蘆筍查爾酮合成酶基因及其編碼的蛋白與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供蘆筍查爾酮合成酶基因及其編碼的蛋白與應(yīng)用。蘆筍查爾酮合成酶基因AoCHS1的CDS序列如SEQ ID NO:1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本發(fā)明首次從蘆筍中克隆得到查爾酮合成酶基因AoCHS1，該基因?yàn)橹参镱慄S酮合成路徑中的關(guān)鍵基因之一，采用基因工程的方法，將基因AoCHS1轉(zhuǎn)化到目標(biāo)植株中，可促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株中總黃酮含量的增加，為今后利用基因工程技術(shù)改良植物品質(zhì)，獲得具有高抗氧化性的藥物或食物提供了重要的理論依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景和極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
蘆筍查爾酮合成酶基因及其編碼的蛋白與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及蘆筍查爾酮合成酶基因及其 編碼的蛋白與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物活性次生代謝產(chǎn)物是其代謝途徑中特有基因群的產(chǎn)物。隨著植物功能基因組 研究的廣泛深入，獨(dú)具特色又有廣闊應(yīng)用前景的植物次生代謝合成相關(guān)功能基因的研究逐 漸成為研究的熱點(diǎn)。類黃酮是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物之一，具有重要的抗氧化和清除 自由基的功能，對(duì)于提高人體免疫力具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在植物類黃酮生物合成途徑 中，查爾酮合成酶是第一個(gè)關(guān)鍵酶，又稱限速酶，它催化丙二酰CoA的3個(gè)乙酸基和β-香豆酰 CoA的1個(gè)乙酸基發(fā)生縮合反應(yīng)，產(chǎn)生查爾酮，形成類黃酮物質(zhì)的基本碳架結(jié)構(gòu)，查爾酮合成 酶是植物次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，對(duì)植物具有非常重要的生理意義。
[0003] 蘆輿(Asparagus officinalis L.)為天門冬科天門冬屬多年生草本植物，以嫩莖 供食，具有極高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值，富含黃酮、皂苷、天冬酰胺、硒和植物多糖等多種活性成 分，能抗腫瘤、抗氧化和降血脂，被譽(yù)為"蔬菜之王"、"世界十大名菜"之一（Jaiswal et al.，2014;Nishimura et al.，2013)。同時(shí)，蘆筍加工產(chǎn)業(yè)鏈長(zhǎng)，可生產(chǎn)出蘆筍抗癌藥、蘆筍 茶、酒和飲料等高附加值產(chǎn)品，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用開發(fā)前景廣闊。目前，我國(guó)蘆筍種植 及加工發(fā)展迅速，已成為世界第一大生產(chǎn)和出口國(guó)，種植面積超過(guò)95，000公頃，約占全球的 43% (陳光宇，2013;張?jiān)榔降龋?013)。
[0004] 目前，已從很多植物中克隆得到查爾酮合成酶基因（CHS)，如擬南芥、水稻、矮牽 牛、葡萄、大豆等。然而，蘆筍作為富含黃酮的重要保健蔬菜作物之一，目前未有任何與蘆 筍CHS基因及其編碼蛋白的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)于蘆筍CHS基因及其編碼的蛋白序列尚不清 楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供蘆筍查爾酮合成酶基因及其編碼的蛋白。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供蘆筍查爾酮合成酶基因在調(diào)控植物類黃酮生物合成中 的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明針對(duì)蘆筍中類黃酮活性物質(zhì)生物合成途徑基礎(chǔ)研究薄弱的現(xiàn)狀，首次克隆 得到蘆筍查爾酮合成酶基因 AoCHSl，并進(jìn)一步分析了該基因在促進(jìn)類黃酮生物合成中的作 用。
[0008] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)蘆筍的全基因組高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物(SEQ ID N0:3-4)，對(duì)蘆筍品種'井岡11Γ嫩莖樣品cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了蘆筍查爾酮合成酶 基因 AoCHSl的CDS序列(全長(zhǎng)1191bp)，基因 AoCHSl的CDS序列為：
[0009] i)SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列;或
[0010] ii)SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且 表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核昔酸序列;或
[0011] iii)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID N0:1所示序列雜交且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸 序列，所述嚴(yán)格條件為在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下雜交，并用該溶液洗膜;或
[0012] iv)與i)、ii)或m)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的 核苷酸序列。
