大豆蛋白殼聚糖微球結(jié)合氨基酸金屬配合物的制備及作為抗氧化劑的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種大豆蛋白殼聚糖納米微球結(jié)合氨基酸希夫堿金屬配合物的制備方法，是將兩種不同類(lèi)型的天然高分子，即：大豆蛋白與殼聚糖，通過(guò)氫鍵、疏水作用相結(jié)合，制得天然高分子納米微球；然后將其與氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合，制備成納米微球與金屬配合物的結(jié)合體，在提高氨基酸希夫堿金屬配合物水溶性的同時(shí)降低其毒性?？寡趸阅苎芯勘砻?，該復(fù)合物具有很強(qiáng)的清除氧自由基能力，因此可作為SOD酶模擬物，在制備抗氧化藥物方面具有很好的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
大豆蛋白殼聚糖微球結(jié)合氨基酸金屬配合物的制備及作為抗氧化劑的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物復(fù)合材料的制備方法，本發(fā)明同時(shí)還涉及該復(fù)合材料作為SOD酶模擬物，在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用，屬于天然高分子復(fù)合材料領(lǐng)域及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]活性氧包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、過(guò)氧化氫和單線態(tài)氧，這些都是人類(lèi)新陳代謝的天然副產(chǎn)物。但是，當(dāng)其過(guò)量時(shí)，就會(huì)攻擊生物分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、酶、DNA和RNA，導(dǎo)致細(xì)胞或組織損傷。超氧化物歧化酶(SOD)是一種體內(nèi)的金屬酶，能夠催化氧自由基的歧化反應(yīng)，平衡體內(nèi)的氧自由基。雖然天然SOD清除氧自由基的能力很強(qiáng)，但其提取工藝復(fù)雜、價(jià)格高并且通過(guò)細(xì)胞膜的通透性很差。因此，研究SOD酶模擬物成為熱點(diǎn)。
[0003]希夫堿金屬配合物已被廣泛用作SOD酶模擬物。然而，大多數(shù)具有生物活性的希夫堿金屬配合物在水中的溶解度差，且有一定毒性，這限制了它們的應(yīng)用。而氨基酸希夫堿金屬配合物毒性較低，可作為SOD酶模擬物，但其缺點(diǎn)是水溶性差。
[0004]殼聚糖(CS)是一種天然的聚陽(yáng)離子類(lèi)多糖，因其有良好的生物可降解性、抗菌性和生物相容性等特性，可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品、藥物載體等領(lǐng)域。在殼聚糖分子鏈上含有大量的伯氨基，在酸性條件下，伯氨基發(fā)生質(zhì)子化而帶正電成為聚陽(yáng)離子，很容易在靜電作用下與聚陰離子聚合。
[0005]大豆分離蛋白作為一類(lèi)天然高分子材料，不僅來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，且具有可降解、生物相容、熱穩(wěn)定、無(wú)污染、綠色環(huán)保等一些優(yōu)良性能，可被廣泛應(yīng)用，因而具有很好的經(jīng)濟(jì)效益、應(yīng)用價(jià)值與發(fā)展前景。
[0006]微凝膠是直徑在I?1000nm之間，分散在溶劑中具有分子內(nèi)交聯(lián)結(jié)構(gòu)的顆粒，呈液態(tài)。近年來(lái)，微凝膠在藥物載體、石油開(kāi)采、化學(xué)分離、傳感器和納米技術(shù)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。但很少有人將其與氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合成結(jié)合體作為SOD酶模擬物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的是提供一種大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的制備方法；
本發(fā)明另一目的是提供該大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體作為抗氧化劑應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0008]—、大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的制備
(I)大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液的制備:將殼聚糖按固液比1:300?1:1000 g/mL攪拌溶解于稀酸溶液中，得到酸性殼聚糖溶液;將大豆蛋白按固液比I: 200-1:750 g/mL攪拌溶解于分散溶劑中，得到大豆蛋白分散液;再在攪拌下將大豆蛋白分散液滴加到酸性殼聚糖溶液中，繼續(xù)攪拌10'60 min，然后透析4?30 h，即得到大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液。
