一種透明質(zhì)酸分子量分級方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種透明質(zhì)酸鈉分子量分級方法，其特征在于，包含以下步驟：(1)配制透明質(zhì)酸鈉溶液；(2)向步驟(1)透明質(zhì)酸鈉溶液中添加4％?40％(w/v)的強(qiáng)堿陰離子交換樹脂，攪拌吸附；(3)加入第一強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液，靜置解析樹脂，收集第一解析液；(4)加入第二強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液，攪拌解析樹脂，收集第二解析液；(5)加入第三強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液和無機(jī)堿溶液再生樹脂，收集再生液；(6)分別對第一解析液、第二解析液和再生液進(jìn)行乙醇沉淀；(7)干燥。該方法使用一種成本低，操作簡單的樹脂分離技術(shù)，且采用靜態(tài)吸附，適合于大規(guī)模化生產(chǎn)。
【專利說明】
一種透明質(zhì)酸分子量分級方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種透明質(zhì)酸分子量分級方法。
【背景技術(shù)】
[0002]透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，簡稱HA)又名玻璃酸，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺雙糖單位反復(fù)交替而形成的一種線性大分子酸性黏多糖，水溶液中帶有負(fù)電荷，其重均分子量一般為1萬?1000萬Da，玻璃酸鈉(sodium hyaluronate)為玻璃酸的鈉鹽形式。目前商品化的HA—般為Na鹽形式，為白色纖維狀或粉末狀固體，存在較強(qiáng)的吸濕性，溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。200萬Da以上的為高分子量HA; 100萬Da-200萬Da為中分子量HA; I萬Da-1OO萬Da為低分子量HA; I萬以下為寡聚HA。其分子量與其生理學(xué)功能密切相關(guān)，不同分子量的玻璃酸鈉具有不同的生物活性。HA分子量是一種重要的藥理學(xué)性質(zhì)，由于HA分子量的重要性，對HA分子量的分級研究已經(jīng)成為技術(shù)人員的研究熱點(diǎn)。
[0003]專利申請CN102516410 A采用酸堿水解結(jié)合法將高分子量的透明質(zhì)酸鈉制備成不同小分子量的透明質(zhì)酸鈉。很難得到經(jīng)濟(jì)價值高、醫(yī)用級別要求的高分子量透明質(zhì)酸鈉。
[0004]超濾膜分離技術(shù)如CN103319627A，對設(shè)備要求高，成本高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)且只能得到兩種規(guī)格的透明質(zhì)酸成品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種透明質(zhì)酸鈉分子量分級的方法。該方法采用了樹脂分離技術(shù)，可以用于透明質(zhì)酸的生產(chǎn)過程中，或者用于對透明質(zhì)酸成品進(jìn)行再處理，根據(jù)需求可得到不同分子量的HA成品，能夠更好的提高HA的商業(yè)應(yīng)用價值。
[0006]—方面，本發(fā)明提供了一種透明質(zhì)酸鈉分子量分級的方法，其特征在于，包含以下步驟:
[0007](I)配制透明質(zhì)酸鈉溶液；
[0008](2)向步驟(I)透明質(zhì)酸鈉溶液中添加4%-40%(w/v)的強(qiáng)堿陰離子交換樹脂，攪拌吸附；
[0009 ] (3)加入第一強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液，靜置解析樹脂，收集第一解析液；
[0010](4)加入第二強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液，攪拌解析樹脂，收集第二解析液；
[0011 ] (5)加入第三強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液和無機(jī)堿溶液再生樹脂，收集再生液；
[0012](6)分別對第一解析液、第二解析液和再生液進(jìn)行乙醇沉淀；