[0013] 本發(fā)明還提供蘆筍查爾酮合成酶基因 AoCHSl編碼的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID N0:2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列。
[0014] 本發(fā)明還提供含有蘆筍查爾酮合成酶基因 AoCHSl的表達(dá)盒、載體、工程菌及轉(zhuǎn)基 因細(xì)胞系。
[0015] 攜帶有所述目的基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn) 化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中（Weissbach，1998,Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463頁(yè)；Geiserson和 Corey，1998，Plant Molecular Biology，2nd Edition)，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
[0016] 使用本發(fā)明的基因片段構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸的前端可 添加任意一種增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或者植株進(jìn)行鑒定 及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入具有抗性的抗生素標(biāo)記物(例如卡那霉素或潮 霉素等）。被轉(zhuǎn)化的宿主是包括煙草在內(nèi)的多種植物，培育不同黃酮含量的植物種類。
[0017] 本發(fā)明還提供蘆筍查爾酮合成酶基因 AoCHSl在調(diào)控植物類黃酮生物合成中的應(yīng) 用。
[0018] 本發(fā)明還提供蘆筍查爾酮合成酶基因 AoCHSl在提高轉(zhuǎn)基因植物總黃酮含量中的 應(yīng)用。
[0019] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，將基因 AoCHSl構(gòu)建到載體PCAMBIA2301上，用所 得重組載體轉(zhuǎn)化煙草，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。
[0020] 優(yōu)選地，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)化所用農(nóng)桿菌為EHA105。
[0021] 本發(fā)明進(jìn)一步提供利用上述基因工程技術(shù)獲得的改良植物（總黃酮含量增加)在 食品、保健品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明首次從蘆筍中克隆得到查爾酮合成酶基因 AoCHSl，該基因?yàn)橹参镱慄S酮合 成路徑中的關(guān)鍵基因之一，采用基因工程的方法，將基因 AoCHSl轉(zhuǎn)化到目標(biāo)植株中，可促進(jìn) 轉(zhuǎn)基因植株中總黃酮含量的增加，為今后利用基因工程技術(shù)改良植物品質(zhì)，獲得具有高抗 氧化性的藥物或食物提供了重要的理論依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景和極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中AoCHSl基因在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)量的檢測(cè)結(jié)果;其中圖1A 是煙草內(nèi)參基因 Actin的跑膠圖，1-7為7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，WT為對(duì)照野生型煙草，Μ為分子量大 ?。粓D1Β是轉(zhuǎn)AoCHS基因的跑膠圖，1-7為7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，Η 20為陰性對(duì)照，WT為對(duì)照野生型 煙草，Ρ為重組質(zhì)粒PCAMBIA2301-A〇CHS1，Μ為分子量大小。
[0024] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例4中總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0025] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中對(duì)照野生型煙草與轉(zhuǎn)化AoCHSl基因的煙草植株總黃酮含 量圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書建議的條件。 [0027] 實(shí)施例1 AoCHSl基因的克隆
[0028]通過(guò)前期對(duì)蘆筍新品種'井岡111'（JK111)的全基因組高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析， 設(shè)計(jì)特異引物P1正向引物：5 ' -ATGGCTGCAACATCAATG-3 '和P2反向引物：5'_ CTATATAGGCACACTGTGAAG-3'（SEQ ID N0:3-4)，采用常用的CTAB法（參照《植物基因工程》， 王關(guān)林，方宏筠主編）從蘆筍品種'井岡11Γ中提取嫩莖總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用上 述引物P1和P2從RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA中擴(kuò)增出如SEQ ID NO: 1所示的蘆筍查爾酮合成酶 基因 AoCHSl的CDS序列，基因 AoCHSl的CDS序列全長(zhǎng)1191bp。
[0029] 具體步驟如下：
[0030] (1)向離心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化銨）提取緩沖液[2 % (W/V)CTAB， NaCl 1.4mol/L，EDTA(乙二胺四乙酸）20mmol/L，Tris.HCl 100mmol/L，2%(W/V)PVP]和 10 % β-巰基乙醇，在水浴鍋中預(yù)熱；