[0009]所述大豆蛋白與殼聚糖的質(zhì)量比為1:0.8-1:10；所述分散溶劑為濃度為5?12mol/L尿素溶液或濃度為0.1?I mol/L的NaOH或KOH溶液;所述稀酸溶液為0.1?I mol/L的醋酸或鹽酸溶液。
[0010](2)大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的制備:將氨基酸希夫堿金屬配合物按固液比1:2?1:5 g/mL溶于有機(jī)溶劑中，再加入到上述大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液，在室溫、避光下攪拌I?2 h，然后透析I?10 h，即得大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體。
[0011]所述氨基酸希夫堿金屬配合物的制備方法為本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有成熟技術(shù)(R.-M.Wang, C.-J.Hao, Y.-P.Wang, S.-B.Li， J.Mol.Catal.A: Chem.1999， 147:173-178)。
[0012]所述有機(jī)溶劑為二甲亞砜或乙醇;所述透析采用2000?18000 Da的透析袋。
[0013]二、大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的表征 1、宏觀與微觀形貌
圖1為本發(fā)明制備的大豆蛋白殼聚糖納米微球的宏觀形貌。從圖1可以看出，大豆蛋白殼聚糖納米微球的水溶液透明性高，且發(fā)一定藍(lán)光，說(shuō)明其粒徑較小。
[0014]圖2為本發(fā)明制備的大豆蛋白殼聚糖納米微球的掃描電鏡圖。通過(guò)掃描電鏡可看出，大豆蛋白與殼聚糖通過(guò)靜電作用形成微球后，呈不規(guī)則球狀結(jié)構(gòu)，直徑約為200~300 nm左右。
[0015]2、紅外光譜
圖3為本發(fā)明制備的大豆蛋白殼聚糖納米微球的紅外吸收光譜圖。圖2中在3356 cm-1處出現(xiàn)了殼聚糖的N-H伸縮振動(dòng)峰和O-H伸縮振動(dòng)峰，2856 cm—1和2821cm—1附近出現(xiàn)了殼聚糖甲基和次甲基的C-H伸縮振動(dòng)峰，1606 cm—1處的吸收峰是CS和SPI中酰胺I帶的特征峰重疊形成的，1504 cm—1附近的吸收峰是CS和SPI中酰胺II帶的特征峰重疊形成的，1160cm—1處的吸收峰歸屬為SPI中酰胺III帶的特征吸收峰。表明大豆蛋白與殼聚糖成功復(fù)合。
[0016]3、紫外-可見(jiàn)光譜
圖4為本發(fā)明制備的大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的紫外-可見(jiàn)光譜。納米微球的特征吸收峰在278 nm左右，氨基酸金屬配合物的特征吸收峰分別在298nm，376nm左右。在大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的曲線上，納米微球的特征吸收峰發(fā)生了藍(lán)移，吸收強(qiáng)度也明顯增大;此外，在370 nm附近出現(xiàn)了氨基酸金屬配合物的特征吸收峰，說(shuō)明大豆蛋白殼聚糖納米微球與氨基酸金屬配合物結(jié)合成功。
[0017]三、大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的性能
1、熱穩(wěn)定性
圖5為本發(fā)明制備的大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的熱重分析圖。從圖5中可以看出:從25°0100°C之間的失重，脫除了材料中的自由水及結(jié)合水；100-300°C之間的失重，主要是納米微球中大豆蛋白和殼聚糖相互作用力減弱，材料分解導(dǎo)致的;在300°0400°(:之間的失重，主要是材料降解;400°C以后，大部分材料已經(jīng)降解，失重率變化不大。因此，大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的熱穩(wěn)定性明顯提高。
[0018]2、抗氧化性能
下面通過(guò)測(cè)試大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體對(duì)超氧陰離子的清除能力，考察其抗氧化性能。
[0019]通過(guò)NBT光還原法測(cè)定大豆蛋白殼聚糖納米微球和大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的清除超氧陰離子能力。結(jié)果如圖6所示:相比大豆蛋白殼聚糖納米微球(曲線b)，結(jié)合氨基酸金屬配合物的結(jié)合體(曲線a)清除超氧陰離子的能力明顯提高，其EC50值為0.013 μπιοI/L，模擬度達(dá)到315.38%，因而是一種優(yōu)異的SOD模擬物。
