治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的化合物及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的化合物、藥物組合物及其應(yīng)用，該化合物具有式(Ⅰ)的結(jié)構(gòu)，這些化合物可作為ROCK抑制劑，而被制成適當(dāng)?shù)乃幬飫┬陀糜谥委熒窠?jīng)退行性疾病。式（I）。
【專利說明】
治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的化合物及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的化合物、藥物組合物 及其應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一系列具有多功能的ROCK抑制劑的制備方法及其應(yīng)用，它們可被 制成適當(dāng)?shù)乃幬飫┬陀糜谥委熒窠?jīng)退行性疾病。
【背景技術(shù)】
[0002] 中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(包括阿爾茨海默病、帕金森氏癥、亨廷頓舞蹈病等）的 發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，但是一般認(rèn)為這些疾病是由多因素促成，主要包括各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 通路的紊亂、氧化應(yīng)激和自由基的形成、神經(jīng)興奮性毒性和炎癥反應(yīng)、蛋白的錯誤折疊、多 巴胺能神經(jīng)和膽堿神經(jīng)遞質(zhì)失衡等。這種多因素促成性，使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的 發(fā)病機(jī)理研究及藥物研發(fā)困難重重。
[0003] 隨著系統(tǒng)生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)復(fù)雜疾?。ㄈ缰袠型诵行约膊?、腫瘤等)并 不是由單一信號通路所介導(dǎo)，而是由整個疾病網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控?；诩膊〉木W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué) (Network pharmacology)理論，調(diào)控疾病網(wǎng)絡(luò)某一節(jié)點(diǎn)的單祀點(diǎn)藥物不能滿足治療復(fù)雜疾 病的需求。"一病一靶點(diǎn)、一藥一靶點(diǎn)"的傳統(tǒng)治療模式，不是治療復(fù)雜疾病的有效策略。針 對誘發(fā)疾病的多個靶點(diǎn)、多個節(jié)點(diǎn)蛋白同時干預(yù)，從而調(diào)控整個疾病機(jī)制網(wǎng)絡(luò)的多靶點(diǎn)藥 物(MTDs)有望成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病更優(yōu)的策略。
[0004] 近年來多項研究結(jié)果顯示，Rho/ROCK信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病 過程中起到了非常重要的作用，ROCK抑制劑有望成為治療中樞神經(jīng)退行性疾病的新藥物。 研究發(fā)現(xiàn)，ROCK抑制劑發(fā)揮作用可能主要通過以下途徑:減少Αβ淀粉樣蛋白的產(chǎn)生;促進(jìn) 神經(jīng)元再生和存活;擴(kuò)張腦血管，改善大腦血流分布；調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸的可塑性;促進(jìn)軸突 的生長;促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化；另外ROCK抑制劑還能調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng) 激和炎癥反應(yīng)。雖然ROCK抑制劑在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中表現(xiàn)出了良好的前景， 但是現(xiàn)有的ROCK抑制劑治療靶點(diǎn)單一，難以透過血腦屏障，易出現(xiàn)低血壓和消化道出血等 副作用，限制了它在這方面的應(yīng)用。
[0005] 硫辛酸（lipoic acid，LA)被譽(yù)為"萬能抗氧劑"，是已知天然抗氧劑中效果最強(qiáng)的 一種。它是丙酮酸脫氫酶的輔助因子，也是代謝性抗氧劑，在生物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為還原型的 二氫硫辛酸((1;[117(11'011?0;^&(^(1，0!11^)，它的抗氧化能力包括 :清除自由基和活性氧;抑 制脂質(zhì)過氧化;螯合金屬離子;與其他體內(nèi)的抗氧劑作用。硫辛酸具有分子量低和兩親性的 特點(diǎn)，容易透過血腦屏障，可以在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化作用，因此被認(rèn)為是治療神經(jīng)退 行性疾病的有用小分子化合物。但是硫辛酸在體內(nèi)不穩(wěn)定，作用靶點(diǎn)較為單一，僅具有抗氧 化作用，近年來多將其與其他藥物聯(lián)用或?qū)⑵渥鳛樵O(shè)計多靶點(diǎn)藥物的藥效團(tuán)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于以上研究和多靶點(diǎn)藥物研發(fā)理論，我們將具有ROCK激酶抑制作用的藥效團(tuán)和 硫辛酸偶聯(lián)，合成了 一系列多功能ROCK抑制劑。
