-a的重組AAVUAV-G陽）在指 導(dǎo)體內(nèi)肝轉(zhuǎn)基因的表達方面比具有替代啟動子/增強子（即，雞的敦動蛋白啟動子/CMV增強 子)的另外的表達G6化se-a的重組AAV顯著更有效。經(jīng)過24小時的研究期，用AAV-G陽處理的 G6PC缺陷小鼠（GSD-Ia的模型）表現(xiàn)出肝G6PC缺陷的完全正常化，如通過正常的血糖、血代 謝物、肝糖原和肝脂肪水平證明的（參見實施例1和Yiu et al. ,Mol Ther 18:1076-1084， 2010)。另外，對AAV-G陽處理的G6pc-/-小鼠的長期研究表明，AAV-G陽介導(dǎo)的基因療法在小 鼠中有效至少70-90周，表達了大于3%的肝G6化se-a。特別地，AAV-GTO處理的小鼠表現(xiàn)出 正常的肝脂肪膽積、正常的血代謝物和葡糖耐量譜，降低的空腹血膜島素水平，并且沒有肝 異常（如肝細胞腺瘤）的跡象（參見實施例2和Lee et al.，Hepatology56:1719-1729， 2012)。
[0109] 本公開內(nèi)容還發(fā)現(xiàn)，G6PC啟動子的上游增強子元件對于GSD-Ia動物模型中的最佳 G6PC表達是關(guān)鍵的。特別地，證明與僅包含383bp的最小G6PC啟動子/增強子的表達G6化se- a的重組AAV相比，利用在核巧酸-2684至-U相對于G6PC起始位點）包含G6PC啟動子/增強子 的AAV-G陽的治療在GSD-Ia小鼠模型中產(chǎn)生了顯著更高的肝G6化se-a表達水平，實現(xiàn)了更 大的肝糖原積累的降低，并且導(dǎo)致了更好的空腹耐量（參見實施例3和Lee et al. ,Mol Genet Me 1:ab. 110(3): 275-280,2013)。
[0110] 本公開內(nèi)容還發(fā)現(xiàn)，存在于G6PC啟動子/增強子和內(nèi)含子之間W及內(nèi)含子和G6PC 編碼序列之間的填充核巧酸序列對于G6化se-a的肝轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達很重要。特別地，由缺少填 充序列的質(zhì)粒UF11-K29-G6PC(SEQ ID腸：2)產(chǎn)生的重組44￥表現(xiàn)出7.：3加 1〇1/111111/111邑的 G6化Se活性。相比之下，由質(zhì)粒UF11-GPE-G6PC(SEQ ID N0:1)產(chǎn)生的重組AAV表現(xiàn)出 33.0nmol/min/mg的G6化Se活性(參見實施例4)。本公開內(nèi)容提供了存在于本文中由SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:3給出的AAV載體中的填充序列的第一次描述。
[0111] 另外，本文公開的數(shù)據(jù)證明，G6PC編碼序列的密碼子優(yōu)化使翻譯效率提高約1.5至 2.5倍，導(dǎo)致與編碼野生型G6PC的AAV-G陽的給藥相比，在AAV-CO-GPE(包含密碼子優(yōu)化的 G6PC核酸序列）給藥后肝臟中顯著更高的G6化se-a表達(參見實施例5)。
[0112] 總之，運些結(jié)果表明，包含位于核巧酸-2684至-1的G6PC啟動子/增強子、合成內(nèi)含 子、內(nèi)含子側(cè)翼的填充序列和G6PC編碼區(qū)（野生型或密碼子優(yōu)化）的重組AAV是有效的肝轉(zhuǎn) 基因表達和體內(nèi)GSD-Ia治療的關(guān)鍵特征。
[0113] 本文提供了重組核酸分子，其包含與SEQ ID NO: 1的核巧酸182-4441核巧酸或SEQ ID NO:3的核巧酸182-4441具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%或至少99%同一性的核巧酸序列。例如，核酸分子可W在G6PC編碼區(qū)中包含 核巧酸置換，例如用于密碼子優(yōu)化。又例如，G6PC編碼區(qū)可W是來自不同物種的G6PC，例如 犬G6PC或犬G6PC的密碼子優(yōu)化(用于在人中表達)形式。在一些實例中，由SEQ ID NO: 1的核 巧酸182-3045或者SEQ ID NO:3的核巧酸182-3045給出的G6PC編碼區(qū)被置換成犬G6PC編碼 序列（SEQ ID N0:9)?；蛘撸琒EQ ID N0:1或SEQ ID N0:3的人G6PC編碼區(qū)可W包含核巧酸置 換，所述核巧酸置換導(dǎo)致在犬和人G6PC蛋白序列之間不同的殘基處的編碼變化。例如，可W 引入核巧酸置換，導(dǎo)致人G6PC蛋白（SEQ ID N0:4)的殘基3、54、139、196、199、242、247、292、 298、301、318、324、332、347、349、350和/或353處的編碼變化。圖9示出了人和犬66化36-口蛋 白序列的比對，圖10提供了示出人、小鼠、大鼠和犬G6化se-a之間的氨基酸差異的表。本公 開內(nèi)容考慮了在圖10中所列的任何殘基處改變氨基酸序列的核巧酸置換。
[0114] 在其他情況下，核巧酸置換可W存在于填充序列或者合成內(nèi)含子序列中。核巧酸 置換還可能會被包含在載體序列中，例如3/ ITR下游（即3/ )，或者5/ ITR和GTO之間，或者 G6PC編碼區(qū)和^ITR之間的載體序列。在一些實施方案中，重組核酸分子包含SEQ ID NO: 1 的核巧酸182-4441或沈Q ID NO:3的核巧酸182-4441。運些重組核酸分子包含核巧酸-2684 至-I處的G6PC啟動子/增強子序列、合成內(nèi)含子、內(nèi)含子側(cè)翼的填充序列和G6PC編碼序列。 SEQ ID NO: 1包含野生型G6PC編碼區(qū)，而SEQ ID NO: 3包含密碼子優(yōu)化的G6PC編碼序列。
[0115] 在一些實施方案中，重組核酸分子還包含y和5/ITR序列。因此，本文提供了重組 核酸分子，其包含與SEQ ID NO: 1的核巧酸17-4819或者SEQ ID NO:3的核巧酸17-4819具有 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一 性的核巧酸序列。在一些實施方案中，重組核酸分子包含SEQ ID NO: 1的核巧酸17-4819或 者SEQ ID NO: 3的核巧酸17-4819。在一些特定的非限制性實例中，重組核酸分子包含SEQ ID NO: 1的完整序列（用于產(chǎn)生AAV-GPE的UFll-G陽-G6PC質(zhì)粒)或者沈Q ID N0:3的完整序 列（用于產(chǎn)生密碼子優(yōu)化的AAV-CO-GPE的UFl I-G陽-CO-G6PC質(zhì)粒）。在其他實例中，重組核 酸分子包含與沈Q ID NO: 1或SEQ ID N0:3具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、 至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的核巧酸序列。
[0116] 在其他實施方案中，本文提供了重組核酸分子，其包含與SEQ ID N0:2的核巧酸 182-4275具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或 至少99%同一性的核巧酸序列。在一些實例中，重組核酸分子包含SEQ ID NO: 2的核巧酸 182-4275。在一些實例中，重組核酸分子包含與SEQ ID NO: 2的核巧酸17-4653具有至少 80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %同一性的 核巧酸序列。在一些實例中，重組核酸分子包含SEQ ID N0:2的核巧酸17-4653。在一些特定 的非限制性實例中，重組核酸分子包含SEQ ID N0:2的完整序列（缺少填充序列的UFll- K29-G6PC質(zhì)粒）。在其他實例中，重組核酸分子包含與SEQ ID NO: 2具有至少80%、至少 85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98%或至少99%同一性的核巧酸序 列。
[0117] 本文還提供了包含本文公開的重組核酸分子的載體。在一些實施方案中，載體是 AAV載體。AAV血清型可W是任何適合于向受試者遞送轉(zhuǎn)基因的血清型。在一些實例中，AAV 載體是血清型SAAV(AAVS)。在其他實例中，AAV載體是血清型1、2、3、4、5、6、7、9、10、11或12 載體（即，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAV11 或AAV12)。也在其他 實例中，AAV載體是兩種或更多種AAV血清型的雜種(例如，但不限于AAV2/l、AAV2/7、AAV2/8 或AAV2/9)"AAV血清型的選擇部分取決于基因療法所祀向的細胞類型。對于GSD-Ia的治療， 肝和腎是相關(guān)的祀器官。
[0118] 本文還提供了包含本文公開的重組核酸分子或載體的分離的宿主細胞。例如，分 離的宿主細胞可W是適合于產(chǎn)生重組AAV(rAAV)的細胞(或細胞系）。在一些實例中，宿主細 胞是哺乳動物細胞，例如皿1(-293、8服、￥6'〇、畑、肌-1080、4549、(：〇3-7、41?陽-19或1亂-5細 胞。
[0119] 本文還提供了包含本文公開的重組核酸分子的rAAV。在一些實施方案中，rAAV是 rAAV8和/或rAAV2。但是，AAV血清型可W是任何其他合適的AAV血清型，例如AAV1、AAV2、 AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAV11 或AAV12,或者兩種或更多種AAV 血清型的 雜種（例如，但不限于44￥2/1、44￥2/7、44￥2/8或44￥2/9)。本公開內(nèi)容還提供了包含本文公 開的rAAV和可藥用載體的組合物。在一些實施方案中，組合物被配制為用于靜脈內(nèi)或肌給 藥。用于rAAV給藥的合適的藥物制劑可W在例如美國專利申請No. 2012/0219528中找到。
[0120] 本文還提供了治療被診斷為患有糖原膽積病的受試者的方法，包括選擇患有GSD- Ia的受試者，W及給予所述受試者治療有效量的本文公開的rAAV(或者包含rAAV的組合 物）。在一些實施方案中，rAAV通過靜脈內(nèi)給予。
[0121 ] 在一些實施方案中，W約1 X 1〇11至約1 X 1〇14病毒顆粒(VP)Ag的劑量給予rAAV。 在一些實例中，W約1 X 1〇12至約8 X l〇i3vp/kg的劑量給予rAAV。在其他實例中，W約1 X l〇u 至約6X l〇i3vp/kg的劑量給予rAAV。在一些特定的非限制性實例中，W至少約1 X 1〇11、至少 約5 X 1〇11、至少約1 X 1〇12、至少約5 X 1〇12、至少約1 X 1〇13、至少約5 X 1〇13或至少約1 X l〇i4vp/kg的劑量給予rAAV。在其他非限制性實例中，W不大于約5 X 1〇11、不大于約1 X 1〇12、 不大于約5 X 1〇12、不大于約1 X l〇u、不大于約5 X l〇u或不大于約1 X l〇i4vp/kg的劑量給予 rAAV。在一個非限制性實例中，W約1 X l〇i2vp/kg的劑量給予rAAV。根據(jù)所需治療結(jié)果的需 要，可WW單劑量或多劑量(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個劑量)給予rAAV。