[0020]綜上所述，本發(fā)明采用簡(jiǎn)單方法，將兩種不同類(lèi)型的天然高分子，S卩:大豆蛋白與殼聚糖，通過(guò)氫鍵、疏水作用相結(jié)合，制得天然高分子納米微球;然后與氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合，制備形成納米微球金屬配合物結(jié)合體，在提高氨基酸希夫堿金屬配合物水溶性的同時(shí)降低其毒性;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該復(fù)合物清除氧自由基的能力得到大幅提高，可作為SOD酶模擬物，用于抗氧化藥物的制備。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為大豆蛋白殼聚糖納米微球的宏觀形貌。
[0022]圖2為大豆蛋白殼聚糖納米微球的掃描電鏡圖。
[0023]圖3為大豆蛋白殼聚糖納米微球的紅外光譜。
[0024]圖4為大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的紫外-可見(jiàn)光譜。
[0025]圖5為大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的熱重分析圖。
[0026]圖6為大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的超氧陰離子清除活性。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的制備和性能作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0028]實(shí)施例1
將0.05 g殼聚糖在50 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液中，攪拌溶解0.5 h，得到酸性殼聚糖溶液;將0.08 g大豆蛋白分散于20 mL的10 mol/L尿素溶液中，攪拌lh，使大豆蛋白完全溶解，得到大豆蛋白分散液;再在室溫、高速攪拌下，將5 mL大豆蛋白分散液緩慢滴入50 mL酸性殼聚糖溶液中，攪拌30 min后，采用18000 Da的透析袋透析4 h，即得大豆蛋白-殼聚糖納米微球分散液。
[0029]將2 g氨基酸希夫堿金屬配合物溶于5 mL乙醇中，取0.15 mL該溶液，加到2 mL大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液中，室溫、避光、攪拌I h，然后用18000 Da的透析袋透析I h，得到大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合體。相對(duì)于天然超氧化物歧化酶，其模擬度達(dá)到了 290%。
[0030]實(shí)施例2
將0.02 g大豆蛋白分散于10 mL的I mol/L的NaOH溶液中，攪拌I h，使大豆蛋白完全溶解，得到大豆蛋白分散液;將0.2 g殼聚糖在100 mL 0.5 mol/L的鹽酸溶液中攪拌溶解0.5h，得到酸性殼聚糖溶液。在室溫、高速攪拌下，將10 mL大豆蛋白分散液緩慢滴入80 mL酸性殼聚糖溶液中，攪拌60 min, 15000 Da的透析袋透析4 h，即得到大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液。
[0031]將10 g的氨基酸希夫堿金屬配合物溶于30 mL二甲亞砜溶劑中，取0.15 mL該溶液，加到2 mL大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液中，室溫、避光下攪拌I h，然后15000 Da的透析袋透析I h，即得到大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合體。相對(duì)于天然超氧化物歧化酶，其模擬度達(dá)到了 315%。
[0032]實(shí)施例3
將0.02 g大豆蛋白分散于15mol/L的KOH溶液中，攪拌3 h，使大豆蛋白完全溶解，得到大豆蛋白分散液;將0.2 g殼聚糖在80 ml 0.3 mol/L的醋酸溶液中攪拌溶解0.5h，得到酸性殼聚糖溶液。在室溫、高速攪拌下，將15 mL大豆蛋白分散液緩慢滴入10 mL酸性殼聚糖溶液中，繼續(xù)攪拌10 min，采用12000 Da的透析袋透析4 h，即得大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液。
[0033]將10 g的氨基酸希夫堿金屬配合物溶于30 mL乙醇溶劑中，取該溶液0.25 mL，加至Ij8 mL大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液中，室溫、避光下攪拌I h，然后采用12000 Da的透析袋透析2 h，得到大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合體。相對(duì)于天然超氧化物歧化酶，其模擬度達(dá)到了 269%。
[0034]實(shí)施例4
將0.03 g大豆蛋白分散于20 mL的0.2 mo I/L的NaOH溶液中，攪拌3 h，使大豆蛋白完全溶解，得到大豆蛋白分散液;將0.3 g殼聚糖在90 mL 0.8 mol/L的鹽酸溶液中攪拌溶解0.5h，得到酸性殼聚糖溶液;在室溫、高速攪拌下，將20 mL大豆蛋白分散液緩慢滴入到30 mL酸性殼聚糖溶液中，然后繼續(xù)攪拌40 min，采用10000 Da的透析袋透析4 h，即得大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液。
