用于鑒定或輔助鑒定黑豬肉的pcr引物對(duì)、鑒定方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于鑒定或輔助鑒定黑豬肉的PCR引物對(duì)、鑒定方法及應(yīng)用，本發(fā)明用于鑒定或輔助鑒定黑豬肉的PCR引物對(duì)，序列為F:5’?AGCCATGAGCTGAGCAGGAC?3’；R:5’?GAAGCAGAGGCTGGACACCAT?3’。用所述引物對(duì)，對(duì)待測(cè)豬肉DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；根據(jù)擴(kuò)增條帶測(cè)序結(jié)果就可以判斷待測(cè)豬肉是否為黑豬肉。本發(fā)明可準(zhǔn)確判定豬肉的種源，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、高效。
【專利說明】
用于鑒定或輔助鑒定黑豬肉的PCR引物對(duì)、鑒定方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明用于鑒定或輔助鑒定黑豬肉的PCR引物對(duì)、鑒定方法及應(yīng)用，涉及黑豬肉的 分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及對(duì)黑豬肉的鑒別和檢測(cè)技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 肉類生產(chǎn)在人類生活中占有極其重要的地位，自1990年以來，我國(guó)肉類產(chǎn)品總產(chǎn) 量和總消費(fèi)量始終處于世界首位，從消費(fèi)結(jié)構(gòu)來看，中國(guó)居民的豬肉消費(fèi)量占全國(guó)全部肉 類總消費(fèi)量的60%以上。隨著社會(huì)的發(fā)展，居民消費(fèi)水平逐漸提高，傳統(tǒng)的供銷模式難以滿 足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的物質(zhì)文明需求，越來越多的消費(fèi)者開始關(guān)注飲食安全、健康和營(yíng)養(yǎng)問題。 因此我國(guó)豬肉產(chǎn)量和需求量還有較大的增長(zhǎng)空間，特別是"優(yōu)質(zhì)放心豬肉"的潛在需求量較 大，呈現(xiàn)出廣闊的市場(chǎng)前景，具有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
[0003] 我國(guó)地方豬種資源豐富，是世界豬遺傳資源的重要組成部分。1986年出版的《中國(guó) 豬品種志》，收錄了我國(guó)48個(gè)地方豬品種資源，12個(gè)培育豬品種資源和6個(gè)引入豬品種資源。 我國(guó)地方豬種大多為黑毛，因此地方豬又俗稱黑豬或土豬。所謂黑豬肉，是指采用我國(guó)地方 豬種且按照農(nóng)家傳統(tǒng)飼養(yǎng)方式"圈養(yǎng)"的家豬，而成為商品豬后并通過"傳統(tǒng)人工宰殺的方 式"屠宰后得到的豬肉。地方黑豬大多散養(yǎng)，對(duì)環(huán)境要求較高，用有機(jī)飼料或谷物喂養(yǎng)，生長(zhǎng) 周期一般為10-12個(gè)月，宰殺后，豬肉顏色深紅，肌肉纖維致密，大理石紋清晰，肌肉內(nèi)脂肪 含量較高，蛋白質(zhì)含量高，煮熟后肉質(zhì)細(xì)嫩，香味濃郁，具有很高的食用營(yíng)養(yǎng)價(jià)值;而市場(chǎng)常 見的瘦肉型豬生產(chǎn)周期一般為5-6個(gè)月，豬肉顏色鮮紅，肌肉纖維不致密，瘦肉內(nèi)沉積的脂 肪量少，其口味相對(duì)土豬肉香味較淡，口感一般。
[0004] 我國(guó)是豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)。近年來，隨著市場(chǎng)多元化的發(fā)展以及人們生活水平 的提高，對(duì)豬肉的需求已經(jīng)不僅僅是能吃上，而是要既瘦肉多，又色、香、味倶全。但是長(zhǎng)期 以來，人們對(duì)豬的選育重點(diǎn)都集中在瘦肉率和生長(zhǎng)速度上，而忽視了豬肉品質(zhì)。導(dǎo)致許多消 費(fèi)者都反映，現(xiàn)在的豬肉不好吃、肉香味不足。一味的追求快大型和瘦肉型豬的選育，已經(jīng) 無法滿足今后多元化的市場(chǎng)需求，更無法保證我國(guó)在豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。
