哌可酸4位羥化酶和利用該酶的4-羥基氨基酸的制造法
【專利摘要】本發(fā)明涉及下述(A)、(B)和(C)所例示的哌可酸4位羥化酶蛋白質(zhì)，其具有在α?酮戊二酸和二價鐵離子的存在下作用于L?哌可酸而生成反式?4?羥基?L?哌可酸的活性；以及一種4?羥基氨基酸的制造方法，其特征在于，使該哌可酸4位羥化酶蛋白質(zhì)或含有該哌可酸4位羥化酶蛋白質(zhì)的細胞、該細胞的制備物或?qū)υ摷毎M行培養(yǎng)而得到的培養(yǎng)液與α?氨基酸發(fā)生作用而生成4?羥基氨基酸。(A)具有序列號2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列的多肽；(B)具有在序列號2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列中缺失、置換和/或添加了1個或幾個氨基酸的氨基酸序列、且具有哌可酸4位羥化酶活性的多肽；或(C)具有與序列號2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列、且具有哌可酸4位羥化酶活性的多肽。
【專利說明】
哌可酸4位羥化酶和利用該酶的4-羥基氨基酸的制造法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及利用新型哌可酸4位羥化酶的4-羥基氨基酸的制造法。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基酸羥化酶是在藥品的中間體等的制造中有用的酶，已報道了脯氨酸4位羥化 酶(非專利文獻1)、L-異亮氨酸雙加氧酶(非專利文獻2)等的存在。作為具有哌可酸的羥化 能力的酶，已報道了幾種脯氨酸羥化酶具有使L-哌可酸的3位或5位羥化的能力（非專利文 獻3 )，但迄今為止還沒有使哌可酸的4位輕化的酶的報道例。
[0003] 序列號2、4、6、8、10或12所記載的氨基酸序列分別與基于尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)Fo5176、米曲霉（Aspergillus oryzae)RIB40株、產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium chrysogenum)Wisconsin 54-1255?n(Gibbere 11a zeae :另lj 名Fusarium graminearum(禾谷鏡抱菌））PH_1株、膠抱炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides)Nara gc5株、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans:別名Emericella nidulans(構(gòu)巢裸胞殼））FGSC A4株的基因組序列信息而預(yù)測為對蛋白質(zhì)進行編碼的DNA序列的翻譯氨基酸序列GenBank 登錄號 E ⑶81245、父?_001827566、父?_002558179、父？_383389』1^34460和父卩_659994相同。由 于任一種蛋白質(zhì)均來源于霉菌，因此，存在的情況下，表達后為受到了糖鏈修飾的狀態(tài)的可 能性尚，但還沒有實際進彳丁分尚等而確認其存在的報道例，關(guān)于它們的功能也完全不清楚。
[0004] 光學活性4-羥基氨基酸是作為藥品的中間體等有用的物質(zhì)。例如，（4S)-羥基-L-哌可酸可用作Rho激酶抑制劑的前體(專利文獻1)，（4S)_羥基-D-哌可酸可用作作為NMDA受 體抑制劑的CGS-20281的前體(非專利文獻4)。另外，（4R)-羥基-L-脯氨酸可用作作為緩激 肽B2受體抑制劑的醋酸艾替班特的前體(非專利文獻5)，（4R)-羥基-D-脯氨酸可用作Xa因 子抑制劑的前體(專利文獻2)。此外，L-高絲氨酸可用作作為ACE抑制劑的奧馬屈拉的前體 (專利文獻3)，4_羥基-L-亮氨酸可用作作為親環(huán)蛋白抑制劑的SCY-635的前體(非專利文獻 6)〇
[0005] 作為光學活性4-羥基氨基酸的合成法，例如，關(guān)于(4S)-羥基-L-哌可酸、（4S)-羥 基-D-哌可酸，報道了使3-丁烯醇和光學活性的C-氨基羰基硝酮或C-烷氧基羰基硝酮立體 選擇性地環(huán)化的方法(非專利文獻7)。另外，關(guān)于(4R)-羥基-L-脯氨酸，報道了利用指孢囊 菌(Dactylosporangium)屬RH1株來源的脯氨酸4位輕化酶由L-脯氨酸進行合成的方法(非 專利文獻1)，關(guān)于(4R)_羥基-D-脯氨酸，報道了經(jīng)由α，β_二脫氫氨基酸的方法(非專利文獻 8)。此外，關(guān)于L-高絲氨酸，報道了通過使用重組大腸桿菌的發(fā)酵進行合成的方法(專利文 獻4)，關(guān)于4-羥基-L-亮氨酸，報道了利用蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)2e2 株來源的L-異亮氨酸雙加氧酶由L-亮氨酸進行合成的方法(非專利文獻2)。
[0006] 但是，這些方法分別存在原料昂貴且工序數(shù)多、可應(yīng)用的化合物種類少、純化的負 荷大等問題，要求更高效的合成法。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0008] 專利文獻
[0009] 專利文獻1:日本特表2010-514720號公報
[0010] 專利文獻2:日本特表2009-526813號公報
[0011] 專利文獻3:日本特開平7-48259號公報
[0012] 專利文獻4:W02013/134625號小冊子
[0013]非專利文獻
[0014] 非專利文獻 1 :Shibasaki等、Appl .Environ.Microbiol ·，1999,65,4028
[0015] 非專利文獻2:Hibi等、Appl .Environ.Microbiol ·，2011,77,6926
[0016] 非專利文獻3 :Klein等、Adv · Synth · Catal ·，2011，353，1375
[0017] 非專利文獻 4: Occhiato 等、SYNTHESIS，2009，3611
[0018] 非專利文獻5:Bork等、Nat.Rev.Drug Discov. ,2008,7,801
[0019] 非專利文獻6:Hopkins等、Antimicrobial .Agents Chemother. ,2010,54,660
