一種蛋白提取和分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蛋白提取和分離純化方法，所述蛋白提取和分離純化方法包括卵粘蛋白分離純化方法、雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分離純化方法和雞蛋免疫球蛋白提取純化方法；本發(fā)明采用先稀釋后均質(zhì)的方法，蛋清液經(jīng)生理鹽水稀釋后均質(zhì)，不僅降低了蛋清液的黏度，而且破壞了其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，從而使蛋清液過濾速度較快，膜清洗較為容易，降低了膜的污染程度，延長(zhǎng)了膜的使用壽命當(dāng)操作壓力在0.15MPa時(shí)，處于相對(duì)平穩(wěn)的流通狀態(tài)，且在一定程度上一直濾液濃差極化現(xiàn)象。本發(fā)明以已水稀釋法為基礎(chǔ)，并結(jié)合聚乙二醇沉淀以及DEAE?Toyopearl 650M一步洗脫離子交換層析進(jìn)行純化，得到高回收率高純度的雞卵黃IgY。
【專利說明】
一種蛋白提取和分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于糖蛋白技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種蛋白提取和分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞卵類粘蛋白是由雞卵清中制得的一種糖蛋白，具有強(qiáng)烈的抑制胰蛋白酶的作 用，常用于胰蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究和胰蛋白酶的親和層析純化制備。分子量:28000Da， 分子由四個(gè)分子量相近的亞基組成糖蛋白組成，即D-甘露糖，D-半乳糖，葡萄糖胺，唾液酸； 化學(xué)穩(wěn)定性，耐熱：在80°C條件下，理化性質(zhì)不發(fā)生改變，耐有機(jī)溶劑:在50 %的丙酮溶液 中，能保持良好的溶解度，耐沉淀劑:在1 〇 %的TCA的溶液中不發(fā)生沉淀。等電點(diǎn)性質(zhì)，等電 點(diǎn):pi在3.9-4.5之間，溶液中的狀態(tài):在pH3.0的溶液中穩(wěn)定，在pH8.0的溶液中容易分解。 雞卵黃免疫球蛋白，簡(jiǎn)稱IgY，又稱雞卵黃抗體。具有免疫原性，在蛋黃中以α-、β-和γ-卵黃 球蛋白三種形式存在。
[0003] 目前國際上采用的IgY分離純化方法主要包括水稀釋法、有機(jī)溶劑抽提沉淀法、超 濾、超臨界萃取法與凍融等物理化學(xué)法及鹽析與DEAE色譜相結(jié)合等方法。國內(nèi)外有關(guān)于從 雞蛋清中分離提取活性物質(zhì)已有較多研究和報(bào)道，且已有相關(guān)的工業(yè)化生產(chǎn)并產(chǎn)生了良好 的經(jīng)濟(jì)效益，如溶菌酶，免疫球蛋白等。而從雞蛋清中提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的研究主要還停留在 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，并未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，研究進(jìn)展相對(duì)緩慢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白提取和分離純化方法，旨在解決【背景技術(shù)】中所述 的問題。
[0005] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種蛋白提取和分離純化方法，所述蛋白提取和分離純化 方法包括卵粘蛋白分離純化方法、雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分離純化方法和雞蛋免疫球蛋白提取純 化方法；
[0006] 所述卵粘蛋白分離純化方法采用GaCL2或MgCl2制備卵粘蛋白；
[0007] 所述雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分離純化方法包括：新鮮雞蛋清原液，0.9生理鹽水稀釋， 3000r/min離心15min去除卵粘蛋白，再用等電點(diǎn)鹽析除去卵白蛋白；經(jīng)離心和等電點(diǎn)沉淀 的樣品微濾除去〇. 1_1〇〇Μ?范圍的雜質(zhì)，進(jìn)而米用超濾，用聚諷樹脂衍生物膜去除lOOkDa以 上大分子蛋白質(zhì)，再用聚砜樹脂衍生物膜截留分子量大于50kDa的蛋白質(zhì)，得濃縮液，得到 的濃縮液進(jìn)行透析處理，并冷凍干燥；
[0008] 所述雞蛋免疫球蛋白提取純化方法采用已水稀釋法結(jié)合聚乙二醇沉淀以及DEAE-Toyopearl 650M-步洗脫離子交換層析進(jìn)行純化，得到高回收率高純度的雞卵黃IgY。
[0009] 進(jìn)一步，所述卵粘蛋白分離純化方法包括以下步驟：
[0010] 全蛋清攪拌均勻后加5倍體積的鹽溶液，0.05mol/LMgCl2或〇.lmol/L NaCl，均質(zhì) 后用0.1mol/L HC1調(diào)pH = 6.0,4°C靜置過夜，15,000g離心10min，4°C，沉淀用0.5mol/L NaCl重懸，4°C放置4h，15,000g離心10min，4°C，將得到的沉淀雙蒸水洗滌至上清中不含蛋 白質(zhì)，沉淀部分即為卵粘蛋白粗提物；
[00?1 ] 粗提物溶解于1 〇mmo 1 /L硼酸鹽酸緩沖液pH = 9.6中配成5mg/ml溶液，4°C攪拌過 夜，0.45μπι微孔濾膜過濾后進(jìn)行凝膠層析，洗脫液為含0.2mol/LMgCld^]TriS-HCl緩沖液， 20mmol/L，pH=8.4，流速0.5ml/min;收集各洗脫峰的凍干樣品經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，目標(biāo) 組分冷凍干燥后-20 °C保存。
[0012] 進(jìn)一步，所述卵粘蛋白對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為0.05mg/mL 和0.2mg/mL。
[0013] 進(jìn)一步，所述雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分離純化方法包括：
[0014] 連接好超濾裝置，通過0.2MPa超純水壓力持續(xù)lh，待水流通量穩(wěn)定后，測(cè)定超濾膜 初始純水通量，超濾完畢后，取出超濾膜進(jìn)行蒸餾水沖洗，并用0.1M NaOH和0.1M HC1浸泡 30min，最后用蒸餾水反復(fù)沖洗，再次測(cè)定膜純水流通量；
[0015] 新鮮雞蛋清原液，0.9生理鹽水稀釋，3000r/min離心15min去除卵粘蛋白，再用等 電點(diǎn)鹽析除去卵白蛋白；
