羊抗人apob多克隆抗體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種羊抗人APOB多克隆抗體的制備方法，步驟依次為抗原提取、動物免疫、抗血清的純化處理；其中：所述抗原提取是將提取的APOB抗原與液體石蠟，羊毛脂，卡介苗及表面活性劑混合乳化；所述表面活性劑包含以下種類中的一種或者幾種：曲拉通X?100、吐溫?20、PEG20000。本發(fā)明從人血清里提取天然的APOB抗原，然后用此抗原免疫動物得到的多抗與其它抗原校準品匹配性很好。本發(fā)明制備工藝簡單，免疫動物時在抗原里加入少許表面活性劑能使抗體效價得到提高。
【專利說明】
羊抗人APOB多克隆抗體的制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及多克隆抗體的一種制備方法，尤其涉及載脂類ΑΡ0Β多克隆抗體的制備
方法。
【背景技術】
[0002] 抗原免疫動物產(chǎn)生的抗體是血清γ -球蛋白的一部分。γ -球蛋白是一組結(jié)構相似但又有差異的蛋白質(zhì)通稱為免疫球蛋白按其結(jié)構和免疫化學性質(zhì)的差異又可分為五
類分別稱為I gG、I gA、I gM、IgD和IgE，抗體以IgG最為穩(wěn)定。因蛋白在體液中含量不同以及分離純化的難易的差別可分別采用多克隆抗體制備法和單克隆抗體制備法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術的不足，如何在少使用抗原的同時增強抗體的活性與效價，為了達到此目的，本發(fā)明設計了一種抗原乳化液，其特征在于:在乳化液里加入卡介苗與少量表面活性劑，使產(chǎn)生的ΑΡ0Β抗體效價大幅度提高。
[0004] 本發(fā)明的目的提供了一種ΑΡ0Β多克隆抗體的制備方法，在抗原乳化液里加入卡介苗與少量表面活性劑，使抗體效價較普通的方法得到提高。
[0005] 本發(fā)明的具體技術方案是:一種羊抗人ΑΡ0Β多克隆抗體的制備方法，步驟依次為抗原提取、動物免疫、抗血清的純化處理;其中：
所述抗原提取是將提取的ΑΡ0Β抗原與液體石蠟，羊毛脂，卡介苗及表面活性劑混合乳化;所述表面活性劑包含以下種類中的一種或者幾種：曲拉通X-100、吐溫-20、PEG20000。
[0006] 進一步的，所述抗原提取步驟是： a.將人血清密度調(diào)整到1.06g/ml。
[0007] b.超速離心，4萬轉(zhuǎn)/分鐘，10小時。
[0008] C.離心結(jié)束后吸取第二層即為較純凈的ΑΡ0Β抗原。
[0009] 進一步的，所述的動物免疫是將乳化好的抗原免疫羊，每半月免疫一次，共免疫 4-6 次。
[0010] 進一步的，所述混合乳化步驟中，每升乳化液中曲拉通X-100的添加量在25μ1? 2.5mL之間。
[0011 ] 進一步的，所述混合乳化步驟中，每升乳化液中吐溫-20的添加量在16μ1?1.6mL之間。
[0012] 進一步的，所述混合乳化步驟中，每升乳化液中PEG20000的添加量在0.5g~10g之間。
【附圖說明】
[0013] 圖1是本發(fā)明用免疫雙擴散方法測定抗體的效價與純度的示意圖。
【具體實施方式】
[0014] 下面對本發(fā)明做進一步描述：
(1)抗原：目前所知的載脂蛋白進入異種機體后能致敏淋巴細胞，與抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合復合物即具備有抗原性?？乖园庖咴院涂乖禺愋詢煞矫娴暮x。載脂蛋白因具備抗原特異性和免疫原性，因此可稱為完全抗原。大多數(shù)動物的免疫系統(tǒng)是非常敏感的，用于免疫的抗原僅需要極微量?？乖瓚撌羌兓?，該純品電泳后僅出現(xiàn)一條區(qū)帶， 即認為可用于免疫抗原純品。