[0031] (2)將蘆筍嫩莖用液氮冷卻研磨，加入提取液中，混勻，65°C水浴10分鐘；
[0032] (3)加入等體積的氯仿：異戊醇（體積比24:1)混合液，顛倒混勻，靜置10min，4°C 12000g離心 10min;
[0033] (4)取上清，重復(fù)步驟(3);
[0034] (5)取上清，加入終濃度為2mol/L的LiCl，冰浴10-12小時(shí)，11000rpm，4°C離心 15min，棄上清，用75%乙醇清洗沉淀兩次，溶于適量的DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水中待用； [0035] (6)從蘆筍品種'井岡111'中提取嫩莖總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自Thermo Fisher Scientif ic公司）將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，反應(yīng)條件為：65°C5min，42°C 50min,70〇C10min；
[0036] (7)利用上述引物P1和P2從RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA中擴(kuò)增出蘆筍查爾酮合成酶基 因 AoCHSl的CDS序列；
[0037] 反應(yīng)條件：94Γ 預(yù)變性 4111丨11;941€3〇86(3,551€3〇86(3,72。(：1.5111丨11，33個(gè)循環(huán) ；721€ 延伸10min。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物連入pMD18-T載體(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司），轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序，獲得所需的全長(zhǎng)基因。從陽(yáng)性克隆中提取攜帶 有基因 AoCHSl⑶S序列的質(zhì)粒，命名為pMD18-AoCHS質(zhì)粒。
[0038] 實(shí)施例2 AoCHSl基因超量表達(dá)載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化
[0039] 為了能更好地分析基因 AoCHSl的生物學(xué)功能，進(jìn)一步將該基因在煙草中實(shí)現(xiàn)超量 表達(dá)，從轉(zhuǎn)基因植株總黃酮含量的表型特征來(lái)驗(yàn)證基因 AoCHSl的生物學(xué)功能。具體步驟如 下：
[0040] 首先將實(shí)施例1中得到的pMD18-AoCHS質(zhì)粒用BamH I和Κηρ I雙酶切，回收目的片 段；同時(shí)，用同樣的方法酶切攜帶雙煙草花葉病毒啟動(dòng)子35S的遺傳轉(zhuǎn)化載體 PCAMBIA2301。酶切完畢，用包含AoCHSl基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA2301載體做連接 反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(菌株購(gòu)自寶生物工程大連有限公司）。通過(guò)酶切篩選陽(yáng)性克隆，獲 得重組載體，命名為pCAMBIA2301-AoCHSl。
[0041] 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入到煙草中，經(jīng)過(guò)侵染、共培養(yǎng)、篩選 同時(shí)具有卡那霉素抗性和潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化苗，再通過(guò)生根、練苗移栽等常規(guī)步驟(參照： J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著；黃培堂，王嘉璽等譯；分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三 版）；北京，科學(xué)出版社;2002版），得到轉(zhuǎn)基因植株。
[0042] 本實(shí)施例中使用的主要試劑和遺傳轉(zhuǎn)化方法如下：
[0043] (1)主要試劑
[0044]所用到的培養(yǎng)基配方和植物激素的縮寫表示如下：1/2MS，MS培養(yǎng)基的配制參照 Murashige T · and F · Skoog · Physiol .Plant, 1962,15: 473-497 公開的方法。6_BA( 6-BenzylaminoPurine，6_節(jié)氨基噪呤）；NAA(Naphthalene acetic acid，萘乙酸）；Kan (1^1^1115^;[11，卡那霉素）;06；1^(06；1^0丨31；[1116，頭孢霉素）。其中，卡那霉素和頭孢霉素米用0.25 μπι濾膜過(guò)濾方法滅菌，在上述除Kan和Cef成分以外的培養(yǎng)基經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌20min 后，待培養(yǎng)基冷卻至50_60°C時(shí)，在超凈工作臺(tái)上加入相應(yīng)的抗生素。
[0045] (2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化
[0046] 1)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
[0047]首先，在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的固體LB培養(yǎng)基（10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/ L氯化鈉 、Kan 100mg/L、瓊脂1.5g/L)上預(yù)培養(yǎng)攜帶有目的基因 AoCHSl的農(nóng)桿菌EHA105 48 小時(shí)，培養(yǎng)溫度28 °C;挑取預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌單菌落，接種于對(duì)應(yīng)抗性選擇的液體LB培養(yǎng)基 (10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化鈉 、Kan 100mg/L)中，于28°C200rpm搖床培養(yǎng)過(guò) 夜，至菌液濃度OD600值約為0.6。