[0122] IV.用于基因療法應(yīng)用的重組AAV
[0123] AAV屬于細小病毒(Parvoviridae)科和依賴病毒(Dependovirus)屬。AAV是小的無 包膜病毒，其包裝有線性單鏈DNA基因 。AAV DNA的正義鏈和反義鏈W相等的頻率被包裝在 AAV衣殼中。
[0124] AAV基因組W兩個開放閱讀框(ORF)側(cè)翼的兩個反向末端重復(fù)（ITR)為特征。在 AAV2基因中，例如，ITR的前125個核巧酸是回文結(jié)構(gòu)，其自折疊 W使堿基配對最大化并且形 成T型發(fā)夾結(jié)構(gòu)。ITR的另外20個堿基(稱為D序列)保持未配對。ITR是對于AAV DNA復(fù)制很重 要的順式作用序列；ITR是復(fù)制起點并且充當了通過DNA聚合酶的第二鏈合成的引物。該合 成過程中形成的雙鏈DNA(也成為復(fù)制形成單體)被用于第二輪的自引物復(fù)制并且形成復(fù)制 形成二聚體。通過鏈置換機制加工運些雙鏈中間產(chǎn)物，得到用于包裝的單鏈DNA和用于轉(zhuǎn)錄 的雙鏈DNA。位于ITR內(nèi)的是Rep結(jié)合元件和末端解離位點（terminal resolution site， TRS)。運些特征在AAV復(fù)制期間被病毒復(fù)制調(diào)節(jié)蛋白R邱利用來加工雙鏈中間產(chǎn)物。除了其 在AAV復(fù)制中的作用外，ITR還是AAV基因組包裝、轉(zhuǎn)錄、非許可條件下的負調(diào)控和位點特異 性整合所必需的（Daya and Berns，Clin Microbiol Rev21(4) :583-593,2008)。
[01巧]AAV左側(cè)的ORF包含R邱基因，其編碼四種蛋白質(zhì)：Rep78、Rep 68、Rep52和R邱40。右 偵化勺ORF包含Cap基因，其產(chǎn)生；種病毒衣殼蛋白（VPl、VP2和VP3) dAAV衣殼蛋白包含排列成 二十面體對稱的60個病毒衣殼蛋白。VPUVP2和VP3Wl:l:10摩爾比存在(Daya and Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583-593,2008)〇
[0126] AAV是目前基因療法中最常用的病毒之一。盡管AAV感染人和一些其他靈長類物 種，已知其不導(dǎo)致疾病并引起非常輕微的免疫應(yīng)答。利用AAV的基因療法載體可W感染分裂 細胞和靜止期細胞二者，并且保持為染色體外狀態(tài)而不整合到宿主細胞的基因組中。由于 AAV的有利特征，本公開內(nèi)容考慮了將AAV用于本文公開的重組核酸分子和方法。
[0127] AAV具有用于基因療法載體的多種所需特征，包括結(jié)合并且進入祀細胞、進入細胞 核的能力、在細胞核中表達較長時間的能力W及低毒性。但是AAV基因組的小尺寸限制了可 W整合的異源DNA的大小。為了使運個問題盡可能小，已經(jīng)構(gòu)建了不編碼Rep和整合效率元 件（I?。┑腁AV載體。保留了 ITR，因為它們是包裝所需的順式信號（Daya and Berns ,Clin Microbiol Rev 21(4):583-593,2008)〇
[0128] 產(chǎn)生適合于基因療法的rAAV的方法是本領(lǐng)域中已知的（參見，例如美國專利申請 No.2012/0100606;2012/0135515;2011/0229971;和2013/0072548;W及(ihosh et al.， Gene Ther 13(4) :321-329,2006),并且可W與本文公開的重組核酸分子和方法一起使用。
[0129] 本文提供了 W下實施例W說明某些特征和/或?qū)嵤┓桨?。運些實施例不應(yīng)解釋為 將本公開內(nèi)容限制于所述的特定特征或?qū)嵤┓桨浮?br>[0130] 實施例
[0131] 實施例1:使用基因療法使Ia型糖原膽積病的肝G6PC缺陷完全正常化
[0132] 本實施例描述了由兩種不同啟動子驅(qū)動的兩種表達G6化se-a的AAV載體在G6PC缺 陷小鼠中的肝基因遞送效率和G6化se-a表達的比較。結(jié)果證明，具有G6PC啟動子/增強子的 AAV載體(AAV-GPE)在指導(dǎo)持久的體內(nèi)肝轉(zhuǎn)基因表達方面比具有雞0-激動蛋白啟動子/CMV 增強子的AAV載體(AAV-CBA)更有效。另外，用AA V-G陽處理的G6PC缺陷小鼠表現(xiàn)出正常的血 糖、血代謝物、肝糖原和肝脂肪水平。
[0133] 材料和方法
[0134] pUFl I-G陽-G6PC的構(gòu)建和AAV載體的制備
[0135] 通過如下方式對pUFll-mG6化se-a-CBA(Ghosh et al. ,Gene Therl3:321-329, 2006)(其中，小鼠 G6化se-a是由CBA啟動子/CMV增強子驅(qū)動（Xu et al.，Hum Gene Ther 12:563-573，2001))進行改變來構(gòu)建包含處于人G6PC啟動子/增強子控制之下的人G6 ^se- 曰的UFl I-G陽-G6PC質(zhì)粒：通過)(hoI/S地I消化切割來自pUFl l-mG6化se-a-CBA的Hp-neo片 段，然后將剩余載體進行凝膠純化，用T4DNA聚合酶補平，然后自連接W產(chǎn)生pUFll- mG6 化36-日-〔84-[化9-1160]-/-。然后在5'-SbfI和3'-NotI位點將pUFll-mG6Pase-a-CBA- [l'kp-neo]-/-中的mG6Pase-a和CBA啟動子/CMV增強子替換成人G6化se-acDNA，產(chǎn)生pUFll- G6PC。然后用PCR克隆包含人G6PC啟動子/增強子的G6PC 5'側(cè)翼區(qū)的核巧酸-2864至-1 dPCR 模板是包含人G6PC基因的細菌人工染色體（Invitrogen Life Technologies ,Carlsbad, 〔八），引物對是15(5'-(：(：1'門646441'(^4〔66161'-3'；56〇10加：5)和245(5'- 〇：1'〔41'刊〇：刊66〔4〇：1'(：-3'；569 10^:6)，其分別在5'和3'端包含額外的牡11巧盼6曰1位 點。然后將包含G6PC啟動子/增強子的KpnI-XbaI片段連接到KpnI-XbaI線性化的pUFll- G6PC中，產(chǎn)生PUF11-G6PC-GPE-1。接下來，使用分別在5/和3/端包含額外的SpeI和SbfI位點 的弓 I 物對 3S(5'-AGGTAAGTATCAAGGTTACA-3' ；SEQ ID NO : 7 )和 4 A S ( 5 '- ACCTGTGGAGAGAAAGGCAA-3';沈Q ID N0:8)來用PCR克隆來自pCI載體的（Promega，Madison, WI)的嵌合內(nèi)含子。然后將運種嵌合內(nèi)含子作為SpeI-Sbf I片段連接到SpeI-Sbf I線性化的 大PUF11-G6PC-GPE-I片段中，產(chǎn)生pUFll-G陽-G6PC(沈Q ID N0:1)。通過DNA測序確認所有 構(gòu)建體。
[0136] 分別使用pUF 11-G 陽-G6PC 和 pUF 11 -mG6I^s e-a -CBA 產(chǎn)生AAV-G 陽和AAV-CBA，并且 如之前所述產(chǎn)生、純化和滴定(Ghosh et al.，Gene Therl3:321-329,2006)。使用實時PCR 利用針對G6PC或CBA啟動子的引物和探針進行載體基因組定量。
[0137] 向G6pc-/-小鼠輸注AAV載體
[0138] 如之前所述對G6pc^^J、鼠給予葡萄糖療法，其由每12小時腹膜內(nèi)注射25-lOOiil 15%葡萄糖組成化ei et al. ,Nat Genet 13:203-209,1996)。使斷奶存活的小鼠不受限地 食用小鼠飼料(Zeigler &ros. ,Inc. ,Gardners,PA)。
[0139] 通過顛靜脈向2天齡的G6p(T/-小鼠輸注，W及通過眶后靜脈竇向2或4周齡的 66口。-/-小鼠輸注44￥載體。使用年齡匹配的66口(3+/76化(3+/-和4至6周齡的66口(3-/-小鼠作為對 照。對于病毒輸注的小鼠，在輸注后立即停止葡萄糖療法。
[0140] 12或14周齡的AAV-GPE輸注的G6pc-/-小鼠的葡糖耐量測試由采血前禁食6小時，然 后皮下注射0.25ml 10%右旋糖，并且每30分鐘通過尾靜脈重復(fù)采血(持續(xù)額外2小時）組 成。
[0141] 憐酸水解酶測定
[0142] 基本上如之前的描述進行微粒體分離和憐酸水解酶測定化ei et al化t Genet 13:203-209,1996)。將包含50mM pH 6.5的二甲神酸鹽緩沖液、IOmM G6P和適量的微粒體制 品的反應(yīng)混合物（IOOiU)在37°C下解育10分鐘。通過將完整膜在0.2%脫氧膽酸鹽中于(TC 下解育20分鐘來制備破壞的微粒體膜。通過將抑5的破壞的微粒體制品在37°C下預(yù)解育10 分鐘使酸性不穩(wěn)定的G6化se-a失活來評估非特異性憐酸酶活性。
[0143] 通過將10皿厚的肝臟組織切片于室溫下在包含40mM pH 6.5的Tris-馬來酸鹽、 IOmM G6P、300mM薦糖和3.6mM硝酸鉛的溶液中解育10分鐘來進行G6化se-a的酶組織化學(xué)分 析（TeutschJrog Histochem切tocheml4:1-92,1981)。捕獲的憐酸鉛在轉(zhuǎn)化成褐色硫化 鉛后可視化（Teutsch,Prog Histochem Cytochem 14:1-92,1981)。
[0144] 表型分析
[0145] 從尾靜脈采集血樣。使用獲自化ermo Electron!；LouiSVilie,CO)的試劑盒分析血 糖、總膽固醇和尿酸。使用獲自Sigma Dia即OStics(St Louis ,MO)的試劑盒測量甘油S醋， 通過來自Trinity BiotecMst. Louis ,MO)的試劑盒測量乳酸。
[0146] 對于蘇木精和曙紅化&E) W及油紅0染色，將肝臟切片保存在10%中性緩沖的福爾 馬林中，并且切成4-10微米厚度。使用Axioskop化Ius顯微鏡和AxioVision 4.5軟件(Carl ZeiSS，化ornwood，NY)使染色的切片可視化。對于脂質(zhì)積累的定量組織學(xué)測量，使用Adobe Photoshop CS3(Adobe System Inco;rporated,San Jose,CA)將油紅0染色轉(zhuǎn)變成像素密度 單位。
[0147] 為了確定肝糖原含量，用HCl使組織均質(zhì)化（煮沸10分鐘），并且用醋酸鋼中和到 4.5的最終抑(Teutsch,Prog Histochem 切tochem 14:1-92,1981)。然后將水解的組織用 淀粉-Q-I，4-a-l ,6-葡萄糖巧酶消化，并且使用獲自Sigma Diagnostics的試劑盒測量釋放 的葡萄糖。糖原含量報道為nmol糖基單元/mg肝蛋白。
[014引抗體測定
