一株雙基因敲除工程菌及其構(gòu)建方法和在發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株雙基因敲除工程菌及其構(gòu)建方法和在發(fā)酵生產(chǎn)1,3?丙二醇中的應(yīng)用。將產(chǎn)1,3?丙二醇的野生型菌株的基因組中的D?乳酸脫氫酶基因和α?乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)敲除后獲得的工程菌株，所述的產(chǎn)1,3?丙二醇的野生型菌株是以甘油為原料發(fā)酵生產(chǎn)1,3?丙二醇。同時(shí)敲除乳酸脫氫酶及乙酰乳酸合成酶兩個(gè)基因后獲得的工程菌應(yīng)用在發(fā)酵法生產(chǎn)1,3?丙二醇過(guò)程中，在發(fā)酵液中1,3?丙二醇占代謝產(chǎn)物比例增加，乳酸與2,3?丁二醇合成同時(shí)大幅度減少，其它副產(chǎn)物沒有顯著增加。本發(fā)明將在微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3?丙二醇過(guò)程中發(fā)揮提高工程菌種合成1,3?丙二醇所占比例、降低合成副產(chǎn)物比例的作用，有利于降低生產(chǎn)成本，具有重要應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
一株雙基因敲除工程菌及其構(gòu)建方法和在發(fā)酵生產(chǎn)1 ,3-丙二 醇中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株同時(shí)敲除乳酸脫氫酶和乙酰乳酸合成酶 基因的工程菌及其構(gòu)建方法和在發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 1，3_丙二醇（PD0)是一種重要的化工原料，可作為有機(jī)溶劑，應(yīng)用于耐壓高潤(rùn)滑 劑、染料、油墨、防凍劑等行業(yè)。PD0可用來(lái)合成聚酯和聚氨酯、雜環(huán)、藥物中間體等，主要用 于合成聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯(PTThPTT是繼50年代聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)、70年代 聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯(PBT)之后實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的新的可成纖聚酯高分子材料，是一種極 有發(fā)展前途的新型聚酯材料。1998年P(guān)TT被美國(guó)評(píng)為六大石化新產(chǎn)品之一。PTT與PETJBT相 比除具有聚酯的耐化學(xué)性外，還具有其它一些更優(yōu)良的特性。如尼龍的彈性恢復(fù)性，在全范 圍無(wú)需添加特殊化學(xué)藥品即能呈現(xiàn)良好的連續(xù)印染特性，抗紫外、臭氧和氮氧化合物的著 色性，抗內(nèi)應(yīng)力，低水吸附、低靜電以及良好的可生物降解性，可循還利用性等。由于PTT的 具有以上優(yōu)良特性，它在地毯工業(yè)、服裝材料、工程熱塑料以及其它眾多領(lǐng)域有著很廣泛的 應(yīng)用。
[0003] 生產(chǎn)PTT纖維的關(guān)鍵在于單體原料PD0的來(lái)源。PTT占領(lǐng)市場(chǎng)的關(guān)鍵在于價(jià)格，而 PTT的價(jià)格主要取決于roo的價(jià)格。由于不能廉價(jià)制得roo，制約了 PTT的研制和市場(chǎng)開拓。直 到90年代中期PDO實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，使得PDO價(jià)格大大降低，PTT才開始工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng) 用。
[0004] 杜邦和殼牌兩家跨國(guó)公司曾采用化學(xué)合成路線，以環(huán)氧乙烷或丙烯為原料生產(chǎn) pdo?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)roo的缺點(diǎn)是副產(chǎn)物多，選擇性和產(chǎn)率較低，操作條件需要高溫高壓， 設(shè)備投資巨大，原料不可再生;同時(shí)由于產(chǎn)量有限，長(zhǎng)期以來(lái)roo售價(jià)偏高。
[0005] 目前1，3_丙二醇的生產(chǎn)方法主要是微生物發(fā)酵法。與化學(xué)合成法相比，微生物發(fā) 酵法生產(chǎn)1，3_丙二醇具有顯著的優(yōu)點(diǎn)：1、利用成本較低的可再生資源(如甘油、玉米、淀粉） 為原料;2、生產(chǎn)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，不需貴重金屬催化劑;3、選擇性好，副產(chǎn)物較少，易于 分離純化;4、環(huán)境污染小。微生物發(fā)酵法是以生物技術(shù)為特征的"綠色工業(yè)"向傳統(tǒng)石油化 工提出的強(qiáng)有力的挑戰(zhàn)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，因而越來(lái)越受到重視。
[0006] 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3_丙二醇是利用微生物發(fā)酵甘油產(chǎn)生。至今所有被發(fā)現(xiàn)的1， 3-丙二醇生產(chǎn)菌種均為細(xì)菌，其中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏梓檬酸桿菌 (Citrobacter freudii)和丁酸梭菌（Clostridium butyricum)具有較高的 1，3_丙二醇轉(zhuǎn) 化率和1，3-丙二醇生產(chǎn)強(qiáng)度，具有較高的開發(fā)前景，從而得到了較多關(guān)注。