[0005] 隨著人們對(duì)飲食安全、健康和營(yíng)養(yǎng)要求的提高，傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)地方豬肉（俗稱黑豬肉） 越來越受消費(fèi)者歡迎。黑豬肉因其生產(chǎn)成本高，市售價(jià)格是普通瘦肉型豬肉幾倍甚至十幾 倍。由于黑豬肉與普通豬肉直觀難以辨別，一些不法商家以次充好、以假冒真，使得消費(fèi)者 和真正黑豬肉商家利益蒙受損害。因此，為了維持黑豬肉市場(chǎng)的穩(wěn)定發(fā)展，急需科學(xué)的黑豬 肉鑒別方法來規(guī)范目前的黑豬肉市場(chǎng)。
[0006] 我國(guó)地方豬種大多為黑毛，而外種豬為白色和棕色皮毛，因此，可以通過中國(guó)地方 豬種特有的黑毛基因?qū)谪i肉進(jìn)行科學(xué)鑒定。該技術(shù)可有效維護(hù)我國(guó)地方黑豬產(chǎn)業(yè)的可持 續(xù)發(fā)展，規(guī)范黑豬肉市場(chǎng)?，F(xiàn)有技術(shù)中還沒有使用黑毛基因?qū)谪i肉進(jìn)行鑒定的記載。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決以上黑豬肉鑒定方面的難題，本發(fā)明提供了用于鑒定或輔助鑒定黑豬肉 的PCR引物對(duì)、鑒定方法及應(yīng)用，可快速、準(zhǔn)確判定豬肉的種源。
[0008] 為此，本發(fā)明，第一方面，提供用于鑒定或輔助鑒定黑豬肉的PCR引物對(duì)，所述引物 對(duì)由SEQ ID No.l和SEQ ID如.2所示的兩條單鏈0嫩分子組成。
[0009] 第二方面，提供用于鑒定或輔助鑒定黑豬肉的試劑盒，所述試劑盒中含有上述由 SEQ ID No.l和SEQ ID如.2所示的兩條單鏈0嫩分子組成的引物對(duì)。
[0010] 所述試劑盒中還含有dNTP和DNA聚合酶。根據(jù)需要還可以包含其他相關(guān)試劑。
[0011] 第三方面，提供所述的引物對(duì)或所述的試劑盒，在鑒定或輔助鑒定黑豬肉中的應(yīng) 用。
[0012] 第四方面，提供利用所述的引物對(duì)或所述的試劑盒，鑒定或輔助鑒定是否為黑豬 肉的方法，步驟如下：
[0013 ] (1)對(duì)目標(biāo)肉樣進(jìn)行DNA提??；
[0014] (2)使用權(quán)利要求1所述引物對(duì)，對(duì)步驟(1)中提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0015] (3)對(duì)步驟(2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序；
[0016] (4)根據(jù)測(cè)序結(jié)果即可直接判斷目標(biāo)肉樣是否為黑豬肉：
[0017] 當(dāng)步驟(2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度為471bp，同時(shí)，第423個(gè)堿基都為C堿基的純 合狀態(tài)時(shí)，為純種黑豬肉；
[0018] 當(dāng)步驟(2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度為471bp，同時(shí)，第423個(gè)堿基都為C和T的雜合 狀態(tài)(同時(shí)存在C堿基和T堿基)時(shí)，為黑豬與外種豬雜交豬肉；
[0019] 當(dāng)步驟(2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度為471bp，同時(shí)，第423個(gè)堿基都為T堿基的純 合狀態(tài)時(shí);或擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長(zhǎng)度為473bp的DNA片段時(shí)，為普通豬肉，即非黑豬肉。其中，前者 為棕毛豬肉，即杜洛克豬肉；后者為白毛或外種豬雜交豬肉。
[0020] 473bp的DNA片段與471bp的DNA片段相比，其第128個(gè)堿基處插入兩個(gè)堿基CC。
[0021] 所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min;94°C變性3〇8,63.5°(：復(fù)性3〇8,72°(：延伸 40s，30個(gè)循環(huán)；72°C終延伸7min。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：
[0023] 建立了黑豬肉的DNA分子標(biāo)記鑒定技術(shù)體系，可準(zhǔn)確判定豬肉的種源，鑒定結(jié)果準(zhǔn) 確率可達(dá)100 %。
[0024] 利用本發(fā)明技術(shù)可有效維護(hù)我國(guó)地方黑豬產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，規(guī)范黑豬肉市場(chǎng)， 促進(jìn)公平競(jìng)爭(zhēng)，保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益。