[0149]通過蛋白質(zhì)印跡分析測定針對人和小鼠 G6化se-a的抗體。通過12%聚丙締酷胺 SDS凝膠的電泳并且將印跡轉(zhuǎn)移到聚偏二氣乙締膜(Millipore，Be壯ord，M)上來解析來自 Ad-human G6F*ase-a或Ad-mouse G6F*ase-a感染的COS-I細胞（Ghosh et al.,J Biol 化em 277 :32837-32842,2002)的微粒體蛋白。將所述膜放在包含多通道的Multi screen Apparatus(Bio-Rad Laboratories,胎rcules ,CA)中。用1: 3000稀釋的兔抗人G6F*ase-a血 清Whosh et al. J Biol Chem 277:32837-32842,2002)或者 1:200稀釋的來自AAV-G陽輸 注的或AAV-CBA輸注的動物的血清樣品解育每個通道下的膜帶(membrane S化ip)。使用來 自未處理的G6pc-/-和G6pc+/7G6pc+/-同窩出生仔的血清樣品作為對照。在過夜解育后，然后 用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠 IgG(Kirkega;rrd&Pe;rry Laboratories ,Gaithersburg ,MD)鵬育膜帶 D通過使用來自 Pierce (Rockford，IL)的 SuperSignal? West Pico化學(xué)發(fā)光底物的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)使免疫復(fù)合物可視化。
[0150] CD8+淋己細胞免疫檢測
[0151] 將小鼠肝臟驟冷，包埋在0. C. T.(Sakura Finetek，Terrance，CA)中，并且切成8微 米厚度的切片。將切片在丙酬中于-20°C下固定10分鐘，干燥，用PBS洗涂，用含有2%BSA的 PBS封閉30分鐘，并且用溶于補充有1%BSA的PBS中的針對CD8的兔多克隆抗體（Abeam Inc.，Cambridge, MA)在4 °C解育過夜。用PBS洗涂后，將切片用與Alexa Fluor愈488 (Invitrogen)染料綴合的山羊抗大鼠 IgG抗體在黑暗中于25 °C下解育1小時。用PBS洗涂后， 用含有DAPI的抗稱色水基封固劑（Vector Laboratories ,Burlingame ,CA)固定標記的細 胞，并且使用Axioskop化Ius巧光顯微鏡Karl Zeiss,Hiornwood,NY)可視化。對200倍放大 率下的十個隨機選擇的視野中的CD8+細胞計數(shù)，并且報道為平均值。
[0152] 統(tǒng)計學(xué)分析
[0153] 使用GraphPadPrism嚴程序版本4(GraphPad Software,San Diego,CA)進行未配 對的t檢驗。p<0.05時認為值是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。
[0154] 結(jié)果
[0155] AAV-G陽輸注指導(dǎo)長期肝G6化se-a表達
[0156] 為了檢驗之前研究的人G6PC啟動子元件化oeberl et al. ,Mol化6'16:665-672， 2008)的核巧酸-298上游的序列的體內(nèi)影響，構(gòu)建了在人G6PC5'側(cè)翼區(qū)的核巧酸-2864至-1 的控制下表達人G6化se-a的AAV8載體AAV-GPE。由于沒有在小鼠中開始AAV介導(dǎo)的基因療法 的標準年齡（Ghosh et al.,Gene Ther 13 :321-329,2006 !Koeberl et al.,Gene Ther 13:1281-1289,2006;Koeberl et al.，Mol Ilier 16:665-672,2008)，并且有證據(jù)表明基因 轉(zhuǎn)移的效率和持久性的喪失受與肝臟生長有關(guān)的肝細胞增殖速率增加的影響(Cunnin曲am et al.，Mol Ther 16:1081-1088,2008)，在2天齡、2周齡或4周齡的S個不同年齡輸注 G6pc-/-小鼠，并且在24周齡時檢查肝G6化se-a表達。盡管年齡具有差異，但是每組小鼠用相 同劑量的AAV-GPEU.2Xl〇ii病毒基因組(Vg)/小鼠）輸注。在24周研究期間監(jiān)測輸注小鼠的 代謝譜，并且將所有測量值與其G6pc+/7G6pc+/-同窩出生仔和4至6周齡的未處理GSpc-/-小 鼠的結(jié)果相比較。GSD-Ia是常染色體隱性疾病，之前的研究表明G6pc+/+和G6pc+/-同窩出生 仔的表型與野生型不能區(qū)分化ei et al.，Nat Genetl3:203-209，1996)。
[0157] 無論輸注時年齡如何，在24周研究期間中，輸注的力物中沒有過早死亡。在 2天齡時輸注AAV-G陽（1.2 X l〇iiyg/小鼠，相當于6 X l〇i3vg/kg)的G6pc-/-小鼠中，2周齡時 的肝G6化se-a活性為對照活性的77.6%，在4周齡時降低至對照活性的16.2%，在6周齡時 降低至對照活性的6.5 % (表1)。但是，在6周W后，肝G6化se-a活性水平穩(wěn)定，直至24周（表 1)。因此，在整個24周的研究中，表達降低了 11.9倍，最大降低發(fā)生在前6周內(nèi)。
[015引相比之下，在2周齡時輸注AAV-G陽（1.2 Xioiiyg/小鼠，相當于1.5 XlQi3VgAg)的 G化C-/-小鼠中，輸注后2周時(4周齡時）的肝G6化se-a活性為其G6pc+/7G6pc+/-同窩出生仔 中的活性的2.4倍(表1)，達到433.4 + 11.1皿ol/mg/min。盡管4至6周齡之間肝G6化se-a活 性隨后確實經(jīng)歷2.6倍的降低（174.0 ± 22.4皿ol/mg/min)，但是其獲得在24周研究期間從6 周齡開始持續(xù)的接近正常的肝G6化se-a活性（174.0 ± 22.4nmol/mg/min)(表1)。同樣地，在 4周齡時輸注相同劑量（1.2X l0iiyg/小鼠，相當于1 X l0i3vg/kg)的AAV-GTO的G6pc-/-小鼠 中，肝G6I^se-a活性在24周齡時為335.6±40.2nmol/min/mg，是對照同窩出生仔中活性的 1.9倍（表1)。運些發(fā)現(xiàn)與之前提出的觀點（Cunnin曲am et al. ,Mol Ther 16:1081-1088， 2008)-致:基因轉(zhuǎn)移的效率和持久性的喪失受與肝臟生長有關(guān)的肝細胞增殖速率增加的 影響。在肝臟生長速率降低的發(fā)育晚期階段注射導(dǎo)致較少的基因表達喪失。
[0159] 研究了肝臟中G6化se-a轉(zhuǎn)基因表達的分布。如預(yù)期的，未處理的G6pc-/-小鼠的肝 臟切片中沒有可染色的G6化se-a活性。在G6PC+/7G帥C+/-小鼠中，酶組織學(xué)分析表明， G6化se-a分布在整個肝臟中，但是在接近血管的地方具有顯著更高的水平。
[0160] 在2天齡時輸注AAV-GTO的G6pc-/-小鼠中，在2周齡時肝G6化se-a活性分布在整個 肝臟中。不同于野生型小鼠，表達是不均勻的，具有比對照肝臟中染色更強的焦點（foci)。 染色的G6化se-a活性從2周齡至4周齡顯著降低，與憐酸水解酶活性4.8倍的降低一致(表 1)。再一次，染色的G6化Se活性降低并且在6周齡和更大時穩(wěn)定。
[0161] 在2或4周齡時輸注AAV-G陽的G6pc^^J、鼠中，酶組織化學(xué)分析再次表明，G6Pase-a 轉(zhuǎn)基因分布在整個肝臟中，具有含顯著更高酶活性水平的焦點。再一次，通過組織化學(xué)分析 評估的G6化se-a活性與定量憐酸水解酶測定一致(表1)。在2周齡時輸注AAV-GPE的G6pc-/- 小鼠中，肝臟中具有比野生型肝臟中的細胞染色更淺的細胞。因此，盡管表現(xiàn)出野生型 G6化se-a活性，但是AAV-G陽輸注的小鼠中并沒有恢復(fù)正常的肝G6化se-a表達模式。
[0162] 表1.輸注1.2X IQiiyg/小鼠的AAV-GPE的G6pc-/-小鼠中的肝G6I^se活性 [01A31
[i
[0165] 如材料和方法部分中所述，在2天齡、2周齡或4周齡時向G6pc-/-(-/-)小鼠輸注1.2 X IQiiyg/小鼠的AAV-GPE。使用年齡匹配的G6pc+/7G6pc+/^+/+&+/-)小鼠作為陽性對照，使 用4至6周齡的G6pc-/-(-/-)小鼠作為陰性對照。已經(jīng)通過從各結(jié)果中減去未處理的G6pc-/- 小鼠肝微粒體中的G6化se-a活性（1.8 ± 0.2nmo 1/min/mg)對表中的值進行了背景校正。數(shù) 據(jù)表示為平均值±561。
[0166] AAV-CBA輸注指導(dǎo)較低水平的肝G6I^se-a表達
[0167] CBA啟動子/CMV增強子已經(jīng)被廣泛用于指導(dǎo)高水平的肝轉(zhuǎn)基因表達(Xu et al.， Hum Gene Ilier 12:563-573,2001)。但是，已知CMV增強子被廣泛的CpG和非CpG甲基化沉默 (brooks et al.,J Gene Med 6:395-404,2004;Meh1:a et al.,Gene 428:20-24,2009)。之 前使用在雜種CBA啟動子/CMV增強子的控制下表達鼠 G6化se-a的AAV8載體AA V-CBA的體內(nèi) 實驗表現(xiàn)出了差的表達(Ghosh et al. ,Gene Ilier 13:321-329,2006)，運可能與CMV啟動 子的甲基化有關(guān)。為了比較AAV-CBA和AAV-GPE之間的體內(nèi)肝臟基因轉(zhuǎn)移效率，W與AAV-GPE 實驗中類似的方式向G6pc^^J、鼠輸注4.8 X IQiiyg/小鼠的增加劑量的AAV-CBA(在2天齡和2 周齡時），并且追蹤至24周齡。
[0168] 對于在2天齡時輸注的G6pc-/-小鼠，AAV-CBA輸注的小鼠中2周齡時肝G6化se-a活 性為AAV-GPE輸注小鼠中的2.8倍(表1和2 )，反映了4倍高的AAV-CBA輸注劑量。但是，新生 AAV-CBA輸注的動物中的肝G6化se-a活性在4周齡時迅速降低到20.6± 1. Inmol/mg/min(表 2)，2周中降低18.6倍，相比之下AAV-GTO輸注的新生G6pc-/-小鼠中降低4.8倍(表1)。由于 CBA和GPE具有相同的載體背景，該發(fā)現(xiàn)表明CBA啟動子/CMV增強子在指導(dǎo)持續(xù)的體內(nèi)肝轉(zhuǎn) 基因表達方面的效率低于G6PC啟動子/增強子。
[0169] 在2周齡時輸注4.8X l〇iiyg/小鼠的AAV-CBA的G6pc-/-小鼠中，肝G6I^se-a活性在 4周齡時為236.9 ±64.7(表2)，其比在2周齡時輸注1.2 Xioiiyg/小鼠的AAV-GPE的4周齡 G6pc-/-小鼠（表1)低1.83倍。另外，使用CBA載體的肝G6化se-a活性從6周齡時的55.7± 2.7皿ol/mg/min持續(xù)降低到24周齡時的38.1±1.7nmol/mg/min(表2)。運與使用G陽載體表 達的水平形成對比，后者在該時期內(nèi)穩(wěn)定在接近野生型的水平(表1).