[0013](7)干燥。
[0014]透明質(zhì)酸鈉是一種高分子量的聚合物，其在水溶液中帶有聚陰子負(fù)電荷，使用強(qiáng)堿性的陰離子交換樹脂能夠?qū)⑼该髻|(zhì)酸鈉吸附，使用不同解析方法，如靜置解析和攪拌解析，可得到不同分子量規(guī)格的透明質(zhì)酸鈉成品。本發(fā)明第一步采用靜態(tài)靜置解析而非常規(guī)的攪拌靜態(tài)解析，目的在于將被吸附于大孔強(qiáng)堿陰離子樹脂外表面的高分子量的透明質(zhì)酸鈉解析出來;第二步采用攪拌靜態(tài)解析，目的在于將被吸附于大孔強(qiáng)堿陰離子樹脂孔徑內(nèi)的中分子量的透明質(zhì)酸鈉解析出來;第三步再生，將低分子量的透明質(zhì)酸鈉解析出來。分步解析的可能機(jī)理解釋:透明質(zhì)酸鈉是一種帶聚陰離子的線性高分子粘多糖決定了其與大孔陰離子樹脂的交換吸附行為受到:1、所帶電荷的；2、分子粒徑3、空間位阻的影響。小分子量的HA能夠鉆到大孔樹脂的孔徑內(nèi)并多位點(diǎn)交換吸附。而高分子量的HA由于粒徑大不能進(jìn)入孔內(nèi)，且位阻較大，在樹脂的外表面形成較弱的吸附，容易被解析。
[0015]在一些實(shí)施例中，第一強(qiáng)電解質(zhì)鹽、第二強(qiáng)電解質(zhì)鹽和第三強(qiáng)電解質(zhì)鹽各自獨(dú)立地為鹵代鹽、硫酸鹽和硝酸鹽。
[0016]在一些實(shí)施例中，無機(jī)堿是強(qiáng)堿。
[0017]在一些實(shí)施例中，第一強(qiáng)電解質(zhì)鹽、第二強(qiáng)電解質(zhì)鹽和第三強(qiáng)電解質(zhì)鹽各自獨(dú)立地為 NaCl、CaCl2、ZnCl2、MgCl2、Na2S04、MgS04 或 NaNO3。
[0018]在一些實(shí)施例中，無機(jī)堿是NaOH或Κ0Η。
[0019]在一些實(shí)施例中，第一強(qiáng)電解質(zhì)鹽、第二強(qiáng)電解質(zhì)鹽和第三強(qiáng)電解質(zhì)鹽各自獨(dú)立地為 NaCl、CaCl2、ZnCl2、Na2S04、MgCl2、MgS04 或 NaNO3 ；無機(jī)堿是 NaOH 或 Κ0Η。
[0020]在一些實(shí)施例中，步驟(I)透明質(zhì)酸鈉分子量為50-95萬Da。
[0021]在一些實(shí)施例中，步驟(I)透明質(zhì)酸鈉溶液濃度為l-10g/L。
[0022]在一些實(shí)施例中，步驟(I)透明質(zhì)酸鈉溶液為水溶液。
[0023]在一些實(shí)施例中，步驟(I)中透明質(zhì)酸鈉分子量為50-95萬Da，其為溶液濃度為1-1 Og/L的水溶液。
[0024]在一些實(shí)施例中，步驟(2)中攪拌吸附在室溫下進(jìn)行。
[0025]在一些實(shí)施例中，室溫是指15°C至40°C。
[0026]在另一實(shí)施例中，室溫是指20°C至35°C。
[0027]在一些實(shí)施例中，步驟(2)中攪拌吸附3-24小時。
[0028]在另一些實(shí)施例中，步驟(2)中攪拌吸附3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13小時。
[0029]在一些實(shí)施例中，步驟(3)中第一強(qiáng)電解質(zhì)鹽濃度為0.05-2M。
[0030]在一些實(shí)施例中，步驟(3)中第一強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液為水溶液。
[0031 ]在一些實(shí)施例中，步驟(3)中靜置解析3-8小時。
[0032]在一些實(shí)施例中，步驟(3)中第一強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液為濃度為0.05-2M的水溶液，靜置解析3-8小時。
[0033]在一些實(shí)施例中，步驟(4)中第二強(qiáng)電解質(zhì)鹽濃度為0.05-2M。
[0034]在一些實(shí)施例中，步驟(4)中第二強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液為水溶液。
[0035]在一些實(shí)施例中，步驟(4)中攪拌解析3-24小時。
[0036]在一些實(shí)施例中，步驟(4)中第二強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液為濃度為0.05-2M的水溶液，攪拌解析3-24小時