[0016] 經(jīng)離心和等電點(diǎn)沉淀的樣品微濾除去0.1 -1 ΟΟμπι范圍的雜質(zhì)，進(jìn)而采用超濾技術(shù)， 用聚砜樹脂衍生物膜去除l〇〇kDa以上大分子蛋白質(zhì)，再用聚砜樹脂衍生物膜截留分子量大 于50kDa的蛋白質(zhì)，得濃縮液，之后得到的濃縮液進(jìn)行透析處理，并冷凍干燥。
[0017] 進(jìn)一步，所述蛋白提取和分離純化方法的超濾裝置壓力為0.15MPa，0.9生理鹽水 稀釋倍數(shù)為10倍，攪拌速率為125r/min，此時(shí)膜通量值為39.80, pH為7。
[0018] 進(jìn)一步，所述雞蛋免疫球蛋白提取純化方法包括：
[0019] 選取新鮮雞蛋，采用蛋清蛋黃分離器，分離得到蛋黃，用蒸餾水將蛋黃洗凈，置于 濾紙上吸干，刺破蛋黃膜，收集蛋黃液，以體積百分比計(jì)，用蒸餾水對(duì)蛋黃進(jìn)行不同倍數(shù)的 稀釋8倍攪拌均勻，調(diào)節(jié)不同pH值5.0~5.6,4°C靜置不同時(shí)間（2h、4h、6h、8h、10h)，5000X 冷凍離心30min后，得澄清上清液含IgY水溶性組分WSF;
[0020] 向所得的WSF中加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG6000,磁力攪拌器攪拌30min，22000Xg冷 凍離心，收集沉淀；
[0021] 透析，收集沉淀加入蒸餾水，攪拌，裝入透析袋，截留分子量為8000-14000KD中，4 °C透析除去部分殘留PEG6000,冷凍干燥即得粗IgY組分；
[0022] 離子交換色譜法純化IgY，用Na2HP〇4_NaH2P〇4緩沖液平衡，設(shè)置pH值為6.0，7.0， 8.0條件下不同緩沖液離子強(qiáng)度（0.03m〇l/L、0.05m〇l/L、0.1m〇l/L)上樣平衡、恒流洗脫 (0.075111 〇1/1，0.1111〇1/1)，洗脫流出液按每管51111/31^11自動(dòng)收集;將層析所收集的組分裝入 透析袋截留分子量為8000-14000KD，置于蒸餾水中，4°C透析除鹽。
[0023]本發(fā)明提供的蛋白提取和分離純化方法，采用GaCL2與MgCl2結(jié)合的方法制備卵粘 蛋白效果最佳，制備的卵粘蛋白純度>97%，采用該方法制備的卵粘蛋白純度大于97%，終 產(chǎn)量408.65 ± 4.32mg/ 100g蛋清，回收率為(85.3 ± 1.08) %。經(jīng)凝膠過濾分離，成功分離得 到純卵粘蛋白為302. lmg，總得率為57.03%。
[0024]本發(fā)明采用先稀釋后均質(zhì)的方法，蛋清液經(jīng)生理鹽水稀釋后均質(zhì)，不僅降低了蛋 清液的黏度，而且破壞了其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，從而使蛋清液過濾速度較快，膜清洗較為容易，降 低了膜的污染程度，延長(zhǎng)了膜的使用壽命當(dāng)操作壓力在〇.15MPa時(shí)，處于相對(duì)平穩(wěn)的流通狀 態(tài)，且在一定程度上一直濾液濃差極化現(xiàn)象。
[0025] 本發(fā)明以已水稀釋法為基礎(chǔ)，并結(jié)合聚乙二醇沉淀以及DEAE-Toyopearl650M-步 洗脫離子交換層析進(jìn)行純化，得到高回收率高純度的雞卵黃IgY。
【附圖說明】
[0026] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的蛋白提取和分離純化方法流程圖。
[0027 ]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的ovomuc i η對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線影響示意圖。
[0028 ]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的ovomuc i η對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)曲線影響示意圖。
[0029] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的ovomucin對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線影響示意圖。
[0030] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白超濾分離的工藝流程圖。
[0031] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的稀釋倍數(shù)對(duì)雞蛋清液相對(duì)粘度的影響示意圖。
[0032] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的剪切速率對(duì)雞蛋清液相對(duì)粘度的影響示意圖。
[0033] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的溫度對(duì)雞蛋清液相對(duì)粘度的影響示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0035] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。
[0036] 一、卵粘蛋白
[0037] 1.2卵粘蛋白分離純化
[0038] 1.2.1卵粘蛋白分離純化的工藝流程，如圖1所示。
[0039] S101:全蛋清攪拌均勻后加5倍體積的鹽溶液（0.05mol/LMgCl2或0.1m〇l/L NaCl)，均質(zhì)后用0.1mol/L HC1 調(diào)pH = 6.0,4°C靜置過夜，15,000g離心 10min(4°C)，沉淀用 0.5mol/L NaCl重懸，4°C放置4h，15，000g離心10min(4°C )，將得到的沉淀雙蒸水洗滌至上 清中不含蛋白質(zhì)，沉淀部分即為卵粘蛋白粗提物；
[0040] S102:粗提物溶解于10mmol/L硼酸鹽酸緩沖液(pH=9.6)中配成5mg/ml溶液，4°C 攪拌過夜，〇. 45μηι微孔濾膜過濾后進(jìn)行凝膠層析(Sephacry IS-300HR，2.0*7cm)，洗脫液為 含0 · 2mol/LMgCl2的Tris-HCl緩沖液(20mmol/L，pH = 8.4)，流速0 · 5ml/min。收集各洗脫峰 的凍干樣品經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，目標(biāo)組分冷凍干燥后-20°C保存。
[0041] 1.2.2分步鹽析制備卵粘蛋白粗品
[0042] 全蛋清攪拌均勻后加5倍體積的鹽溶液(0.05mol/LMgCl2或0. lmol/L NaCl)，均質(zhì) 后用0.1mol/L HC1調(diào)pH = 6.0,4°C靜置過夜，15,000g離心10min(4°C)，沉淀用0.5mol/L NaCl重懸，4°C放置4h，15,000g離心10min(4°C)，將得到的沉淀雙蒸水洗滌至上清中不含蛋 白質(zhì)，沉淀部分即為卵粘蛋白粗提物。