[0048] 2)葉盤轉(zhuǎn)化法
[0049] a.剪取早花煙草無(wú)菌苗上部完全展開的幼嫩葉片，將葉片剪成1.5cm XI. 5cm大小 形狀，放入無(wú)菌燒杯中；
[0050] b.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的農(nóng)桿菌稀釋到0D6QQ約為0.8，倒入燒杯，浸潤(rùn)葉盤，間或振 蕩30min;
[0051] c.將步驟b中的葉片取出，轉(zhuǎn)移至滅好菌的濾紙上吸干;然后放置在共培養(yǎng)培養(yǎng)基 (共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方:MS培養(yǎng)基、6-BA 2 · 25mg/L、NAA 0 · 3mg/L、蔗糖30 · 0g/L和瓊脂8 · 0g/L， pH值6.0)上暗培養(yǎng)3天，培養(yǎng)溫度為28 °C ;
[0052] d. 3天后，將葉片轉(zhuǎn)入抗性篩選誘導(dǎo)培養(yǎng)基，光照和暗培養(yǎng)交替（光照強(qiáng)度1000-15001x，光照時(shí)間：16h/d，黑暗時(shí)間：8h/d)下培養(yǎng)，進(jìn)行Kan抗性芽的篩選分化，培養(yǎng)溫度為 28°C，約一個(gè)月在葉盤邊緣誘導(dǎo)出綠色芽點(diǎn)，約15天左右繼代一次；
[0053] e .抗性芽長(zhǎng)大后，從外植體上切下，轉(zhuǎn)入芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，在光照和暗培養(yǎng)交替（光 照強(qiáng)度1000-15001x，光照時(shí)間：16h/d，黑暗時(shí)間：8h/d)下培養(yǎng)，進(jìn)行Kan抗性苗的篩選，培 養(yǎng)溫度為28°C，約一個(gè)月后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，約15天繼代一次；
[0054] f.將篩選得到的抗性苗轉(zhuǎn)入如上所述的生根選擇培養(yǎng)基上（生根選擇培養(yǎng)基配 方:MS培養(yǎng)基、Kan 100mg/L、Cef 400mg/L、蔗糖30 · 0g/L和瓊脂8 · 0g/L，pH值6 · 0)使其生根， 在光照和暗培養(yǎng)交替(光照強(qiáng)度1000-15001x，光照時(shí)間：16h/d，黑暗時(shí)間：8h/d)下培養(yǎng)，培 養(yǎng)溫度為28 °C。
[0055] 3)移栽
[0056] 生根健壯后煉苗2天，洗掉轉(zhuǎn)基因煙草植株根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的 幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初一周內(nèi)保持水分濕潤(rùn)。
[0057]本實(shí)施例共獲得15個(gè)株系的PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒(或稱轉(zhuǎn)化質(zhì)粒） pCAMBIA2301-AoCHSl的T0代轉(zhuǎn)基因煙草。
[0058] 實(shí)施例3 AoCHSl基因轉(zhuǎn)基因 T0代在田間的RT-PCR檢測(cè)
[0059]為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因煙草總黃酮含量的改變是否與轉(zhuǎn)入的AoCHSl基因有關(guān)，采用RT-PCR方法對(duì)部分轉(zhuǎn)基因煙草植株中AoCHSl基因表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見圖1。具體步驟如下：
[0060] 采用TRIZ0L試劑(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司）從轉(zhuǎn)基因煙草1-7號(hào)株系中提取 植株的總RNA(提取方法參照TRIZ0L試劑說(shuō)明書操作），利用反轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司）將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，反應(yīng)條件為65°C5min，42°C50min，70°C 10min。先用報(bào)道的內(nèi)參基因 Actin對(duì)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行檢測(cè)和濃度調(diào)整，根據(jù)內(nèi)參基 因 Act in的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物P5正向引物(5 '-CTTGAAACAGCAAAGACCAGC-3 '）和P6反向引物 (5 ' -CATCCTATCAGCAATGCCCG-3 '），進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性4min; 94°C 30sec， 55￡€3〇86〇，72￡€3〇86〇，25個(gè)循環(huán);72°(：延伸1〇1^11。擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1八 所示，內(nèi)參基因 Actin在對(duì)照野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草植株中均能擴(kuò)出，并且亮度一致。然 后，根據(jù)AoCHSl基因的序列，利用引物P1和P2，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 41^11 ;941€3〇86(3,551€3〇86(3,72°(：1.5111丨11，33個(gè)循環(huán) ；72°(：延伸1〇1^11。擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝 膠電泳結(jié)果表明（圖1B )，7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系煙草內(nèi)均檢測(cè)到AoCHSl基因的表達(dá)。