[0007] 本發(fā)明的一系列化合物的特點(diǎn)在于存在兩個主要的單元:抗氧化部分和ROCK激酶 抑制部分，通過偶聯(lián)，將這兩部分雜合在一個分子中，以達(dá)到多靶點(diǎn)，同時改善化合物血腦 屏障透過性的目的，從而有效治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。
[0008] 本發(fā)明涉及式(I)的化合物或其互變異構(gòu)體、藥用鹽、前藥或溶劑化物：
其中，
[0009] 本發(fā)明的另一方面提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明所述的任一化合物或其藥 學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0010] 本發(fā)明的另一方面提供本發(fā)明的任一化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療 中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病為阿爾 茨海默病、帕金森氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥或亨廷頓舞蹈病。
[0011] 本發(fā)明的另一方面提供一種多功能ROCK抑制劑，其包含本發(fā)明所述的任一化合物 或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0012] 除非另外指明，本發(fā)明的化合物還意欲包括區(qū)別僅在于存在一個或多個同位素富 集的原子的化合物。例如，用氘或氚替換氫，或者用 13C或14C_富集的碳原子替換碳原子，或 15n-富集的氮原子替換氮原子的化合物屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0013] 屬于"藥用鹽、衍生物、溶劑化物、前藥"是指任何藥用鹽，酯，溶劑化物，或經(jīng)施用 于接受者后能夠提供(直接或間接)本文所述化合物的其他化合物。然而，應(yīng)當(dāng)理解非藥用 鹽也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)，因為那些可能用于植被藥用鹽，鹽，前藥和衍生物的植被可以通 過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。例如，本發(fā)明提供的化合物的藥用鹽可以通過常規(guī)方法由母體 化合物合成，該母體化合物含有堿或酸部分。通常，該鹽例如通過將游離酸或堿形式的這些 化合物與化學(xué)計算量的適當(dāng)堿或酸在水中或在有機(jī)溶劑中或在兩者的混合物中制備。通 常，非水性介質(zhì)如乙醚，乙酸乙酯，乙醇，異丙醇或乙腈是優(yōu)選的。酸加成鹽的實(shí)例包括無機(jī) 酸加成鹽例如，鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，硫酸鹽，硝酸鹽，和有機(jī)酸加成鹽，如例如乙酸 鹽，馬來酸鹽，富馬酸鹽，檸檬酸鹽，草酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，蘋果酸鹽，扁桃酸鹽和對 甲苯磺酸鹽。堿加成鹽的實(shí)例包括無機(jī)鹽如鈉、鉀、鈣、銨、鎂、鋁和鋰鹽；以及有機(jī)堿如乙二 胺、乙醇胺、N，N-二烷基乙醇胺、三乙醇胺、葡糖胺和堿性氨基酸鹽。
[0014]優(yōu)選的衍生物或前藥是相對于母體物質(zhì)，當(dāng)將這些化合物使用于患者時提高本發(fā) 明化合物的生物利用度(例如通過使得口服給藥的化合物更容易被吸收到血液中）或增強(qiáng) 母體化合物向生物區(qū)室(例如腦或淋巴系統(tǒng)）的傳遞的那些。
[0015] 式（I)化合物前藥的任何化合物屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語"前藥"以其最廣泛的 意義使用并且包括在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為本發(fā)明化合物的那些衍生物。這些衍生物對于本領(lǐng)域技術(shù) 人員是顯而易見的，并且根據(jù)分子中存在的官能團(tuán)，包括不限于本發(fā)明化合物的下列衍生 物:酯;氨基酸酯;磷酸;金屬鹽硫酸;氨基甲酸酯和酰胺。
[0016] 本發(fā)明的化合物可以是作為有利化合物或作為溶劑化物的晶體形式，意欲將兩種 形式都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。溶劑化的方法是本領(lǐng)域公知的。適當(dāng)?shù)娜軇┗锸撬幱萌?劑化物。在一個具體實(shí)施方案中，溶劑化物是水合物。
[0017] 反應(yīng)路線列舉了制備本發(fā)明的化合物的方法。
[0018] 反應(yīng)路線1 在〇°C條件下將鈉氫(60%)加入包含取代基的醇中，反應(yīng)15分鐘后加入化合物a，將反應(yīng) 溫度升至室溫，攪拌過夜，反應(yīng)完畢，加水和有機(jī)溶劑（乙酸乙酯或者二氯甲烷)萃取得到粗 產(chǎn)物b; 將化合物2、4-吡啶硼酸噸吶醇酯、K2C03、Pd (pph3) 4、混合溶劑（甲苯:水：乙醇=3:2:1) 加入到15ml封管中，抽真空，使混合物在真空、100°C條件反應(yīng)6-10小時，反應(yīng)完畢，除去溶 劑后，通過快速色譜法純化粗產(chǎn)物得化合物c; 化合物c在甲醇溶液中通過雷尼鎳、水合肼還原，反應(yīng)完畢過濾得到化合物d; 化合物d和硫辛酸在EDCI、DMAP、Et3N(或HATU、DIEA)存在的條件下在二氯甲烷(或DMF) 溶液中偶聯(lián)反應(yīng)6-12小時，反應(yīng)完畢通過萃取、快速色譜法純化粗產(chǎn)物得目標(biāo)化合物1-8。
[0019] 反應(yīng)路線2