[0043] 1.2.3凝膠過濾層析
[0044] 粗提物溶解于1 Ommo 1 /L硼酸鹽酸緩沖液(pH = 9.6)中配成5mg/ml溶液，4 °C攪拌過 夜，0.45μηι微孔濾膜過濾后進(jìn)行凝膠層析（Sephacry IS-300HR，2.0*7cm)，洗脫液為含 0·2mol/LMgCl2的Tris-HCl緩沖液(20mmol/L，pH = 8.4)，流速0·5ml/min。收集各洗脫峰的 凍干樣品經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，目標(biāo)組分冷凍干燥后-20°C保存。
[0045] 1.2.4聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
[0046] SDS-PAGE采用Tris-HCl緩沖系統(tǒng)進(jìn)行垂直電泳，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度 為5%，考馬斯亮藍(lán)R-250(2%)和Schifft試劑分別進(jìn)行染色。蛋白質(zhì)溶解液為含SDS(1%， w/v)和2-巰基乙醇（ΙΟμΙ/mL)的0·01mol/L Tris-HCl(pH=7·0)緩沖液。工作電壓8V/cm。
[0047] PAGE膠經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像后經(jīng)Gelpro. 32蛋白質(zhì)圖像分析軟件對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行 分析。
[0048] 1.2.5純度測(cè)定
[0049] 采用HPLC法測(cè)定卵粘蛋白的純度，目標(biāo)組分配制成lmg/mL的溶液進(jìn)樣，RP-HPLC采 用C4柱，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)0.05 %三氟醋酸水溶液，柱溫30°C，進(jìn)樣量20μ1，15-95 %乙腈梯 度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，流速為lmL/min 〇 [0050] 1.2.6產(chǎn)量和得率的測(cè)定
[0051]卵粘蛋白的含量用l〇〇g蛋清蛋白質(zhì)中卵粘蛋白的毫克數(shù)表示。計(jì)算公式為：
[0053]其中，W=100g蛋清為原料制備的冷凍干燥后的粉末質(zhì)量(g);
[0054]卵粘蛋白的得率即為制備樣品中含量與蛋清原料中含量的比率，計(jì)算公式為：
[0056]其中，Wi為干燥后樣品的質(zhì)量，W2為蛋清質(zhì)量 [0057] 1.2.7卵粘蛋白抗菌特性研究
[0058] 以大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)卵粘蛋白的體外抗菌性能 進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0059] 1)菌種活化與接種
[0060] 菌種解凍后置無菌操作臺(tái)上接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37°C恒溫震蕩培養(yǎng)12h，使菌落數(shù) 達(dá)1〇1()并制成菌懸液。
[00611 2)最小抑菌濃度的測(cè)定(MIC)
[0062] MIC采用二倍稀釋法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)過程參照文獻(xiàn)(左娟和馬美湖2010)。
[0063] 3)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
[0064] 活化的菌種用滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋至菌體濃度為108CFU/ml，進(jìn)而取100yL加到96 孔酶標(biāo)板中，在樣品孔加入l〇〇yL經(jīng)過0.45μπι的細(xì)菌過濾器過濾的卵粘蛋白溶液(0.05mg/ mL)混勻，37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后于酶標(biāo)儀上測(cè)定0D6QQnm。以0D6QQ對(duì)培養(yǎng)時(shí)間作圖繪 制菌體生長(zhǎng)曲線，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，每孔5個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 [0065] 4)抑菌率的測(cè)定
[0066] 96孔板中依次加入稀釋的活化菌懸液100yL，0.05mg/mL卵粘蛋白溶液(0.45μπι細(xì) 菌過濾器過濾）l〇〇yL，混勻后于37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，酶標(biāo)儀上測(cè)定ODsoonm，空白對(duì) 照為100yL培養(yǎng)基加100yL生理鹽水，對(duì)照組為生理鹽水代替樣品組的卵粘蛋白溶液，抑菌 率按照以下公式計(jì)算(Kodama，Kimura，2001)。
[0068] 1.2.8卵黏蛋白體外抗病毒活性評(píng)價(jià)
[0069] 1.2.8.1病毒的活化及病毒懸液的制備
[0070] 取出低溫凍存的試驗(yàn)病毒株，37°C溫水浴融化，加入l_2mL細(xì)胞維持液，然后接種 于已經(jīng)長(zhǎng)滿單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37°C溫箱中使與細(xì)胞吸附、生長(zhǎng)。逐日在顯微鏡下 觀察病變，待3/4細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收集培養(yǎng)液，并反復(fù)凍融宿主細(xì)胞，釋放病毒。6000rpm離 心15min，去除沉淀(主要為細(xì)胞碎片），上清液即為所需要的病毒懸液。分裝存于-70°C冰箱 中，滴定效價(jià)備用。
[0071] 1.2.8.2雞紅細(xì)胞的制備
[0072]滅菌注射器預(yù)先用3.8%的檸檬酸鈉洗后吸取正常健康雞血，放于預(yù)先加入3倍體 積的阿氏液的滅菌離心管內(nèi)，輕輕混勻后經(jīng)1800r/min離心10min，棄上清液。再加滅菌的 PBS懸浮血球，1800r/min離心10min，棄上清液。重復(fù)該步驟3次，充分吸取白細(xì)胞與血小板 等后，將沉淀的紅細(xì)胞根據(jù)所需用量用生理鹽水配成1 %濃度。
[0073] 1.2.8.3病毒毒力的測(cè)定
[0074] 1)流感病毒的血凝滴度