[0007] 目前被用來(lái)生產(chǎn)1，3_丙二醇的克雷伯氏菌主要分離自土壤環(huán)境中?？死撞暇?能利用甘油（不能利用糖類)產(chǎn)生1，3_丙二醇。在產(chǎn)生1，3_丙二醇的過(guò)程中，甘油發(fā)生岐化 反應(yīng)，氧化途徑中的產(chǎn)物與糖類發(fā)酵產(chǎn)物一致，并產(chǎn)生供細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的ATP，在氧化產(chǎn) 物形成的同時(shí)釋放還原力NADH;還原途徑則消耗氧化途徑中多余的還原力，生成1，3_丙二 醇。氧化途徑中甘油先被氧化生成丙酮酸;丙酮酸可能轉(zhuǎn)化為多種發(fā)酵副產(chǎn)物，如乳酸、2， 3_ 丁二醇、丁二酸、乙酸、乙醇等。1摩爾丙酮酸生成1摩爾乳酸的過(guò)程要消耗1摩爾還原力，2 摩爾丙酮酸生成1摩爾2,3_丁二醇的過(guò)程要消耗1摩爾還原力，而1摩爾丙酮酸生成琥珀酸 的過(guò)程要消耗2摩爾還原力；丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解為乙酰CoA和甲酸，甲酸 再分解為⑶ 2和H2;乙酰CoA在經(jīng)乙酰磷酸形成乙酸的過(guò)程中生成過(guò)量的ATP，而在經(jīng)乙醛形 成乙醇的反應(yīng)中要消耗2摩爾還原力。還原途徑包括兩步反應(yīng):第一步，由依賴于輔酶B 12的 甘油脫水酶催化甘油脫水生成3-羥基丙醛;第二步，由1，3-丙二醇氧化還原酶催化3-羥基 丙醛還原生成1，3-丙二醇，此過(guò)程消耗1摩爾還原力。
[0008] 根據(jù)克雷伯氏菌發(fā)酵甘油的代謝途徑，在發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)胞利用底物甘油發(fā)酵的 代謝產(chǎn)物除主產(chǎn)物1，3_丙二醇外，還有乳酸、2,3_丁二醇、乙醇、乙酸、丁二酸等主要副產(chǎn) 物。副產(chǎn)物合成對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇主要具有三方面不利影響：1)消耗底物甘油，降低底 物對(duì)1，3_丙二醇的轉(zhuǎn)化率;2)積累較高濃度副產(chǎn)物時(shí)對(duì)細(xì)胞繼續(xù)發(fā)酵形成較強(qiáng)抑制作用， 妨礙得到高濃度1，3_丙二醇發(fā)酵液，同時(shí)也降低了發(fā)酵液中目標(biāo)產(chǎn)物1，3_丙二醇在整個(gè)代 謝產(chǎn)物中的所占比例;3)從發(fā)酵液提取1，3_丙二醇時(shí)，副產(chǎn)物較多會(huì)增加分離提純1，3_丙 二醇難度與成本。在主要副產(chǎn)物中，又以乳酸和2,3_丁二醇的產(chǎn)量最多，文獻(xiàn)報(bào)道野生型克 雷伯氏菌發(fā)酵甘油產(chǎn)生1，3_丙二醇的過(guò)程中副產(chǎn)物乳酸產(chǎn)量最高可達(dá)40g/L以上;其次是 2,3_ 丁二醇，產(chǎn)量最高可達(dá)30g/L以上。因此，減少副產(chǎn)物的生成，尤其是減少乳酸和2,3_ 丁 二醇的生產(chǎn)，對(duì)提高發(fā)酵甘油生成1，3-丙二醇水平，降低發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇成本，具有重 要的意義。研究報(bào)道單獨(dú)敲除乳酸合成代謝途徑中乳酸脫氫酶基因，可以大幅度減少乳酸 合成，但同時(shí)2,3_ 丁二醇合成大幅度增加，說(shuō)明切斷乳酸合成代謝途徑，代謝流主要轉(zhuǎn)向2， 3_丁二醇合成，不能明顯提升1，3_丙二醇在總的代謝產(chǎn)物中所占比例；而單獨(dú)敲除2,3_丁 二醇合成代謝途徑中的關(guān)鍵催化酶基因，可以大幅度減少2,3_丁二醇合成，但同時(shí)乳酸合 成大幅度增加。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)敲除乳酸與2,3_ 丁二醇合成代謝途徑編碼基因的 雙基因敲除工程菌及其構(gòu)建方法及其在生產(chǎn)1，3_丙二醇中應(yīng)用。
[0010]我們的前期研究發(fā)現(xiàn)敲除克雷伯氏菌乙酰乳酸合成酶編碼基因，發(fā)酵液中合成乳 酸濃度可達(dá)到野生菌的2倍以上，說(shuō)明切斷2,3_ 丁二醇合成代謝途徑，代謝流主要轉(zhuǎn)向乳酸 合成，也不能明顯提升1，3_丙二醇在總的代謝產(chǎn)物中所占比例。如果同時(shí)切斷乳酸與2,3_ 丁二醇合成代謝途徑，代謝流是主要轉(zhuǎn)向1，3_丙二醇合成還是轉(zhuǎn)向其它代謝副產(chǎn)物合成途 徑？如轉(zhuǎn)向合成乙酸、乙醇或丁二酸？是不是可以提升1，3_丙二醇在所有代謝產(chǎn)物中的比 例?鑒于克雷伯氏菌代謝網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，存在多種代謝副產(chǎn)物合成途徑，加上對(duì)雙基因敲除 工程菌的甘油代謝動(dòng)力學(xué)的不可預(yù)測(cè)性，我們不能判定同時(shí)切斷乳酸與2,3-丁二醇合成代 謝途徑對(duì)克雷伯氏菌發(fā)酵甘油生產(chǎn)1，3_丙二醇的影響。由于對(duì)克雷伯氏菌進(jìn)行連續(xù)基因敲 除的遺傳操作的存在一定技術(shù)難度，因此研究同時(shí)敲除乳酸脫氫酶與乙酰乳酸合成酶對(duì)發(fā) 酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的影響具有創(chuàng)新性。
[0011]本發(fā)明的雙基因敲除工程菌，其是通過(guò)以下方法構(gòu)建的，是將產(chǎn)1，3_丙二醇的野 生型菌株的基因組中的D-乳酸脫氫酶基因和α-乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)敲除后獲得的工 程菌株，所述的產(chǎn)1，3-丙二醇的野生型菌株是以甘油為原料發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇。
[0012] 所述的1，3_丙二醇的野生型菌株優(yōu)選為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的細(xì)菌，進(jìn)一 步優(yōu)選為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) 〇
[0013] 所述的將肺炎克雷伯氏菌的乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)敲除，優(yōu) 選通過(guò)以下方法敲除：
[0014] a、PCR擴(kuò)增肺炎克雷伯氏菌的乳酸脫氫酶基因，將其與克隆載體相連，然后再導(dǎo)入 含Red重組酶質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌Dh5a中，得到含有Red重組酶質(zhì)粒pKD46及乳酸脫氫酶基 因克隆載體的大腸桿菌Dh5a;