將化合物b、N-B0C-吡唑硼酸頻哪醇酯、Cs2C03、PdCl (dppf)、混合溶劑（1，4-二氧六環(huán)： 水=10:1)加入到15ml封管中，抽真空，使混合物在真空、70°C條件反應(yīng)6-8小時，反應(yīng)完畢， 除去溶劑后，通過快速色譜法純化粗產(chǎn)物得化合物e; 化合物e在甲醇溶液中通過鈀碳/氫氣還原，反應(yīng)完畢過濾得到化合物f; 化合物f和硫辛酸在HATU、DIEA存在的條件下在DMF溶液中偶聯(lián)反應(yīng)4-12小時，反應(yīng)完 畢通過萃取、快速色譜法純化粗產(chǎn)物得化合物g; 化合物g在二氯甲烷溶液中，三氟乙酸存在的條件下脫掉B0C保護(hù)基，飽和碳酸氫鈉萃 取得到目標(biāo)化合物9-16。
[0020] 如果需要，可以通過常規(guī)方法如結(jié)晶法或色譜法純化反應(yīng)產(chǎn)物。當(dāng)用于制備本發(fā) 明化合物的上述方法產(chǎn)生立體異構(gòu)體的混合物時，這些異構(gòu)體可以通過常規(guī)技術(shù)如制備色 譜法分離。如果存在手性中心，化合物可能以外消旋形式制備，或者可以通過對映特異性合 成或通過拆分來制備單個的對映異構(gòu)體。
[0021] -種優(yōu)選的藥用形式是結(jié)晶形式，包括藥物組合物中的這種形式。如果是鹽和溶 劑化物，另外的離子或溶劑部分也應(yīng)當(dāng)是非毒性。本發(fā)明的化合物可以存在不同的多晶型 物，意欲本發(fā)明包括所有這些形式。
[0022] 由上述發(fā)明式（I)表示的典型化合物，其鹽，它們的溶劑化物或前藥顯示較強(qiáng)的血 腦屏障透過率，相當(dāng)?shù)腞OCK抑制作用、提高內(nèi)源性抗氧化蛋白谷胱甘肽的水平、神經(jīng)保護(hù)作 用以及溫和的血管擴(kuò)張作用。因此，本發(fā)明另一方面涉及治療、改善或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病 的方法，該方法包含向需要這種治療的對象施用治療有效量的式（I)的化合物或其藥物組 合物。在優(yōu)選的方法中，所述對象為哺乳動物，例如人。
[0023] 本發(fā)明的化合物和組合物可以與其它藥物一起使用以提供聯(lián)合治療。其它藥物可 以形成相同組合物的一部分，或者可以作為同時或不同時給藥的分開的組合物提供。
【附圖說明】
[0024] 圖1:化合物對L-glutamate誘導(dǎo)HT22細(xì)胞死亡的保護(hù)作用。###P〈0.001，與正常組 比較；*Ρ〈〇·〇5廣Ρ〈0·01，*# K0.001與谷氨酸組比較。
[0025] 圖2:化合物15對細(xì)胞內(nèi)R0S(A，B)和GSH(C)水平的影響。A (a) CT; (b) Glu; (c) ΙμΜ 15 + Glu; (d) 3μΜ 15 + Glu; (e) ΙΟμΜ 15 + Glu; (f) ΙΟμΜ LA + Glu;標(biāo)尺： 100 μπι ###K〇.〇01，與正常組比較；***Ρ〈〇·〇01，**Ρ〈〇·01與谷氨酸組比較。
[0026] 圖3:化合物15對預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用。#P〈0.01廣*P〈0.001與DMS0組比較。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 提供下列實(shí)施例進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，它們不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是對本發(fā)明范圍的限 定。
[0028] 實(shí)施例丨-5-(12-二硫環(huán)戊烷-3-基)-N-(4_(吡啶-4-基)苯基)戊酰胺(1)
按照上述合成路線1合成化合物1，得到淡黃色固體，三步總產(chǎn)率為52%. ^NMR (400 MHz, CDC13) δ 8.62 (d, /= 4.7 Hz, 2H), 7.96 (s, 1H), 7.68 (d, /= 8.1 Hz, 2H), 7.60 (d, /= 8.4 Hz, 2H), 7.48 (d, /= 5.2 Hz, 2H), 3.64 - 3.49 (m, 1H), 3.22 - 3.04 (m, 2H), 2.53 - 2.33 (m, 3H), 1.90 (dt, /= 19.7, 6.8 Hz, 1H), 1.84 - 1.62 (m, 4H), 1.61 - 1.43 (m, 2H). 13C 匪R (100 MHz, CDC13) δ 171.4， 150.1, 147.7, 139.2, 133.4, 127.6, 121.3, 120.2, 56.4, 40.3, 38.5, 37.4, 34.7， 28.9， 25.2. ESI-HRMS for [Ci9H23N20S2]+，calcd: 359.1246; found: 359.1232. 純度：100% (HPLC)?！?實(shí)施例2 - [ 5-(1,2-二硫環(huán)戊烷-3-基)-N-(2-氟-4-(吡啶-4-基)苯基)戊酰胺(2)
按照上述合成路線1合成化合物2,得到淡黃色固體，3步總產(chǎn)率為32.8%.咕NMR (400 MHz, CDC13) δ 8.65 (d， J = 6.0 Hz, 2H)， 8.48 (t， J = 8.2 Hz, 1H)， 7.51 - 7.35 (m, 5H), 3.66 - 3.53 (m, 1H), 3.25 - 3.06 (m, 2H), 2.57 - 2.37 (m, 3H), 1.93 (td, J = 13.6, 6.9 Hz, 1H), 1.87 - 1.72 (m, 4H), 1.62 - 1.47 (m, 2H).13C NMR (100 MHz, CDCb) δ 170.16 (s), 151.50 (d, /= 243.8 Hz), 149.33 (s), 145.51 (d, /= 1.8 Hz), 133.04 (d, /= 7.5 Hz), 126.22 (d, /= 10.5 Hz), 122.13 (d, /= 3.0 Hz), 121.10 (s), 120.13 (s), 112.21 (d, /= 20.7 Hz), 55.32 (s), 39.24 (s), 37.49 (s), 36.43 (s), 33.64 (s), 27.80 (s), 24.07 (s). ESI-HRMS for [Ci9H22FN20S2] +，calcd: 377.1158; found: 377.1151.純度：99%(HPLC). 實(shí)施例3 - 5-(1,2-二硫環(huán)戊烷-3-基)-N-(2-甲氧基-4-(吡啶-4-基)苯基)戊酰胺(3)