[0075] 取塑料96孔板，自左至右歌加入30yL于第二孔，混勻，以此倍比稀釋至11孔，吸取 30yL吸棄至消毒液中。稀釋后各孔的稀釋度分別1:2、1:4，1:8……最后一孔為對(duì)照。各孔加 入1 %的雞RBC30yL，衛(wèi)星混合器上搖振lmin，使血球與病毒充分混合。37 °C溫箱中作用15-30min，待對(duì)照孔的紅細(xì)胞沉淀可觀察結(jié)果。效價(jià)判定時(shí)對(duì)照管應(yīng)不凝集，試驗(yàn)管中以能使 發(fā)生"++"凝集的病毒最高稀釋度為凝集效價(jià)，該管稀釋度即為1個(gè)血凝單位。
[0076] 2)流感病毒的TCID50的測(cè)定
[0077] 取出一塊細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)孔大約傳 8000-10000個(gè)細(xì)胞，每個(gè)孔的細(xì)胞大約70% 豐度即可接種病毒。在EP管中用無血清孵育液10倍倍比稀釋病毒原液。用多道加樣器吸去 97孔板中的培養(yǎng)液，吸取孵育液加在每孔中再輕輕吹打一次，然后吸出孵育液。將稀釋好的 病毒液加到96孔板上，每孔100yL，設(shè)置正常的細(xì)胞對(duì)照。37 °C ω2培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出培 養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。觀察CPE，找出能引起半數(shù)細(xì)胞瓶或管感染的病毒稀釋倍數(shù)， 按Reed-Muench法計(jì)算出該病毒液的TCID50。
[0078] lgTCID50 =距離比例X稀釋對(duì)數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對(duì)數(shù)
[0079] TCID50=Antilog高于50%病變的病毒最高稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例
[0081 ] 1.2.8.4對(duì)雞紅細(xì)胞的毒性
[0082] 用PBS將ovomucin配成10mg/mL的原液，在96孔V型微量血凝板中用PBS將ovomucin 原液依次倍比稀釋，每孔30此。然后每孔加1%紅細(xì)胞懸液30yL，并使之充分搖勻，于溫室靜 置30-60min，觀察紅細(xì)胞的凝聚情況。
[0083] 2結(jié)果與分析 [0084] 2.1卵粘蛋白的粗制備
[0085] 采用GaCL2與MgCl2結(jié)合的方法制備卵粘蛋白效果最佳。該方法制備的卵粘蛋白純 度>97 %，采用該方法制備的卵粘蛋白純度大于97 %，終產(chǎn)量408.65 ±4.32mg/100g蛋清，回 收率為(85·3±1·08)%。
[0086] 2.2卵粘蛋白的層析純化
[0087] 鹽析后卵粘蛋白粗提物在Sephacry S-300上洗脫，洗脫液為含0.05mol/ LMgCl2Tris-HCl (20mmo 1/L，pH8.4)，粗提物經(jīng)凝膠層次西后有4個(gè)蛋白洗脫峰。將不同洗脫 峰的蛋白進(jìn)行SDA-PAGE電泳分析，100g全蛋清中約有385.87 ± 5.32mg，得率約為73.83%， 經(jīng)凝膠過濾分離，成功分離得到純卵粘蛋白為302. lmg，總得率為57.03%。
[0088] 2.3卵粘蛋白對(duì)不同細(xì)菌的抑制效果
[0089] 采用常量肉湯稀釋法研究了不同濃度的卵粘蛋白對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的沙門氏菌、大 腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。結(jié)果如表1所示。
[0090] 表1卵粘蛋白對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)
[0092] 注：表示葡萄糖-酚紅肉湯培養(yǎng)基未變色；"+"表示葡萄糖-酚紅肉湯培養(yǎng)基變 成黃色，有菌落生長(zhǎng)
[0093] Note :''-''represent that the color of Broth medium does not change,no bacterial grow;〃+〃represent that the color of Broth medium changed to yellow, bacterial grow.
[0094] 從表1中可以看出，卵粘蛋白對(duì)三種細(xì)菌的抗菌性有顯著差異，其中對(duì)大腸桿菌和 沙門氏菌均有不同程度的抑制作用，在卵粘蛋白濃度達(dá)到〇.2mg/mL以上時(shí)，沙門氏菌培養(yǎng) 基不變色，表明沙門氏菌生長(zhǎng)受到明顯抑制。而在卵粘蛋白濃度達(dá)到0.050mg/mL以上時(shí)，大 腸桿菌培養(yǎng)基不變色，表明此時(shí)大腸桿菌生長(zhǎng)受到明顯抑制。因此，卵粘蛋白對(duì)大腸桿菌和 沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為0.05mg/mL和0.2mg/mL。而在試驗(yàn)濃度度范圍內(nèi)，卵粘蛋白 對(duì)金黃色葡萄球菌的影響則相反，加入卵粘蛋白的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基均變?yōu)辄S色，即各實(shí)驗(yàn)組 均有菌落生長(zhǎng)，且培養(yǎng)基顏色比空白對(duì)照組顏色較深，表明此時(shí)菌體生長(zhǎng)不但未受到抑制， 反而受到促進(jìn)，但各濃度組的效果差異不顯著(P>〇.05)。因此卵粘蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌 無明顯抑制作用。
[0095] 2.4卵粘蛋白對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響
[0096] 采用比濁法測(cè)定了不同濃度卵粘蛋白對(duì)三種細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響，結(jié)果分別如圖 2,圖3,圖4所示：
[0097] 由上述各圖可以看出，卵粘蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)用三種細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響比較顯著。且 在圖2中可以看出，加入0.05mg/mL卵粘蛋白后大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線在整個(gè)生長(zhǎng)周期均位于 對(duì)照組之下。表明大腸桿菌在整個(gè)生長(zhǎng)周期的過程中均受到明顯抑制。在圖3中，沙門氏菌 在適應(yīng)期和對(duì)數(shù)期受到抑制。因此，卵粘蛋白對(duì)沙門氏菌的發(fā)揮作用方式是延緩菌體的對(duì) 數(shù)期，無明顯殺菌活性。而卵粘蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌(圖4)則無明顯抑制作用。