[0015] b、設(shè)計(jì)與乳酸脫氫酶基因序列同源的兩側(cè)翼各~40bp的引物，以質(zhì)粒pIJ773為模 板，PCR擴(kuò)增Apra+篩選抗性基因盒，純化得到兩側(cè)與乳酸脫氫酶基因同源的Apra+篩選抗性 基因盒DNA片段；
[0016] c、將步驟b獲得的兩側(cè)與乳酸脫氫酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段電 轉(zhuǎn)化導(dǎo)入含有Red重組酶質(zhì)粒pKD46及乳酸脫氫酶基因克隆載體的大腸桿菌Dh5a中；誘導(dǎo) Red重組酶表達(dá)，兩側(cè)與乳酸脫氫酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段與乳酸脫氫 酶基因克隆載體之間基因同源重組，通過(guò)Apra+抗性篩選出含重組片段的克隆菌；
[0017] d、通過(guò)PCR擴(kuò)增兩端為長(zhǎng)側(cè)翼同源片段，中間為Apra+抗性篩選標(biāo)記基因盒的DNA 片段；
[0018] e、將步驟d獲得的DNA片段電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入含有Red重組酶質(zhì)粒pi J790的野生型克雷伯 氏菌中，誘導(dǎo)Red重組酶表達(dá)，兩端長(zhǎng)側(cè)翼同源片段與乳酸脫氫酶基因之間發(fā)生基因同源重 組，將Apra+抗性基因盒插入到乳酸脫氫酶基因中間，通過(guò)Apra+抗性篩選出重組菌，即乳酸 脫氫酶基因失活的克雷伯氏菌；
[0019] f、向步驟d獲得的乳酸脫氫酶基因失活的克雷伯氏菌中電轉(zhuǎn)入PCP20質(zhì)粒，誘導(dǎo)重 組酶表達(dá)，通過(guò)Apra+抗性基因盒兩端的FRT位點(diǎn)刪除Apra+抗性基因，得到乳酸脫氫酶基因 失活的克雷伯氏菌突變株，然后將含有Red重組酶的質(zhì)粒pIJ790轉(zhuǎn)化進(jìn)入乳酸脫氫酶基因 失活的克雷伯氏菌突變株，得到含有Red重組酶質(zhì)粒pIJ790的乳酸脫氫酶基因失活的克雷 伯氏菌突變株；
[0020] g、PCR擴(kuò)增肺炎克雷伯氏菌的乙酰乳酸合成酶基因，將其與克隆載體相連，然后再 導(dǎo)入含Red重組酶質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌Dh5a中，得到含有Red重組酶質(zhì)粒pKD46及乙酰乳酸 合成酶基因克隆載體的大腸桿菌Dh5a;
[0021] h、設(shè)計(jì)與乙酰乳酸合成酶基因同源的兩側(cè)翼各~40bp的引物，以質(zhì)粒PIJ773為模 板，PCR擴(kuò)增Apra+篩選抗性基因盒，純化該兩側(cè)與乙酰乳酸合成酶基因同源的Apra+篩選抗 性基因盒DNA片段；
[0022] i、將步驟h獲得的兩側(cè)與乙酰乳酸合成酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片 段電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入含有Red重組酶質(zhì)粒pKD46及乙酰乳酸合成酶基因克隆載體的大腸桿菌Dh5a 中，誘導(dǎo)Red重組酶表達(dá)，兩側(cè)與乙酰乳酸合成酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段 與乙酰乳酸合成酶基因克隆載體之間基因同源重組，通過(guò)Apra+抗性篩選出含重組片段的 克隆菌；
[0023] j、通過(guò)PCR擴(kuò)增兩端為長(zhǎng)側(cè)翼同源片段，中間為Apra+抗性篩選標(biāo)記基因盒的DNA 片段；
[0024] k、將步驟j獲得的DNA片段電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入含有Red重組酶質(zhì)粒pIJ790的乳酸脫氫酶基 因失活的克雷伯氏菌突變株中，誘導(dǎo)Red重組酶表達(dá)，兩端長(zhǎng)側(cè)翼同源片段與乙酰乳酸合成 酶基因之間發(fā)生基因同源重組，將Apra+抗性基因盒插入到乙酰乳酸合成酶基因中間，通過(guò) Apra+抗性篩選出重組菌，即乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因都失活的克雷伯氏菌；
[0025] 1、向步驟k獲得的乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因都失活的克雷伯氏菌中 電轉(zhuǎn)入PCP20質(zhì)粒，誘導(dǎo)重組酶表達(dá)，通過(guò)Apra+抗性基因盒兩端的FRT位點(diǎn)刪除Apra+抗性 基因，獲得乳酸脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶基因都失活的雙基因敲除工程菌。
[0026] 所述的步驟a-Ι的使用的與克雷伯氏菌乳酸脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶基因的 同源序列是乳酸脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶基因的哪一部分序列并不重要，只要是乳酸 脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶基因其中的一部分即可。
[0027] 所述的克隆菌、質(zhì)粒載體:E.coli Dh5a、克隆載體如pMD18-T、質(zhì)粒pIJ773、質(zhì)粒 pKD46、質(zhì)粒pCP20等，可從商業(yè)公司購(gòu)買。
[0028] 本發(fā)明還提供了敲除乳酸與2,3_ 丁二醇代謝途徑基因的雙基因敲除工程菌在生 產(chǎn)1，3_丙二醇中的應(yīng)用。
[0029] 優(yōu)選，所述的雙基因敲除工程菌在生產(chǎn)1，3_丙二醇中的應(yīng)用，雙基因敲除工程菌 在發(fā)酵過(guò)程中底物甘油濃度為l_50g/L，通氣速度為1.0-3.Ovvm，溫度為30-40攝氏度，pH為 6·0 _8·0 〇