[0020] 非專利文獻7:Cordero等、Eur.J.Org.Chem. ,2006,3235
[0021] 非專利文獻8:Kimura等、Bull.Chem.Soc.Jpn. ,2002,75,2517

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022]發(fā)明所要解決的問題
[0023]本發(fā)明的課題在于提供新型哌可酸4位羥化酶（U ^酸4位水酸化酵素)和能 夠廉價且簡便地制造4_羥基氨基酸、特別是光學活性4-羥基氨基酸的新方法。
[0024]用于解決問題的方法
[0025] 本發(fā)明人們?yōu)榱私鉀Q上述問題，對光學活性4-羥基氨基酸的制造方法進行了深入 研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，迄今尚無以蛋白質(zhì)形式被分離的報道、功能不清楚的尖孢鐮刀菌 (Fusarium oxysporum)Fo5176株來源的蛋白質(zhì)F0XB_08233及其同源蛋白質(zhì)具有α-酮戊二 酸依賴性的哌可酸4位羥化酶活性。而且發(fā)現(xiàn)，通過使用編碼這些蛋白質(zhì)的DNA制作轉(zhuǎn)化體 并使該轉(zhuǎn)化體細胞、其制備物和/或培養(yǎng)液與各種氨基酸發(fā)生作用，能夠以高光學純度得到 各種光學活性4-羥基氨基酸。本發(fā)明是基于這些發(fā)現(xiàn)而完成的。
[0026] ΒΡ，本發(fā)明的主旨如下。
[0027] [1]-種哌可酸4位羥化酶蛋白質(zhì)，其具有在α_酮戊二酸和二價鐵離子的存在下作 用于L-哌可酸而生成反式-4-羥基-L-哌可酸的活性。
[0028] [2]如[1]所述的哌可酸4位羥化酶蛋白質(zhì)，其選自由下述(Α)、（Β)和(C)組成的組：
[0029] (Α)具有序列號2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列的多肽；
[0030] (Β)具有在序列號2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列中缺失、置換和/或 添加了 1個或幾個氨基酸的氨基酸序列、且具有哌可酸4位羥化酶活性的多肽;或
[0031] (C)具有與序列號2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列具有80%以上的同 一性的氨基酸序列、且具有哌可酸4位羥化酶活性的多肽。
[0032] [3]如[2]所述的哌可酸4位羥化酶蛋白質(zhì)，其利用不具有糖基化能力的宿主以重 組蛋白質(zhì)的形式制造而成。
[0033] [4]-種4-羥基氨基酸的制造方法，其特征在于，使[1]~[3]中任一項所述的哌可 酸4位羥化酶蛋白質(zhì)或含有該哌可酸4位羥化酶蛋白質(zhì)的細胞、該細胞的制備物或?qū)υ摷毎?進行培養(yǎng)而得到的培養(yǎng)液與氨基酸發(fā)生作用而生成4-羥基氨基酸。
[0034] [5]如[4]所述的4-羥基氨基酸的制造方法，其中，上述α-氨基酸由下述通式（I)表 示，上述4-羥基氨基酸由下述通式（II)表示，
[0036]式（I)中，1^、1?2、1?3、1?4和1?5分別表示氫原子或碳原子數(shù)1~3的烷基，1? 2可以與1?5或 氨基的氮原子鍵合而形成環(huán)結(jié)構(gòu)，
[0038] 式（II)中，R\R2、R3、R4和R5分別表示氫原子或碳原子數(shù)1~3的烷基，R 2可以與R5或 氨基的氮原子鍵合而形成環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0039] [6]如[4]所述的4-羥基氨基酸的制造方法，其中，上述α-氨基酸為哌可酸，上述為 4-羥基-L-哌可酸。
[0040] [7]如[4]~[6]中任一項所述的4-羥基氨基酸的制造方法，其中，含有上述哌可酸 4位羥化酶的細胞是被編碼哌可酸4位羥化酶蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化了的細胞。
[0041] [8]如[7]所述的4-羥基氨基酸的制造方法，其中，編碼上述哌可酸4位羥化酶蛋白 質(zhì)的DNA選自由下述(D)、（E)和(F)組成的組：
[0042] (D)具有序列號1、3、5、7、9、11、15或17所表示的堿基序列的0嫩；
[0043] (E)包含在序列號1、3、5、7、9、11、15或17所表示的堿基序列中置換、缺失或添加了 1個或幾個堿基的堿基序列、且編碼具有哌可酸4位羥化酶活性的多肽的DNA;
[0044] (F)包含在嚴格條件下與序列號1、3、5、7、9、11、15或17所表示的堿基序列的互補 鏈雜交的堿基序列、且編碼具有哌可酸4位羥化酶活性的多肽的DNA。
[0045] [9]-種微生物，其為被選自由下述(D)、（E)和(F)組成的組中的編碼哌可酸4位羥 化酶蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化了的微生物：
[0046] (D)具有序列號1、3、5、7、9、11、15或17所表示的堿基序列的0嫩；
[0047] (E)包含在序列號1、3、5、7、9、11、15或17所表示的堿基序列中置換、缺失或添加了 1個或幾個堿基的堿基序列、且編碼具有哌可酸4位羥化酶活性的多肽的DNA;
[0048] (F)包含在嚴格條件下與序列號1、3、5、7、9、11、15或17所表示的堿基序列的互補 鏈雜交的堿基序列、且編碼具有哌可酸4位羥化酶活性的多肽的DNA。
[0049] [10]如[9]所述的微生物，其選自埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和棒狀桿 菌屬。
[0050] 發(fā)明效果
[0051] 根據(jù)本發(fā)明，能夠高效地制造各種4-羥基氨基酸。特別是能夠以高光學純度高效 地制造作為藥物中間體有用的(4S)-羥基-L-哌可酸、（4S)-羥基-D-哌可酸等光學活性4-羥 基氨基酸。
【附圖說明】
[0052]圖1是示出使經(jīng)pF〇PA4H轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌與L-脯氨酸反應(yīng)而得到的反應(yīng)液的LC-MS分析結(jié)果的圖。
[0053]圖2是示出使經(jīng)pF〇PA4H轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌與L-亮氨酸反應(yīng)而得到的反應(yīng)液的LC-MS分析結(jié)果的圖。