[0098] 2.5卵黏蛋白體外抗病毒活性評(píng)價(jià)
[0099] 2.5.1受試病毒株的毒力
[0100]將出他受試病毒株感染敏感細(xì)胞后每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，以7d 內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞病變的樣品孔為陽性孔，計(jì)算實(shí)驗(yàn)病毒株的TCID5Q，并測(cè)定毒株的血凝效價(jià)。結(jié) 果發(fā)現(xiàn)HiNi受試病毒株的血凝效價(jià)為1:320，TCID 5Q為ΚΓ3·4。
[0101] 2.5.2不同樣品對(duì)雞紅細(xì)胞的毒性
[0102] 分別對(duì)卵粘蛋白進(jìn)行稀釋，研究不同濃度稀釋液對(duì)HiNi-MDCK細(xì)胞的毒性，結(jié)果如 表2。
[0103]表2雞蛋卵粘蛋白對(duì)雞紅細(xì)胞的細(xì)胞毒性
[0105]注：表示發(fā)生血凝，不沉積；"+"輕微血凝；"++"不發(fā)生血凝，細(xì)胞完全沉積 [0106]由表所示，當(dāng)卵粘蛋白濃度為5mg/mL或低于5mg/mL時(shí)，對(duì)雞血紅細(xì)胞無毒性作用， 但當(dāng)卵粘蛋白濃度達(dá)到10mg/mL以后，細(xì)胞不能發(fā)生正常的沉積作用，而平鋪在微量血凝板 的V型孔中，因此認(rèn)為10mg/mL卵粘細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用。
[0107] 不同濃度卵粘蛋白對(duì)新城疫病毒的血凝效價(jià)隨濃度升高而降低，對(duì)新城疫病毒的 血凝效價(jià)抑制率隨濃度增加而上升。說明雞卵粘蛋白對(duì)新城疫病毒具有很強(qiáng)的抑制作用。
[0108] 二、雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（卵伴白蛋白）分離純化及體外抗菌研究
[0109] 國內(nèi)外有關(guān)于從雞蛋清中分離提取活性物質(zhì)已有較多研究和報(bào)道，且已有相關(guān)的 工業(yè)化生產(chǎn)并產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟(jì)效益，如溶菌酶，免疫球蛋白等。而從雞蛋清中提取卵轉(zhuǎn)鐵 蛋白的研究主要還停留在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，并未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，研究進(jìn)展相對(duì)緩慢。本實(shí)驗(yàn)采 用兩步超濾法分離提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，經(jīng)冷凍干燥后得到產(chǎn)品，為工業(yè)生產(chǎn)提供參考。
[0110] 1材料與方法
[0111] 1.1材料
[0112] 1.1.1原材料
[0113] 鮮雞蛋金翼蛋品有限公司提供 [0114]卵轉(zhuǎn)鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品sigma中國公司 [0115] 供試菌種：
[0116]金黃色葡萄球菌（Staphylovovvus aure，ATCC 29213)
[0117] 大腸桿菌(Escherichia coli，ATCC 25922)
[0118] 沙門氏菌(Salmonella，CICC 21382)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0119] 1.1.2主要試劑

[0122] 1.2實(shí)驗(yàn)方法
[0123] 1.2.1卵轉(zhuǎn)鐵蛋白超濾分離的工藝流程，如圖5所示。
[0124] 1.2.2超濾裝置及操作要點(diǎn)
[0125] 連接好超濾裝置，預(yù)先通過0.2MPa超純水壓力持續(xù)lh，待水流通量穩(wěn)定后，測(cè)定超 濾膜初始純水通量，超濾完畢后，取出超濾膜進(jìn)行蒸餾水沖洗，并用0.1M NaOH和0.1M HC1 浸泡30min，最后用蒸餾水反復(fù)沖洗，再次測(cè)定膜純水流通量，保證其初始通量達(dá)到98 %以 上。
[0126] 新鮮雞蛋清原液，0.9生理鹽水稀釋，3000r/min離心15min去除卵粘蛋白，再用等 電點(diǎn)鹽析除去卵白蛋白。經(jīng)離心和等電點(diǎn)沉淀的樣品微濾除去〇. 1 -1 OOwn范圍的雜質(zhì)，進(jìn)而 采用超濾技術(shù)，用聚砜樹脂衍生物膜(截留分子量lOOkDa)去除lOOkDa以上大分子蛋白質(zhì)， 再用聚砜樹脂衍生物膜(截留分子量50kDa)截留分子量大于50kDa的蛋白質(zhì)，得濃縮液，之 后得到的濃縮液進(jìn)行透析處理，并冷凍干燥
[0127] 1.2.3前處理對(duì)蛋清液粘度的影響
[0128] 1.2.3.1稀釋倍數(shù)對(duì)蛋清液黏度的影響
[0129] 取適量蛋清液，用0.9 %的NaCl溶液稀釋，稀釋倍數(shù)分別為5倍，10倍，15倍，20倍， 25倍，3000r/min冷凍離心10min，取上清液測(cè)定蛋清黏度。
[0130] 1.2.3.2剪切速率對(duì)蛋清液黏度的影響
[0131 ]稀釋后的蛋清分別在4000r/min，5000r/min，6000r/min，7000r/min，8000r/min 高 速分散均質(zhì)器上進(jìn)行均質(zhì)，分別測(cè)定蛋清液黏度，考察均質(zhì)對(duì)蛋清液黏度的影響。
[0132] 1.2.3.3溫度對(duì)蛋清液黏度的影響
[0133] 將經(jīng)過稀釋的蛋清液分別加熱到30°C，35°C，40°C，45°C，50°C，測(cè)定不同溫度下蛋 清液的黏度，研究溫度對(duì)蛋清液黏度的影響。
[0134] 1.2.4超濾工藝條件的研究
[0135] 1.2.4.1物料稀釋倍數(shù)對(duì)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分離的影響
[0136]將雞蛋液攪拌速率固定為125r/min，操作壓力為0 . lOMPa，pH值為6以體積比5倍， 10倍，15倍，20倍進(jìn)行稀釋，以單位時(shí)間膜通量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察蛋清液稀釋倍數(shù)對(duì)卵轉(zhuǎn)鐵 蛋白膜分離效果的影響。
[0137] 1.2.4.2攪拌速率對(duì)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分離的影響