[0030] 本發(fā)明利用同源重組、基因敲除的方法使產(chǎn)1，3_丙二醇的野生型菌株中的乳酸脫 氫酶、乙酰乳酸合成酶基因失活，從而得到乳酸與2,3_ 丁二醇代謝途徑被失活的基因工程 菌。用本發(fā)明的工程菌進(jìn)行1，3-丙二醇的發(fā)酵生產(chǎn)，乳酸與2，3-丁二醇合成大幅度減少，1， 3_丙二醇在發(fā)酵甘油得到的代謝產(chǎn)物中的所占比例顯著增加；由于副產(chǎn)物乳酸與2,3_丁二 醇減少，1，3_丙二醇比例增加，降低了生產(chǎn)成本。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明的工程菌按常規(guī)方法 發(fā)酵36小時(shí)，1，3-丙二醇在發(fā)酵甘油主要代謝產(chǎn)物中的質(zhì)量比例由55.1 %提高到68.2%。 本發(fā)明將在微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3_丙二醇的工業(yè)化生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，具有重要的應(yīng)用 前景。
【附圖說(shuō)明】：
[0031] 圖1是敲除乳酸脫氫酶基因（LDH)示意圖；
[0032 ]圖2是敲除乙酰乳酸合成酶基因（budB/ALS)示意圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0033]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0034]實(shí)施例1:乳酸合成代謝途徑關(guān)鍵基因一乳酸脫氫酶基因被失活的肺炎克雷伯氏 菌突變株的構(gòu)建。出發(fā)菌株野生肺炎克雷伯氏菌，構(gòu)建過(guò)程如圖1所示。
[0035] (1)克隆乳酸脫氫酶基因 LDH
[0036] 根據(jù)乳酸脫氫酶基因 LDH的DNA序列(GenBank號(hào)：CP000647.1)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增 基因序列，引物序列如下：上游引物L(fēng)DH-F: 5 ' -CCTCGGACATTTCCTGTTAAT-3 '）與下游引物 LDH-R: (5 '-GGCAAACGCTGCAGCGAGCAG-3 '）。以野生型肺炎克雷伯氏菌(保藏于中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心，保藏編號(hào)為:CCTCC Μ 2011075)基因組DNA為模板，在引物L(fēng)DH-F和LDH-R的引 導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增乳酸脫氫酶基因 LDH的核酸序列，PCR擴(kuò)增條件為：先95°C3min;然后94°C 111^11，55°(：11^11，721€2.51^11，共35個(gè)循環(huán)；最后72°(：1〇1^11。反應(yīng)結(jié)束后，將?0財(cái)廣增產(chǎn)物進(jìn) 行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化約210 0 b p目的D N A片段，將其克隆入載體p M D18 - T (TaKaRa公司）中，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dh5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒， 通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定，表明獲得了插入序列正確的重組載體，命名為ρΤ-LDH質(zhì)粒。由此獲得 含有pT-LDH質(zhì)粒的大腸桿菌Dh5a，再將含有Red重組酶質(zhì)粒pKD46轉(zhuǎn)化進(jìn)入該含有pT-LDH質(zhì) 粒的大腸桿菌Dh5a中，由此獲得含有Red重組酶質(zhì)粒pKD46及乳酸脫氫酶基因克隆載體的大 腸桿菌Dh5a。
[0037] (2)構(gòu)建以乳酸脫氫酶基因 LDH序列為側(cè)翼的Apra抗性基因盒
[0038]合成弓| *LDH-Apra-F:5'_ gaactggaattcttcgatttcctgctgacagcgaagactgTTCCGGGGATCCGTCGACC-3 '；LDH-Apra-R:5 '-agtggtctccgaaatgctgatcagcgcctcggcggtgaggGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 '。以LDH-Apra-F， LDH-Apra-R為引物，以質(zhì)粒p IJ773為模板，PCR擴(kuò)增Apra+篩選抗性基因盒，得到約1400bp的 DNA片段，其兩側(cè)各40bp序列與乳酸脫氫酶基因 LDH序列同源，中間為Apra+篩選抗性基因 盒。回收純化該DNA片段，用于下一步構(gòu)建長(zhǎng)側(cè)翼LDH同源序列的抗性基因盒。
[0039]將以上純化得到的DNA片段電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入含有Red重組酶質(zhì)粒pKD46及乳酸脫氫酶基 因克隆載體的大腸桿菌Dh5a中；誘導(dǎo)Red重組酶表達(dá)，兩側(cè)與乳酸脫氫酶基因同源的Apra+ 篩選抗性基因盒DNA片段與乳酸脫氫酶基因克隆載體之間基因同源重組，通過(guò)Apra+抗性篩 選出含重組Apra+抗性基因盒的克隆菌；以LDH-F:5'-CCTCGGACATTTCCTGTTAAT-3'與LDH-R: (5 ' -GGCAAACGCTGCAGCGAGCAG-3 '為引物，以上一步克隆菌為模板，通過(guò)PCR獲得長(zhǎng)側(cè)翼LDH 同源序列的抗性基因盒LDH-Apra-LDILPCR擴(kuò)增條件為：先95°C3min;然后94°C lmin，55°C lmin，72°C4min，共35個(gè)循環(huán);最后72°C lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5 %瓊脂 糖凝膠電泳，回收并純化約2700bp目的DNA片段。該DNA片段左側(cè)翼LDH同源序列約為500bp， 右側(cè)翼LDH同源序列約為750bp，中間為約1400bp的Apra抗性基因盒。該具長(zhǎng)側(cè)翼LDH同源序 列的抗性基因盒LDH-Apra-LDH用于下一步構(gòu)建乳酸脫氫酶基因失活的工程菌。
[0040] (3)構(gòu)建以乳酸脫氫酶基因失活的克雷伯氏菌
[0041] 將上一步獲得的具長(zhǎng)側(cè)翼LDH同源序列的Apra抗性基因盒LDH-Apra-LDH電轉(zhuǎn)化導(dǎo) 入含有Red重組酶質(zhì)粒pIJ790的野生型克雷伯氏菌中；誘導(dǎo)Red重組酶表達(dá)，兩端長(zhǎng)側(cè)翼同 源片段與乳酸脫氫酶基因相應(yīng)序列之間發(fā)生基因同源重組，將Apra抗性基因盒插入到乳酸 脫氫酶基因中間，通過(guò)Apra抗性(50ug/ml)篩選出重組菌，即乳酸脫氫酶基因失活的克雷伯 氏菌;通過(guò)傳代使PIJ790質(zhì)粒丟失，由此獲得乳酸脫氫酶基因失活的克雷伯氏菌。