[0054]圖3是示出使經(jīng)pF〇PA4H轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌與L-哌可酸反應(yīng)而得到的反應(yīng)液的LC-MS分析結(jié)果的圖。
[0055] 圖4是示出使經(jīng)pEnPA4H轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌與D-脯氨酸反應(yīng)而得到的反應(yīng)液的LC-MS分析結(jié)果的圖。
[0056] 圖5是示出使經(jīng)pEnPA4H轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌與（S)-2-氨基丁酸反應(yīng)而得到的反應(yīng) 液的LC-MS分析結(jié)果的圖。
[0057]圖6是示出使將pF〇PA4H轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌與L-哌可酸反應(yīng)而得到的反應(yīng)產(chǎn)物的 h-NMR分析結(jié)果的圖（半色調(diào)畫像）。
[0058]圖7是示出使經(jīng)pF〇PA4H轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌與L-哌可酸反應(yīng)而得到的反應(yīng)產(chǎn)物的 13c-nmr分析結(jié)果的圖（半色調(diào)畫像）。
[0059] 圖8是示出使由經(jīng)pEnPA4H轉(zhuǎn)化了的大腸桿菌得到的無細胞提取液與（5S)-羥基-L-哌可酸反應(yīng)而得到的反應(yīng)液的LC-MS分析結(jié)果的圖。
[0060] 圖9是示出使由經(jīng)pEnPA4H進行了轉(zhuǎn)化的大腸桿菌得到的無細胞提取液與(4S)-羥 基-L-脯氨酸反應(yīng)而得到的反應(yīng)液的LC-MS分析結(jié)果的圖。
【具體實施方式】
[0061 ]以下，詳細地對本發(fā)明進行說明。
[0062]〈哌可酸4位羥化酶和使用哌可酸4位羥化酶的4-羥基氨基酸的制造方法〉
[0063]本發(fā)明的哌可酸4位羥化酶為具有序列號2、4、6、8、10、12、16或18所記載的氨基酸 序列的物質(zhì)、或者作為該氨基酸序列的同源物且具有哌可酸4位羥化酶活性的物質(zhì)。
[0064] 序列號2、4、6、8、10或12所記載的氨基酸序列分別來源于尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)c8D株、米曲霉（Aspergillus oryzae)RIB40株、產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium chrysogenum)Wisconsin 54-1255?n(Gibbere 11a zeae :另lj 名Fusarium graminearum(禾谷鏡抱菌））PH_1株、膠抱炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides)Nara gc5株、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans:別名Emericella nidulans(構(gòu)巢裸胞殼））FGSC A4株，是本發(fā)明中被鑒定為哌可酸4位羥化酶的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。序列號16或18所記載 的氨基酸序列是經(jīng)由從日本國內(nèi)的土壤樣品中直接回收的DNA的解析而得到的序列，是本 發(fā)明中被鑒定為哌可酸4位羥化酶的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。序列號16所記載的氨基酸序列 與Variovorax paradoxus EPS(爭論貪菌EPS)來源的功能未知蛋白質(zhì)(GenBank登錄號 YP_004156498)顯示出97 %的同源性，但尚無確認其功能的報道例。另外，序列號18所記載 的氨基酸序列與Burkholderia sp Α1(伯克霍爾德氏菌Α1)來源的功能未知蛋白質(zhì) (GenBank登錄號WP_029951026)顯示出50 %的同源性，但尚無確認其功能的報道例。
[0065]任一種序列僅根據(jù)序列信息均難以推測為哌可酸的羥化酶，本發(fā)明中首次鑒定為 哌可酸4位羥化酶。
[0066]需要說明的是，哌可酸4位羥化酶可以使用多種。
[0067]本說明書中，哌可酸4位羥化酶活性是指，在α-酮戊二酸和二價鐵的存在下向L-哌 可酸的4位的碳原子上附加羥基而生成反式-4-羥基-L-哌可酸的活性。這樣的活性可以通 過如下方法來確認:在含有L-哌可酸作為底物、且進一步含有α-酮戊二酸和二價鐵作為輔 因子的反應(yīng)體系中，作為酶對目的蛋白質(zhì)、表達該蛋白質(zhì)的細胞或其制備物起作用，如后述 的實施例那樣測定反式-4-羥基-L-哌可酸的生成。
[0068]作為具有本發(fā)明的序列號2、4、6、8、10、12、16或18所記載的氨基酸序列的哌可酸4 位羥化酶的同源物，只要保持哌可酸4位羥化酶活性，可以列舉具有在序列號2、4、6、8、10、 12、16或18所記載的氨基酸序列中缺失、置換或添加了 1個或幾個氨基酸的氨基酸序列的蛋 白質(zhì)。在此，"1個或幾個氨基酸"是指例如1~100個、優(yōu)選1~50個、更優(yōu)選1~20個、進一步 優(yōu)選1~10個、特別優(yōu)選1~5個氨基酸。
[0069] 另外，只要保持哌可酸4位羥化酶活性，上述同源物也可以為與序列號2、4、6、8、 10、12、16或18所示的氨基酸序列全長具有至少80%以上、優(yōu)選90%以上、進一步優(yōu)選95% 以上的序列同一性的蛋白質(zhì)。
[0070] 本發(fā)明中可使用的哌可酸4位羥化酶也可以由上述的微生物純化得到，但也可以 通過利用PCR、雜交等公知的方法對編碼哌可酸4位羥化酶的DNA進行克隆化、并使其在適當 的宿主中表達來得到。
[0071] 作為編碼哌可酸4位羥化酶的DNA，可以列舉例如包含序列號1、3、5、7、9、11、15或 17所表示的堿基序列的DNA。