[0170] AAV-CBA輸注的動物的酶組織化學(xué)分析表明活性染色與GPE載體的那些類似，具有 多個比對照肝臟中染色更強的焦點的不均勻分布。但是與定量憐酸水解酶測定(表2)-致， 總?cè)旧珡姸入S著輸注小鼠年齡的增加顯著降低。
[0171] 表2.輸注4.8 X IQiiyg/小鼠的AAV-CBA的G6pc-/-小鼠中的肝G6I^se活性
[01791
[0173] 如在材料和方法部分中所述，在2天齡和2周齡時向G6pc^^-/-)小鼠輸注4.8 X 1 Qiiyg/小鼠的AAV-CBA。使用年齡匹配的G6pc+/7G6pc+/- (+/+&+/-)小鼠作為陽性對照，使用 4至6周齡的G6pc-/-(-/-)小鼠作為陰性對照。已經(jīng)通過從各結(jié)果中減去未處理的G6pc-/-小 鼠肝微粒體中的G6化se-a活性（1.8±0.2皿ol/min/mg)對表中的值進行了背景校正。數(shù)據(jù) 表示為平均值±SEM。
[0174] AAV-G陽輸注糾正了 GSD-Ia的病理性臨床表現(xiàn)
[0175] 接受葡萄糖療法的G6pc-/-小鼠生長遲緩，并且在2周齡時平均體重為其G6PC+/7 G6pc+/-同窩出生仔的約 60% 化 ei et al.，化 t Genet 13:203-209,1996)。輸注 AAV-G 陽的 新生GSpc-/-小鼠具有顯著提高的生長速率，并且輸注動物的體重與對照小鼠相當（圖1)。在 2或4周齡時輸注AAV-GPE的G6pc-/-小鼠表現(xiàn)出與其G6pc+/7G6pc+/-同窩出生仔平行但是更 低值的生長曲線，與開始基因療法之前GSpc-/-小鼠更低的初始體重一致(圖1A)。
[0176] 在葡萄糖療法下，G6pc^^J、鼠持續(xù)表現(xiàn)出低血糖、高膽固醇血癥、高甘油S脂血 癥、高尿酸血癥和乳酸血癥化ei et al.，Nat Genet 13:203-209，1996;Kim et al.，J 胎patol 48:479-485,2008)。相比之下，AAV-GTO輸注的G6pc-/-小鼠具有正常血糖譜（圖 1B)，輸注的動物中沒有出現(xiàn)未處理的G6pc-/-小鼠化ei et al.，化t Genet 13:203-209， 1996)和人GSD-Ia患者(化OU et al. ,Curr Mol Med 2:121-143,2002)中常見的頻繁的低 血糖癒痛化ypoglycemic seizure)。新生輸注的G6pc-/-小鼠的血糖水平比其對照同窩出生 仔顯著更低（圖1B)，表明肝G6化se-a活性恢復(fù)到對照水平的6.5%不足W維持正常血糖譜。 相比之下，在2或4周齡時輸注AAV-GPE的G6pc^^J、鼠中的血糖水平與其對照同窩出生仔中 的血糖水平?jīng)]有差別（圖IB) "AAV-GPE輸注還使血清膽固醇、甘油S醋、尿酸和乳酸水平正 ?；切律斪⒌腉Spc-/-小鼠具有稍高的血膽固醇和乳酸水平(圖1B)。
[0177] 肝腫大是GSD-Ia的另一個臨床表現(xiàn)，并且主要由過量的糖原和脂質(zhì)沉積造成 (Chou et al. ,Curr Mol Med 2:121-143,2002)。在24周齡的未受影響的和AAV-G陽轉(zhuǎn)導(dǎo)的 小鼠的肝臟組織切片中沒有觀察到組織學(xué)異常。24周齡G6pc+/7G6pc+/-小鼠的肝臟中糖原 含量平均為1.89±0.17nmol糖基單元/mg蛋白質(zhì)。在新生AAV-GPE輸注的動物中，24周齡時 的糖原含量顯著更高，為4.65 + 0.19nmol糖基單元/mg蛋白質(zhì)，表明在GSD-Ia小鼠中觀察到 了糖原膽積缺陷。相比之下，在2或4周齡接受輸注的小鼠在24周齡時表現(xiàn)出野生型的糖原 水平，即分別為1.61 ± 0.39和1.65 ±0.19nmol糖基單元/mg蛋白質(zhì)，表明在該發(fā)育階段沒有 GSD-Ia疾病的典型組織學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0178] 油紅0染色表明，在24周齡時，AAV-G陽輸注的動物中的脂質(zhì)含量與G6pc+/7G6pc+/- 同窩出生仔中的脂質(zhì)含量類似。對于定量組織化學(xué)測量，使用Adobe Photoshop將利用油紅 0染色成像的脂質(zhì)轉(zhuǎn)化成像素密度單位。AAV-GPE處理的G6pc-/-小鼠的肝臟中的密度單位低 于對照小鼠中的那些密度單位(約150像素密度單位/V對比300像素密度單位/V)，但是差 異不是統(tǒng)計學(xué)上顯著的?？傊\些結(jié)果表明，AAV-G陽輸注的G6pc-/-小鼠沒有表現(xiàn)出組織 學(xué)異常并且在肝臟中具有正常糖原和脂肪含量。
[0179] AAV-GPE輸注的G6pc-/-小鼠表現(xiàn)出正?？崭蛊咸烟呛推咸悄土孔V
[0180] 分別檢查在2周齡和4周齡時輸注AA V-G陽的12和14周齡G6pc-/-小鼠中的空腹葡萄 糖水平。在6小時禁食后，G6pc+/VG6pc+/-小鼠中的血糖水平無變化。重要的是，在2或4周齡 時輸注AAV-GPE的G6pc-/-小鼠中的血糖水平在禁食6小時后也沒有變化，證明輸注的G6pc-/- 小鼠不再患有空腹低血糖，運是GSD-Ia的特征（化OU et al. ,Curr Mol Med 2:121-143， 2002)。使用未處理的GSpc-/-小鼠進行的類似禁食實驗獲得僅短時間禁食后的迅速低血糖， 然后是低血糖癒痛。
[0181 ] 研究表明，肝G6化se-a的過表達可能誘導(dǎo)糖尿病化iu et al. ,Biochem Bio地ys 民es Commun 205:680-686，1994;Antinozzi et al.,Annu Rev Nutr 19:511-544,1999; Clore et al. ,Diabetes 49:969-974,2000)。由于在4周齡時輸注AAV-G陽的24周齡G6pc-/- 小鼠的肝G6化se-a活性為其G6pc+/7G6pc+/-同窩出生仔中活性的近2倍，本發(fā)明人在4周齡 時輸注AAV-GTO的14周齡G6pc^^J、鼠中進行葡糖耐量測試。作為對照，還在2周齡時輸注 AAV-G陽的12周齡G6pc-/-小鼠中進行葡糖耐量測試。運些動物表現(xiàn)出野生型的肝G6化se-a 活性水平。輸注的GSpc-/-小鼠中的葡糖耐量譜與對照同窩出生仔無差別。
[0182] 不存在針對人G6化se-a的免疫應(yīng)答
[0183] 為了確定輸注的G6pc-/-小鼠中是否產(chǎn)生針對人G6化se-a的體液應(yīng)答，使用來自用 AAV-GPE或AAV-CBA輸注的小鼠的血清進行蛋白質(zhì)印跡分析。使用同樣識別鼠 G6化se-a的兔 抗人G6化se-a血清作為陽性對照。在任何存活至24周齡的AA V-G陽輸注的或AAV-CBA輸注的 G6pc-/-小鼠中均沒有檢出針對G6I^se-a的抗體。此外，在G6pc+/7G6pc+/-同窩出生仔或未處 理的G6pc-/-小鼠的血清中不存在針對G6化se-a的內(nèi)源抗體。
[0184] AAV-CBA輸注引起增加的肝CD8+淋己細胞浸潤
[0185] AA V-CBA輸注的G6pc-/-小鼠的肝臟中沒有可檢測的針對G6化se-a的抗體，表明細 胞介導(dǎo)的對于G6化se-a轉(zhuǎn)基因的免疫應(yīng)答不是運種載體指導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達迅速降低的原 因。另一種可能性是AAV-CBA載體引起的炎性免疫應(yīng)答。因此，在向G6pc^^J、鼠輸注AAV-CBA 或AAV-GPE后2周檢查肝CD8+淋己細胞浸潤。在2或4周齡的野生型或G6pc-/-小鼠中，肝CD8+ 淋己細胞計數(shù)很低。在2天齡時輸注AAV-CBA或AAV-GPE的G6pc-/-小鼠中，每種載體類型的2 周齡時的肝CD8+淋己細胞計數(shù)類似，并且與未處理的2周齡野生型或G6pc-/-動物中的計數(shù) 相當。在2周齡時輸注AAV-GPE的G6pc-/-小鼠中，肝CD8+淋己細胞計數(shù)在4周齡時依然很低。 相比之下，在2周齡時輸注AAV-CBA的G6pc-/-小鼠中，肝CD8+淋己細胞計數(shù)在4周齡時顯著增 加。結(jié)果表明，AAV-CBA引起的炎性應(yīng)答可W至少部分地解釋了 CBA啟動子/CMV增強子指導(dǎo) 的肝G6化se-a表達的迅速降低和低效率。
[0186] 實施例2:使用基因療法預(yù)防肝細胞腺瘤W及糾正IA型糖原膽積病中的代謝異常
[0187] 本實施例描述了在長期研究中評估AAV-GPE載體的效力的研究。G6pc^^J、鼠中 AAV-G陽載體介導(dǎo)的基因療法在小鼠中有效至少70-90周，表達大于3%的野生型肝G6化se? ct 。結(jié)果證明 AAV-GPE 處理的小鼠表現(xiàn)出正常的肝脂肪膽積，正常血代謝物和葡糖耐量譜，降 低的空腹血膜島素水平，并且沒有肝異常的跡象。
[0188] 材料和方法
[0189] 向G6pc-/-小鼠輸注AAV-G陽
[0190] 通過眶后靜脈竇將AAV-GTO載體（如實施例1中所述，Yiu et al. ,Mol Ther 18: 1076-1084,2010)輸注到G6pc-/-小鼠中化ei et al.，化t Genet 13:203-209,1996)。使用 年齡匹配的G6pc+/VG6pc+/-和6至10周齡的G6pc-/-小鼠作為對照。對于病毒輸注的小鼠，在 輸注后立即停止葡萄糖治療化ei et al. ,Nat Genet 13:203-209,1996)。
[0191] 小鼠的葡糖耐量測試由采血前禁食6小時，然后腹膜內(nèi)注射2mg/g體重的葡萄糖溶 液，并且重復(fù)通過尾靜脈采血2小時組成。
[0192] 憐酸水解酶和微粒體G6P攝取測定
[0193] 如之前的描述進行微粒體分離、憐酸水解酶測定、G6Pase-a的酶組織化學(xué)測定和 微粒體G6P攝取測定（Yiu et al.，Mol Ilier 18:1076-1084,2010;Lei et al.，化t Genet 13:203-209,1996)O
[0194] 表型分析
