作為TLR4信號通路抑制劑用于結(jié)腸癌治療的sTLR4和MD2蛋白復(fù)合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種作為TLR4信號通路抑制劑用于結(jié)腸癌治療的sTLR4和MD2蛋白復(fù)合物。本發(fā)明通過分別構(gòu)建表達人源分泌型蛋白sTLR4和MD2后，將兩者按摩爾比1:1混合后制備成sTLR4/MD2蛋白復(fù)合物，用于炎癥相關(guān)疾病以及與TLR4直接相關(guān)的結(jié)直腸癌腫瘤的治療。
【專利說明】
作為TLR4信號通路抑制劑用于結(jié)腸癌治療的sTLR4和MD2蛋白 復(fù)合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種作為TLR4信號通路抑制劑用于結(jié)腸癌治 療的sTLR4和MD2蛋白復(fù)合物。
【背景技術(shù)】
[0002] Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是一種在物種進化上高度保守的受體家 族，Toll蛋白目前為止在哺乳動物相繼發(fā)現(xiàn)了 11種TLRs，不同的TLRs識別不同病原體相關(guān) 模式分子(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)來啟動機體天然免疫系統(tǒng) 抗感染的第一道防線，同時對獲得性免疫也具有重要的調(diào)節(jié)作用。TLRs的活化是一把"雙刃 劍"，一方面通過產(chǎn)生前炎性因子和調(diào)節(jié)免疫細胞活性清除病原體，另一方面可能通過過量 產(chǎn)生的細胞因子促進內(nèi)毒素休克、自身免疫病、慢性炎癥和感染性疾病，使機體產(chǎn)生"過激" 反應(yīng)帶來不利影響。最新的研究顯示，TLRs與腫瘤的關(guān)系密切，TLR在多種腫瘤中均有異常 表達，TLR參與腫瘤的形成并且TLR可以作為腫瘤治療的靶標或者輔助治療手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種作為TLR4信號通路抑制劑用于結(jié)腸癌 治療的sTLR4和MD2蛋白復(fù)合物。
[0004] 為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0005] 所述作為TLR4信號通路抑制劑用于結(jié)腸癌治療的sTLR4和MD2蛋白復(fù)合物，所述 sTLR4和MD2蛋白復(fù)合物中sTLR4蛋白與MD2蛋白兩者的摩爾比為1: 1。.
[0006] 其中，所述sTLR4和MD2蛋白復(fù)合物中sTLR4蛋白與MD2蛋白之間離子鍵結(jié)合。
[0007] 所述sTLR4和MD2蛋白復(fù)合物的制備方法包括如下步驟：
[0008] (1)構(gòu)建pTT5-hsTLR4-his質(zhì)粒并將該質(zhì)粒導入感受態(tài)細菌表達sTLR4蛋白；所述 pTT5-hsTLR4-his質(zhì)粒序列如SEQ ID N0.1 所示；
[0009] (2)構(gòu)建pTT5-hsMD-2-his質(zhì)粒并將該質(zhì)粒導入感受態(tài)細菌表達MD-2蛋白，所述 pTT5-hsMD-2-his質(zhì)粒序列如SEQIDN0.2所示；
[0010] (3)將表達出的sTLR4蛋白與MD-2蛋白按權(quán)利要求1所述比例混合，即得sTLR4和 MD2蛋白復(fù)合物。
[0011]所述sTLR4和MD2蛋白復(fù)合物可用于制備治療結(jié)直腸癌藥劑。還可用于制備TLR4信 號通路抑制劑。
[0012] 本發(fā)明將原本在膜表面表達的蛋白TLR4以可溶性的形式表達，其可以有效地模擬 TLR4與配體的結(jié)合并且可能競爭性抑制膜型TLR4與所有配體的結(jié)合，模擬體內(nèi)天然存在的 情況，促進分子的全面研究。