[0072] 另外，只要編碼具有哌可酸4位羥化酶活性的蛋白質(zhì)，也可以為包含序列號1、3、5、 7、9、11、15或17的堿基序列的DNA的同源物。作為這樣的同源物，可以列舉例如包含在序列 號1、3、5、7、9、11、15或17的堿基序列中置換、缺失或添加了1個或幾個堿基的堿基序列的 DNA〇
[0073] 在此所述的1個或幾個堿基為例如1~300個、優(yōu)選1~150個、更優(yōu)選1~60個、進一 步優(yōu)選1~30個、特別優(yōu)選1~15個堿基。
[0074] 此外，只要編碼具有哌可酸4位羥化酶活性的蛋白質(zhì)，上述DNA的同源物也可以為 在嚴格條件下與序列號1、3、5、7、9、11、15或17的堿基序列的互補鏈雜交的DNA。在此，作為 "嚴格條件"，可以列舉例如包括在〇· 1 XSSC(saline-sodium citrate，朽1檬酸鈉緩沖液）、 0 · 1 % SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉）、60°C的條件下進行清洗的條件。
[0075] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過使用定點誘變法（Nucleic Acids Res . 10，pp . 6487 (1982)、Methods in Enzymol.100 ，pp.448(1983)、Molecular Cloning、PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991))等向序列號1、3、5、7、9、11、15或17的0嫩等中適當導 入置換、缺失、插入和/或添加突變來得到如上所述的DNA同源物。
[0076] 另外，也可以基于序列號2、4、6、8、10、12、16或18的氨基酸序列或其一部分、序列 號1、3、5、7、9、11、15或17所表示的堿基序列或其一部分，對例如日本DNA數(shù)據(jù)庫（DNA Databank of JAPAN，DDBJ)等數(shù)據(jù)庫進行同源檢索，獲取哌可酸4位羥化酶活性的氨基酸信 息或?qū)ζ溥M行編碼的DNA的堿基序列信息。
[0077] 本發(fā)明的4-羥基氨基酸的制造方法中，可以將哌可酸4位羥化酶直接用于反應(yīng)，但 優(yōu)選使用含有哌可酸4位羥化酶的細胞、該細胞的制備物或?qū)υ摷毎M行培養(yǎng)而得到的培 養(yǎng)液。
[0078] 作為含有哌可酸4位羥化酶的細胞，可以使用原本就具有哌可酸4位羥化酶的微生 物等的細胞，但優(yōu)選使用利用編碼哌可酸4位羥化酶的基因進行了轉(zhuǎn)化的細胞。
[0079] 作為含有哌可酸4位羥化酶的細胞的制備物，可以使用例如將該細胞利用丙酮、二 甲基亞砜(DMS0)、甲苯等有機溶劑、表面活性劑進行處理而得到的制備物、進行冷凍干燥處 理而得到的制備物、利用物理方法或酶進行破碎而得到的制備物等細胞制備物、將細胞中 的酶級分以粗制物或純化物的形式取出而得到的制備物、以及進一步將這些制備物固定到 以聚丙烯酰胺膠、卡拉膠等為代表的載體上而得到的制備物等。
[0080] 將如上所述分離得到的、編碼哌可酸4位羥化酶的DNA以能夠表達的方式插入到公 知的表達載體中，由此提供哌可酸4位羥化酶表達載體。然后，利用該表達載體對宿主細胞 進行轉(zhuǎn)化，由此能夠得到導入有編碼哌可酸4位羥化酶的DNA的轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體也可以通過 將編碼哌可酸4位羥化酶的DNA利用同源重組等方法以能夠表達的方式組入宿主的染色體 DNA中來得到。
[0081 ]作為轉(zhuǎn)化體的制作方法，具體而言，可以例示如下方法:將編碼哌可酸4位羥化酶 的DNA導入到在微生物等的宿主細胞中穩(wěn)定存在的質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體中，將 所構(gòu)建的表達載體導入到該宿主細胞中，或者直接將該DNA導入到宿主基因組中，對其遺傳 信息進行轉(zhuǎn)錄、翻譯。此時，優(yōu)選在宿主中將適當?shù)膯幼舆B接于DNA的5'-側(cè)上游，進一步， 更優(yōu)選將終止子連接于3'-側(cè)下游。作為這樣的啟動子和終止子，只要是已知在用作宿主的 細胞中發(fā)揮功能的啟動子和終止子則沒有特別限定，例如，在"微生物學基礎(chǔ)講座8基因工 程·共立出版"等中詳細地記述了能夠在宿主微生物中利用的載體、啟動子和終止子。
[0082] 作為用于表達哌可酸4位羥化酶的作為轉(zhuǎn)化對象的宿主微生物，只要宿主本身不 會給氨基酸的反應(yīng)帶來不利影響則沒有特別限定，具體而言可以列舉如下所示的微生 物。
[0083] 屬于埃希氏菌（Escherichia)屬、芽孢桿菌（Bacillus)屬、假單胞菌屬 (Pseudomonas)屬、沙雷氏菌（Serratia)屬、短桿菌（Brevibacterium)屬、棒狀桿菌 (Corynebacterium)屬、鏈球菌（Streptococcus)屬、乳桿菌(Lac tobac i 1 lus)屬等的已確立 了宿主載體系統(tǒng)的細菌。
[0084] 屬于紅球菌（Rhodococcus)屬、鏈霉菌（Streptomyces)屬等的已確立了宿主載體 系統(tǒng)的放線菌。
[0085] 屬于酵母（Saccharomyces)屬、克魯維酵母（Saccharomyces)屬、裂殖酵母 (Schizosaccharomyces)屬、接合酵母(Zygosaccharomyces)屬、耶氏酵母(Yarrowia)屬、絲 抱酵母(Trichosporon)屬、紅冬抱酵母(Rhodosporidium)屬、漢遜酵母(Hansenula)屬、畢 赤酵母(Pichia)屬、假絲酵母(Candida)屬等的已確立了宿主載體系統(tǒng)的酵母。
[0086] 屬于脈抱菌（Neurospora)屬、曲霉（Aspergi llus)屬、頭抱菌（Cephalosporium) 屬、木霉菌(Trichoderma)屬等的已確立了宿主載體系統(tǒng)的霉菌。
[0087] 用于制作轉(zhuǎn)化體的步驟、適合于宿主的重組載體的構(gòu)建和宿主的培養(yǎng)方法可以按 照分子生物學、生物工程、基因工程的領(lǐng)域中常用的技術(shù)來進行（例如，分子克隆 (Molecular Cloning)中記載的方法）。
[0088] 以下，具體地列舉優(yōu)選的宿主微生物、各微生物的優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法、載體、啟動子、 終止子等的示例，但本發(fā)明不限定于這些示例。