按照上述合成路線1合成化合物3,得到淡黃色固體，三步總產(chǎn)率為22%.咕NMR (400 MHz, CDC13) δ 8.62 (dd， J = 4.5， 1.6 Hz, 2H)， 8.50 (d， J = 8.4 Hz, 1H)， 7.83 (s, 1H), 7.47 (dd, J = 4.5, 1.6 Hz, 2H), 7.29 - 7.23 (m, 1H), 7.11 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.64 - 3.52 (m, 1H), 3.24 - 3.06 (m, 2H), 2.54 - 2.39 (m, 3H), 1.97 - 1.85 (m, 2H), 1.83 - 1.69 (m, 4H), 1.60 - 1.47 (m, 2H). 13C 匪R (100MHz, CDC13) δ 170.0， 149.2， 147.1， 147.0， 132.3， 127.7， 120.3， 119.0, 107.3, 75.7, 55.4, 54.9, 39.3, 37.5, 36.7, 33.7, 27.8, 24.2. ESI-HRMS for [C20H25N202S2] +，calcd: 389.1352; found: 389.1350.純度：99%. 實(shí)施例4 - 5-(1,2-二硫環(huán)戊烷-3-基)-N-(3-氟-4-(吡啶-4-基)苯基)戊酰胺(4)
按照上述合成路線1合成化合物4,淡黃色固體，3步總產(chǎn)率為45.2%.咕NMR (400 MHz, CDCb) δ 8.66 (s, 1H), 8.63 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 7.68 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.59 - 3.48 (m, 1H), 3.21 - 3.02 (m, 2H), 2.46 - 2.36 (m, 3H), 1.87 (td, J = 13.6, 6.9 Hz, 1H), 1.81 - 1.61 (m, 4H), 1.56 - 1.43 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, CDCh) δ 171.8， 161.3， 158.8， 149.7， 143.5， 140.8， 140.6， 130.3， 130.2， 123.5, 123.4, 121.1, 121.0, 115.6, 108.1, 107.8, 56.4, 40.3, 38.5, 37.3, 34.6, 28.9, 25.2. ESI-HRMS for [C19H22FN2OS2]+,calcd: 377.1152; found: 377.1136.純度：98%. 實(shí)施例5 - 5-(1,2-二硫環(huán)戊烷-3-基)-N-(3-甲氧基-4-(吡啶-4-基)苯基)戊酰胺(5)
按照上述合成路線1合成化合物5,得到黃色固體，3步總產(chǎn)率為78.8%.咕NMR (400 MHz, CDC13) δ 8.59 (dd, /= 4.6, 1.6 Hz, 2H), 7.78 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.47 (dd, /= 4.5, 1.6 Hz, 2H), 7.28 (d, /= 8.3 Hz, 1H), 6.96 (dd, /= 8.3, 2.0 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.58 (td, /= 12.7, 6.4 Hz, 1H), 3.26 - 3.06 (m, 2H), 2.51 - 2.39 (m, 3H), 1.91 (dt, /= 19.7, 6.9 Hz, 1H), 1.84 - 1.69 (m, 4H), 1.58 - 1.48 (m, 2H). 13C 匪R (100 MHz, CDC13) δ 171.5，157.2，149.2， 146.2, 140.3, 130.5, 124.2, 122.9, 111.7, 103.4, 56.4, 55.6, 40.3, 38.5, 37.4, 34.7, 28.9, 25.2. ESI-HRMS for [C20H25N202S2] +,calcd: 389.1352; found: 389.1342.純度：99%. 實(shí)施例6 - N-(2-(2-(二甲基氨基）乙氧基)-4-(吡啶-4-基)苯基)-5-(1,2-二硫環(huán)戊 烷基-3_)戊酰胺(6)
按照上述合成路線1合成化合物6,得到淡黃色固體，4步總產(chǎn)率為67.8%.咕NMR (400 MHz, CDC13) δ 9.34 (s， 1H)， 8.54 (dd， J = 4.5， 1.6 Hz, 2H)， 8.40 (d， J = 8.5 Hz, 1H), 7.39 (dd, J = 4.5, 1.6 Hz, 2H), 7.24 (dd, J = 8.5, 2.0 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.12 (t, J = 5.2 , 2H), 3.57 - 3.48 (m, 1H), 3.17 - 2.99 (m, 2H), 2.63 (t , J = 5.2 , 2H), 2.41 - 2.34 (m, 3H), 2.29 (s, 6H), 1.85 (td, J = 13.8, 7.0 Hz, 1H), 1.76 - 1.62 (m, 4H), 1.53 - 1.40 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, CDCb) δ 170.7, 149.1, 147.0, 146.8, 132.2, 130.0, 120.2, 112.1, 67.0, 57.0, 55.4, 44.2, 39.2, 37.5, 36.2, 33.7, 28.0, 24.3. ESI-HRMS for [C23H32N302S2]+,calcd: 446.1930; found: 446.1929. Purity: 99%. 實(shí)施例7- 5-(1,2-二硫環(huán)戊烷-3-基)-N-(2-((l-甲基哌啶-4-基）甲氧基)-4-(吡啶-4-基)苯基)戊酰胺(7)