[0035]將15g的氨基酸希夫堿金屬配合物溶于30 mL乙醇溶劑中，取該溶液0.3 mL，加到15 mL大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液，室溫、避光、攪拌I h，然后采用10000 Da的透析袋透析8 h，得到大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合體。相對(duì)于天然超氧化物歧化酶其模擬度達(dá)到了 302%。
[0036]實(shí)施例5
將0.04 g大豆蛋白分散于30mol/L的KOH溶液中，攪拌3 h，使大豆蛋白完全溶解，得到大豆蛋白分散液;將0.1 g殼聚糖在90 mL 0.1 mol/L的醋酸溶液中攪拌溶解2h，得到酸性殼聚糖溶液。在室溫、高速攪拌下，將20 mL大豆蛋白分散液緩慢滴入50 mL酸性殼聚糖溶液中，然后繼續(xù)攪20 min，采用2000 Da的透析袋透析4 h，即得大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液。
[0037]將5 g的氨基酸希夫堿金屬配合物溶于20 mL二甲亞砜溶劑中，取該溶液0.4 mL,加到20 mL大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液，室溫、避光下攪拌I h，然后采用2000 Da的透析袋透析5 h，得到大豆蛋白-殼聚糖納米微球氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合體。相對(duì)于天然超氧化物歧化酶，其模擬度達(dá)到了 285%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合體的制備，包括以下步驟: (1)大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液的制備:將殼聚糖按固液比1:300?1:1000g/mL攪拌溶解于稀酸溶液中，得到酸性殼聚糖溶液;將大豆蛋白按固液比I: 200-1:750 g/mL攪拌溶解于分散溶劑中，得到大豆蛋白分散液;再在攪拌下將大豆蛋白分散液滴加到酸性殼聚糖溶液中，繼續(xù)攪拌10?60 min，然后透析4?30 h，即得到大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液； (2)大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體的制備:將氨基酸希夫堿金屬配合物按固液比1?1:5 g/mL溶于有機(jī)溶劑中，再加入到上述大豆蛋白殼聚糖納米微球分散液中，在室溫、避光下攪拌I?2 h，然后透析I?10 h，即得大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸金屬配合物結(jié)合體。2.如權(quán)利要求1所述大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合體的制備，其特征在于:步驟(I)中，大豆蛋白與殼聚糖的質(zhì)量比為1:0.8?1:10。3.如權(quán)利要求1所述大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合體的制備，其特征在于:步驟(I)中，所述分散溶劑為濃度為5?12 mol/L尿素溶液或濃度為0.1?Imo 1/L 的 NaOH 或 KOH 溶液。4.如權(quán)利要求1所述大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合體的制備，其特征在于:步驟(I)中，所述稀酸溶液為0.1-1 mol/L的醋酸或鹽酸溶液。5.如權(quán)利要求1所述大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合體的制備，其特征在于:步驟(2)中，氨基酸希夫堿金屬配合物溶液與大豆蛋白納米微球的體積比為1:10~1:50。6.如權(quán)利要求1所述大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合體的制備，其特征在于:步驟(2 )中，所述有機(jī)溶劑為二甲亞砜或乙醇。7.如權(quán)利要求1所述大豆蛋白殼聚糖納米微球-氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合體的制備，其特征在于:所述透析采用2000?18000 Da的透析袋。8.如權(quán)利要求1所述方法制備的大豆蛋白殼聚糖納米微球氨基酸希夫堿金屬配合物結(jié)合體，作為SOD酶模擬物在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P39/06GK105949793SQ201610378277
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】何玉鳳, 閆桂芳, 王榮民, 徐知麗, 王建風(fēng)
【申請(qǐng)人】西北師范大學(xué)