[0138] 固定雞蛋清液稀釋倍數(shù)為10倍(v/v)，超濾裝置操作壓力為0. lOMPa，溶液pH值為 6。攪拌速率分別為50r/min，125r/min，200r/min，以單位時(shí)間膜通量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究攪拌 速率對(duì)雞蛋清卵轉(zhuǎn)鐵蛋白膜分離效果的影響。
[0139] 1.2.4.3操作壓力對(duì)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分離的影響
[0140]固定雞蛋清液稀釋倍數(shù)為10倍(v/v)，攪拌速率為125r/min，pH值為6,操作壓力分 別為0.05MPa，0. lOMPa，0.15MPa，以單位時(shí)間內(nèi)膜通量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究操作壓力對(duì)蛋清卵 轉(zhuǎn)鐵蛋白膜分離效果的影響。
[0141] 1.2.4.4pH值對(duì)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分離的影響
[0142] 固定雞蛋清液稀釋倍數(shù)為10倍(v/v)，攪拌速率為125r/min，超濾裝置操作壓力為 0· lOMPa。用0· lmol/L NaOH和0· lmol/L HC1分別將蛋清液的pH值調(diào)至6、7、8,以單位時(shí)間內(nèi) 膜通量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究pH值對(duì)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分離效果的影響。
[0143] 1.2.5相對(duì)黏度的測(cè)定
[0144] 使用烏氏黏度計(jì)測(cè)定。參考文獻(xiàn)尹業(yè)平、王輝憲2007。
[0145] 1.2.6膜通量的測(cè)定
[0146] 用來表征超濾膜過濾料液的速率，是衡量膜性能的重要指標(biāo)。
[0147] 膜通量率計(jì)算公式：
[0149] 式中J:膜通量，L· (m'h'Q:通過量，L;t:操作時(shí)間，h;A:膜面積，m2
[0150] 1.3SDS-PAGE 電泳
[0151]凝膠制備:配置分離膠濃度為10%、濃縮膠濃度為5%。
[0152] 樣品處理:將樣品用緩沖液配成lmg/mL濃度，電泳前沸水加熱3~5min。
[0153] 電泳條件:濃縮膠中恒壓80V，待樣品進(jìn)入分離膠調(diào)整電壓至120V，恒壓lh。
[0154] 1.4反向高效液相色譜(RT-HPLC)檢測(cè)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白
[0155] 將lmg/mL卵轉(zhuǎn)鐵蛋白做標(biāo)樣，色譜柱選用Vydac214TP54C4柱。
[0156] 1.5卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的鑒定與純度分析
[0157] 將透析的蛋清液、層析后的收集液先經(jīng)過10 %的SDS-PAGE電泳對(duì)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行 鑒定，然后通過HPLC測(cè)定純度。
[0158]蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理:取蛋白質(zhì)樣液與樣品處理液等體積混勻，在100°C水浴中處 理2min，冷卻室溫后備用。
[0161] 1.6數(shù)據(jù)分析
[0162] 采用Excel建立數(shù)據(jù)庫，用0rigin7.5版本軟件繪圖，用DPS200，SAS8.1數(shù)據(jù)處理軟 件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
[0163] 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
[0164] 2.1降低蛋清黏度的單因素實(shí)驗(yàn)
[0165] 2.1.1稀釋倍數(shù)對(duì)蛋清液黏度的影響結(jié)果
[0166] 采用先稀釋后均質(zhì)的方法，蛋清液經(jīng)生理鹽水稀釋后均質(zhì)，不僅降低了蛋清液的 黏度，而且破壞了其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，從而使蛋清液過濾速度較快，膜清洗較為容易，降低了膜 的污染程度，延長(zhǎng)了膜的使用壽命
[0167] 由圖6可以看出，蛋清液的相對(duì)黏度隨稀釋倍數(shù)的增加而下降，稀釋倍數(shù)從5倍大 15倍，黏度下降明顯。進(jìn)而緩慢，趨近于時(shí)間軸，確定最佳倍數(shù)15倍。
[0168] 2.1.2剪切速率對(duì)蛋清液黏度的影響結(jié)果
[0169]蛋清經(jīng)稀釋后，蛋液的黏稠度還有可能阻塞活污染超濾膜，因此采用高速分散均 質(zhì)機(jī)來降低蛋清液黏度。經(jīng)過高速分散均質(zhì)后的蛋白，相對(duì)黏度下降很快，如圖7所示：
[0170] 2.1.3溫度對(duì)蛋清液黏度的影響結(jié)果
[0171]溫度升高可降低蛋清液黏度，但溫度過高又會(huì)造成蛋白質(zhì)變性，因此考察溫度對(duì) 蛋清液黏度的影響。如圖8所示：
[0172]如圖8所示，隨著溫度的升高，蛋清液黏度下降很明顯。但當(dāng)溫度過高，超過45°C 后，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的黏度迅速增大，這和蛋清液中蛋白因高溫而改變結(jié)構(gòu)有關(guān)。因此實(shí)驗(yàn)選擇 45 °C為適宜操作溫度。
[0173] 2.1.4膜通量的單因素試驗(yàn)
[0174] 2.1.4.1物料稀釋倍數(shù)對(duì)分離卵轉(zhuǎn)鐵蛋白膜通量的影響結(jié)果
[0175] 膜通量隨著超濾時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，前l(fā)Omin內(nèi)膜通量下降均較快，lOmin后， 膜通量下降較為平緩。當(dāng)稀釋倍數(shù)確定為15倍時(shí)，濾液的濃差極化現(xiàn)象較平緩且設(shè)備運(yùn)行 較穩(wěn)定，因此稀釋倍數(shù)控制在15倍以內(nèi)（v/v)。
[0176] 2.1.4.2攪拌速率對(duì)分離卵轉(zhuǎn)鐵蛋白膜通量的影響結(jié)果
[0177]膜通量隨著蛋清液超濾的進(jìn)行，下降較為平緩。攪拌速率為50r/min時(shí)超濾系統(tǒng)運(yùn) 行平穩(wěn)，但膜通量低。攪拌速率為125r/min時(shí)流通量下降較慢，相對(duì)流通量較大。攪拌速率 為200r/min時(shí)膜通量下降較快，且超濾后期流通量下降較快。綜合考慮，將攪拌速率控制在 125r/min 左右。