[0089] 在埃希氏菌屬、特別是大腸桿菌(Escherichia coli)中，作為質(zhì)粒載體，可以列舉 pBR、pUC系質(zhì)粒，可以列舉lac(0-半乳糖苷酶）、trp(色氨酸操縱子）、七8(：、1：1^(]^、1:印的融 合）、來源于λ噬菌體PL、PR等的啟動子等。另外，作為終止子，可以列舉trpA來源、噬菌體來 源、rrnB核糖體RNA來源的終止子等。
[0090] 在芽孢桿菌屬中，作為載體，可以列舉PUB110系質(zhì)粒、PC194系質(zhì)粒等，另外，也可 以整合到染色體中。作為啟動子和終止子，可以利用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等 的酶基因的啟動子、終止子等。
[0091] 在假單胞菌屬中，作為載體，可以列舉在惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、洋 蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)等中已確立的一般的宿主載體系統(tǒng)、參與甲苯化合物 的分解的質(zhì)粒、以T0L質(zhì)粒為基礎(chǔ)的廣宿主載體(包含來源于RSF1010等的自主復制所需要 的基因）pKT240(Gene，26，273-82( 1983)) 〇
[0092] 在短桿菌屬、特別是乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)中，作為 載體，可以列舉pAJ43(Gene 39,281 (1985))等質(zhì)粒載體。作為啟動子和終止子，可以利用在 大腸桿菌中使用的各種啟動子和終止子。
[0093] 在棒狀桿菌屬、特別是谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)中，作為 載體，可以列舉 pCSll(日本特開昭57-183799 號公報）、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196,175 (1984))等質(zhì)粒載體。
[0094] 在酵母(Saccharomyces)屬、特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，作 為載體，可以列舉YRp系、YEp系、YCp系、Yip系質(zhì)粒。另外，可以利用醇脫氫酶、甘油醛-3-磷 酸脫氫酶、酸性磷酸酶、半乳糖苷酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶等的各種酶基因的啟動 子、終止子。
[0095] 在裂殖酵母（Schizosaccharomyces)屬中，作為載體，可以列舉Mol .Cell .Biol .6， 80(1986)中記載的粟酒裂殖酵母(5(：11丨2〇83(^1^1'〇1115^68。〇11^6)來源的質(zhì)粒載體。特別是 PAUR224,其由寶酒造銷售，可以容易地利用。
[0096] 在曲霉(Aspergillus)屬中，黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)等在霉菌中被研究得最多，能夠用于向質(zhì)粒、染色體中的整合，能夠利用菌體外蛋 白酶、淀粉酶來源的啟動子(Trendsin Biotechnology 7,283-287(1989))。
[0097] 作為上述微生物中特別優(yōu)選的微生物，可以列舉不具有糖基化能力的埃希氏菌 屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和棒狀桿菌屬的微生物。
[0098]另外，除了上述以外，已確立了適于各種微生物的宿主載體系統(tǒng)，可以對它們進行 適當使用。
[0099]另外，除了微生物以外，在植物、動物中已確立了各種宿主載體系統(tǒng)，特別是確立 了使用蠶的在昆蟲等動物中（Nature 315,592-594(1985))或在菜籽、玉米、馬鈴薯等植物 中大量表達異種蛋白質(zhì)的系統(tǒng)、以及使用大腸桿菌無細胞提取液或小麥胚芽等的無細胞蛋 白質(zhì)合成系統(tǒng)的系統(tǒng)，可以適當?shù)丶右岳谩?br>[0100]使哌可酸4位羥化酶、含有該酶的細胞、該細胞的制備物或培養(yǎng)液在α-酮戊二酸和 二價鐵離子的存在下作用于作為反應(yīng)底物的氨基酸，由此生成4-羥基氨基酸。
[0101]在此，作為反應(yīng)底物的α-氨基酸只要在4位具有能夠取代為羥基的氫原子則沒有 特別限制，可以例示下述通式(I)所表示的化合物。另外，作為4-羥基氨基酸，可以例示下述 通式(II)所表示的化合物。需要說明的是，α-氨基酸和4-羥基氨基酸優(yōu)選為L體或D體，但也 可以為外消旋體。
[0103] 通式（I)和（II)中，R\R2和R5分別表示氫原子或碳原子數(shù)1~3的烷基，R3和R 4分別 表示氫原子、碳原子數(shù)1~3的烷基或羥基。R2可以與R5或氨基的氮原子鍵合而形成環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0104] 作為具體的α-氨基酸的種類，可以列舉例如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸(R2 與氨基的氮原子鍵合而形成了 5元環(huán)）、α_氨基丁酸、正纈氨酸、正亮氨酸、哌可酸(R2與R5鍵 合而形成了 6元環(huán)）、3_羥基脯氨酸、3-羥基哌可酸、5-羥基哌可酸等，特別優(yōu)選為哌可酸。
[0105] 反應(yīng)在含有α_氨基酸、α_酮戊二酸、二價鐵離子和哌可酸4位羥化酶或含有哌可酸 4位羥化酶的細胞、該細胞的制備物或培養(yǎng)物的水性介質(zhì)中、或該水性介質(zhì)與有機溶劑的混 合物中進行。
[0106] 作為水性介質(zhì)，可以列舉水或緩沖液。在此，作為緩沖液，只要是不抑制哌可酸4位 羥化酶的活性的緩沖液則沒有特別限制，可以例示例如磷酸緩沖液、MES(2-1〇印11〇1；[11061：1^1168111；1^011；[03(^(1，2-嗎啉乙磺酸）緩沖液等。作為有機溶劑，可以使用甲 醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亞砜等反應(yīng)底物的溶解度高的溶 劑。另外，作為有機溶劑，還可以使用對于反應(yīng)副產(chǎn)物的除去等具有效果的乙酸乙酯、乙酸 丁酯、甲苯、氯仿、正己烷等。