[0015] 本發(fā)明的ΑΡ0Β抗原是從人血清里經(jīng)超速離心提取，經(jīng)電泳后出現(xiàn)一條帶，故可用于動物免疫。
[0016] (2)佐劑:佐劑是指與抗原混合注入機體后能增加抗原的免疫性或者能改變免疫反應類型的一種物質(zhì)。人們公認的佐劑是福氏佐劑(Freund’adjuvant )，具有明顯的免疫刺激作用。福氏佐劑又可分為兩種：即不完全佐劑和完全佐劑，屬于一種油包水的乳劑。由羊毛脂與液體石蠟組成。油包水乳化劑有助于促進免疫反應的進行，還可起部分保護不穩(wěn)定抗原的作用，使抗原在體內(nèi)的吸收期延長，從而減少加強注射的次數(shù)。在不完全佐劑內(nèi)加入殺死的分枝桿菌(如結(jié)核桿菌或卡介苗)制備成完全佐劑。分枝桿菌能增加局部淋巴結(jié)的炎癥反應，擴大免疫原性，從而促進最終高親和力抗體的形成。
[0017] 佐劑制備方法:取石蠟油6份、羊毛脂4份再加5份不含抗原的抗原緩沖液，混勻， 滅菌分裝于小玻璃瓶中，〇—8°C保存，此為不完全全佐劑。在不完全佐劑中加入卡介苗 (3—5mg)即為完全佐劑，均貯存于0—8°C。臨用時取完全佐劑3份加入含抗原的緩沖液1份， 混勻振搖或研磨，使其成為乳化狀態(tài)，注射入動物體內(nèi)時一定要保持乳化狀態(tài)?？乖昧恳暱乖肿恿坎煌懊庖咴约懊庖邉游锊煌幸欢ú町?，無統(tǒng)一標準和固定模式。一般是每羊(約20kg重)最多每次不超過3mg抗原量。
[〇〇18]本發(fā)明乳化液的組成：
液體石蠟6份羊毛脂4份抗原緩沖液5份卡介苗1份 ΑΡ0Β抗原2份表面活性劑0.5份
將上述物質(zhì)混合后研磨成乳化狀就可以免疫動物了。
[0019] (3)免疫途徑及方法免疫部位可分別選用皮內(nèi)、皮下或淋巴結(jié)。第1次免疫采用皮內(nèi)結(jié)合皮下多點注射，常注射在背部或腿部。許多作者介紹在后足皮下或皮內(nèi)注射，因為四足落地的關系很易造成感染，使第1次免疫失效，并使動物行走不便，造成傷害。整個免疫過程以2—3個月為宜。一般是第1次免疫后的2—3周再進行第2次免疫，待最后一次免疫后的7—10天取靜脈血測試抗體效價(試血），效價達到要求后即可一次性放血，采用頸動脈放血，得抗血清。
[0020] (4)抗血清的獲得與保存:免疫成功的動物放血過程，所有用具均嚴格消毒并按無菌操作方式進行放血。放血收集的血清一般含有的雜質(zhì)比較多，需要進一步純化，本發(fā)明采用飽和硫酸銨方法純化血清得到純度較高的APOB抗體?？寡宓姆栏瘎┮驭?. 1 %疊氮鈉為宜，也可采用加入20%?30%無菌甘油保存的方法。若時間較長，可采用一70°C低溫保存。一般在0 — 8°C保存1年，抗體效價幾乎無改變保存2年，其效價稍有降低?？贵w切忌反復凍融，否則抗體效價很快降低，以頸動脈一次性放血為宜。
[0021 ] (5)抗體的鑒定:抗體檢測可分別采用免疫火箭電泳法、單向擴散法、免疫電泳法、
ELI SA法、免疫透射比濁法和放射免疫沉淀法。
[〇〇22] 1，免疫擴散法
將均勻地混合制備0.8%瓊脂糖凝板，呈三角形打三個孔分別加樣人ΑροΒ抗原，抗人 ΑροΒ血清、人全血清于三孔內(nèi)，水平置于37°C溫箱內(nèi)擴散，觀察白色沉淀線。
[〇〇23] 2.免疫電泳擴散法
制備10x6cm瓊脂糖膠板沾橫軸方向間隔打三個孔挖二條小槽于孔內(nèi)加入全血清各電泳，電壓40分鐘后取出膠塊，再治電泳方向于三孔間挖二條小槽，再分別加入抗人 ΑροΒ血清和抗人全血清，待血清進入洗膠后，水平置于37度溫箱中，S卩12-24h觀察沉淀線。 [〇〇24] 3.免疫火箭電泳