[0042] (4)消除Apra抗性基因盒
[0043]將PCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入上一步獲得的乳酸脫氫酶基因失活的克雷伯氏菌中，誘導(dǎo) 重組酶表達(dá)，使兩個(gè)FRT序列之間的Apra抗性基因盒消除，得到消除了 Apra抗性基因盒的乳 酸脫氫酶基因失活的克雷伯氏菌;通過(guò)傳代使PCP20質(zhì)粒丟失。
[0044] 通過(guò)以上4個(gè)操作步驟，獲得乳酸合成代謝途徑關(guān)鍵基因一乳酸脫氫酶基因失活 的肺炎克雷伯氏囷關(guān)變株。
[0045]將含有Red重組酶質(zhì)粒pIJ790轉(zhuǎn)化進(jìn)入乳酸脫氫酶基因失活的肺炎克雷伯氏菌突 變株中，得到含有Red重組酶質(zhì)粒pIJ790的已經(jīng)失活乳酸脫氫酶的克雷伯氏菌。
[0046] 實(shí)施例2:2，3_丁二醇合成代謝途徑關(guān)鍵基因一乙酰乳酸合成酶基因被失活的肺 炎克雷伯氏菌突變株的構(gòu)建。構(gòu)建過(guò)程如圖2所示。
[0047] 出發(fā)菌株是實(shí)施例1得到的乳酸脫氫酶基因失活的肺炎克雷伯氏菌突變株，構(gòu)建 過(guò)程如圖2所示。
[0048] (1)克隆乙酰乳酸合成酶基因 ALS
[0049] 根據(jù)乙酰乳酸合成酶基因 ALS的DNA序列（GenBank號(hào)：CP006738.1)設(shè)計(jì)引物，PCR 擴(kuò)增基因序列，引物序列如下：上游引物ALS-F:5'-atggacaaacagtatccggtacgc_3'與下游 引物ALS-R: 5 ' -ttacagaatctgactcagatgcag-3 '。以野生型肺炎克雷伯氏菌(保藏于中國(guó)典 型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為:CCTCC Μ 2011075)基因組DNA為模板，在引物ALS-F和ALS-R的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增乙酰乳酸合成酶基因 ALS的核酸序列，PCR擴(kuò)增條件為:先95 °C3min;然 后94°(：1111丨11，55°(：1111丨11，721€2.〇111丨11，共33個(gè)循環(huán) ；最后72°(：1〇1^11。反應(yīng)結(jié)束后，將?0財(cái)廣增 產(chǎn)物進(jìn)行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化約15 0 0 b p目的D N A片段，將其克隆入載體 PMD18-T (TaKaRa公司）中，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dh5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提 取質(zhì)粒，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定，表明獲得了插入序列正確的重組載體，命名為ρΤ-ALS質(zhì)粒。 由此獲得含有pT-ALS質(zhì)粒的大腸桿菌Dh5a，再將含有Red重組酶質(zhì)粒pKD46轉(zhuǎn)化進(jìn)入該含有 pT-ALS質(zhì)粒的大腸桿菌Dh5a中，由此獲得含有Red重組酶質(zhì)粒pKD46及乙酰乳酸合成酶基因 克隆載體的大腸桿菌Dh5a。
[0050] (2)構(gòu)建以乙酰乳酸合成酶基因 ALS序列為側(cè)翼的Apra抗性基因盒
[0051] 合成弓| *ALS-Apra-F:5'_ CGCCGCGCCGGATGATGCCATCGACCAGGTGGCGAAGCTTTTCCGGGGATCCGTCGACC-3 '；ALS-Apra-R:5 '-CGATATTTTGCGCCAGCTTGTTGAGAGTGCCGGCGATATCGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3 '。以ALS-Apra-F， ALS-Apra-R為引物，以質(zhì)粒p IJ773為模板，PCR擴(kuò)增Apra+篩選抗性基因盒，得到約1400bp的 DNA片段，其兩側(cè)各40bp序列與乙酰乳酸合成酶基因序列同源，中間為Apra+篩選抗性基因 盒?；厥占兓揇NA片段，用于下一步構(gòu)建長(zhǎng)側(cè)翼ALS同源序列的抗性基因盒。
[0052]將以上純化得到的DNA片段電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入含有Red重組酶質(zhì)粒pKD46及乙酰乳酸合成 酶基因克隆載體的大腸桿菌Dh5a中；誘導(dǎo)Red重組酶表達(dá)，兩側(cè)各40bp與乙酰乳酸合成酶基 因同源序列的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段與乙酰乳酸合成酶基因克隆載體之間基因同 源重組，通過(guò)Apra +抗性篩選出含重組Apra +抗性基因盒的克隆菌；以ALS-F:5'_ atggacaaacagtatccggtacgc-3 ' 與ALS-R: 5 ' -ttacagaatctgactcagatgcag-3 ' 為弓|物，以上 一步克隆菌為模板，通過(guò)PCR獲得長(zhǎng)側(cè)翼ALS同源序列的抗性基因盒ALS-Apra-ALSICR擴(kuò)增 條件為：先 95°C3min;然后 94°(：1111丨11，55°(：1111丨11，721€3111丨11，共34個(gè)循環(huán)；最后72°(：1〇111丨11。反 應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化約2500bp目的DNA片段。 該DNA片段左側(cè)翼ALS同源序列約為400bp，右側(cè)翼ALS同源序列約為700bp，中間為約1400bp 的Apra抗性基因盒。該具長(zhǎng)側(cè)翼ALS同源序列的抗性基因盒ALS-Apra-ALS用于下一步構(gòu)建 乙酰乳酸合成酶基因失活的工程菌。
[0053] (3)構(gòu)建以乙酰乳酸合成酶基因失活的克雷伯氏菌