按照上述合成路線1合成化合物7,棕黃色固體，4步總產(chǎn)率為64.8%.咕NMR (400 MHz, CDCb) δ 8.62 (d, J = 4.6 Hz, 2H), 8.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.47 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 7.10 (s, 1H), 3.99 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 3.64 -3.53 (m, 1H), 3.21- 3.08 (m, 2H), 3.06 - 2.91 (m, 3H), 2.51- 2.43 (m, 3H), 2.33 (s，3H)，2.08 - 1.72 (m，17H). 13C NMR (100 MHz, CDCb) δ 171.0，150.2， 148.2, 147.5, 133.4, 128.7, 121.4, 120.2, 120.0, 109.4, 73.2, 56.4, 55.2, 46.2, 40.3, 38.5, 37.8, 35.2, 34.7, 29.0, 28.9, 25.3. ESI-HRMS for [C26H36N302S2]+，calcd: 486.2243; found: 486.2234.純度：98%. 實(shí)施例8 - 5_( 1，2_二硫環(huán)戊燒_3_基)-N-(4_B比啶_4_基)2-(2,2,2,-二氣乙氧基)苯 基)戊酰胺(8)
按照上述合成路線1合成化合物8,得到淡黃色固體，4步總產(chǎn)率為40.4%.咕NMR (400 MHz, CDC13) δ 8.64 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 8.52 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.45 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.13 (s, 1H), 4.52 (dd, J = 15.7, 7.8 Hz, 2H), 3.69 - 3.52 (m, 1H), 3.29 - 3.04 (m, 2H), 2.59 -2.37 (m, 3H), 1.92 (dt, J = 19.7, 6.8 Hz, 1H), 1.88 - 1.67 (m, 4H), 1.64 -1.45 (m, 2H). 13C 匪R (100 MHz, CDCh) δ 170.0, 149.3，146.2，145.2，132.7， 128.2, 123.5, 121.2, 120.7, 120.2, 120.1, 109.7, 66.5, 66.1, 65.8, 65.4, 55.3, 39.2, 37.5, 36.7, 33.7, 27.8, 24.1. ESI-HRMS for [C21H24F3N202S2] +, calcd: 457.1226; found: 457.1225.純度：99%. 實(shí)施例9 - N-(4-(lH-吡唑-4-基)苯基)-5-(1,2-二硫環(huán)戊烷-3-基)戊酰胺(9)
按照上述合成路線2合成化合物9,得到白色固體，4步總產(chǎn)率為5.6%.咕匪R (400 MHz, DMS0) δ 12.81 (s, 1H), 9.86 (s, 1H), 7.97 (s, 2H), 7.57 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 3.74 - 3.56 (m, 1H), 3.26 - 3.05 (m, 2H), 2.41 (td, J = 12.5, 6.3 Hz, 1H), 2.30 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.87 (dt, J = 19.7, 6.8 Hz, 1H), 1.77 - 1.55 (m, 4H), 1.46 - 1.37 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 170.9, 137.2, 127.7, 125.3, 120.9, 119.4, 56.1, 38.1, 36.2, 34.1, 28.3, 24.9. ESI-HRMS for [C17H22N30S2] +，calcd: 348.1199; found: 348.1195.純度：97%. 實(shí)施例10 - 5-(1,2-二硫環(huán)戊烷-3-基)-N-(2-氟吡唑-4-基）苯基)戊酰胺 (10)
按照上述合成路線2合成化合物10,得到淡黃色固體，4步總產(chǎn)率為7%.咕匪R (400 MHz, DMSO) δ 12.94 (s, 1Η), 9.60 (s, 1H), 8.06 (s, 2H), 7.77 (t, /= 8.4 Hz, 1H), 7.49 (dd, /= 12.3, 1.8 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 8.3, 1.5 Hz, 1H), 3.62 (td, J = 12.3, 6.2 Hz, 1H), 3.22 - 3.05 (m, 2H), 2.45 - 2.31 (m, 3H), 1.87 (dq, J = 13.5, 6.8 Hz, 1H), 1.75 - 1.52 (m, 4H), 1.48 - 1.33 (m, 5H). 13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 171.41 (s), 154.14 (d, J = 243.8 Hz), 130.44 (d, J = 7.6 Hz), 124.73 (s), 123.62 (d, J = 12.2 Hz), 120.62 (d, J = 2.8 Hz), 119.98 (d, J = 1.9 Hz), 111.82 (d, J = 20.8 Hz), 56.10 (s), 38.07 (s), 35.52 (s), 34.08 (s), 28.23 (s), 24.87 (s). ESI-HRMS for [C17H21FN30S2] +, calcd: 366.1105; found: 366.1098.純度：97%. 實(shí)施例11 - 5-(1,2-二硫環(huán)戊烷-3-基)-N-(2-甲氧基吡唑-4-基)苯基)戊酰 胺(11)