[01巧]首先通過使用Vevo 2100系統(tǒng)（ViSiialSoniCS ,Ontario ,Canada)的超聲波檢查小 鼠的肝結(jié)節(jié)化epatic nodule)并且從尾靜脈采集血樣。使用獲自化日；?。Electron 化ouisvilie ,CO)的試劑盒分析血糖、總膽固醇和尿酸；通過來自Sigma Dia即OStics(St Louis ,MO)的試劑盒分析甘油S醋；通過來自Trinity BiotecKst丄ouis,MO)的試劑盒分 析乳酸；W及通過來自化ystal化em(Downers Grove, IL)的超靈敏小鼠膜島素化ISA試劑 盒分析膜島素。如之前所述測量肝糖原含量(Yiu et al. ,Mol Ther 18:1076-1084,2010)。 為了確定肝甘油S醋、葡萄糖和G6P含量，將肝臟組織在RIPA緩沖液（50mM pH 8.0的化is 肥l、150mM 化Cl、l%lYiton X-100、0.5%脫氧膽酸鋼和0.1%SDS)(Thermo Scientific, Rockford, IL)中均質(zhì)化，并且使用來自Sigma Diagnostics的試劑盒測量甘油S醋，通過來 自11161'1]1〇616(3化〇]1的試劑盒測量葡萄糖，^及通過來自8；[0￥13；[0]1(1〇11]11日；[]1￥16*,〔4)的 試劑盒測量G6P。
[0196]對于蘇木精和曙紅（H&E) W 及油紅 0染色（Yiu et al. ,Mol TherlS :1076-1084, 2010)，將肝臟切片保存在10%中性緩沖的福爾馬林中并且切成4-10微米厚度。使用 Axioskop2plus顯微鏡W及AxioVision4.5軟件（Ca;rlZeiss,l'ho;rnwood,NY)使染色切片 可視化。
[0197]定量實時RT-PCR和抗體分析
[019引使用TRIzol?試劑（Invitrogen ,Carlsbad ,CA)從肝臟組織中分離總RNA。在使用 Applied Biosystems TaqMan探針的Applied Biosystems 7300實時PCR系統(tǒng)（Foster City,CA)中通過實時RT-PCR對mRNA表達進行定量。使用Applied Biosystems SDS vl.3軟 件分析數(shù)據(jù)并且歸一化到的敦動蛋白RNA。如之前所述通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測針對人 G6I^se-a的抗體（Yiu et al. ,Mol Ilier 18:1076-1084,2010)
[0199] 統(tǒng)計學(xué)分析
[0200] 使用GraphPad PHsm駁程序版本4(San Diego,CA)進行未配對t檢驗。P<0.05時認 為值是統(tǒng)計學(xué)顯著的。
[0201 ]結(jié)果
[0202] AAV-G陽輸注指導(dǎo)長期肝G6化se-a表達
[0203] 向2或4周齡的G6pc-/-小鼠（n= 18)輸注不同劑量的AAV-G陽（5 X 10"至3 X 10"病 毒顆粒(vpVkg)，所述劑量預(yù)期恢復(fù)并且維持3%至100%的野生型肝G6化se-a活性。還輸 注了一只15周齡(5Xl〇i2vp/kg)和一只30周齡（lXl〇i3vp/kg)G6pc^^J、鼠。接受葡萄糖療 法的GSD-Ia小鼠的低存活率嚴重限制了可用于研究的成年小鼠的數(shù)目化ei et al. ,Nat Genet 13:203-209，1996)。監(jiān)測20只輸注動物的代謝和組織學(xué)譜70至90周，并且將所有測 量結(jié)果與其G6pc+/+和G6pc+/-同窩出生仔相比較。G化C+/+和G6pc+/-小鼠的表型與野生型無差 別(Xei et al.,Nat Genet 13:203-209,1996)。
[0204] 沒有過早死亡的AAV-GTO處理的G6pc-/-小鼠。在24小時禁食后處死的小鼠中評估 肝G6化se-a活性和糖原含量。70至90周齡的野生型小鼠（n = 20)的平均空腹肝G6化se-a活 性為185.8+ 12.7nmol/mg/min(圖2A)。如計劃的，經(jīng)處理的小鼠中恢復(fù)了一定范圍的肝 G6化se-a活性。在20只AA V-G陽處理的在70至90周齡處死的G6pc-/-小鼠中，6只小鼠具有低 水平（野生型活性的3%至9%)的肝G6化se-a活性并且稱為AAV-L，9只小鼠具有中等水平 (野生型活性的22%至63%)的肝G6化se-a活性并且稱為AAV-M，5只小鼠具有高水平(野生 型活性的81 %至128%)的肝G6化se-a活性并且稱為AAV-H(圖2A)。實時RT-PCR分析表示出 了肝G6化se-amRNA表達和G6化se-a活性之間的線性關(guān)系（圖2B)。
[0205] 酶組織化學(xué)分析表明，野生型小鼠中的G6化se-a分布在整個肝臟中，在接近血管 的地方具有顯著更高的水平。在未處理的小鼠G6pc-/-的肝臟切片中，沒有可染色的G6化se- a活性。在AAV-G陽處理的G6pc^^J、鼠中，G6Pase-a也分布在整個肝臟中，但是具有含顯著更 高水平酶活性的焦點，并且與血管無關(guān)。AAV-GPE處理的G6pc-/-小鼠中肝G6化se-a的不均勻 分布表明相當大比例的肝細胞具有低的或者幾乎沒有G6化se-a，包括表達野生型G6化se-a 活性的81-128%的AAV-H肝臟。不均勻的肝G6化se-a表達不是GSD-Ia表型營救所需的。
[0206] AAV-G陽輸注糾正GSD-Ia中的代謝異常
[0207] GSD-Ia W低血糖、高膽固醇血癥、高甘油S脂血癥、高尿酸血癥和乳酸血癥為特征 (Xei et al.,Nat Genet 13:203-209,1996;Kim et al.,J Hepatol 48:479-485,2008)。 表達野生型肝G6化se-a活性的AAV-H小鼠中的血糖水平與對照同窩出生仔中的那些血糖水 平無差別（圖3A)。分別表達22-63 %和3-9 %的正常肝G6I^se-a活性的AAV-M和AAV-L的也保 持了血糖正常（~lOOmg/dl)狀態(tài)（Yoshizawa et al.，J Clin Invest 119:2807-2817， 2009)，但是其血糖水平始終低于對照同窩出生仔（圖3A)。所有AAV-GPE處理的G6p(T/-小鼠 表現(xiàn)出正常的膽固醇和甘油S醋的血清譜，而經(jīng)處理的GSpc-/-小鼠中的尿酸和乳酸血清水 平低于對照同窩出生仔中的那些尿酸和乳酸血清水平（圖3A)。
[020引 70至90周齡的雌性和雄性AAV-G陽處理小鼠的平均體重分別為其年齡和性別匹配 的對照小鼠中的70%和62% (圖3B)。但是經(jīng)處理的G6pc-/-小鼠的平均體長為對照的90% (圖3B)。因此，AAV-GPE處理的G6pc-/-小鼠的體重指數(shù)(BMI)值（B址ary et al.，Proc化tl Acad Sci USA87:8642-8646，1990)顯著低于對照同窩出生仔中的那些BMI值（圖3B)。盡管 兩組小鼠的BMI值表明為正常生長（Bahary et al. ,Proc r^tlAcadSciUSA 87:8642- 8646,1990)，但是AAV-GPE處理的G6pc-/-小鼠相當瘦。野生型小鼠的肝重量相對恒定（圖 3C)。在AAV-G陽輸注的小鼠中，肝重量與恢復(fù)的肝G6化se-a活性逆相關(guān)（圖3C)。當肝重量表 示為體重的百分比時，AAV-GPE處理的GSpc-/-小鼠具有顯著更高的值，因為其體重較低。但 是，當直接比較絕對肝重量時，AAV-M、AAV-H和對照同窩出生仔之間沒有顯著差異（圖3C)。 但是，AAV-L小鼠持續(xù)表現(xiàn)出肝腫大。AAV-G陽向腎遞送很少或不遞送轉(zhuǎn)基因（Yiu et al.， Mol Ther 18:1076-1084，2010)。但是，表達更高G6化se-a活性的輸注小鼠具有更低腎重 量，表明好的肝代謝控制使腎肥大正常化。
[0209] AAV-G陽輸注的G6pc-/-的肝臟中不存在組織異常、脂肪變性或HCA
[0210] 為了確定AAV-GPE處理的G6pc^^h鼠中HCA結(jié)節(jié)的存在，每個肝臟使用5個或更多 個獨立切片進行超聲分析，然后進行廣泛的肝臟檢查和肝活檢樣品的組織學(xué)分析。在存活 至70-90周齡的野生型(n = 20)和44￥-6陽轉(zhuǎn)導(dǎo)的66口。-/-(11 = 20)小鼠中超聲和形態(tài)學(xué)分析 沒有檢出肝結(jié)節(jié)。在2或4周齡輸注的AAV-GPE處理的G6pc^^h鼠（n=18)除了增加的糖原膽 積外沒有表現(xiàn)出組織學(xué)異常。在15周齡輸注的84周齡小鼠（表達正常肝G6化se-a活性的 6%)表現(xiàn)出提高的糖原膽積并且在一個肝臟切片中具有一些壞死性病灶(foci)。盡管大部 分在30周齡輸注的90周齡小鼠的肝臟組織切片（表達正常肝G6化se-a活性的38%)其未表 現(xiàn)出組織學(xué)異常，但是一個肝臟切片確實具有許多壞死性病灶。因為壞死性病灶是6周齡或 更大的未處理的GSD-Ia小鼠中見到的典型肝病狀化im et al. J胎patol 48:479-485， 2008)，非常可能的是在15或30周齡的基因療法開始之前壞死性病灶已經(jīng)形成。
[02川已經(jīng)報道了肝特異性G6pc無效(null)小鼠的肝臟形成了具有顯著脂肪變性的肥A (Mutel et al. J Hepatol 54:529-537,2011)。盡管一些野生型小鼠具有提高的肝脂肪膽 積，但是在AAV-G陽處理的G6pc-/-小鼠的肝臟中幾乎沒有或沒有脂肪膽積。此外，AAV-GPE處 理的G6p(TM、鼠（n = 20)中的肝甘油S醋含量與野生型小鼠中的肝甘油S醋含量沒有統(tǒng)計 學(xué)差異。油紅0染色確認了 AAV-GPE處理動物(n = 20)中脂質(zhì)含量與對照動物中的脂質(zhì)含量 類似。
[0212] 已經(jīng)充分確認，環(huán)氧合酶-2(C0X-2)是在許多惡變前和惡性癌癥中（包括肥C)中過 表達的標志物(Wu,Cancer Treat Rev 32: 28-44,2006)。定量RT-PCR分析表明，AAV-GPE處 理的G6pc^^日對照同窩出生仔中表達類似的肝C0X-2信使水平。
[0213] AAV-GPE處理的G6pc-/-小鼠表現(xiàn)正?？崭蛊咸烟呛推咸悄土孔V