[0013] 本發(fā)明選擇與結(jié)腸癌的關(guān)系證據(jù)最為確鑿的TLR4作為靶標，采用STLR4和MD2蛋白 復(fù)合物作為阻斷TLR4信號的策略，其可以有效地模擬TLR4與配體的結(jié)合，并且可能競爭性 抑制膜型TLR4與所有配體的結(jié)合(如細菌成分和內(nèi)源性配體等）。本發(fā)明所述sTLR4和MD2蛋 白復(fù)合物可以有效抑制LPS誘導的TLR4信號傳導以及TLR4活化后誘導的炎癥因子以及其他 因子的產(chǎn)生，可以應(yīng)用于炎癥相關(guān)疾病及及結(jié)直腸腫瘤的治療，為治療結(jié)腸癌提供新的策 略和方法。
【附圖說明】
[0014] 圖 1 為pTT5-hsTLR4-his酶切鑒定圖；圖中：Lanel，2:pTT5-hsTLR4-his digested by Hindlll+BamHI；
[0015] 圖2為pTT5-hSTLR4表達過Ni柱電泳圖；
[0016] 圖3為pTT5-hSTLR4過分子篩圖；
[0017] 圖4為pTT5-hSTLR4過分子篩電泳圖；
[0018] 圖5為pTT5-hSTLR4終產(chǎn)物電泳圖；
[0019] 圖6為pET-28a-MD-2質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果圖；圖中：Lanel，2:pET-28a-MD-2NdeI + Xohl雙酶切鑒定結(jié)果；
[0020] 圖7為PET28a-MD-2蛋白變性過Ni柱電泳圖；
[0021] 圖8為PET28a-MD-2蛋白復(fù)性后電泳圖；
[0022]圖9為TLR4和MD-2的表達與臨床CRC患者的臨床病理特征的關(guān)系圖；
[0023]圖10為sTLR4和MD-2復(fù)合物抑制細胞膜表面TLR4與LPS的結(jié)合實驗結(jié)果圖；
[0024] 圖11為sTLR4和MD-2復(fù)合物抑制LPS誘導的SW480細胞的周期，迀移和侵襲實驗結(jié) 果圖；
[0025]圖12為sTLR4和MD-2復(fù)合物抑制LPS誘導的SW480細胞促炎及迀移因子的分泌實驗 結(jié)果圖；
[0026]圖13為STLR4和MD-2復(fù)合物抑制小鼠腫瘤模型的成瘤性實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0027] pTT5-hsTLR4_his質(zhì)粒構(gòu)建以及蛋白表達純化
[0028] -、pTT5-hsTLR4-his 載體構(gòu)建
[0029] 基因名稱：hsTLR4-his(1914bp)
[0030] 模板質(zhì)粒:pMD18-T-hsTLR4
[0031] 表達載體質(zhì)粒:pTT5
[0032] 克隆位點：Hindll I+BamHI
[0033] 引物：
[0034] PTT5-hsTLR4-HindIII-F(正向引物）：
[0035] 5'-CCCAAGCTTGCCACCATGATGTCTGCCTCGCGCCTGG-3'（SEQ ID N0.3)
[0036] pTT5-hsTLR4-BamHI_R(反向引物）：
[0037] 5 '-CGCGGATCCTTAGTGATGGTGATGGTGATGCTTATTCATCTGACAGGTGATATTC-3 '（SEQ ID N0.4)
[0038] 實驗方法：
[0039] 1.PCR擴增目的基因
[0040] PCR擴增hs TLR4-h i s，在引物中引入Hi nd III和Bamm酶切位點. [0041 ]按以下組分制備PCR反應(yīng)體系(表1):
[0042]表 1
[0044] 按以下條件設(shè)置反應(yīng)程序進行PCR反應(yīng)(表2):
[0045] 表 2
[0048] 瓊脂糖凝膠回收目的條帶，大小為1914bp。
[0049] 2.載體質(zhì)粒pTT5及目的基因的Hindlll+BamHI雙酶切 [0050]酶切反應(yīng)在37°C水浴反應(yīng)2h，載體質(zhì)粒酶切體系(表3):
[0051]表 3
[0053] 目的基因酶切體系(表4):
[0054] 表 4
[0056]分別回收質(zhì)粒pTT5酶切大片段和目的基因酶切產(chǎn)物
[0057] 3.質(zhì)粒pTT5HindIII+BamHI回收大片段與目的基因連接，連接反應(yīng)在22°C反應(yīng)2小 時，連接反應(yīng)體系(表5):