[0037]在一些實(shí)施例中，步驟(5)中第三強(qiáng)電解質(zhì)鹽濃度為0.05-2M。
[0038]在一些實(shí)施例中，步驟(5)中第三強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液為水溶液。
[0039]在一些實(shí)施例中，步驟(5)中無機(jī)堿濃度為0.1-0.5M。
[0040]在一些實(shí)施例中，步驟(5)中無機(jī)堿溶液為水溶液。
[0041 ] 在一些實(shí)施例中，步驟(5)中再生3-24小時。
[0042]在一些實(shí)施例中，步驟(5)中第三強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液為濃度為0.05-2M的水溶液，無機(jī)堿溶液為濃度為0.1-0.5M的水溶液，再生3-8小時。
[0043]不同的鹽濃度作為離子交換解析劑，能夠?qū)⒉煌肿恿恳?guī)格的透明質(zhì)酸鈉聚合物從樹脂上置換出來，可得到不同分子量規(guī)格的透明質(zhì)酸鈉成品。
[0044]在一些實(shí)施例中，步驟(6)中用1.5-2倍體積95 %乙醇沉淀。
[0045]在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種透明質(zhì)酸鈉分子量分級的方法，其特征在于，包含以下步驟:
[0046](a)配制分子量為50-95萬Da的透明質(zhì)酸鈉溶液，其溶液濃度為l-10g/L;
[0047](b)向步驟(a)透明質(zhì)酸鈉溶液中添加4%-40%(w/v)的強(qiáng)堿陰離子交換樹脂，室溫攪拌吸附3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13小時；
[0048](c)加入0.05-2M第一強(qiáng)電解質(zhì)鹽水溶液，靜置解析樹脂3-8小時，收集第一解析液；
[0049](d)加入0.05-2M第二強(qiáng)電解質(zhì)鹽水溶液，攪拌解析樹脂3-24小時，收集第二解析液；
[0050](e)加入0.05-2M第三強(qiáng)電解質(zhì)鹽水溶液和0.1-0.5M無機(jī)堿水溶液再生樹脂3_24小時，收集再生液；
[0051 ] (f)分別對第一解析液、第二解析液和再生液用1.5-2倍體積95%乙醇沉淀；
[0052](g)干燥。
[0053]在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的方法進(jìn)一步的包括:攪拌吸附前，用酸或堿調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸鈉溶液的PH值為5-7。
[0054]本發(fā)明提供的透明質(zhì)酸鈉分子量分級的方法，使用一種成本低，操作簡單的樹脂分離技術(shù)，且采用靜態(tài)吸附，適合于大規(guī)?；a(chǎn);特別是能夠?qū)?0-95萬Da的透明質(zhì)酸分子量分級成醫(yī)藥用途以及化妝品用途所需的分子量，3種不同分子量規(guī)格的透明質(zhì)酸鈉成品，充分提高其商業(yè)價值。
[0055]本發(fā)明所使用的術(shù)語“強(qiáng)電解質(zhì)鹽”在溶液中全部以離子的形態(tài)存在，即不存在電解質(zhì)的“分子”。
[0056]本發(fā)明所使用的術(shù)語“溶液”是指適用于本發(fā)明所述方法的任何溶液，包括單一溶劑溶液或混合溶劑溶液。在一些實(shí)施例中為水溶液。
[0057]本發(fā)明所使用的術(shù)語“鹵代鹽”是指在溶液中全部以離子的形態(tài)存在的強(qiáng)電解質(zhì)型鹵代鹽。
[0058]本發(fā)明所使用的術(shù)語“硫酸鹽”是指在溶液中全部以離子的形態(tài)存在的強(qiáng)電解質(zhì)型硫酸鹽。
[0059]本發(fā)明所使用的術(shù)語“硝酸鹽”是指在溶液中全部以離子的形態(tài)存在的強(qiáng)電解質(zhì)型硝酸鹽。
[0060]本發(fā)明所使用的術(shù)語“強(qiáng)堿”是指堿金屬和部分堿土金屬對應(yīng)的堿。
[0061 ]下面簡寫詞的使用貫穿本發(fā)明:
[0062]w/v 質(zhì)量體積比
[0063]NaCl 氯化鈉
[0064]CaCl2 氯化鈣
[0065]ZnCl2 氯化鋅
[0066]Na2SO4硫酸鈉
[0067]NaNO3硝酸鈉
[0068]NaOH氫氧化鈉
[0069]KOH氫氧化鉀
[0070]Da道爾頓