按照上述合成路線2合成化合物11，得到白色固體，4步總產(chǎn)率為14.3%. ^NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.90 (s, 1Η), 9.02 (s, 1H), 8.34 - 7.76 (m, 3H), 7.23 (s, 1H), 7.13 (d, /= 8.2 Hz, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.62 (td, /= 12.5, 6.2 Hz, 1H), 3.26 -3.06 (m, 2H), 2.47 - 2.32 (m, 3H), 1.87 (dq, /= 13.5, 6.8 Hz, 1H), 1.77 -1.50 (m, 4H), 1.48 - 1.33 (m, 2H).13C 匪R (100 MHz, DMSO) δ 171.6， 150.5， 129.7, 125.8, 122.9, 121.7, 117.3, 108.6, 56.7, 56.2, 38.6, 36.3, 34.6, 28.8, 25.5. ESI-HRMS for [C18H24N302S2] + ,calcd: 378.1304; found: 378.1306. Purity: 99%. 實(shí)施例12 - 5-(1,2-二硫環(huán)戊烷-3-基)-N-(3-氟-4_(1H-吡唑-4-基）苯基)戊酰胺 (12)
按照上述合成路線2合成化合物12,得到淡黃色固體，4步總產(chǎn)率為15.3%.咕匪R (400 MHz, DMSO) δ 13.00 (s, 1Η), 10.08 (s, 1H), 7.98 (s, 2H), 7.73 - 7.57 (m, 2H), 7.28 (dd, J = 8.5, 1.8 Hz, 1H), 3.67 - 3.56 (m, 1H), 3.24 - 3.06 (m, 2H), 2.47 - 2.37 (m, 1H), 2.33 (dd, J = 18.4, 11.0 Hz, 2H), 1.87 (td, J = 13.4, 6.8 Hz, 1H), 1.74 - 1.52 (m, 4H), 1.46 - 1.35 (m, 2H).13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 171.8, 159.9, 157.4, 139.0, 138.9, 128.3, 128.2, 115.5, 115.5, 115.4, 115.3, 115.1, 115.0, 107.0, 106.7, 56.6, 38.6, 36.7, 34.6, 28.8, 25.2. ESI-HRMS for [C17H21FN30S2]+,calcd: 366.1105; found: 366.1090. Purity: 98%. 實(shí)施例13 - 5-(1,2-二硫環(huán)戊烷-3-基)-N-(3-甲氧基-4_(1H-吡唑-4-基)苯基)戊酰 胺（13)
按照上述合成路線2合成化合物13,得到橘黃色固體，4步總產(chǎn)率為4.3%.咕NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.78 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 7.96 (s, 2H), 7.50 (d, /= 8.3 Hz, 1H), 7.44 (d, /= 1.6 Hz, 1H), 7.15 (dd, /= 8.4, 1.8 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.67 - 3.57 (m, 1H), 3.23 - 3.07 (m, 2H), 2.41 (dt, /= 18.7, 6.3 Hz, 1H), 2.30 (t, /= 7.3 Hz, 2H), 1.87 (td, /= 13.5, 6.8 Hz, 1H), 1.75 - 1.54 (m, 4H), 1.46 - 1.36 (m, 2H). 13C 匪R (100 MHz, DMSO) δ 171.0，155.4，138.4， 127.0, 116.8, 116.2, 111.2, 102.7, 56.1, 55.2, 38.1, 36.3, 34.1, 28.3, 24.8. ESI-HRMS for [C18H24N302S2]+,calcd: 378.1304; found: 378.1301. Purity: 98%. 實(shí)施例14^(2-(2-(二甲基氨基）乙氧基)-4-(1!1-吡唑-4-基)苯基)-5-(1，2-二硫環(huán)戊 燒_3_基)戊酰胺(14)
按照上述合成路線2合成化合物14,得到淡黃色固體，4步總產(chǎn)率為16.1%.咕匪R (400 MHz, DMSO) δ 12.89 (s, 1Η), 9.34 (s, 1H), 8.14 (s, 2H), 7.92 (d, /= 8.0 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.18 (d, /= 7.9 Hz, 1H), 4.16 (t, /= 4.8 Hz, 2H), 3.71 - 3.53 (m, 1H), 3.22 - 3.11 (m, 2H), 2.63 (t, /= 4.8 Hz, 2H), 2.46 - 2.38 (m, 1H), 2.38 - 2.30 (m, 2H), 2.27 (s, 6H), 1.87 (dt, /= 19.2, 6.5 Hz, 1H), 1.80 - 1.50 (m, 4H), 1.50 - 1.30 (m, 2H).13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 171.3, 149.4, 136.9, 129.6, 127.5, 125.9, 122.5, 121.5, 118.5, 112.3, 68.3, 58.0, 56.6, 55.4, 45.7, 38.6, 36.6, 34.7, 28.8, 25.5. ESI-HRMS for [C21H31N402S2]+, calcd: 435.1883; found: 435.1883.純度：99%. 實(shí)施例15 - 5-( 1,2-二硫環(huán)戊烷-3-基)-N-(2-((1-甲基哌啶-4-基）甲氧基-4-( 1H-吡 唑-4-基)苯基)戊酰胺(15)