[0061] 實(shí)施例4轉(zhuǎn)AoCHSl煙草植株總黃酮的提取及測(cè)定
[0062] (1)總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0063]選用蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品（經(jīng)測(cè)試蘆丁在510nm處有明顯的吸收峰）。精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品 50mg，其純度為91.7%(精確至0.00018)，用60%乙醇溶解，并40°(：水浴加熱，室溫下配成 50mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，待用。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.4，1.5，2.5，5，7.5，1 OmL分別置于50mL容量瓶中，加 10mL 30% 乙醇和0.7mL的5%NaN02搖勻，6min后，加入0.7mL的 10%Al(N03)3,6min后再加 入51111^的4%似0!1混勾，用30%乙醇定容至5〇1111^，30~40°(^水浴中顯色3〇111；[11，在510111]1處測(cè)定 吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(單位mg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 (表1，圖2)。
[0064]表1總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
[0066] (2)樣品的制備及總黃酮的測(cè)定
[0067] 根據(jù)RT-PCR結(jié)果，選擇對(duì)轉(zhuǎn)基因植株AoCHS-3、AoCHS-6、AoCHS-7的總黃酮進(jìn)行提 取和測(cè)定，具體方法如下:煙草葉60°C過(guò)夜烘干，研磨成粉末。精密稱取樣品粉末0.4g，置于 大試管中，加入5mL30%乙醇，于70°C下超聲振蕩0.5h后，離心機(jī)離心15min(4500r/min)，過(guò) 濾至10mL的容量瓶中，用30%乙醇溶液定容至10mL，將10mL過(guò)濾液移至50mL的容量瓶中，加 入0 · 7mL的 5 % NaN02搖勻，6min后加入0 · 7mL的 10 % A1 (N〇3) 3，6min后再加入 5mL的 4 % NaOH 混 勻，用30%乙醇定容至50mL，30~40°C水浴中顯色30min，在510nm處測(cè)定吸光值，結(jié)果如圖3 所示。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株AoCHS-3、AoCHS-6和AoCHS-7的總黃酮含量比對(duì)照野生型煙草 (WT)有大幅提尚。
[0068] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。 [00 69] 參考文獻(xiàn)
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 蘆筍查爾酮合成酶基因 AoCHSl，其特征在于，基因 AoCHSl的⑶S序列為： i) SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；或 ii) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá) 相同功能蛋白質(zhì)的核昔酸序列;或 iii) 在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 1所示序列雜交且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序 列，所述嚴(yán)格條件為在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下 雜交，并用該溶液洗膜;或 iv) 與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷 酸序列。2. 蘆筍查爾酮合成酶基因 AoCHSl編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的 氨基酸序列。3. 含有權(quán)利要求1所述基因 AoCHSl的表達(dá)盒。4. 含有權(quán)利要求1所述基因 AoCHSl或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒的載體。5. 含有權(quán)利要求1所述基因 AoCHSl、權(quán)利要求3所述表達(dá)盒或權(quán)利要求4所述載體的工 程菌。6. 權(quán)利要求1所述基因 AoCHSl在調(diào)控植物類黃酮生物合成中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1所述基因 AoCHSl在提高轉(zhuǎn)基因植物總黃酮含量中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物包括煙草。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，將基因 AoCHSl構(gòu)建到載體pCAMBIA2301上， 用所得重組載體轉(zhuǎn)化煙草，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草， 優(yōu)選所用農(nóng)桿菌為EHA105。
【文檔編號(hào)】C12N9/90GK105936914SQ201610464151
【公開日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年6月23日
【發(fā)明人】張?jiān)榔? 陳光宇, 瞿華香, 羅紹春, 湯泳萍, 趙萍, 周勁松, 謝啟鑫
【申請(qǐng)人】江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所