[0071]g/L克每升
[0072]M摩爾每升
【具體實(shí)施方式】
[0073]本發(fā)明實(shí)施例公開了一種透明質(zhì)酸鈉分子量分級的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品及方法進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0074]為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的一種透明質(zhì)酸鈉分子量分級的方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0075]實(shí)施例1
[0076]取分子量為74.7萬Da的透明質(zhì)酸鈉樣品1.0g，溶于600mL純化水中，得到濃度為1.67g//L的透明質(zhì)酸鈉溶液，用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸鈉溶液的pH值為6.5后加入強(qiáng)堿陰離子交換樹脂40.0g攪拌吸附8h。過濾溶液得樹脂。解吸附過程分為3個階段:先加入2M的NaCl 600mL溶液靜置解析3h，期間每隔Ih攪動一次，后過濾得第一解析液;再加入2M的NaCl 600mL溶液攪拌解析3h，攪拌轉(zhuǎn)速10rpm后過濾得到第二解析液;最后加入2M NaCl+0.1M NaOH 600mL溶液攪拌再生3h后過濾得到再生液。第一解析液與第二解析液和再生液分別用2倍體積95%的乙醇沉淀，真空干燥得到3種不同分子量的透明質(zhì)酸鈉成品。
[0077]采用GPC凝膠色譜法測定分子量，第一解析液的透明質(zhì)酸鈉分子量147萬Da收率25.18%;第二解析液的透明質(zhì)酸鈉分子量106萬Da收率23.05%;再生液透明質(zhì)酸鈉的分子量為35.8萬Da收率45.31 %。
[0078]實(shí)施例2
[0079]取分子量為74.7萬Da的透明質(zhì)酸鈉樣品1.0g，溶于600mL純化水中，得到濃度為1.67g//L的透明質(zhì)酸鈉溶液，用lmol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸鈉溶液的pH值為6.5后加入強(qiáng)堿陰離子交換樹脂樹脂40.0g攪拌吸附8h。過濾溶液得樹脂。解吸附過程分為3個階段:先加入0.1M的NaCl 600mL溶液靜置解析3h，期間每隔Ih攪動一次，后過濾得第一解析液;再加入2M的NaCl 600mL溶液攪拌解析3h，攪拌轉(zhuǎn)速10rpm后過濾得到第二解析液;最后加入2M NaCl+0.lM NaOH 600mL溶液攪拌再生3h后過濾得到再生液。第一解析液與第二解析液和再生液分別用2倍體積95%的乙醇沉淀，真空干燥得到3種不同分子量的透明質(zhì)酸鈉成品O
[0080]采用GPC凝膠色譜法測定分子量，第一解析液的透明質(zhì)酸鈉分子量98.8萬Da收率7.1 %，第二解析液的透明質(zhì)酸鈉分子量132萬Da收率37.87%，再生液透明質(zhì)酸鈉的分子量為 29.8 萬 Da 收率 40.31 %。[0081 ] 實(shí)施例3
[0082]取分子量為92.5萬Da的透明質(zhì)酸鈉樣品1.0g，溶于600mL純化水中，得到濃度為I.67g/L的透明質(zhì)酸鈉溶液，pH值為5.65。向其中加入強(qiáng)堿陰離子交換樹脂40.0g攪拌吸附8h。過濾溶液得樹脂。解吸附過程分為3個階段:先加入2M NaCl 600mL溶液靜置解析3h，期間每隔Ih攪動一次，后過濾得第一解析液;再加入2M的NaCl 600mL溶液攪拌解析3h，攪拌轉(zhuǎn)速10rpm后過濾得到第二解析液;最后加入2M NaCl+0.lM NaOH 600mL溶液攪拌再生3h后過濾得到再生液。第一解析液與第二解析液和再生液分別用2倍體積95 %的乙醇沉淀，真空干燥得到3種不同分子量的透明質(zhì)酸鈉成品。
[0083]采用GPC凝膠色譜法測定分子量，第一解析液的透明質(zhì)酸鈉分子量169.7萬Da收率26.5%，第二解析液的透明質(zhì)酸鈉分子量110萬Da收率22.15%，再生液透明質(zhì)酸鈉的分子量分子量為45.8萬Da收率41.65 %。