[0214] 開始禁食前野生型小鼠（n = 20)的平均血糖水平為165.0±3.0mg/dl(零時間），其 在禁食24小時后降低到113.3±6.5111旨/(11(圖44)。44￥-1和44￥-1小鼠的空腹血糖譜與對照 小鼠的空腹血糖譜平行，但是血糖水平始終較低（圖4A)，而AAV-H小鼠的空腹葡萄糖譜與對 照小鼠的空腹葡萄糖譜無區(qū)別。鮮明對比的是，未處理的GSpc-/-小鼠在禁食60至75分鐘內(nèi) 表現(xiàn)出顯著的低血糖（圖4B)，運是GSD-Ia的標志（化OU et al.,化t Rev Endocrinol 6: 676-688,2010)?？傊?，AAV-G陽處理的G6pc-/-小鼠不再患有GSD-Ia的空腹低血糖特征(Chou et al.,Nat Rev Elndocrinol 6:676-688,2010)。
[0215] AAV-M和AAV-H小鼠中的血糖耐量譜與野生型同窩出生仔的那些血糖耐量譜無區(qū) 另Ij(圖4C)。在AAV-L小鼠中，腹膜內(nèi)葡萄糖注射后，血糖水平W比野生型對照更快的速率降 低。
[0216] AAV-GPE處理的G6pc-/-小鼠中降低的空腹血膜島素水平
[0217] 膜島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)肝葡萄糖和脂質(zhì)代謝化eavens and Birnbaum,Crit Rev Biochem Mol Biol 46:200-215,2011)。禁食24小時后，70-90周齡的野生型(n = 20)和AAV- GPE處理的G6pc-/-小鼠（n = 20)中的血膜島素水平分別為1.84±0.29和0.56 ±0.09ng/ml (圖 5A)。二者均在正常范圍內(nèi)（de Luca et al. J Clin Invest 115::3484-3493,2005)，但 是AA V-G陽處理的G6pc-/-小鼠中的空腹血膜島素水平更接近正常平均值(de Luca et al.， J Clin Investl 15:3484-3493,2005)。盡管AAV-GPE處理的G6pc-/-小鼠中的空腹血膜島素 水平與恢復(fù)的肝G6化se-a不相關(guān)，但是野生型和經(jīng)處理的G6pc-/-小鼠中的膜島素水平與其 體重表現(xiàn)出線性關(guān)系（圖5A)。
[0218] 膜島素的轉(zhuǎn)錄效果是由固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白Ic(SREBP-Ic)介導(dǎo)化eavens and Birnbaum,Crit Rev Biochem Mol Biol 46:200-215,2011)。定量RT-PCR分析表明，禁食24 小時的AAV-GTO處理的G6pc-/-小鼠和對照小鼠表達了類似水平的肝SREBP-IC轉(zhuǎn)錄物（圖 5B)。葡萄糖激酶是葡萄糖感受器(Massa et al. ,IUBMB Life 63:1-6,2011)。當血膜島素 水平低時，如在禁食時，肝葡萄糖激酶活性降低（Massa et al. ,IUBMB Life 63:1-6， 2011)。如利用血膜島素所看到的，在禁食24小時后，AAV-GPE處理的G6pc-/-小鼠中的肝葡萄 糖激酶轉(zhuǎn)錄物顯著低于對照同窩出生仔中的肝葡萄糖激酶轉(zhuǎn)錄物（圖5C)。值得注意的是， 肝葡萄糖激酶mRNA的水平和空腹血膜島素的水平在野生型和AAV-G陽處理的G6p(T/-小鼠中 均表現(xiàn)出線性關(guān)系（圖5C)。
[0219] AAV-GPE輸注的G6pc-/-小鼠的肝臟中的葡萄糖穩(wěn)態(tài)
[0220] 禁食期間，通過在糖異生和糖原分解的最終步驟中由G6PT/G6Pase-a復(fù)合物使G6P 水解來在肝臟中產(chǎn)生內(nèi)源葡萄糖來維持血糖穩(wěn)態(tài)（化OU et al.Nat Rev Endocrinol 6: 676-688,2010)。缺少功能性66化36-〇的66口。-/-小鼠不能肝臟、腎或腸中產(chǎn)生內(nèi)源葡萄糖。 禁食24小時后，野生型小鼠（n = 20)中的肝游離葡萄糖水平為389±17nmol/mg蛋白質(zhì)，AAV- L(n = 6)、AAV-M(n = 9)和AAV-H(n = 5)小鼠中的肝游離葡萄糖水平分別為野生型小鼠中的 61 %、68 %和90 %。禁食AAV-L和AAV-M肝臟中的細胞內(nèi)G6P水平分別為野生型肝臟中細胞內(nèi) G6P水平的2.9倍和1.6倍，但是禁食AAV-H肝臟中的細胞內(nèi)G6P水平與野生型肝臟中的細胞 內(nèi)G6P水平在統(tǒng)計學(xué)上類似。
[0221] 肝G6P參與多種代謝途徑，包括細胞質(zhì)中的糖原合成、糖酵解、戊糖憐酸途徑W及 ER腔中的內(nèi)源葡萄糖產(chǎn)生。禁食24小時后，在小鼠中檢查參與上述途徑的多種關(guān)鍵酶的肝 表達。運些包括催化肝糖異生中的第一個關(guān)鍵步驟的胞質(zhì)憐酸締醇式丙酬酸激酶。6?0(- CKHanson and Reshef,BiocMmie 85:1199-1205,2003);將果糖-1,6-二憐酸轉(zhuǎn)化成果 糖-6憐酸的果糖-1,6-二憐酸酶（FBPase-I)化ers, J Inherit Metab Dis 13:395-410， 1990);在糖原分解和糖原合成中催化葡萄糖-6-P和葡萄糖-I-P的可逆轉(zhuǎn)化的葡萄糖憐酸 變位酶(PGMase)化ers,J Inherit Metab Dis 13:395-410,1990);通過將果糖-6-P轉(zhuǎn)化成 果糖-1，6-二憐酸來催化糖酵解中的不可逆限速步驟的憐酸果糖激酶1 (PFK-1)化ers，J Inherit Metab Dis 13:395-410,1990);通過將G6P轉(zhuǎn)化成6-憐酸葡糖酸內(nèi)醋來催化戊糖 憐酸途徑中的第一個反應(yīng)的G6P脫氨酶(G6PDH) (Wamelink et al. ,J Inherit Metab Dis 31:703-717,2008);?及將胞質(zhì)G6P轉(zhuǎn)運到ER腔中的G6PT(Chou et al.，Nat Rev Elndocrinol 6:676-688,2010)。
[0222] 定量實時RT-PCR分析表明，在禁食肝臟中，與對照相比，AAV-GTO處理的G6pc-/-小 鼠中陽PCK-C和PGMase轉(zhuǎn)錄物無變化，而FB化se-1轉(zhuǎn)錄物增力日。AAkUff臟中的PFK-I轉(zhuǎn)錄物 和G6PDH轉(zhuǎn)錄物二者均增加，但是在AAV-M和AAV-H肝臟中其依然與野生型肝臟中在統(tǒng)計學(xué) 上類似。不論所恢復(fù)的肝G6化se-a活性水平如何，AAV-GTO處理的G6pc-/-小鼠中的肝G6PT mRNA水平為野生型對照中的2.2倍。G6PT介導(dǎo)的肝微粒體G6P攝取活性是內(nèi)源葡萄糖產(chǎn)生中 的速度限制（Arion et al.，J Biol 化em251:6784-690,1976)，但是共同依賴于G6化se-a 活性化ei et al.，化t Genet 13:203-209,1996)。與野生型肝微粒體相比，由G6pc-/-小鼠 制備的肝微粒體（具有完整的G6PT)表現(xiàn)出顯著更低的G6P攝取活性化ei et al.，Nat Genet 13:203-209,1996)，如果通過基因轉(zhuǎn)移使G6化se-a活性恢復(fù)，其可W逆轉(zhuǎn)（Zingone et al. J Biol Chem 275:828-832,2000)。在AAV-L、AAV-M和AAV-H肝臟中，微粒體G6P攝取 活性分別為野生型活性的43%、50%和72%，反映了與肝游離葡萄糖水平平行的肝G6化se? ct 活性的增加 (圖 2A)。
[0223] 不存在針對人G6化se-a的免疫應(yīng)答
[0224] 為了確定在輸注的小鼠中是否產(chǎn)生針對人G6化se-a的體液應(yīng)答，使用從70-90周 齡的對照和AAV-GTO處理的GSpc-/-小鼠獲得的血清進行蛋白質(zhì)印跡分析。使用也識別鼠 G6化se-a的針對人G6I^se-a的單克隆抗體(Yiu et al. ,Mol Ilier 18:1076-1084,2010)作 為陽性對照。在任何存活到70至90周齡的AAV-G陽輸注的G6pc-/-小鼠或野生型對照小鼠中 均未檢出針對G6化S e-a的抗體。
[0225] 實施例3:G6PC啟動子的上游增強子元件對于Ia型糖原膽積病中的最佳 [0。6] G6PC表達是關(guān)鍵的
[0227]本實施例描述的研究進一步評估了 AAV-G陽載體的效力。AAV-G陽是包含2684bp的 G6PC啟動子/增強子的單鏈載體，將其與包含38化P的最小G6PC啟動子/增強子的雙鏈載體 AAV-miG陽相比較。本實施例中所述的結(jié)果表明與AAV-miG陽載體相比，AAV-G陽載體在GSD- Ia小鼠中指導(dǎo)了顯著更高水平的肝G6化se-a表達，取得了肝糖原積累的更大的降低，并且 獲得更好的空腹耐受性。
[022引材料和方法
[0229] 向G6pc-/-小鼠輸注rAAV載體
[0230] 所有G6pc-/-小鼠利用葡萄糖療法保持存活化ei et al. ,Nat.Genet. 13:203- 209，1996)。通過眶后靜脈竇將rAAV載體輸注到2周齡G6pc-/-小鼠中。使用年齡匹配的G6pc +/7G6pc+/-小鼠作為對照。對于rAAV載體輸注的小鼠，在輸注后立即終止葡萄糖療法。在2周 齡說PC-/-小鼠中進行所有病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)并且在12周齡時評估效力。
[0231 ] 憐酸水解酶測定
[0232] 基本上如之前所述，確定微粒體分離和憐酸水解酶測定（Le i et a 1 .， Nat. Genet. 13:203-209，1996)。對于憐酸水解酶測定，將包含50mM pH 6.5的二甲神酸鹽緩 沖液、1 OmM G6P和適量微粒體制品的反應(yīng)混合物（100山)在30°C下解育10分鐘。通過將完整 膜在0.2%脫氧膽酸鹽中于(TC下解育20分鐘來制備破壞的微粒體膜。通過將pH 5的破壞的 微粒體制品在37°C下預(yù)解育10分鐘使酸性不穩(wěn)定的G6化se-a失活來評估非特異性憐酸酶 活性。