制備含有人ΑροΒ抗血清或抗人全血清的0.8%瓊脂糖膠板，在含抗體的瓊脂糖膠板一端打一抗原孔，將抗原置陰極電泳3-4小時置于10%三氯醋酸固定15-20min取出膠板，在黑色背景下量取白色沉淀峰的高度或面積。
[〇〇25] 4干燥、染色
將上述各類型膠塊轉(zhuǎn)移到薄膠片上，置〇.9%Nacl中漂洗除去膠中血清，此時免疫復合物仍將化膠中.清洗完畢，取出附在膠片，涼干，再染色，可照相，復印，永久保存。
[0026] 本發(fā)明用免疫雙擴散方法測定抗體的效價與純度，具體方法是以瓊脂糖為基質(zhì)緩沖液，在培養(yǎng)皿里鋪板，在板中央打一個孔，放人血清標本。在板周圍打一圈孔，放置按一定效價稀釋好的ΑΡ0Β抗體（比如按此比例稀釋抗體：1:80，1:120，1:160，1: 200，1: 260，1: 300)，如圖1所示。
[0027] 加好樣后放在烘箱里37度烘烤24小時，然后觀察反應沉淀線的情況。本實驗效價能達到1:300，且只有單一沉淀線，抗體比較純。
[0028] 從實驗數(shù)據(jù)看本發(fā)明所產(chǎn)生的抗體效價比較高且比較純。
【主權項】
1. 一種羊抗人APOB多克隆抗體的制備方法，步驟依次為抗原提取、動物免疫、抗血清的 純化處理;其中： 所述抗原提取是將提取的ΑΡ0Β抗原與液體石蠟，羊毛脂，卡介苗及表面活性劑混合乳 化;所述表面活性劑包含以下種類中的一種或者幾種：曲拉通Χ-100、吐溫-20、PEG20000。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種羊抗人APOB多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述抗 原提取步驟是： a. 將人血清密度調(diào)整到1.06g/ml; b. 超速離心，4萬轉(zhuǎn)/分鐘，10小時； c. 離心結(jié)束后吸取第二層即為較純凈的APOB抗原。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種羊抗人APOB多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述的 動物免疫是將乳化好的抗原免疫羊，每半月免疫一次，共免疫4-6次。4. 根據(jù)權利要求1所述的一種羊抗人APOB多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述混 合乳化步驟中，每升乳化液中曲拉通X-100的添加量在25μ1?2.5mL之間。5. 根據(jù)權利要求1所述的一種羊抗人APOB多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述混 合乳化步驟中，每升乳化液中吐溫-20的添加量在16μ1?1.6mL之間。6. 根據(jù)權利要求1所述的一種羊抗人APOB多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述混 合乳化步驟中，每升乳化液中PEG20000的添加量在0.5g~10g之間。
【文檔編號】C07K16/06GK105949310SQ201610584752
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月25日
【發(fā)明人】任傳伍, 劉作鵬, 崔鵬飛, 練子富
【申請人】上海華臣生物試劑有限公司