【附圖說明】
[0025] 圖1為采用本發(fā)明引物對(duì)對(duì)目標(biāo)肉樣進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體試驗(yàn)方法和附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案及其所產(chǎn)生的技術(shù)效果進(jìn)行 進(jìn)一步的闡述，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本 發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027] 本發(fā)明中所使用的方法如無特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用 的試驗(yàn)材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028] 實(shí)施例1.用于鑒定或輔助鑒定黑豬肉的PCR引物對(duì)的設(shè)計(jì)與合成
[0029] F:5 '-AGCCATGAGCTGAGCAGGAC-3 '
[0030] R:5 '-GAAGCAGAGGCTGGACACCAT-3 '
[0031] 毛色是動(dòng)物品種的重要特征之一，不同豬品種間毛色差異很大。毛色性狀可作為 一種遺傳標(biāo)記，在進(jìn)行雜交育種過程中，可有助于獲得所需要的、能穩(wěn)定遺傳的毛色類型。 而MC1R基因是動(dòng)物黑色素形成調(diào)控中的一個(gè)關(guān)鍵基因，對(duì)決定動(dòng)物的皮毛顏色起著重要的 作用。MC1R通過與α-促黑素(α-MSH)及腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)結(jié)合控制黑色素的形成。它能 被黑素細(xì)胞刺激素(MSH)激活，導(dǎo)致黑素體中真黑素（黑色和褐色）的形成增加，然后通過黑 素體轉(zhuǎn)運(yùn)到周圍的毛發(fā)中。因此，本方法選用MC1R基因作為分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行黑豬肉的鑒 定。
[0032] 針對(duì)MC1R基因，參考其編碼序列（Ensembl序列號(hào)：ENSSSCG00000020924)設(shè)計(jì)了 PCR引物對(duì)，該引物覆蓋了 MC1R基因的外顯子1和外顯子2的編碼序列，通過其編碼區(qū)的單核 苷酸(SNP)突變類型來判定黑豬肉。
[0033] 實(shí)施例2.用于鑒定或輔助鑒定黑豬肉的試劑盒
[0034]將實(shí)施例1設(shè)計(jì)合成的引物F和R分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的dNTP、DNA聚 合酶、10 X buffer緩沖液等包裝于同一試劑盒中，或者將引物F和R分別單獨(dú)包裝后，與 SuperMix-同包裝于同一試劑盒中，即得到本發(fā)明用于鑒定或輔助鑒定黑豬肉的試劑盒。 [0035]實(shí)施例3.鑒定待測(cè)肉樣是否為黑豬肉 [0036] (1)樣品準(zhǔn)備
[0037] 選擇純種的萊蕪黑豬、大蒲蓮黑豬、大白豬、杜洛克豬及雜交的魯萊黑豬、杜長(zhǎng)大 三元商品豬各3頭，從其肌肉組織中提取基因組DNA，提取方法為通用方法。
[0038] (2)PCR 擴(kuò)增
[0039]將上述萊蕪黑豬、大蒲蓮黑豬、大白豬、杜洛克豬、魯萊黑豬、杜長(zhǎng)大三元商品豬6 個(gè)豬種的基因組DNA各三份，用本發(fā)明引物對(duì)一一進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后凝膠電泳檢測(cè)是否有 相應(yīng)擴(kuò)增條帶。
[0040] PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為25yL，其中SuperMix 12.5yL，上、下游引物各0.8yL (lOpmol/μΙ)，模板lyL(100ng/yl)，ddH2〇補(bǔ)足25yL。
[0041 ] PCR 擴(kuò)增程序:94°C 預(yù)變性 3min;94°C 變性 3〇8,63.5°(：復(fù)性3〇8,72°(：延伸4〇8,30個(gè) 循環(huán);72°C終延伸7min;4°C保存。
[0042] PCR結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶，結(jié)果如圖1所示。
[0043] (3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序