按照上述合成路線2合成化合物15,得到白色固體，4步總產(chǎn)率為24.6%.咕NMR (400 MHz, CDC13) δ 8.34 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.80 (s, 2H), 7.73 (s, 1H), 7.09 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 3.96 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 3.64 - 3.52 (m, 1H), 3.24 - 3.08 (m, 2H), 3.06 - 2.96 (m, 2H), 2.50 - 2.41 (m, 4H), 2.36 (s, 3H), 2.15 - 2.05 (m, 3H), 1.96 - 1.82 (m, 5H), 1.82 - 1.68 (m, 5H), 1.66 - 1.50 (m, 5H). 13C NMR (100 MHz, CDCb) δ 170.8, 147.6, 131.0, 128.3, 126.3, 122.5, 120.5, 118.5, 108.7, 73.1, 56.4, 55.2, 46.1, 40.3, 38.5, 37.7, 35.2, 34.7, 29.7, 28.9, 25.4. ESI-HRMS for [C24H35N402S2] +, calcd: 475.2196; found: 475.2179.純度：99%. 實(shí)施例16 - N-(4-(lH-吡唑-4-基)苯基）-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基)-5-(1,2-二 硫環(huán)戊烷基_3_)戊酰胺(16)
按照上述合成路線2合成化合物16,得到白色固體，4步總產(chǎn)率為8.7%.咕匪R (400 MHz, DMSO) δ 12.91 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.09 (s, 2H), 7.66 (d, /= 7.0 Hz, 1H), 7.40 (s, 1H), 7.25 (d, /= 7.8 Hz, 1H), 4.81 (d, /= 8.6 Hz, 2H), 3.68 - 3.60 (m, 1H), 3.25 - 2.98 (m, 2H), 2.46 - 2.22 (m, 3H), 1.88 (dd, /= 12.0, 6.2 Hz, 1H), 1.80 - 1.52 (m, 4H), 1.49 - 1.36 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 171.7, 149.7, 130.7, 125.9, 125.8, 125.2, 123.1, 121.2, 119.2, 111.2, 66.6, 66.3, 65.9, 65.6, 56.6, 38.6, 36.3, 34.7, 28.7, 25.5. ESI-HRMS for [C19H23F3N302S2] + ,calcd: 446.1178; found: 446.1161.純度：98%. 實(shí)施例17 -化合物對多種蛋白激酶活性抑制作用 采用基于焚光共振能量轉(zhuǎn)移的Z'-LYTE激酶法試劑盒（Invitrogen, Carlsbad, CA) 測定化合物對ROCK 2，PKA (protein kinase A, PKA), PKG (protein kinase G, PKG)激 酶的IC5Q值。將待測化合物配置成10 mM，再逐級3倍往下稀釋，一共設(shè)置10個濃度。384孔板 中每孔加入 10 yL反應(yīng)液(包含2 μΜ溶解在50mM HEPES, pH 7.5，0.01% Brij-35, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA的短肽底物，和適量的ROCK l，ROCK 2，PKA, PKG)和一系列3倍稀釋的待 測化合物。ATP的終濃度為75 μΜ。1 h的孵育之后，反應(yīng)終止，根據(jù)說明書計算熒光比值。采 用Prism 5.0擬合得到量效曲線，并計算IC5Q值。結(jié)果見表1，由實(shí)驗結(jié)果可以看出，化合物7， 14和15表現(xiàn)出一定的ROCK抑制作用，而且與法舒地爾相比，這些化合物對R0CK2的選擇性更 好。
[0029]表1.待測化合物對不同蛋白激酶的抑制作用
實(shí)施例18 -化合物抑制L-glutamate誘導(dǎo)細(xì)胞毒性作用 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞株HT22,用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，在37°C，飽和濕 度，含體積分?jǐn)?shù)為5% C02、95%空氣的二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以 0.25%胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸，顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為10 X 104 個/ml，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μ!7孔，培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。