[0084]以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種透明質(zhì)酸鈉分子量分級方法，其特征在于，包含以下步驟: (1)配制透明質(zhì)酸鈉溶液； (2)向步驟(I)透明質(zhì)酸鈉溶液中添加4%-40%(w/v)的強(qiáng)堿陰離子交換樹脂，攪拌吸附； (3)加入第一強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液，靜置解析樹脂，收集第一解析液； (4)加入第二強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液，攪拌解析樹脂，收集第二解析液； (5)加入第三強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液和無機(jī)堿溶液再生樹脂，收集再生液； (6)分別對第一解析液、第二解析液和再生液進(jìn)行乙醇沉淀； (7)干燥。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是第一強(qiáng)電解質(zhì)鹽、第二強(qiáng)電解質(zhì)鹽和第三強(qiáng)電解質(zhì)鹽各自獨(dú)立地為 NaCl、CaCl2、ZnCl2、Na2S04、MgCl2、MgS04 或 NaNO3;無機(jī)堿是 NaOH 或 KOH。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟⑴中透明質(zhì)酸鈉分子量為50-95萬Da^為溶液濃度為1-1 Og/L的水溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟(2)中攪拌吸附在室溫下進(jìn)行3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 或13 小時。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征是步驟(3)中第一強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液為濃度為0.05-2M的水溶液，靜止解析3-8小時。6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征是步驟(4)中第二強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液為濃度為0.05-2M的水溶液，攪拌解析3-24小時。7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征是步驟(5)中第三強(qiáng)電解質(zhì)鹽溶液為濃度為0.05-2M的水溶液，無機(jī)堿溶液為濃度為0.1-0.5M的水溶液，再生3_24小時。8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征是步驟(6)中用1.5-2倍體積95%乙醇沉淀。9.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，包含以下步驟: (a)配制分子量為50-95萬Da的透明質(zhì)酸鈉溶液，其溶液濃度為l-10g/L; (b)向步驟(a)透明質(zhì)酸鈉溶液中添加4%-40%(w/v)的強(qiáng)堿陰離子交換樹脂，室溫攪拌吸附3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13小時； (c)加入0.05-2M第一強(qiáng)電解質(zhì)鹽水溶液，靜置解析樹脂3-8小時，收集第一解析液； (d)加入0.05-2M第二強(qiáng)電解質(zhì)鹽水溶液，攪拌解析樹脂3-24小時，收集第二解析液； (e)加入0.05-2M第三強(qiáng)電解質(zhì)鹽水溶液和0.1-0.5M無機(jī)堿水溶液再生樹脂3_24小時，收集再生液； (f)分別對第一解析液、第二解析液和再生液用I.5-2倍體積95 %乙醇沉淀； (g)干燥。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是進(jìn)一步的包括:攪拌吸附前，用酸或堿調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸鈉溶液的PH值為5-7。
【文檔編號】C08B37/08GK105949348SQ201610289516
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月3日
【發(fā)明人】羅明明, 石江水, 林小鵲, 王海剛, 屈代鑫, 郭振權(quán), 趙裕棟, 張鴻, 李文佳
【申請人】廣東東陽光藥業(yè)有限公司