[0058]表5
[0061 ] 4.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。取10μ1上述連接產(chǎn)物與100μΙ JM109感受態(tài)細菌混勻后冰浴 30min，42°C熱激45s，立即置冰上放置2min，加入預(yù)熱至室溫的400μ1 LB培養(yǎng)基，37°C恒溫 搖床培養(yǎng)lh，4000rpm離心lmin，棄去400μ1培養(yǎng)上清，剩余100μΙ用移液器混勻后均勻涂布 于含1 〇〇μg/ml Ampici 11 in抗性的LB平板上，37 °C恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。
[0062] 5.挑取單菌落接種于含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB培養(yǎng)液中，250rpm，37 °C恒溫搖床培養(yǎng)過夜，用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)Hindlll+BamHI雙酶切，陽性克 隆可切出1914bp的條帶。鑒定正確的重組克隆進行測序驗證。
[0063] 實驗結(jié)果：
[0064] l.pTT5-hsTLR4-his 酶切鑒定圖見圖 1。
[0065] 2.測序結(jié)果
[0066] 二、sTLR4 蛋白純化
[0067] l.hSTLR4 特性：
[0068] ①分子量預(yù)測為78k，PI為5.02
[0069] ②His標簽 [0070] 2.表達純化步驟
[0071 ]①復(fù)蘇CH0-S細胞lml，加入含有2 %的血清，1 %的雙抗的CH0培養(yǎng)基（培養(yǎng)基1) 6ml，1000r離心5min，倒掉上清，加入20ml培養(yǎng)基1，放到細胞培養(yǎng)搖床上，37 °C，8 %的C02培 養(yǎng)過夜。
[0072]②細胞計數(shù)，用培養(yǎng)基1，傳代到3*105個細胞/ml，血清逐漸降低到0,連續(xù)傳代幾 天，到細胞計數(shù)為1 * 106個細胞/ml，，21，用CH0細胞培養(yǎng)基(細胞培養(yǎng)基2)
[0073] ③pTT5-hSTLR4質(zhì)粒2ml，CH0培養(yǎng)基80ml，polyfectine轉(zhuǎn)染試劑3ml，混勻，靜止 30min，一滴滴加入CH0細胞培養(yǎng)基21，連續(xù)培養(yǎng)72h。
[0074] ④sTLR4細胞培養(yǎng)液2000r離心30min。
[0075] ⑤離心上清過Ni2+柱，緩沖溶液用20mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH7.0。
[0076] 1)先用緩沖溶液平衡Ni2+柱。
[0077] 2)上清過GE公司的20mlNi柱，然后用緩沖溶液洗平基線。
[0078] 3)洗脫液為在緩沖溶液中分別加入30mM，50mM，500mM咪唑進行梯度洗脫。
[0079] ⑥過Ni柱30mM咪唑洗脫峰濃縮過分子篩，型號是HiprepTM16/60Sephacry I TMS-200HR，緩沖液為20mM的磷酸鈉，pH7.0。
[0080] ⑦濃縮過內(nèi)毒素去除柱，去除內(nèi)毒素。
[0081 ]⑧用MILLEXGV filter Unit 0.22um過濾膜過濾終產(chǎn)物。
[0082]⑨用BCA法測濃度。
[0083] ⑩凍干。
[0084] 3.實驗過程圖分析
[0085] 從pTT5-MTLR4電泳圖（圖2)未見明顯目的條帶，30mM咪唑洗出的蛋白可能含目的 條帶，需要進一步純化。從圖3和圖4中可以看到過分子篩峰2為目的蛋白，但還是有些雜，進 一步過內(nèi)毒素去除柱。從圖5中可以看到很純的目的條帶。
[0086] pTT5-hsMD-2_his質(zhì)粒構(gòu)建以及蛋白表達純化
[0087] 一、pTT5-hsMD-2_his 載體構(gòu)建
[0088] 基因名稱:hsMD-2
[0089] 表達質(zhì)粒載體:pET_28a
[0090] 克隆位點：Ndel+Xohl