[0044] 利用毛細(xì)管電泳DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)定，主要操作步驟如下：
[0045] 1)PCR產(chǎn)物的測(cè)序PCR反應(yīng):純化的PCR產(chǎn)物lyL(10ng/yL)，BigDye8yL(2.5x)，引物 lyL(3.2pmol/yL)，滅菌去離子水10yL。反應(yīng)程序:96°C預(yù)變性lmin; (96°C變性10s，50°C復(fù) 性5s，60°C延伸4min，25個(gè)循環(huán);4°C保溫。
[0046] 2)醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物：每孔依次加入2yL 125mM EDTA和2yL 3M NaAc到 溶液中，再加入50yL 100%酒精，蓋好，震蕩4次，室溫15min。臺(tái)式離心機(jī)12000x g 4°C離心 30min，馬上用槍吸盡上清液。然后，每孔加入70yL70%酒精，12000x g 4°C離心15min，馬上 用槍吸盡上清液。讓酒精在室溫?fù)]發(fā)干凈后，加入10yL Hi-Di Formamide溶解DNA。
[0047] 3)在PCR儀上變性:95 °C4min，4°C 4min。上機(jī)電泳2h。電泳結(jié)束后儀器會(huì)自動(dòng)分析 或打印出彩色測(cè)序圖譜。擴(kuò)增條帶序列如SEQ ID No.3-7所示。
[0048] ⑷結(jié)果
[0049] 測(cè)序結(jié)果表明，由萊蕪黑豬、大蒲蓮黑豬基因組DNA擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度 為471bp，且第423個(gè)堿基處為C堿基純合狀態(tài)(SEQ ID如.3、4)。由魯萊黑豬基因組0嫩擴(kuò)增 出的PCR產(chǎn)物堿基長(zhǎng)度為471bp的DNA片段，且第423個(gè)堿基處為雜合狀態(tài)，即同時(shí)存在C和T 堿基（SEQ ID如.3、5)。由杜洛克豬基因組0嫩擴(kuò)增出的？〇?產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度為47化？，且第 423個(gè)堿基處是T堿基純合狀態(tài)(SEQ ID No.6)。由大白豬、杜長(zhǎng)大三元豬基因組DNA擴(kuò)增出 的PCR產(chǎn)物同時(shí)存在堿基長(zhǎng)度為471bp和473bp(第128個(gè)堿基處插入兩個(gè)堿基CC)的DNA片 段，471bp擴(kuò)增產(chǎn)物的第423個(gè)堿基處是T堿基純合狀態(tài)(SEQ ID No.6、7)。
[0050] 由此，獲得本發(fā)明鑒定或輔助鑒定黑豬肉的方法：用引物對(duì)？：5'_ AGCCATGAGCTGAGCAGGAC-3 ' ； R: 5 ' -GAAGCAGAGGCTGGACACCAT-3 ' 對(duì)待測(cè)豬肉DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度為471bp，同時(shí)，第423個(gè)堿基處為C堿基純合狀態(tài)時(shí)，可鑒定 為純種黑豬肉（黑毛）；當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)存在堿基長(zhǎng)度為471bp的DNA片段，而第423個(gè)堿 基處為雜合狀態(tài)，即同時(shí)存在C和T堿基時(shí)，可鑒定為黑豬與外種豬雜交豬肉，即帶有黑豬血 統(tǒng)的雜種豬肉；當(dāng)PCR產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度為471bp，且第423個(gè)堿基處是T堿基純合狀態(tài)時(shí)，或擴(kuò) 增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度為473bp時(shí)，可鑒定為普通豬肉，即非黑豬肉。