[0054]將上一步獲得的具長(zhǎng)側(cè)翼ALS同源序列的抗性基因盒ALS-Apra-ALS電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入含 有Red重組酶質(zhì)粒pIJ790的已經(jīng)失活乳酸脫氫酶的克雷伯氏菌中（實(shí)施例1中構(gòu)建）；誘導(dǎo) Red重組酶表達(dá)，兩端長(zhǎng)側(cè)翼同源片段與乙酰乳酸合成酶基因相應(yīng)序列之間發(fā)生基因同源 重組，將Apra抗性基因盒插入到乙酰乳酸合成酶基因中間，通過(guò)Apra抗性(50ug/ml)篩選出 重組菌，即乙酰乳酸合成酶基因及乳酸脫氫酶基因同時(shí)失活的克雷伯氏菌；通過(guò)傳代使 PIJ790質(zhì)粒丟失。由此得到乙酰乳酸合成酶基因及乳酸脫氫酶基因同時(shí)失活的克雷伯氏 菌。
[0055] (4)消除Apra抗性基因盒
[0056]將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入上一步獲得的乙酰乳酸合成酶基因及乳酸脫氫酶基因同時(shí) 失活的克雷伯氏菌中，誘導(dǎo)重組酶表達(dá)，使兩個(gè)FRT序列之間的Apra抗性基因盒消除，得到 消除了 Apra抗性基因盒的雙基因失活的克雷伯氏菌;通過(guò)傳代使pCP20質(zhì)粒丟失。
[0057]通過(guò)以上4步操作，獲得乳酸與2，3_丁二醇合成代謝途徑關(guān)鍵基因一乳酸脫氫酶 基因和乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)失活的肺炎克雷伯氏菌突變株，即為雙基因敲除工程菌。 [0058]實(shí)施例3:乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)失活的肺炎克雷伯氏菌突 變株的乳酸脫氫酶與乙酰乳酸合成酶活性檢測(cè)。
[0059] 對(duì)實(shí)施例2的乳酸脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)失活的肺炎克雷伯氏菌 突變株進(jìn)行乳酸脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶的活性檢測(cè)，以野生型肺炎克雷伯氏菌為對(duì) 照，具體方法包括以下步驟：
[0060] 1、乳酸代謝途徑關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶的活性檢測(cè)：
[0061 ]對(duì)實(shí)施例2構(gòu)建的同時(shí)失活乳酸與2，3-丁二醇代謝途徑關(guān)鍵基因的乳酸脫氫酶基 因和乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)失活的肺炎克雷伯氏菌突變株進(jìn)行乳酸脫氫酶的活性檢測(cè)， 以野生型菌株為對(duì)照，具體方法包括以下步驟：
[0062] (1)取菌種接種LB培養(yǎng)基，37 °C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，得到種子培養(yǎng)菌液；
[0063] (2)取種子培養(yǎng)菌液接種至200ml發(fā)酵培養(yǎng)基(見實(shí)施例4)中，37 °C振蕩培養(yǎng)12-24 小時(shí)，每2小時(shí)取樣離心收集菌體；
[0064] (3)用100ml預(yù)冷的磷酸緩沖液(0.1M，pH7.5)懸浮洗滌菌體2次；
[0065] (4)用2 · 5ml預(yù)冷的磷酸緩沖液(0 · 1M，pH7 · 5)懸浮菌體；
[0066] (5)超聲波破碎菌體(400W探頭工作3秒，間歇3秒，冰浴作用80-100次）；
[0067] (6)2000g離心10min，取上清用于測(cè)定酶活（用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定0D340nm 在lmin內(nèi)的變化）。乳酸脫氫酶反應(yīng)體系含有:含25mmol · Γ1的pH 7.4磷酸鉀緩沖液79〇111、 5mmol · L-1 的NADH 80ul、lmol · L-1 MgCl2 10ul、20mmol · L-1 果糖-1，6-二磷酸50ul、 400mmol · L-1丙酮酸50ul、粗酶液20yL。加入酶液后開始反應(yīng)分光光度計(jì)測(cè)量Δ A34〇nm/min。 一個(gè)酶活單位定義為1分鐘消耗lymo 1 NADH所需的酶量。
[0068] 結(jié)果顯示，實(shí)施例2構(gòu)建的乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)失活的肺 炎克雷伯氏菌突變株的乳酸脫氫酶活性為野生型菌株的1.8%-5.3%，表明實(shí)施例2構(gòu)建的 乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)失活的肺炎克雷伯氏菌突變株的乳酸脫氫酶 失活。
[0069] 2、2，3-丁二醇代謝途徑關(guān)鍵酶乙酰乳酸合成酶的活性檢測(cè)：
[0070]對(duì)實(shí)施例2構(gòu)建的同時(shí)失活乳酸與2，3-丁二醇代謝途徑關(guān)鍵基因的乳酸脫氫酶基 因和乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)失活的肺炎克雷伯氏菌突變株進(jìn)行乙酰乳酸合成酶的活性 檢測(cè)，以野生型菌株為對(duì)照，具體方法包括以下步驟：
[0071] (1)將乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)失活的肺炎克雷伯氏菌突變株 接種于lOOmL培養(yǎng)基(每L水中含有甘油30g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，pH 7.0，120 °C滅菌20min)中，在37°C下振蕩培養(yǎng)12-24小時(shí)，每2小時(shí)取樣離心收集菌體；
[0072] (2)用1 OOmL磷酸緩沖液(0.1M，pH7.5)懸浮洗滌菌體2次；
[0073] (3)用2 · 5mL磷酸緩沖液(0 · 1M，pH7 · 5)懸浮菌體；
[0074] (4)4°C超聲波破碎菌體；
[0075] (5)酶活測(cè)定根據(jù)乙酰乳酸在一定溫度條件下會(huì)脫羧形成乙偶姻，而乙偶姻在堿 性條件下可以與肌酸和萘酚的混合物反應(yīng)生成紅色物質(zhì)，可在525nm下檢測(cè)。反應(yīng)體系為 lmL 0 · 1M磷酸鈉緩沖液(pH 7 · 0)，其中含40mmol/L的丙酮酸鈉，lmmol/L的氯化鎂，lmmol/L 的TPP，ΙΟμ mol/L的FAD，37°C加入20yL酶液（即破碎菌體液）啟動(dòng)反應(yīng)，10min后加50yL3mol/ L硫酸終止反應(yīng)，37°C脫羧25min，2 000r/min離心lmin后，上清稀釋20倍后取500yL加入 0 · 25mL 0 · 17 %肌酸和0 · 25mL 1 · 7 %的α-萘酚，37 °C顯色30min，于525nm處測(cè)定吸光度。乙 偶姻的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y = 〇.〇139x，其中X為乙偶姻濃度(ymol/L)，y為0D525值。酶活單位 (IU)定義為在該反應(yīng)條件下，lmin內(nèi)催化生成Ιμπιο?/L乙偶姻所需的酶量。