[0091] 引物:pET-28a-MD-2-F (正向引物）：
[0092] 5'-CCCATATGATGGAAGCGCAGAAACAGTACTGGG-3'（SEQ ID N0.5)
[0093] pET-28a-MD-2_R(反向引物）：
[0094] 5'-CCCTCGAGTAAGTTAGAGTTCGGCTGGTGCAGGATA-3'（SEQ ID N0.6)
[0095] 1.PCR擴增目的基因
[0096] PCR擴增MD-2,在引物中引入Ndel+Xoh頂每切位點.
[0097]按以下組分制備PCR反應(yīng)體系(表6):
[0098]表 6
[0101 ]按以下條件設(shè)置反應(yīng)程序進行PCR反應(yīng)(表7):
[0102]表7
[0104]經(jīng)三次PCR后瓊脂糖凝膠回收目的條帶，大小為435bp。
[0105] 2.載體質(zhì)粒pET_28a及目的基因的Ndel+Xohl雙酶切
[0106] 酶切反應(yīng)在37°C水浴反應(yīng)2h，載體質(zhì)粒酶切體系(表8):
[0107] 表8
[0109] 目的基因酶切體系(表9):
[0110] 表9
[0113]分別回收質(zhì)粒pET_28a酶切大片段和目的基因酶切產(chǎn)物
[0114] 3.質(zhì)粒pET_28a Ndel+Xohl回收大片段與目的基因連接，連接反應(yīng)在22°C反應(yīng)2小 時，連接反應(yīng)體系(表10):
[0115] 表10
[0117] 4.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。取10μ1上述連接產(chǎn)物與100μΙ JM109感受態(tài)細菌混勻后冰浴 30min，42°C熱激45s，立即置冰上放置2min，加入預(yù)熱至室溫的400μ1 LB培養(yǎng)基，37°C恒溫 搖床培養(yǎng)lh，4000rpm離心lmin，棄去400μ1培養(yǎng)上清，剩余100μΙ用移液器混勻后均勻涂布 于含l〇〇μg/ml Kan+抗性的LB平板上，37°C恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。
[0118] 5.挑取2個單菌落接種于含5ml，100μg/ml Kan+抗性的LB培養(yǎng)液中，250rpm，37°C 恒溫搖床培養(yǎng)過夜，用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒Ndel+Xohl雙酶切鑒定（見圖 譜如Figl所示），陽性克隆可切出435bp的條帶。鑒定正確的重組克隆進行測序驗證。測序引 物為:T7-F(5-TAATACGACTCACTATAGGG-3)(SEQIDN0·7)挑選鑒定正確的重組質(zhì)粒進行病 毒包裝。
[0119] 實驗結(jié)果：
[0120] 1 · pET-28a-MD_2 質(zhì)粒酶切鑒定
[0121] 酶切鑒定結(jié)果表明，所挑克隆均為陽性克隆。
[0122] 2.測序結(jié)果
[0123] 二、PET28a-MD_2蛋白的純化
[0124] l.PET28a-MD_2 蛋白基本性質(zhì)
[0125] (1 )PET28a-MD_2分子量預(yù)測為19K，PI為8 · 4
[0126] (2)PET28a-MD-2 帶 his 標簽
[0127] (3)K+抗性
[0128] 2 · PET28a-MD_2變性復(fù)性純化步驟
[0129] (1)菌體破菌后離心，沉淀研磨，加入100ml緩沖溶液(20mM磷酸鈉，8M尿素，pH7 · 0) 變性，用高壓勻漿破碎儀破菌1次。
[0130] (2)16000r離心30min，上清過GE公司的20ml Ni柱
[0131] ①先用緩沖溶液(20mM磷酸鈉，8M尿素，pH7.0)平衡Ni 2+柱
[0132] ②上清過GE公司的20mlNi柱，然后用緩沖溶液洗平基線
[0133] ③洗脫液為在緩沖溶液中分別加入30mM，50mM，500mM咪唑進行梯度洗脫
[0134] (3)過Ni柱500mM咪唑洗脫液透析至20mM磷酸鈉，1 %的精氨酸，ImM還原性谷胱甘 肽，0.1 mM氧化性谷胱甘肽.