將96孔板中培養(yǎng)基吸走， 待測化合物用DMS0溶解，用完全培養(yǎng)基稀釋，加入到96孔板中，100 μ!7孔。預(yù)孵育30min后， 加入2 yL lOOmM L-glutamate。模型組不加待測化合物，直接加入2 yL lOOmM L-glutamate。孵育24 h后，每孔加入10 yL 5mg/mL MTT，孵育2h，棄去上清，加 DMS0 100 μ!7 孔，振蕩使生成物formazan充分溶解，在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度值，測定波長570 nm。采 用公式化合物促進(jìn)細(xì)胞的存活率(％)=1〇〇%*(Α待/ 計算細(xì)胞存活 率。結(jié)果見圖1，可以看出大部分化合物的神經(jīng)保護(hù)作用都較硫辛酸更好，其中化合物11，14 和15在10μΜ的時候幾乎能完全逆轉(zhuǎn)由谷氨酸誘導(dǎo)的HT22死亡。
[0030] 實(shí)施例19 -體外血腦屏障透過率 1)取4 UL 2%(PBL)溶液加于ΜΑΙΡη4550的96孔板的疏水膜上，滴加過程中注意移液槍 頭勿接觸膜表面以防破壞膜結(jié)構(gòu)； 2) 迅速（10 min內(nèi)）定量吸取200 yL待測樣品液(0.1 mg/ml)加入到96孔板中的膜上方 作為給藥池，膜另一側(cè)加入200 uL PBS (pH=7.4)為接受池，注意保持接受液與膜的充分接 觸； 3) 室溫靜止10h后，小心移除給藥池，每孔取200ul，用UV光譜儀測試接受池內(nèi)化合物吸 光度值（250-500 nm); 4) 吸取100 uL待測樣品液與100 uL PBS充分混勻，作為理論平衡溶液，測試其吸光度 值（250-500 nm)，需要用acceptor板測試； 5) 根據(jù)公式計算logPe值：
式中Vd是接受池的體積，Va是接受池的體積，A是膜面積，t是滲透時間，[drug]accept〇r 是接受池的吸光度，[drug] equilibrium是理論平衡吸光度。
[0031] 注:凡X10_6 cm 值大于5.3,則化合物能夠透過血腦屏障，小于2.4被定義為不 能透過血腦屏障。結(jié)果見表2.由結(jié)果可知，大部分化合物都能透過體外模型的血腦屏障。 [0032] 表2體外PAMPA-BBB法檢測血腦屏障透過率，結(jié)果用均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示
實(shí)施例20 -化合物對自由基的清除作用 采用DHE染色檢測氧自由基的生成情況。HT-22細(xì)胞用DMEM +10%胎牛血清，并置于37 °C，含5% C02孵箱中。將細(xì)胞以合適的密度種在多聚賴氨酸包被的24孔板;待細(xì)胞貼壁后， 分別用培養(yǎng)基配制好的PT243加入對應(yīng)的孔中，處理30 min后，加入2 mM谷氨酸處理10 h。 收集細(xì)胞，并用DHE染料孵育細(xì)胞30 min左右，洗凈DHE染料，用高內(nèi)涵系統(tǒng)檢測DHE的熒光 強(qiáng)度。實(shí)驗結(jié)果顯示化合物15能明顯減少由谷氨酸誘導(dǎo)的R0S升高，而硫辛酸在ΙΟμΜ的濃度 下對R0S的含量無明顯影響。
[0033]實(shí)施例21 -化合物對內(nèi)源性抗氧化蛋白谷胱甘肽(Glutathione, GSH)的影響 采用GSH測定的試劑盒檢測化合物15對內(nèi)源性GSH的影響。HT-22細(xì)胞用不同濃度的化 合物處理30 min后，加入2 mM谷氨酸處理10 h。收集細(xì)胞，方法參照南京建成GSH試劑盒進(jìn) 行測定。結(jié)果見圖2.可以看出，化合物15能顯著升高由谷氨酸誘導(dǎo)的GSH耗竭。而硫辛酸在 ΙΟμΜ的濃度下無明顯作用。
[0034]實(shí)施例22 -血管環(huán)實(shí)驗檢測化合物的舒血管作用 快速去除大鼠胸主動脈，并在冰盒上冰的K r e b s液中分離結(jié)締組織。通入混合氣體 (95%02，5%C02)，調(diào)節(jié)氣體速度，使基線保持平穩(wěn)，將血管掛于5mL Krebs液的浴槽中，每 15min換一次Krebs液。待平衡約lh后，換KC1 (60mM) 5ml，使血管達(dá)到最大的收縮值，并穩(wěn) 定15min，再換KC1 (60mM) 5mL，重復(fù)做2次;將血管重新平衡后，用累積法加入藥物(3 μΜ， 10 μΜ，20 μΜ，30 μΜ)。記錄下預(yù)收縮時的最大張力以及每個藥物加入后的張力，以便比較。 結(jié)果見圖3,可以看出，與法舒地爾相比，化合物15表現(xiàn)出較為溫和的血管擴(kuò)張作用。
【主權(quán)項】
1. 式(I)的化合物或其藥用鹽： 穴τ，Ri 選自-H、-F、-Cl、-Br、-I、-〇CH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-OCH2CH2CH2CH32. -種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1所述的任一化合物或其藥用鹽，以及藥學(xué)上可接 受的載體。3. 權(quán)利要求1所述的任一化合物或其藥用鹽在制備治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的藥 物中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病為阿爾茨海默病、帕 金森氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥或亨廷頓舞蹈病。5. -種多功能ROCK抑制劑，其包含權(quán)利要求1所述的任一化合物或其藥用鹽。
【文檔編號】A61K31/454GK105949180SQ201610304191
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】皮榮標(biāo), 涂亞林, 文石軍, 王勝男, 楊曉紅, 陳秋荷, 陳景考
【申請人】中山大學(xué)