[0233] 載體DNA和mRNA的定量
[0234] 使用Ge址lute? Mammalian Genomic DNA Miniprep Kits(Sigma-Aldrich,St Louis ,MO)分離來自小鼠組織的總DNA，使用TRIzol? ReagentQnvitrogen,Carlsbad,CA) 從小鼠組織分離總RNA。分別在使用App I i e d B i O S y S t ems Ta qMan探針的Applied Biosystems 7300實時PCR系統(tǒng)中（Applied Biosystems,Foster City,CA)通過PCR和實時 RT-PCR對載體基因組數(shù)目和mRNA表達進行定量。使用TaqMan探針組化00609178_ml (對于 G6PC)和Mm00607939_s 1 (對于0-激動蛋白）將人G6PC基因的數(shù)目歸一化至小鼠0-激動蛋白。 標準曲線中使用對應(yīng)于0.01至100拷貝的人G6PC基因的質(zhì)粒DNA。為了確定載體基因組拷貝 數(shù)，將樣品的Ct值與標準曲線比較。使用TaqMan膨探針組化00609178_ml (對于G6PC)和 Mm02601633_g 1 (對于化 119)將G6PC mRNA表達歸一化至化 119RNA。
[0235] 表型分析
[0236] 使用獲自!"Iiermo Electron(Lc)Uisville ,CO)的試劑盒分析血糖。如之前所述，測J 量肝糖原和憐酸S醋含量(參見實施例1和2, W及Yiu et al.，Mol. Ther. 18:1076-1084, 2010;Lee et al. ,Hepatology 56:1719-1729,2012)。為了確定肝甘油S醋，將肝臟組織在 RIPA緩沖液巧OmM pH 8.0的Tris HCl、150mM NaCl、l%Triton X-100、0.5%脫氧膽酸鋼和 0.1%SDS)(The;rmo Scientific,Rockford,IL)中均質(zhì)化，并且使用來自 Sigma Dia即ostics(St Louis,MO)的試劑盒測量甘油S醋。
[0237] 小鼠的葡糖耐量測試由采血前禁食6小時，然后腹膜內(nèi)注射2mg/g體重的葡萄糖溶 液，并且重復(fù)通過尾靜脈采血2小時組成。
[0238] 統(tǒng)計學(xué)分析
[0239] 使用GraphPadPrism敏程序版本4(GraphPad Software,San Diego,CA)進行未配 對的t檢驗。p<0.05時認為值是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。
[0240] 結(jié)果
[0241] rAAV-G陽處理的或rAAV-miG陽處理的說PC-/-小鼠中的肝G6Pase-a表達
[0242] 在處理的G6pc-/-小鼠中進行12周的研究W檢查rAAV-G陽(參見實施例1和Yiu et al.，Mol.Ther. 18:1076-1084,2010)和rAAV-miG陽化oeberl et al.，Mol.Ther. 16:665- 672,2008)載體的效力。每種載體在兩個不同研究中屯、使用兩個劑量，1 XlQi3病毒顆粒 (VP)Ag(高劑量)和2Xl〇i2vp/kg(低劑量），每組6只小鼠。兩個中屯、獲得了類似結(jié)果。盡管 轉(zhuǎn)導(dǎo)的G6pc-/-小鼠中的肝G6化se-a活性代表了兩個中屯、的組合數(shù)據(jù)，但是其他報道的數(shù) 據(jù)來自單個研究。研究表明，rAAV介導(dǎo)的肝基因轉(zhuǎn)移的效率和持久性在早期發(fā)育中較低，運 是因為與肝臟生長有關(guān)的快速肝細胞增殖速率，其稀釋了rAAV有效轉(zhuǎn)染的細胞的數(shù)目（Yiu et al. ,Mol .Hier. 18:1076-1084,2010;Cunnin曲am,Mol .Hier. 16:1081-1088,2008)。在本 研究中，當肝細胞增殖保持為高時，向2周齡G6pc-/-小鼠給予rAAV載體。結(jié)果，在12周齡時 檢查的肝G6化se-a表達顯著低于用相同載體劑量輸注的成年小鼠中看到的肝G6化se-a表 達。依然需要確定人疾病中的最佳介入時間。
[0243] 所有處理的G6pc-/-小鼠存活至12周齡，兩個中屯、均沒有過早死亡。在12周齡野生 型小鼠的肝臟中，微粒體G6F*ase-a活性為203.5 ± 10.3nmol/min/mg(n = 24)。在兩個中屯、獨 立確定的組合數(shù)據(jù)(每次處理n = 12)表明，在12周齡時，高劑量rAAV-G陽療法重建了約18 % 的野生型肝G6化se-a活性，其為rAAV-miG陽活性的3.5倍W上，而低劑量rAAV-G陽療法產(chǎn)生 的活性為rAAV-miG陽的3.6倍W上（圖6A)。肝G6化se-a活性與肝載體基因組拷貝數(shù)呈線性 關(guān)系增加，AAV-G陽處理的G6pc-/-小鼠（n = 6)中的拷貝數(shù)顯著高于rAAV-miGPE處理的小鼠 (n = 6)(圖 6A)。
[0244] rAAV-GPE 或 rAAV-miGPE 處理的 G6pc-/-小鼠的代謝譜
[0245] 所有rAAV-G陽和r AAV-miG陽處理的G6pc-/-小鼠表現(xiàn)出與其野生型同窩出生仔平 行的生長曲線，但是具有更低體重（圖6B)。不論載體或劑量水平如何，經(jīng)處理小鼠的體重指 數(shù)(BMI)值與野生型小鼠無區(qū)別（圖6C)。所有經(jīng)處理的G6pc-/-小鼠的血糖水平始終低于野 生型對照，但是依然高于正常范圍的下限（圖6D)，輸注的動物均不具有GSD-Ia的典型的頻 繁低血糖癒痛（Chou et al.,Curr.Mol.Med.2:121-143,2002;Chou et al.化t.Rev.Elndocrinol.6:676-688,2010;Lee et al.,Hepatology 56:1719-1729, 2012)0
[0246] 肝臟相對于體重的相對重量是對肝糖原和/或中性脂肪積累的一種量度(Chou et al.,Curr.Mol.Med.2:121-143,2002;Chou et al化t.Rev.Endocrinol.6:676-688, 2010)，其在所有4個經(jīng)處理的G6pc-/-小鼠組中均高于野生型小鼠，但是高劑量rAAV-G陽處 理的小鼠比其他組顯著更接近于正常（圖7A)。與此一致的是，rAAV-G陽和rAAV-miG陽處理 的G6pc-/-小鼠中的糖原含量顯著低于其野生型對照（圖7B)，較高載體劑量比較低載體劑 量更好地減少糖原，證明恢復(fù)更高的肝G6化se-a表達改善了肝腫大。但是，僅比較高劑量療 法時，rAAV-miG陽處理的小鼠具有的糖原比rAAV-GPE處理的小鼠多43%。盡管肝糖原持續(xù) 升高，但是在任何12周齡的rAAV處理的G6pc-/-小鼠的肝臟組織切片中均沒有觀察到組織 學(xué)異常。除了低劑量的rAAV-miG陽處理的小鼠W外，野生型和其他3組rAAV處理的G6pc-/- 小鼠之間的肝甘油=醋含量沒有統(tǒng)計學(xué)差異（圖7C)。
[0247] rAAV-G陽處理的和rAAV-miG陽處理的G6pc-/-小鼠中的空腹葡萄糖和葡糖耐量譜
[0248] 對于野生型小鼠（n = 24)，禁食前的平均血糖水平為172.2 ± 2.6mg/dl (零時間）， 其在禁食8小時后降低到134.6 ± 3.8mg/dl (圖8A)。高劑量療法的小鼠（每種處理n = 6)的空 腹血糖譜顯著好于低劑量療法的小鼠（每種處理n = 6)，但是即使在高劑量下，rAAV-GPE處 理的小鼠保持顯著更高的葡萄糖水平，其在禁食6小時內(nèi)穩(wěn)定至野生型水平，而rAAV-miGPE 處理的小鼠的穩(wěn)定期（plateau)更低，為野生型水平的60% (圖8A)。高劑量rAAV-GPE和 rAAV-miG陽處理的小鼠還可W維持24小時禁食，但是rAAV-G陽處理的小鼠中的空腹血糖水 平比rAAV-miGPE處理的小鼠中的空腹血糖水平顯著更高（圖8B)?？傊啾扔趓AAV-miGPE 處理的G6pc-/-小鼠，rAAV-GTO處理的G6pc-/-小鼠更接近于野生型并且更加能夠耐受禁 食。
[0249] 在腹膜內(nèi)葡萄糖注射后監(jiān)測經(jīng)處理的G6pc-/-小鼠（每種處理n = 6)的血糖耐量 譜?？偟膩碚f，所述譜平行于野生型小鼠（圖SC)，高劑量處理的小鼠的應(yīng)答比低劑量處理的 小鼠更好。
[0巧0] 通過定量PCR分析12周齡的高劑量rAAV-GTO處理的G6pc-/-小鼠中人G6PC轉(zhuǎn)基因 在肝臟、腎、腸、腦、睪丸和卵巢中的生物學(xué)分布(表1)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝臟中，載體基因組拷貝 數(shù)Aig DNA為94，440 ± 7，624(或者0.51 ±0.04載體拷貝/二倍體基因組）。在轉(zhuǎn)導(dǎo)的腎和腸 中，數(shù)目急劇降低，平均分別僅為肝拷貝數(shù)的2.57%和0.64%，表明rAAV8病毒不能有效轉(zhuǎn) 導(dǎo)腎和腸。腦和睪丸中的基因組拷貝數(shù)/yg DNA甚至更低，分別為肝拷貝數(shù)的0.12%和 0.02%。在卵巢中僅檢出了背景水平的人G6PC基因組。
[0251] 包含組織特異性啟動子/增強子元件的rAAV-GTO載體主要在肝臟、腎近端小管和 腸中表達（Chou et al.,Curr.Mol.Med.2:121-143,2002;Chou et al., Nat. Rev.化docrinol. 6:676-688，2010)。人G6PC轉(zhuǎn)錄物的定量實時RT-PCR分析示出了基因 組拷貝數(shù)和基因表達之間的相關(guān)性(表3)。在肝臟中，與化119轉(zhuǎn)錄物相比的人G6PC mRNA的 水平為0.62740±0.04445。如從基因拷貝數(shù)分析所預(yù)期的，腎僅表達肝人66口(：1111?論的 0.03%，在腸、腦、睪丸和卵巢中僅檢出了背景水平的人G6PC mRNA。
[0252] 表3.12周齡高劑量rAAV-G陽處理的G6pc-/-小鼠中人G6PC基因組分布和mRNA表達 「0巧31