[0135] (4)復(fù)性成功后，進一步透析到20mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0。
[0136] (5)過內(nèi)毒素檢測柱Detoxi-GelTM Endotoxin Removing Columns(Thermo) -次。
[0137] (6)用內(nèi)毒素檢測試劑盒檢測內(nèi)毒素，（湛江安度斯生物有限公司）
[0138] (7)用MILLEXGV filter Unit 0.22um過濾
[0139] (8)BCA法測濃度，分裝，凍干。
[0140] 3.實驗過程圖分析
[0141] 從圖7中可以看出該蛋白過Ni柱500mM咪唑①純度可以，可以復(fù)性。
[0142] 從圖8中可以看到目的蛋白位置大約在19k，純度>90%，符合要求，內(nèi)毒素檢測〈1， 過濾，測濃度，凍干。
[0143] 由于這兩種蛋白的生理上相互作用是通過離子鍵實現(xiàn)，因此將兩種蛋白復(fù)合時可 選用簡單的混合處理，以避免改變兩種蛋白的空間結(jié)構(gòu):每lml 0.01%BSA中含sTLR4 5.0μ g和MD-2 1.25yg，37°C混合處理至少1小時。
[0144] 復(fù)合物的應(yīng)用
[0145] 一、體外實驗
[0146] 1. sTLR4和MD-2與細胞膜上的TLR4受體競爭性結(jié)合LPS，從而抑制了LPS-TLR4信號 通路。
[0147] 2. sTLR4和MD-2抑制SW480細胞的周期進展及迀移，侵襲能力。
[0148] 3.STLR4和MD-2抑制SW480細胞炎癥因子及趨化因子的釋放。
[0149] 二、體外實驗
[0150] 1. sTLR4和MD-2抑制荷瘤裸鼠的成瘤性。
[0151] 2. sTLR4和MD-2抑制荷瘤裸鼠的體重下降。
[0152] 3.STLR4和MD-2抑制裸鼠腫瘤組織中炎癥因子以及趨化因子的分泌。
[0153] 4. sTLR4和MD-2抑制裸鼠腫瘤組織中的血管生成。
[0154] 5.在A0M/DSS小鼠模型中，sTLR4和MD-2抑制了小鼠的成瘤性及體重減輕，同時延 長了小鼠的生存曲線。
[0155] 實驗結(jié)果：
[0156] 1 .TLR4和MD-2的表達與臨床CRC患者的臨床病理特征的關(guān)系
[0157] 巨噬細胞在炎性疾病和炎癥相關(guān)的癌癥中發(fā)揮重要作用，是分泌促炎細胞因子的 主要來源之一。為檢測LPS對TLR4信號通路的影響，我們檢測了巨噬細胞及CRC細胞上TLR4 和MD-2的表達。RT-PCR結(jié)果顯示LPS促進了巨噬細胞及CRC細胞TLR4和MD-2基因水平的表 達。對細胞上清中兩種蛋白水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)LPS對兩者的表達無明顯影響。此外，檢測血 清中TLR4和MD-2的表達，RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRC患者血清中TLR4和MD-2的mRNA表達明顯高于 健康對照者，而ELISA結(jié)果顯示CRC患者血清中TLR4和MD-2的蛋白表達與健康對照者相比無 顯著差異。進一步通過免疫組化對CRC腫瘤組織中TLR4和MD-2蛋白的表達進行驗證。結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，與正常組織相比，CRC腫瘤組織中的TLR4和MD-2蛋白的表達明顯增高。以上結(jié)果顯示，在 CRC細胞，巨噬細胞及CRC腫瘤組織中，TLR4和MD-2的表達均明顯增高。（見圖9, *P〈 0.05, * *Ρ〈0·01)