[0076] 結(jié)果顯示，實(shí)施例2構(gòu)建的乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)失活的肺 炎克雷伯氏菌突變株的乙酰乳酸合成酶活性為野生型菌株的3.5%-6.0%，表明實(shí)施例2構(gòu) 建的工乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)失活的肺炎克雷伯氏菌突變株的乙酰 乳酸合成酶失活。
[0077]實(shí)施例4:乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)失活的肺炎克雷伯氏菌突 變株(LDH、ALS雙基因敲除菌)發(fā)酵甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇 [0078] (1)培養(yǎng)基
[0079] LB培養(yǎng)基(g · Γ1):酵母粉5,蛋白胨10，NaCl 10,瓊脂10,調(diào)節(jié)至pH 7.0,用于克雷 伯氏菌菌種的短期保藏及活化。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基組成見表1:
[0080] 表1:培養(yǎng)基組成
[0081]
[0082] (2)培養(yǎng)方式
[0083] (i)種子活化:從甘油管保藏的實(shí)施例2中的乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基 因同時(shí)失活的肺炎克雷伯氏菌突變株接種至LB培養(yǎng)基斜面活化，溫度37°C下培養(yǎng)12小時(shí)活 化種子。
[0084] (ii)種子培養(yǎng):250mL三角瓶9層紗布封口，裝液量100mL種子培養(yǎng)基，接入斜面菌 苔(步驟i的活化種子)一環(huán)，搖床中進(jìn)行好氧種子培養(yǎng)，溫度30°C，轉(zhuǎn)速150r · mirT1。
[0085] (iii)發(fā)酵培養(yǎng):為了考察所構(gòu)建的LDH、ALS雙基因失活的對(duì)肺炎克雷伯氏菌發(fā)酵 甘油產(chǎn)1，3_丙二醇的影響，以實(shí)施例2中的乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)失 活的肺炎克雷伯氏菌突變株為實(shí)驗(yàn)組，以出發(fā)野生菌肺炎克雷伯氏菌為對(duì)照組，進(jìn)行補(bǔ)料 分批發(fā)酵，采用島津LC-20A HPLC分析發(fā)酵液中物質(zhì)組成。
[0086]在5L攪拌發(fā)酵罐中進(jìn)行時(shí)，裝液量3L，接種量1%，通入0.5vvm空氣進(jìn)行微氧發(fā)酵 培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速為200印111。發(fā)酵溫度恒定在37<€;似0!1調(diào)節(jié)卩!1至6.8，發(fā)酵過(guò)程中體系卩!1通過(guò) 流加 40 %的NaOH溶液調(diào)控。待菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行甘油補(bǔ)料，甘油濃度控制在1-50g/L〇
[0087] (iv)發(fā)酵結(jié)果
[0088]發(fā)酵進(jìn)行36小時(shí)，底物消耗、1，3_丙二醇及其它副產(chǎn)物合成情況結(jié)果，見表2。
[0089]表2:失活乳酸脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶基因?qū)Ψ窝卓死撞暇l(fā)酵甘油生 產(chǎn)1，3-丙二醇的影響
[0090]
[0091] 從發(fā)酵結(jié)果可以得知，失活LDH、ALS基因使菌種生物量略微降低，甘油消耗量也稍 微降低，說(shuō)明失活LDH、ALS對(duì)菌種的生長(zhǎng)存在一定影響；失活LDH、ALS基因工程菌合成1，3_ 丙二醇濃度與野生菌相比也略微降低，但不顯著；工程菌合成1，3-丙二醇生產(chǎn)強(qiáng)度和得率 與野生菌相比無(wú)顯著差異;失活LDH、ALS基因工程菌合成副產(chǎn)物乳酸和2,3_ 丁二醇比野生 菌顯著降低，其中乳酸合成降低88.06%，2,3_丁二醇合成降低58.36%;其它副產(chǎn)物合成無(wú) 顯著變化。由于工程菌發(fā)酵合成副產(chǎn)物乳酸、2,3_丁二醇減少，1，3_丙二醇占總代謝產(chǎn)物的 比例顯著提高，與野生菌相比提高13.1 %。工程菌株發(fā)酵液中1，3-丙二醇占總代謝產(chǎn)物比 例是野生菌株的1.24倍。這表明工程菌種發(fā)酵甘油代謝流分布1，3_丙二醇提高，主要副產(chǎn) 物乳酸和2,3_ 丁二醇降低，這種特征有利于產(chǎn)品提取過(guò)程中降低處理副產(chǎn)物的生產(chǎn)成本， 具有重要應(yīng)用價(jià)值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株雙基因敲除工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，是將產(chǎn)1，3-丙二醇的野生型菌株 的基因組中的D-乳酸脫氫酶基因和α-乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)敲除后獲得的工程菌株，所 述的產(chǎn)1，3_丙二醇的野生型菌株是以甘油為原料發(fā)酵生產(chǎn)1，3_丙二醇。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的產(chǎn)1，3_丙二醇的野生型菌株為 克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的細(xì)菌。