[0254] 數(shù)據(jù)為平均值±SEM。不包含轉(zhuǎn)基因的野生型組織的值為肝臟、腎、腸、腦、睪丸和 卵巢的平均值±SEM。括號中的數(shù)值為肝臟值的％。
[02W]實施例4:具有和不具有填充序列的AAV載體的比較
[0256] 本實施例描述了 W下發(fā)現(xiàn):表達G6化se-a的AAV載體中內(nèi)含子側(cè)翼的填充核巧酸 序列對于有效肝轉(zhuǎn)導(dǎo)很重要。
[0257] 為了評估填充序列對G6化se-a的轉(zhuǎn)基因遞送和肝表達的貢獻，構(gòu)建了質(zhì)粒UFll- K29-G6PCdUF11-K29-G6PC(沈Q ID N0:2)與UFll-G陽-G6PC(沈Q ID N0:1)的區(qū)別在于缺少 內(nèi)含子周圍的填充序列。每種質(zhì)粒中的G6PC啟動子/增強子(GPE)和G6PC編碼序列相同。
[0258] 向G6pc-/-小鼠給予 1 X l〇i3vp/kg的重組AAV-K29-G6PC或重組AAV-G陽-G6PC。結(jié)果 表明與AAV-G陽-G6PC相比，AAV-K29-G6PC在GSD-Ia小鼠中表現(xiàn)出顯著降低的肝轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。 八八￥-1(29-66?(：轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝臟和44￥-6?6-66?(：轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝臟中的66化36活性分別為7.3和 33.0nmol/min/mg。運些結(jié)果證明，內(nèi)含子側(cè)翼的填充序列對于有效肝轉(zhuǎn)導(dǎo)很重要。
[0259] 實施例5:編碼密碼子優(yōu)化的G6PC的AAV載體的產(chǎn)生
[0260] 本實施例描述了含密碼子優(yōu)化的G6PC的AAV載體的構(gòu)建和表征。 惦61] UFll-G陽-CO-G6PC質(zhì)粒(包含密碼子優(yōu)化的G6PC;SEQ ID NO:3)來源于UFll-GW- G6PC質(zhì)粒(SEQ ID N0:1)，但是將AAV-G陽-G6PC中的野生型G6化Se編碼序列替換成了合成 的密碼子優(yōu)化的G6I^se(SEQ ID N0:3的核巧酸3368-4441)。
[0262] 轉(zhuǎn)錄物體內(nèi)表達測定表明，CO-G6化Se表現(xiàn)出的酶活性為野生型人G6化Se的1.9 倍。另外，在GSD-Ia小鼠中評估了兩個批次的重組AAV-GPE-CO-G6PC的體內(nèi)活性并且與重組 AAV-G陽-G6PC的活性相比較。第一批次的AAV-GPE-CO-G6PC在轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟方面的效率比AAV- GPE-G6PC高50%。第二批次的AAV-GPE-co-G6PC在轉(zhuǎn)導(dǎo)肝臟方面的效率比重組AAV-GPE- G6PC高2.5倍。
[0263] 運些結(jié)果證明，G6PC的密碼子優(yōu)化提高了表達G6化se-a的重組AAV的肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)能 力。
[0264] 實施例6:表達密碼子優(yōu)化的人G6化Se的重組AAV載體的效力的評估
[02化]本實施例描述了在GSD-Ia小鼠中比較rAAV8-G陽-G6Pase和rAAV8-G陽-CO-GSPase 介導(dǎo)的基因遞送的效力的研究。
[0%6] 使用2-3個獨立批次的兩種AAV載體比較GSD-Ia小鼠中的基因遞送的效力：1) rAAV8-G陽-G6Pase(在~3kb的人G6PC啟動子/增強子(G陽）指導(dǎo)下表達人G6I^se-a的rAAV8 載體；W及2)rAAV8-GPE-c〇-G6I^se (在G陽的指導(dǎo)下表達密碼子優(yōu)化的（CO)人G6化se-a的 rAAV8載體）。圖11中的結(jié)果表明，4周齡和12周齡的rAAV8-GPE-c〇-hG6化Se處理的GSD-Ia小 鼠中肝G6Pas e活性為通過r AAV8-G陽-G6Pas e載體恢復(fù)的各活性的1.9倍。
[0267]所有處理的GSD-Ia小鼠表現(xiàn)出正常的膽固醇、甘油S醋、尿酸和乳酸的血清譜W 及正常的肝脂肪水平。在rAAV輸注的小鼠中，肝重量與所恢復(fù)的肝G6化Se活性逆相關(guān)。與 r AAV-G陽-CO-G6化Se處理的小鼠相比，rAAV-G陽-G6Pase處理的小鼠表現(xiàn)出顯著更嚴重的 肝腫大（圖12)。
[0%引在功能上，12周齡時，rAAV8-G陽-CO-GSPase處理的GSD-Ia小鼠表現(xiàn)出正常的葡糖 耐量譜(圖13A)并且在24小時禁食中保持血糖正常（圖13B)。
[0269] 實施例7:使用基于AAV的基因療法治療人GSD-Ia
[0270] 本實施例描述了臨床上使用編碼的G6PC的AAV載體治療GSD-Ia的示例性方法。
[0271] 選擇診斷為患有GSD-Ia的患者進行治療。通常，患者為至少18歲，并且可能或不可 能已經(jīng)預(yù)暴露于免疫調(diào)節(jié)。向所述患者給予治療有效量的表達G6PC的重組AAV載體，例如本 文公開的AAV-GPE-G6PC或AAV-GPE-CO-G6PC。重組AAV可W靜脈內(nèi)給予。可W由醫(yī)生選擇合 適的治療劑量。在一些情況下，治療有效劑量為1 X 1〇11至約1 X 1〇14病毒顆粒(vpVkg，例如 約1 X l〇i2vp/kg。在大部分情況下，向所述患者給予單劑量。在不存在免疫調(diào)節(jié)的情況下，所 述患者可能僅耐受單次rAAV輸注。如果所述患者已經(jīng)預(yù)暴露于免疫調(diào)節(jié)，可W給予兩個或 更多個劑量?？蒞隨時間監(jiān)測受試者的健康W確定治療的有效性。
[0272] 考慮到可W應(yīng)用所公開的發(fā)明的原理的許多可能實施方案，應(yīng)認識到所舉例說明 的實施方案僅是本發(fā)明的優(yōu)選實例，并且不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。相反地，本發(fā)明范 圍由所附權(quán)利要求限定。因此，本發(fā)明人要求保護運些權(quán)利要求的范圍和精神內(nèi)的所有發(fā) 明。
【主權(quán)項】
1. 一種重組核酸分子，其包含SEQ ID NO :3的核苷酸182-4441或SEQ ID NO :1的核苷酸 182-4441〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組核酸分子，其包含SEQ ID N0:3的核苷酸17-4819或SEQ ID NO: 1 的核苷酸17-4819。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的重組核酸分子，其包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 1的核苷酸序列。4. 一種載體，其包含權(quán)利要求1至3中任一項所述的重組核酸分子。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其中所述載體是腺相關(guān)病毒(AAV)載體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，其中所述AAV載體是AAV血清型8 (AAV8)載體。7. -種分離的宿主細胞，其包含權(quán)利要求1至3中任一項所述的重組核酸分子，或者所 述權(quán)利要求4-6中任一項所述的載體。8. -種重組AAV(rAAV)，其包含權(quán)利要求1至3中任一項所述的重組核酸分子。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的rAAV，其中所述rAAV是rAAV8。10. -種組合物，其包含在可藥用載體中的權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的rAAV。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其被配制用于靜脈內(nèi)給藥。12. -種治療被診斷為患有糖原貯積病的受試者的方法，包括選擇患有Ia型糖原貯積 病(GSD-Ia)的受試者并且給予所述受試者治療有效量的權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的 r AAV，或者權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的組合物。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中靜脈內(nèi)給予所述rAAV。14. 根據(jù)權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的方法，其中以約I X IO11至約I X IO14病毒顆粒 (vp) /kg的劑量給予所述rAAV。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中以約I X IO12至約8 X 1013vp/kg的劑量給予所述 rAAV 〇16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中以約IX 1013至約6X1013vp/kg的劑量給予所述 rAAV 〇17. 根據(jù)權(quán)利要求12至16中任一項所述的方法，其中給予所述rAAV包括給予單次劑量 的rAAV〇18. 根據(jù)權(quán)利要求12至16中任一項所述的方法，其中給予所述rAAV包括給予多次劑量 的rAAV〇
【文檔編號】C12N15/86GK105934515SQ201480074046
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2014年11月25日
【發(fā)明人】J·J·周, B·J·伯恩
【申請人】美國政府(由衛(wèi)生和人類服務(wù)部的部長所代表), 佛羅里達大學(xué)研究基金會有限公司