[0158] 2.STLR4和MD-2復(fù)合物抑制細胞膜表面TLR4與LPS的結(jié)合
[0159] 為檢測sTLR4和MD-2復(fù)合物對膜表面TLR4與LPS結(jié)合能力的影響，sTLR4，MD-2及 sTLR4和MD-2復(fù)合物分別與LPS-FITC預(yù)混后加入到經(jīng)PMA誘導的THP-1細胞中，通過檢測細 胞表面LPS-FITC的熒光強度評估TLR4與LPS結(jié)合能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)sTLR4和MD-2復(fù)合物處 理后，THP-1細胞上的熒光強度與LPS-FITC組相比明顯下降，而經(jīng)sTLR4或MD-2蛋白單獨處 理后，細胞的熒光強度沒有明顯降低。相同結(jié)果在結(jié)腸癌細胞株SW480上也得到驗證。以上 結(jié)果提示，sTLR4和MD-2復(fù)合物可以與LPS結(jié)合，從而競爭性抑制了細胞膜上TLR4與LPS的結(jié) 合。（見圖10)
[0160] 3.STLR4和MD-2復(fù)合物抑制LPS誘導的SW480細胞的周期，迀移和侵襲
[0161] 為檢測sTLR4和MD-2復(fù)合物對LPS誘導后SW480細胞周期的影響，流式細胞術(shù)檢測 相應(yīng)蛋白作用后各組細胞周期的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)sTLR4和MD-2復(fù)合物顯著抑制了細胞的周 期進程。此外，我們檢測了sTLR4和MD-2復(fù)合物對結(jié)腸癌細胞迀移和侵襲能力的影響。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，sTLR4和MD-2復(fù)合物顯著抑制了腫瘤細胞的迀移和侵襲能力。（見圖11，* P〈0 · 05)
[0162] 4. sTLR4和MD-2復(fù)合物抑制LPS誘導的SW480細胞促炎及迀移因子的分泌
[0163] 為檢測sTLR4和MD-2復(fù)合物對炎癥的抑制作用，LPS與相應(yīng)蛋白混合后分別作用于 SW480細胞，檢測各組細胞中促炎因子及趨化因子的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)sTLR4和MD-2復(fù)合物 處理后，腫瘤細胞分泌的促炎因子TNF-α，IL-8，IL-6及趨化因子CXCL1，麗P2的mRNA水平顯 著降低，同時IL-8和CXCL1的蛋白水平也明顯下降。以上結(jié)果提示，sTLR4和MD-2復(fù)合物抑制 了LPS誘導的SW480細胞促炎因子及迀移因襲的分泌。（見圖12，* P〈0.05)
[0164] 5. sTLR4和MD-2復(fù)合物抑制小鼠腫瘤模型的成瘤性
[0165] 為探討sTLR4和MD-2復(fù)合物在小鼠腫瘤模型中的保護作用，我們成功構(gòu)建裸鼠荷 瘤模型和腹腔種植轉(zhuǎn)移模型，并觀察sTLR4和MD-2復(fù)合物對兩種小鼠模型在LPS作用后的影 響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sTLR4和MD-2復(fù)合物處理后，兩種腫瘤模型小鼠的腫瘤體積與其他組相比均 明顯減小，而體重無明顯改變。此外，腫瘤組織中的促炎因子TNF-α和IL-6的mRNA及蛋白表 達明顯下降，而具有抑制炎癥因子IL-10的表達卻顯著增高。同時，我們發(fā)現(xiàn)sTLR4和MD-2復(fù) 合物處理后，腫瘤組織中VEGF的mRNA水平明顯下降，免疫組化結(jié)果也顯示腫瘤組織中⑶31 顯著降低。另外，我們還在A0M/DSS小鼠模型中探討sTLR4和MD-2復(fù)合物的保護作用。同樣 的，STLR4和MD-2復(fù)合物抑制了小鼠結(jié)腸的縮短程度，抑制了小鼠體重的下降，延長了小鼠 的生存時間。（見圖13, *Ρ〈0·05)