[0178] 2.1.4.3操作壓力對(duì)分離卵轉(zhuǎn)鐵蛋白膜通量的影響結(jié)果
[0179] 隨著濾液超濾時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋清液濃差極化現(xiàn)象加重，膜通量變小。當(dāng)操作壓力在 0.15MPa時(shí)，處于相對(duì)平穩(wěn)的流通狀態(tài)，且在一定程度上一直濾液濃差極化現(xiàn)象。
[0180] 2.1.4.4pH值對(duì)分離卵轉(zhuǎn)鐵蛋白膜通量的影響結(jié)果
[0181] 隨著超濾時(shí)間的延長(zhǎng)，濾液的膜通量迅速下降，當(dāng)pH為7時(shí)，整體超濾系統(tǒng)處于相 對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。
[0182] 2.1.5超濾最佳條件的優(yōu)化結(jié)果
[0183] 實(shí)驗(yàn)選取操作壓力、稀釋倍數(shù)、攪拌速率3個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以單位時(shí)間內(nèi)膜 通量為考察指標(biāo)，對(duì)超濾工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)組合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，影響超濾膜通量的主次順序 為操作壓力 > 稀釋倍數(shù)>攪拌速率，最優(yōu)組合為超濾裝置壓力為〇.15MPa，溶液稀釋倍數(shù)10 倍，攪拌速率為125以11^11。此時(shí)膜通量值為39.80。
[0184] 2.1.6SDS-PAGE 電泳結(jié)果
[0185] 凍干后獲得的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白樣品主要是78KDa左右的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和45KDa左右的卵 清蛋白，還有點(diǎn)雜蛋白條帶，原因可能是部分卵轉(zhuǎn)鐵蛋白與其他蛋白以結(jié)合態(tài)形式存在，不 易分開。
[0186] 2 · 1 · 7RT-HPLC 分析結(jié)果
[0187] 2.1.8體外抗菌研究
[0188] 表3卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和防腐劑的抑菌活性比較
[0190] 注：牛津杯法又稱管蝶法，抑菌圈直徑蘭20mm為極敏感"+++"，15mm蘭抑菌圈直徑 蘭20mm為高敏感"++"，10mm蘭抑菌圈直徑蘭15mm為中敏感"+"，抑菌圈直徑蘭10mm為低敏或 無效"一"
[0191 ]由表可知，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)大腸桿菌抑菌效果最強(qiáng)，對(duì)沙門氏菌次之，對(duì)金黃色葡萄 球菌抑菌效果相對(duì)較弱。
[0192] 三、雞蛋免疫球蛋白提取純化及體外抑菌效果
[0193] 雞卵黃免疫球蛋白，簡(jiǎn)稱IgY，又稱雞卵黃抗體。具有免疫原性，在蛋黃中以α-、β- 和γ-卵黃球蛋白三種形式存在。目前國際上采用的IgY分離純化方法主要包括水稀釋法、 有機(jī)溶劑抽提沉淀法、超濾、超臨界萃取法與凍融等物理化學(xué)法及鹽析與DEAE色譜相結(jié)合 等方法。本實(shí)驗(yàn)在首先實(shí)驗(yàn)室中操作，因此前期研究已水稀釋法為基礎(chǔ)，并結(jié)合聚乙二醇沉 淀以及DEAE-Toyopearl 650M-步洗脫離子交換層析進(jìn)行純化，得到高回收率高純度的雞 卵黃IgY。
[0194] 1 方法
[0195] 1.1粗IgY 制備
[0196] 1.1.1水稀釋法獲得水溶性組分(WSF)
[0197] 選取新鮮雞蛋，采用蛋清蛋黃分離器，分離得到蛋黃，用蒸餾水將蛋黃洗凈，置于 濾紙上吸干，刺破蛋黃膜，收集蛋黃液，以體積百分比計(jì)，用蒸餾水對(duì)蛋黃進(jìn)行不同倍數(shù)的 稀釋(2倍，4倍，6倍，8倍，10倍)攪拌均勻，調(diào)節(jié)不同pH值(4.6、4.8、5.0、5.2、5.4)，4°C靜置 不同時(shí)間（2h、4h、6h、8h、10h)，5000 X冷凍離心30min后，得澄清上清液含IgY水溶性組分 (ffSF)〇
[0198] 1.1.2PEG 沉淀蛋白
[0199] 向所得的WSF中加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG6000,磁力攪拌器攪拌30min，22000Xg冷 凍離心，收集沉淀。
[0200] 1.1.3透析
[0201]收集沉淀加入一定量的蒸餾水，攪拌，裝入透析袋(截留分子量為8000-14000KD) 中，4°C透析除去部分殘留PEG6000,冷凍干燥即得粗IgY組分。
[0202] 1 · 1 · 4離子交換色譜法純化IgY
[0203] 用Na2HP〇4_NaH2P〇4緩沖液平衡，設(shè)置pH值為6.0，7.0，8.0條件下不同緩沖液離子 強(qiáng)度（0.03111〇1凡、0.051]1〇1凡、0.11]1〇1凡）上樣平衡、恒流洗脫（0.0751]1〇1凡，0.11]1〇1凡），通過 對(duì)比研究確定最佳緩沖液pH和洗脫液離子強(qiáng)度。洗脫流出液按每管5ml/3min自動(dòng)收集。將 層析所收集的組分裝入透析袋(截留分子量為8000-14000KD)，置于蒸餾水中，4°C透析除 鹽。
[0204] 1.1.5蛋白質(zhì)含量測(cè)定
[0205] 1.1.5.1粗蛋白含量測(cè)定以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋 白質(zhì)含量。
[0206] 1.1.5.2粗 IgY 含量測(cè)定
[0207] 測(cè)定樣品280nm下吸光值。
[0208] 1.1.6IgY 純度測(cè)定
[0209] SDS-PAGE凝膠電泳分析，5 %的濃縮膠，10 %的分離膠，濃縮膠電泳電壓80V，分離 膠電壓120V，電泳樣品用G250考馬斯亮藍(lán)染色后再按照標(biāo)準(zhǔn)程序褪色。利用Lab-Image軟件 推算IgY純度。
[0210] 1.1.7IgY回收率測(cè)定
[0211] IgY回收率公式計(jì)算：
[0213] 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0214] 2.1不同稀釋倍數(shù)對(duì)IgY分離效果的影響