[0051 ]實(shí)施例4.本發(fā)明鑒定或輔助鑒定黑豬肉方法準(zhǔn)確率及靈敏性驗(yàn)證 [0052]準(zhǔn)確率驗(yàn)證:采集員采集若干個(gè)豬品種的肌肉樣本，并編號(hào)，其中有3個(gè)是萊蕪黑 豬(來自萊蕪市萊蕪黑豬保種場(chǎng)），3個(gè)是大蒲蓮豬(來自濟(jì)寧市大蒲蓮豬保種場(chǎng)）、3個(gè)沂蒙 黑豬(來自臨沂市江泉原種豬場(chǎng)），3個(gè)煙臺(tái)黑豬(來自威海市煙臺(tái)黑豬保種場(chǎng)），3個(gè)五蓮黑 豬(來自日照市五蓮黑豬保種場(chǎng)），3個(gè)杜洛克(來自山東省農(nóng)科院原種豬場(chǎng)），3個(gè)大白豬(來 自山東省農(nóng)科院原種豬場(chǎng)），3個(gè)長(zhǎng)白豬（來自山東省農(nóng)科院原種豬場(chǎng)），3個(gè)杜長(zhǎng)大三元豬 (來自濟(jì)南綠安食品有限責(zé)任公司），采集員知曉哪些編號(hào)是黑豬肉，哪些編號(hào)不是黑豬肉， 且未告知實(shí)驗(yàn)人員。實(shí)驗(yàn)人員使用上述引物按照上述方法對(duì)27個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)鑒定，判定 結(jié)果經(jīng)采集員確認(rèn)，準(zhǔn)確率達(dá)到100 %。說明上述黑豬肉的鑒定方法準(zhǔn)確度高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于鑒定或輔助鑒定黑豬肉的PCR引物對(duì)，其特征是，所述引物對(duì)由SEQ ID No. 1和 SEQ ID如.2所示的兩條單鏈0嫩分子組成。2. 用于鑒定或輔助鑒定黑豬肉的試劑盒，其特征是，所述試劑盒中含有權(quán)利要求1所述 引物對(duì)。3. 用于鑒定或輔助鑒定黑豬肉的試劑盒，其特征是，所述試劑盒中還含有dNTP和DNA聚 合酶。4. 權(quán)利要求1所述的引物對(duì)或權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，在鑒定或輔助鑒定黑豬肉 中的應(yīng)用。5. 利用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)或權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，鑒定或輔助鑒定是否 為黑豬肉的方法，其特征是，步驟如下： (1) 對(duì)目標(biāo)肉樣進(jìn)行DNA提?。? (2) 使用權(quán)利要求1所述引物對(duì)，對(duì)步驟(1)中提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3) 對(duì)步驟(2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序； (4) 根據(jù)測(cè)序結(jié)果即可直接判斷目標(biāo)肉樣是否為黑豬肉。6. 如權(quán)利要求5所述方法，其特征是，所述步驟(4)判斷目標(biāo)肉樣是否為黑豬肉的標(biāo)準(zhǔn) 是： a. 當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度為47lbp，同時(shí)，第423個(gè)堿基都為C堿基的純合狀態(tài)時(shí)，為純 種黑豬肉； b. 當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度為471bp，同時(shí)，第423個(gè)堿基為C和T的雜合狀態(tài)， 即同時(shí)存在C堿基和T堿基時(shí)，為黑豬與外種豬雜交豬肉； c. 當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長(zhǎng)度為471bp，同時(shí)，第423個(gè)堿基都為T堿基的純合狀態(tài)時(shí)，或擴(kuò) 增產(chǎn)物堿基長(zhǎng)度為473bp的DNA片段時(shí)，為普通豬肉，即非黑豬肉。7. 權(quán)利要求6所述方法，其特征是，所述473bp的DNA片段與471bp的DNA片段相比，其第 128個(gè)堿基處插入兩個(gè)堿基CC。8. 權(quán)利要求5所述鑒定或輔助鑒定是否為黑豬肉的方法，其特征是，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增 反應(yīng)時(shí)，所采用的退火溫度為63.5 °C。9. 權(quán)利要求5或8所述鑒定或輔助鑒定是否為黑豬肉的方法，其特征是，所述PCR擴(kuò)增程 序?yàn)?94°C預(yù)變性3min;94°C變性3〇8,63.5°(：復(fù)性3〇8,72°(：延伸4〇8,30個(gè)循環(huán) ;72°(：終延伸 7min〇
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105936934SQ201610440259
【公開日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年6月16日
【發(fā)明人】藺海朝, 王彥平, 王繼英, 郭建鳳, 成建國(guó), 林松
【申請(qǐng)人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所