[0166] TLR4已經(jīng)被證實與多種癌癥密切相關(guān)，包括胃癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和結(jié)腸 癌。又有研究報道TLR4的高表達與結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。我們的研究同樣證實了這 一點。鑒于TLR4在老鼠和結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)腸炎中的作用，缺失TLR4的老鼠可以達到預(yù)防結(jié) 直腸癌的作用，證實了TLR4可以直接或間接促進腫瘤進展。我們的研究從體內(nèi)體外兩方面 分別證實了 sTLR4/sMD-2復(fù)合物對腫瘤細胞生物學行為和腫瘤生成的抑制作用。國外也有 學者報道了類似的研究在胃癌腫瘤細胞中的作用?？傊?，LPS誘導的TLR4信號的活化促進了 CRC生長，粘性和轉(zhuǎn)移能力。針對TLR4信號通路的研究將有可能為結(jié)直腸癌的防治提供新的 治療策略。
【主權(quán)項】
1. 一種作為TLR4信號通路抑制劑用于結(jié)腸癌治療的STLR4和MD2蛋白復(fù)合物，其特征在 于，所述sTLR4和MD2蛋白復(fù)合物中sTLR4蛋白與MD2蛋白兩者的摩爾比為1:1。2. 如權(quán)利要求1所述的sTLR4和MD2蛋白復(fù)合物，其特征在于，所述sTLR4和MD2蛋白復(fù)合 物中sTLR4蛋白與MD2蛋白之間離子鍵結(jié)合。3. 如權(quán)利要求1或2所述sTLR4和MD2蛋白復(fù)合物的制備方法，其特征在于，所述方法包 括如下步驟： (1) 構(gòu)建pTT5-hsTLR4-hi s質(zhì)粒并將該質(zhì)粒導入感受態(tài)細菌表達sTLR4蛋白；所述pTT5-hsTLR4-his質(zhì)粒序列如SEQ ID Ν0.1所示； (2) 構(gòu)建pTT5-hsMD-2-his質(zhì)粒并將該質(zhì)粒導入感受態(tài)細菌表達MD-2蛋白，所述pTT5-hsMD-2-his質(zhì)粒序列如SEQIDN0.2所示 ； (3) 將表達出的sTLR4蛋白與MD-2蛋白按權(quán)利要求1所述比例混合，即得sTLR4和MD2蛋 白復(fù)合物。4. 權(quán)利要求1或2所述sTLR4和MD2蛋白復(fù)合物在制備治療結(jié)直腸癌藥劑中的應(yīng)用。5. 如權(quán)利要求1或2所述sTLR4和MD2蛋白復(fù)合物在制備TLR4信號通路抑制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K38/17GK105949319SQ201610268515
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】戴盛明, 鄒燕, 覃鳳嫻, 陳紀飛, 蒙杰, 韋柳華, 梧春林, 張巧云, 陳翔, 陳曉麗, 吳昊, 韋東
【申請人】柳州市工人醫(yī)院