[0107] 成為反應(yīng)底物的α-氨基酸，通常以底物濃度為0.01%w/v~90%w/v、優(yōu)選為0.1% w/v~30 % w/v的范圍使用。反應(yīng)底物可以在反應(yīng)開始時一次性地添加，但從減少存在酶的 底物抑制的情況下的影響的觀點、提高產(chǎn)物的蓄積濃度的觀點出發(fā)，優(yōu)選連續(xù)地或間歇地 進行添加。
[0108]反應(yīng)所需要的α-酮戊二酸通常以與底物為等摩爾或等摩爾以上、優(yōu)選為等摩爾~ 1.2倍摩爾的范圍添加。α_酮戊二酸可以在反應(yīng)開始時一次性地添加，但從減少對酶存在抑 制作用的情況下的影響的觀點、提高產(chǎn)物的蓄積濃度的觀點出發(fā)，優(yōu)選連續(xù)地或間歇地進 行添加。或者，也可以添加葡萄糖、L-谷氨酸等宿主能夠進行代謝的廉價化合物來代替α-酮 戊二酸，使宿主代謝，將在該過程中產(chǎn)生的酮戊二酸用于反應(yīng)。
[0109] 反應(yīng)所需要的二價鐵離子通常以0 · 01mmol/L~100mmol/L、優(yōu)選0 · lmmol/L~ 10mmol/L的范圍使用。二價鐵離子通常在反應(yīng)開始時一次性地添加來進行使用，但在反應(yīng) 中被氧化為三價鐵離子、或者形成沉淀而減少的情況下，補充添加也是有效果的。另外，在 哌可酸4位羥化酶、含有該酶的細胞、該細胞的制備物或培養(yǎng)液中已經(jīng)含有足夠的二價鐵離 子的情況下，也可以不添加。
[0110] 反應(yīng)在通常在4°C~60°C、優(yōu)選為10°C~45°C的反應(yīng)溫度下在通常為pH3~11、優(yōu) 選為pH5~8的條件下進行。反應(yīng)時間通常為約1小時~約7 2小時。
[0111] 關(guān)于向反應(yīng)液中添加的細胞和/或該細胞制備物的量，在添加細胞的情況下，向反 應(yīng)液中按照該細胞的濃度以濕菌體重計通常為約0.1 % w/v~約50 % w/v、優(yōu)選為1 % w/v~ 20 % w/v的方式添加，在使用細胞制備物的情況下，求出細胞制備物的酶的比活性，以添加 時達到上述細胞濃度的量進行添加。
[0112] 通過本發(fā)明的方法生成的4-羥基氨基酸可以在反應(yīng)結(jié)束后利用離心分離、膜處理 等分離出反應(yīng)液中的菌體、蛋白質(zhì)等，之后通過將利用1-丁醇、叔丁醇等有機溶劑進行的提 取、蒸餾、使用離子交換樹脂或硅膠等的柱層析法、等電點處的析出或利用一鹽酸鹽、二鹽 酸鹽、鈣鹽等進行的析出等適當組合來進行純化。
[0113] [實施例]
[0114] 以下，利用實施例進一步詳細地對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不限定于此。
[0115] 實施例1
[0116] 〈哌可酸4位羥化酶基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建〉
[0117] (1)基因的克隆
[0118] 基于編碼尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)Fo5176來源的假定蛋白質(zhì)F0XB_ 08233的基因序列，設(shè)計、合成出用于擴增假定蛋白質(zhì)F0XB_08233同源基因的全長的引物 B0F1和B0R1。將各自的堿基序列示于序列表的序列號13和14。
[0119]將尖抱鏡刀菌（Fusarium oxysporum)c8D在馬鈴薯葡萄糖（Potato dextrose)液 體培養(yǎng)基（日本BD公司制造）下培養(yǎng)一夜，使用DNeasy血液和組織試劑盒(DNeasy Blood& Tissue Kit)(奪7^公司制造)從所得到的菌體中制備出染色體DNA。
[0120] 以所制備的各菌株來源的染色體DNA作為模板，以序列號13和14的寡核苷酸作為 引物，利用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)分別擴增出約lkbp的DNA片段。PCR使用Tks Gflex DNA聚 合酶(寶生物公司制造），按照附帶的操作說明書的條件實施反應(yīng)。溫度程序為:在95°C保持 1分鐘保持后，將(98 °C、10秒;56 · 5 °C、15秒;68°C、40秒)重復35個循環(huán)，在72 °C保持3分鐘后 結(jié)束。將解析所得到的DNA序列的結(jié)果示于序列號1，另外，將該DNA序列所編碼的氨基酸序 列示于序列號2。
[0121] (2)表達用質(zhì)粒的制備
[0122] 將上述（1)中得到的DNA片段利用限制性酶BamΗI和Hi nd 111進行消化，使用 Ligation-Convenience試劑盒（日本基因公司制造），導入到利用限制性酶BamHI和Hindlll 進行了消化的質(zhì)粒載體PQE80L(奪7歹乂公司制造）中。以下，將所得到的質(zhì)粒稱為 pF〇PA4H。另外，由DNA2.0公司合成序列號3、5、7、9和11的DNA序列，并由該公司插入到表達 質(zhì)粒pjexpress411中。以下，將所得到的質(zhì)粒分別稱為pAoPA4H、pPcPA4H、GzPA4H、pCgPA4H 和pEnPA4H。
[0123] 實施例2
[0124] 〈哌可酸4位羥化酶的活性評價〉
[0125] 使用實施例 1 中得到的 6 種質(zhì)粒、pFoPA4H、pAoPA4H、pPcPA4H、GzPA4H、pCgPA4!^P pEnPA4H，按照常規(guī)方法對大腸桿菌(Escherichia coli)Rosetta 2(DE3)(默克密理博公司 制造）進行轉(zhuǎn)化。所得到的重組大腸桿菌分別使用含有卡那霉素50mg/L、氯霉素15mg/L、 IPTG( Isopropyl0-D_l-thiogalactopyranoside，異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷）lmmol/L 的 液體LB培養(yǎng)基在30°C振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)第20小時收集菌體。
[0126] 使用所得到的菌體，在含有α-酮戊二酸15mmol/L、抗壞血酸5mmol/L、三(2-羧基乙 基)膦鹽酸鹽5mmol/L、FeS〇4 · 7H2〇 0.5mmol/L、梓檬酸3mmol/L、各種底物化合物10mmol/L 的50mmol/L MES(2_Morpholinoethanesulfonic acid，2-嗎啉乙橫酸）緩沖液中在20°C、 PH6的條件下反應(yīng)21小時。