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的產(chǎn)1，3_丙二醇的野生型菌株為 肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) 〇4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述將肺炎克雷伯氏菌的基因組中的D-乳 酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因同時(shí)敲除是通過(guò)RED同源重組基因敲除方法將D-乳 酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因敲除。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的將肺炎克雷伯氏菌的D-乳酸脫氫酶 基因和α-乙酰乳酸合成酶基因敲除同時(shí)敲除，是通過(guò)以下方法敲除： a、 PCR擴(kuò)增肺炎克雷伯氏菌的乳酸脫氫酶基因，將其與克隆載體相連，然后再導(dǎo)入含 Red重組酶質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌Dh5a中，得到含有Red重組酶質(zhì)粒pKD46及乳酸脫氫酶基因 克隆載體的大腸桿菌Dh5a; b、 設(shè)計(jì)與乳酸脫氫酶基因序列同源的兩側(cè)翼各~40bp的引物，以質(zhì)粒pIJ773為模板， PCR擴(kuò)增Apra+篩選抗性基因盒，純化得到兩側(cè)與乳酸脫氫酶基因同源的Apra+篩選抗性基 因盒DNA片段； c、 將步驟b獲得的兩側(cè)與乳酸脫氫酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段電轉(zhuǎn)化 導(dǎo)入含有Red重組酶質(zhì)粒pKD46及乳酸脫氫酶基因克隆載體的大腸桿菌Dh5a中；誘導(dǎo)Red重 組酶表達(dá)，兩側(cè)與乳酸脫氫酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段與乳酸脫氫酶基因 克隆載體之間基因同源重組，通過(guò)Apra+抗性篩選出含重組片段的克隆菌； d、 通過(guò)PCR擴(kuò)增兩端為長(zhǎng)側(cè)翼同源片段，中間為Apra+抗性篩選標(biāo)記基因盒的DNA片段； e、 將步驟d獲得的DNA片段電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入含有Red重組酶質(zhì)粒pIJ790的野生型克雷伯氏菌 中，誘導(dǎo)Red重組酶表達(dá)，兩端長(zhǎng)側(cè)翼同源片段與乳酸脫氫酶基因之間發(fā)生基因同源重組， 將Apra+抗性基因盒插入到乳酸脫氫酶基因中間，通過(guò)Apra+抗性篩選出重組菌，即乳酸脫 氫酶基因失活的克雷伯氏菌； f、 向步驟d獲得的乳酸脫氫酶基因失活的克雷伯氏菌中電轉(zhuǎn)入pCP20質(zhì)粒，誘導(dǎo)重組酶 表達(dá)，通過(guò)Apra+抗性基因盒兩端的FRT位點(diǎn)刪除Apra+抗性基因，得到乳酸脫氫酶基因失活 的克雷伯氏菌突變株，然后將含有Red重組酶的質(zhì)粒pIJ790轉(zhuǎn)化進(jìn)入乳酸脫氫酶基因失活 的克雷伯氏菌突變株，得到含有Red重組酶質(zhì)粒pIJ790的乳酸脫氫酶基因失活的克雷伯氏 菌突變株； g、 PCR擴(kuò)增肺炎克雷伯氏菌的乙酰乳酸合成酶基因，將其與克隆載體相連，然后再導(dǎo)入 含Red重組酶質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌Dh5a中，得到含有Red重組酶質(zhì)粒pKD46及乙酰乳酸合成 酶基因克隆載體的大腸桿菌Dh5a; h、 設(shè)計(jì)與乙酰乳酸合成酶基因同源的兩側(cè)翼各~40bp的引物，以質(zhì)粒pIJ773為模板， PCR擴(kuò)增Apra+篩選抗性基因盒，純化該兩側(cè)與乙酰乳酸合成酶基因同源的Apra+篩選抗性 基因盒DNA片段； i、 將步驟h獲得的兩側(cè)與乙酰乳酸合成酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段電 轉(zhuǎn)化導(dǎo)入含有Red重組酶質(zhì)粒pKD46及乙酰乳酸合成酶基因克隆載體的大腸桿菌Dh5a中，誘 導(dǎo)Red重組酶表達(dá)，兩側(cè)與乙酰乳酸合成酶基因同源的Apra+篩選抗性基因盒DNA片段與乙 酰乳酸合成酶基因克隆載體之間基因同源重組，通過(guò)Apra+抗性篩選出含重組片段的克隆 菌； j、 通過(guò)PCR擴(kuò)增兩端為長(zhǎng)側(cè)翼同源片段，中間為Apra+抗性篩選標(biāo)記基因盒的DNA片段； k、 將步驟j獲得的DNA片段電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入含有Red重組酶質(zhì)粒pIJ790的乳酸脫氫酶基因失 活的克雷伯氏菌突變株中，誘導(dǎo)Red重組酶表達(dá)，兩端長(zhǎng)側(cè)翼同源片段與乙酰乳酸合成酶基 因之間發(fā)生基因同源重組，將Apra+抗性基因盒插入到乙酰乳酸合成酶基因中間，通過(guò)Apra +抗性篩選出重組菌，即乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因都失活的克雷伯氏菌； l、 向步驟k獲得的乳酸脫氫酶基因和乙酰乳酸合成酶基因都失活的克雷伯氏菌中電轉(zhuǎn) 入pCP20質(zhì)粒，誘導(dǎo)重組酶表達(dá)，通過(guò)Apra+抗性基因盒兩端的FRT位點(diǎn)刪除Apra+抗性基因， 獲得乳酸脫氫酶基因與乙酰乳酸合成酶基因都失活的雙基因敲除工程菌。6. -種按照權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的雙基因敲除工程菌。7. 權(quán)利要求6所述的雙基因敲除工程菌在生產(chǎn)1，3_丙二醇中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的雙基因敲除工程菌在生產(chǎn)1，3_丙二醇中 的應(yīng)用，是雙基因敲除工程菌在發(fā)酵過(guò)程中底物甘油濃度為l-50g/L，通氣速度為1.0-3 · Ovvm，溫度為 30-40攝氏度，pH為 6 · 0-8 · 0。
【文檔編號(hào)】C12P7/18GK105936915SQ201610179046
【公開日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年3月24日
【發(fā)明人】周勝, 秦啟偉, 王著希, 黃友華
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所