[0215]分別取15mL蛋黃液，用不同量的無菌水稀釋，攪拌均勻，稀釋倍數(shù)為2,4,6,8，10 倍，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，確定最佳稀釋倍數(shù)為8倍，蛋白質(zhì)含量為375.27mg/mL。 [0216] 2.2不同pH對(duì)IgY分離效果的影響
[0217] 上清液中蛋白質(zhì)含量在pH5 · 0-5 · 6時(shí)回收率較高，均在300mg/mL以上，其中pH5 · 2 時(shí)達(dá)到最高值321.57mg/mL。
[0218] 2.3SDS-PAGE 凝膠電泳
[0219] 2.4IgY抗菌實(shí)驗(yàn)效果
[0220] IgY對(duì)大腸桿菌，沙門氏菌，金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線抗菌效果：
[0221] 當(dāng)在細(xì)菌液中加入IgY和優(yōu)爾蛋白后，IgY和優(yōu)爾蛋白對(duì)枯草芽飽桿菌和大腸桿菌 在生長(zhǎng)初期有明顯的抑制作用，試驗(yàn)組和對(duì)照組的0D值有明顯的差異。而經(jīng)過24小時(shí)后的 抑制作用下降，推測(cè)是由于溫度對(duì)其的影響導(dǎo)致IgY的失活，從而使IgY成為菌株的氮源有 利于菌株得生長(zhǎng)。IgY對(duì)于金黃色葡萄球菌抑制作用不明顯，對(duì)照組的0D值較實(shí)驗(yàn)組的值 小。
[0222] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蛋白提取和分離純化方法，其特征在于，所述蛋白提取和分離純化方法包括卵 粘蛋白分離純化方法、雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分離純化方法和雞蛋免疫球蛋白提取純化方法； 所述卵粘蛋白分離純化方法采用GaCL2或MgCl2制備卵粘蛋白； 所述雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分離純化方法包括:新鮮雞蛋清原液，〇. 9生理鹽水稀釋，3000r/ min離心15min去除卵粘蛋白，再用等電點(diǎn)鹽析除去卵白蛋白；經(jīng)離心和等電點(diǎn)沉淀的樣品 微濾除去0.1-IOOlWi范圍的雜質(zhì)，進(jìn)而采用超濾，用聚砜樹脂衍生物膜去除IOOkDa以上大分 子蛋白質(zhì)，再用聚砜樹脂衍生物膜截留分子量大于50kDa的蛋白質(zhì)，得濃縮液，得到的濃縮 液進(jìn)行透析處理，并冷凍干燥； 所述雞蛋免疫球蛋白提取純化方法采用已水稀釋法結(jié)合聚乙二醇沉淀以及DEAE-Toyopearl 650M-步洗脫離子交換層析進(jìn)行純化，得到高回收率高純度的雞卵黃IgY。2. 如權(quán)利要求1所述的蛋白提取和分離純化方法，其特征在于，所述卵粘蛋白分離純化 方法包括以下步驟： 全蛋清攪拌均勻后加5倍體積的鹽溶液，0.05mol/LMgCl2或O.lmol/L NaCl，均質(zhì)后用 O.lmol/L HCl調(diào)pH=6.0,4°C靜置過夜，15,000g離心10min，4°C，沉淀用0.5mol/L NaCl重 懸，4°C放置4h，15，000 g離心10min，4°C，將得到的沉淀雙蒸水洗滌至上清中不含蛋白質(zhì)， 沉淀部分即為卵粘蛋白粗提物； 粗提物溶解于I Ommo 1/L硼酸鹽酸緩沖液pH=9.6中配成5mg/ml溶液，4 °C攪拌過夜，0.45 μπι微孔濾膜過濾后進(jìn)行凝膠層析，洗脫液為含0.2 mol/LMgCl2的Tris-HCl緩沖液，20mmol/ L，pH=8.4，流速0.5ml/min;收集各洗脫峰的凍干樣品經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，目標(biāo)組分冷凍 干燥后-20 °C保存。3. 如權(quán)利要求2所述的蛋白提取和分離純化方法，其特征在于，所述卵粘蛋白對(duì)大腸桿 菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為〇. 〇5mg/mL和0.2mg/mL。4. 如權(quán)利要求1所述的蛋白提取和分離純化方法，其特征在于，所述雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白分 離純化方法包括： 連接好超濾裝置，通過〇. 2MPa超純水壓力持續(xù)Ih，待水流通量穩(wěn)定后，測(cè)定超濾膜初始 純水通量，超濾完畢后，取出超濾膜進(jìn)行蒸餾水沖洗，并用0.1 M NaOH和0.1 M HCl浸泡 30min，最后用蒸餾水反復(fù)沖洗，再次測(cè)定膜純水流通量； 新鮮雞蛋清原液，〇 .9生理鹽水稀釋，3000r/min離心15min去除卵粘蛋白，再用等電點(diǎn) 鹽析除去卵白蛋白； 經(jīng)離心和等電點(diǎn)沉淀的樣品微濾除去0.1 -1 OOym范圍的雜質(zhì)，進(jìn)而采用超濾技術(shù)，用聚 砜樹脂衍生物膜去除IOOkDa以上大分子蛋白質(zhì)，再用聚砜樹脂衍生物膜截留分子量大于 50kDa的蛋白質(zhì)，得濃縮液，之后得到的濃縮液進(jìn)行透析處理，并冷凍干燥。5. 如權(quán)利要求4所述的蛋白提取和分離純化方法，其特征在于，所述蛋白提取和分離純 化方法的超濾裝置壓力為0.15MPa，0.9生理鹽水稀釋倍數(shù)為10倍，攪拌速率為125r/min， 此時(shí)膜通量值為39.80，pH為7。6. 如權(quán)利要求1所述的蛋白提取和分離純化方法，其特征在于，所述雞蛋免疫球蛋白提 取純化方法包括： 選取新鮮雞蛋，采用蛋清蛋黃分離器，分離得到蛋黃，用蒸餾水將蛋黃洗凈，置于濾紙 上吸干，刺破蛋黃膜，收集蛋黃液，以體積百分比計(jì)，用蒸餾水對(duì)蛋黃進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋8 倍攪拌均勻，調(diào)節(jié)不同pH值5.0~5.6，4°C靜置，5000 X冷凍離心30min后，得澄清上清液含 IgY水溶性組分WSF; 向所得的WSF中加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG6000,磁力攪拌器攪拌30min，22000Xg冷凍離 心，收集沉淀； 透析，收集沉淀加入蒸餾水，攪拌，裝入透析袋，截留分子量為8000-14000KD中，4 °C透 析除去部分殘留PEG6000,冷凍干燥即得粗IgY組分； 離子交換色譜法純化IgY，用Na2HP〇4_NaH2P〇4緩沖液平衡，緩沖液離子強(qiáng)度上樣平衡、恒 流洗脫，洗脫流出液按每管5ml/3min自動(dòng)收集;將層析所收集的組分裝入透析袋截留分子 量為8000-14000KD，置于蒸餾水中，4°C透析除鹽。
【文檔編號(hào)】C07K1/30GK105949300SQ201610344942
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月23日
【發(fā)明人】楊濤, 劉巖, 都韌寧, 于寒松
【申請(qǐng)人】吉林厚德食品有限公司