[0127] 將反應(yīng)后的反應(yīng)液利用下述條件的高效液相色譜(HPLC)進行分析。
[0128] 柱:CHIRALPAK AD-3(4.6X250mm、大賽璐化學公司制造）
[0129] 洗脫液：己烷：乙醇:三氟乙酸=95:5:0.1
[0130] 流速:0.8ml/分鐘
[0131] 溫度：30°C
[0132] 檢測：UV 210nm
[0133] 實施例3
[0134] 〈反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定〉
[0135] 將實施例2中得到的反應(yīng)液使用沃特世公司的AccQ標簽(AccQ · Tag)法制成衍生 物后，用下述條件的高效液相色譜質(zhì)譜儀(LC-MS)進行分離分析，由此測定氨基酸的反應(yīng)產(chǎn) 物。
[0136] 柱:XBridge C18 5ym(2.1X150mm、沃特世公司制造）
[0137] 洗脫液厶:乙酸銨（10臟〇1/1、？!15)
[0138] 洗脫液B:甲醇（0~0 · 5分鐘（0 % 41 % )，0 · 5~18分鐘（1 % -5 % )，18~19分鐘 (5%49%)，19~29.5分鐘（9%417%)，29.5~40分鐘（17%-60%)，40~43分鐘（60%))
[0139] 流速:0.3ml/分鐘
[0140] 溫度：3(TC
[0141] 檢出：質(zhì)譜儀
[0142] 關(guān)于使用6種大腸桿菌得到的反應(yīng)液，將在LC-MS分析中確認到出現(xiàn)新的峰的底物 氨基酸示于表1。確認到這些新反應(yīng)產(chǎn)物的分子量均比底物增加16,由此認為均為在底物中 添加了氧原子的化合物。
[0143] 表1
[0145] 將（1)含有利用pF〇PA4H進行了轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和L-脯氨酸的反應(yīng)液的LC-MS分析 結(jié)果示于圖1。反應(yīng)產(chǎn)物的峰顯示出與反式-4-羥基-L-脯氨酸的標準物質(zhì)相同的保留時間， 由此推定該反應(yīng)產(chǎn)物為反式-4-羥基-L-脯氨酸。該結(jié)果在使用利用pAoPA4H或pEnPA4H進行 了轉(zhuǎn)化的大腸桿菌時也同樣。
[0146] 將(2)含有利用pF〇PA4H進行了轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和L-亮氨酸的反應(yīng)液的LC-MS分析 結(jié)果示于圖2。反應(yīng)產(chǎn)物的峰顯示出與4-羥基-L-亮氨酸的標準物質(zhì)相同的保留時間，由此 推定該反應(yīng)產(chǎn)物為反式-4-羥基-L-亮氨酸。該結(jié)果在使用利用pA 〇PA4H、pPCPA4H、GzPA4H、 pCgPA4H或pEnPA4H進行了轉(zhuǎn)化的大腸桿菌時也同樣。
[0147] 將(3)使利用pF〇PA4H轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌與L-哌可酸反應(yīng)而得到的反應(yīng)產(chǎn)物利用 下述條件的高效液相色譜(HPLC)進行了分離。
[0148] 柱：TSKgel Amide80(7.8X300mm、東曹公司制造）
[0149] 洗脫液：乙酸銨（10臟〇1/1、？!15):乙腈=15:85
[0150] 流速:2.3ml/分鐘
[0151] 溫度:4(TC
[0152] 檢測：UV 210nm
[0153] 回收含有反應(yīng)產(chǎn)物的洗脫液，利用離心蒸發(fā)器進行減壓干燥。將殘留物利用重水 懸浮后，測定核磁共振譜。
[0154] 根據(jù)1H-NMR(圖6)、13C-NMR(圖7)解析的結(jié)果所得到的化學位移值和HH-COSY、CH-HM Q C解析的結(jié)果所得到的相關(guān)性、以及文獻信息（Μ ο 1 n a r，T .等、2 0 0 8， Bioorg.Med.Chem.Lett.，18,6290)，鑒定出該反應(yīng)產(chǎn)物為反式-4-羥基-L-哌可酸。
[0155] 將含有利用pF〇PA4H進行了轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和L-哌可酸的反應(yīng)液的LC-MS分析結(jié) 果示于圖3。作為反應(yīng)產(chǎn)物的反式-4-羥基-L-哌可酸的峰在10.9分洗脫。該結(jié)果在使用利用 pAoPA4H、pPcPA4H、GzPA4H、pCgPA4H或pEnPA4H進行了轉(zhuǎn)化的大腸桿菌時也同樣。
[0156] 將(4)含有利用pEnPA4H進行了轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和D-脯氨酸的反應(yīng)液的LC-MS分析 結(jié)果示于圖4。反應(yīng)產(chǎn)物的峰顯示出與順式-4-羥基-L-脯氨酸的標準物質(zhì)相同的保留時間， 由此推定該反應(yīng)產(chǎn)物為順式-4-羥基-D-脯氨酸。
[0157] 將(5)含有利用pEnPA4H進行了轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和(S)-2-氨基丁酸的反應(yīng)液的LC-MS分析結(jié)果示于圖5。反應(yīng)產(chǎn)物的峰顯示出與L-高絲氨酸的標準物質(zhì)相同的保留時間，由此 推定該反應(yīng)產(chǎn)物為L-高絲氨酸。
[0158] 實施例4
[0159] 〈哌可酸4位羥化酶的羥化為羥基氨基酸的羥化活性評價〉
[0160] 使用由實施例2中得到的菌體得到的無細胞提取液，在含有α-酮戊二酸15mmo 1/L、 抗壞血酸5mmol/L、三（2-羧基乙基）膦鹽酸鹽5mmol/L、FeS〇4 · 7H2〇 0.5mmol/L、梓檬酸 3mmol/L、各種底物化合物10mmol/L的50mmol/L MES緩沖液中，在20°C、pH6的條件下反應(yīng)21 小時。反應(yīng)后的反應(yīng)液利用實施例2中記載的條件的高效液相色譜(HPLC)進行分析。
[0161] 關(guān)于使用2種無細胞提取液得到的反應(yīng)液，將在LC-MS分析中確認到出現(xiàn)新的峰的 底物的羥基氨基酸示于表2。確認到這些新反應(yīng)產(chǎn)物的分子量比底物增加16,由此認為均為 在羥基氨基酸上添加了氧原子而得到的二羥基氨基酸。
[0162] 表2
[0164] 實施例5
[0165] <哌可酸4位羥化酶基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建>
[0166] 根據(jù)從土壤樣品中直接回收的DNA的序列解析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了認為可能是氨基酸 羥化酶的基因的序列號15和17。將各自所編碼的氨基酸序列示于序列號16和18。
[0167] 通過PCR分別擴增出約lkbp的DNA片段。對于所得到的片段，按照實施例1中記載的 方法導入到PQE80L(奪公司制造）中。以下，將所得到的質(zhì)粒分別稱為pVsPA4H和 pBsPA4H。
[0168] 實施例6
[0169] <哌可酸4位羥化酶的活性評價>
[0170] 使用實施例5中得到的2種質(zhì)粒pVsPA4H和pBsPA4H，按照常規(guī)方法對大腸桿菌 (Escherichia coli)Rosetta 2(DE3)(默克密理博公司制造)進行轉(zhuǎn)化。將所得到的重組大 腸桿菌分別使用含有氨芐青霉素50mg/L、氯霉素15mg/L、IPTG lmmol/L的液體LB培養(yǎng)基在 30°C下振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)第20小時收集菌體。使用由所得到的菌體得到的無細胞提取液，在 含有α-酮戊二酸15mmol/L、抗壞血酸5mmol/L、三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽5mmol/L、FeS〇4 · 7H2〇 0·5mmol/L、梓檬酸3mmol/L、底物化合物(L-哌可酸）10mmol/L的50mmol/L MES緩沖液 中，在20 °C、pH6的條件下反應(yīng)21小時。
[0171] 將反應(yīng)后的反應(yīng)液利用上述的高效液相色譜(HPLC)進行分析。其結(jié)果，在任一反 應(yīng)液中均確認到與反式-4-羥基-L-哌可酸的分子量一致的化合物。
【主權(quán)項】
1. 一種贓可酸4位徑化酶蛋白質(zhì)，其具有在α-酬戊二酸和二價鐵離子的存在下作用于 k贓可酸而生成反式-4-徑基-心贓可酸的活性。2. 如權(quán)利要求1所述的贓可酸4位徑化酶蛋白質(zhì)，其選自由下述(A)、（B)和（C)組成的 組： (A) 具有序列號2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列的多膚； (B) 具有在序列號2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列中缺失、置換和/或添加 了 1個或幾個氨基酸的氨基酸序列、且具有贓可酸4位徑化酶活性的多膚;或 (C) 具有與序列號2、4、6、8、10、12、16或18所表示的氨基酸序列具有80%^上的同一性 的氨基酸序列、且具有贓可酸4位徑化酶活性的多膚。3. 如權(quán)利要求2所述的贓可酸4位徑化酶蛋白質(zhì)，其利用不具有糖基化能力的宿主W重 組蛋白質(zhì)的形式制造而成。4. 一種4-徑基氨基酸的制造方法，其特征在于，使權(quán)利要求1~3中任一項所述的贓可 酸4位徑化酶蛋白質(zhì)或含有該贓可酸4位徑化酶蛋白質(zhì)的細胞、該細胞的制備物或?qū)υ摷毎?進行培養(yǎng)而得到的培養(yǎng)液與α-氨基酸發(fā)生作用而生成4-徑基氨基酸。5. 如權(quán)利要求4所述的4-徑基氨基酸的制造方法，其中， 所述α-氨基酸由下述通式(I)表示，所述4-徑基氨基酸由下述通式(II)表示，式(I)中，Ri、R哺R5分別表示氨原子或碳原子數(shù)1~3的烷基，R哺R4分別表示氨原子、碳 原子數(shù)1~3的烷基或徑基，R2可W與R5或氨基的氮原子鍵合而形成環(huán)結(jié)構(gòu)，式（II)中，Ri、R2和R5分別表示氨原子或碳原子數(shù)1~3的烷基，R3和R 4分別表示氨原子、 碳原子數(shù)1~3的烷基或徑基，R2可W與R5或氨基的氮原子鍵合而形成環(huán)結(jié)構(gòu)。6. 如權(quán)利要求4所述的4-徑基氨基酸的制造方法，其中，所述α-氨基酸為贓可酸，所述 4-徑基氨基酸為4-徑基-心贓可酸。7. 如權(quán)利要求4~6中任一項所述的4-徑基氨基酸的制造方法，其中，含有所述贓可酸4 位徑化酶的細胞是被編碼贓可酸4位徑化酶蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化了的細胞。8. 如權(quán)利要求7所述的4-徑基氨基酸的制造方法，其中，編碼所述贓可酸4位徑化酶蛋 白質(zhì)的DNA選自由下述(D)、化)和(巧組成的組： (D) 具有序列號1、3、5、7、9、11、15或17所表示的堿基序列的DNA; 化)包含在序列號1、3、5、7、9、11、15或17所表示的堿基序列中置換、缺失或添加了1個 或幾個堿基的堿基序列、且編碼具有贓可酸4位徑化酶活性的多膚的DNA; (F)包含在嚴格條件下與序列號1、3、5、7、9、11、15或17所表示的堿基序列的互補鏈雜 交的堿基序列、且編碼具有贓可酸4位徑化酶活性的多膚的DM。9. 一種微生物，其為被選自由下述(D)、化)和(F)組成的組中的編碼贓可酸4位徑化酶 蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化了的微生物： (D)具有序列號1、3、5、7、9、11、15或17所表示的堿基序列的DNA; 化)包含在序列號1、3、5、7、9、11、15或17所表示的堿基序列中置換、缺失或添加了1個 或幾個堿基的堿基序列、且編碼具有贓可酸4位徑化酶活性的多膚的DNA; (F)包含在嚴格條件下與序列號1、3、5、7、9、11、15或17所表示的堿基序列的互補鏈雜 交的堿基序列、且編碼具有贓可酸4位徑化酶活性的多膚的DNA。10. 如權(quán)利要求9所述的微生物，其選自埃希氏菌屬、芽抱桿菌屬、假單胞菌屬和棒狀桿 園屬。
【文檔編號】C12P13/04GK105940103SQ201580006796
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2015年1月27日
【發(fā)明人】日比慎, 小川順, 三宅良磨, 川端潤
【申請人】株式會社Api