以纖維素酶及其復合酶協(xié)同雙酶法提高木薯原料出酒率的方法
【專利摘要】以纖維素酶及其復合酶協(xié)同雙酶法提高木薯原料出酒率的方法，本發(fā)明以木薯粉為原料生產(chǎn)酒精，液化階段按10U/g木薯粉添加α?淀粉酶，糖化階段按10U/g木薯粉添加纖維素酶或按200U/g木薯粉添加糖化酶同時添加由果膠酶14U/g木薯粉、纖維素酶10U/g木薯粉、植酸酶8U/g木薯粉組合酶。與雙酶法制備木薯酒精工藝比較，本發(fā)明所述的方法能提高木薯原料的出酒率，降低了木薯酒精生產(chǎn)成本、節(jié)約能耗。
【專利說明】
以纖維素酶及其復合酶協(xié)同雙酶法提高木薯原料出酒率的 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于工業(yè)生物，特別涉及復合酶制劑在木薯酒精生產(chǎn)中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 木薯是一種非糧作物，種植成本低，是用于制備燃料乙醇的優(yōu)質(zhì)原料。干木薯粉中 碳水化合物含量約74%，纖維素含量約5%。目前，國內(nèi)主要采用由α-淀粉酶、糖化酶組合的 雙酶法制備木薯酒精，包括液化、糖化、發(fā)酵、蒸餾四個過程，淀粉出酒率約37%。為提高糖 化率和出酒率，本發(fā)明人提出過"一種普魯蘭酶協(xié)同雙酶法降解木薯淀粉的方法"（專利號： 201010156920.4)，該方法提高了木薯淀粉還原糖含量、加快水解速率。但目前國內(nèi)關(guān)于普 魯蘭酶的研究還大部分停留在篩選天然的產(chǎn)普魯蘭酶菌株和初步的異源表達上，發(fā)酵水平 不高，關(guān)鍵生產(chǎn)技術(shù)由國外大型酶制劑公司掌握，如丹麥Novozymes和美國Genencor，成本 較高(甄杰等，一個新型耐熱普魯蘭酶的結(jié)構(gòu)與功能.《生物工程學報》，2014，1:119-128.)。
[0003] 纖維素酶能降解原料淀粉中纖維素和半纖維素等成分為可發(fā)酵糖，提高原料利用 率。已有文獻報道將果膠酶、纖維素酶、植酸酶的組合用于玉米為第一代原料的燃料乙醇生 產(chǎn)中（張強，陸軍，侯霖等.發(fā)酵增強劑在酒精生產(chǎn)中的應用，釀酒科技，2004,2:54-57)，可 顯著提高原料出酒率，縮短發(fā)酵時間，其添加量為果膠酶12u/g、纖維素酶50u/g、植酸酶8u/ g。然而，未得到重視的是，用單一酶和雙酶提高以木薯為第二代原料的燃料乙醇產(chǎn)率，如單 一的果膠酶、纖維素酶或植酸酶以及與復合酶制劑對比。作為【背景技術(shù)】，我們還以不同配比 的木聚糖酶、葡聚糖酶、中性蛋白酶等與雙酶配合實驗了木薯原料出酒率，其中，一定配比 的木聚糖酶的木薯原料出酒率為2 7.0 3 %，其它酶制劑得到的結(jié)果分別為12.9 9 %~ 22.21%〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種在糖化階段與糖化酶同時添加的酶或復合酶，以協(xié)同雙 酶法提高木薯原料出酒率，即以纖維素酶及其由果膠酶、纖維素酶、植酸酶三種酶制劑組合 協(xié)同雙酶法提高木薯原料出酒率的方法，推進以薯類作物為原料的燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0005] 本發(fā)明通過以下方式實現(xiàn)：
[0006] 以纖維素酶及其復合酶協(xié)同雙酶法提高木薯原料出酒率的方法，包括以下步驟：
[0007] (1)將木薯粉與水按3:1混勻，加入α-淀粉酶，升溫至70°C，保持30min;所述的α-淀 粉酶為中溫發(fā)酵α-淀粉酶，添加量為1 oooou/g木薯粉；
[0008] (2)降溫至60°C，添加糖化酶和纖維素酶，保持60min;所述的纖維素酶按?ου/g木 薯粉添加;糖化酶按200U/g木薯粉添加；
[0009] (3)酵母活化后，按0.2 %添加酵母，32 °C恒溫發(fā)酵7 2h，過濾、蒸餾。
[0010] 進一步，所述步驟⑵降溫至60°C，添加糖化酶和由果膠酶14U/g木薯粉、纖維素酶 10U/g木薯粉、植酸酶8U/g組成的復合酶，保持60min。
[0011] 進一步，所述步驟(3)酵母的活化方法為按5~10倍35°C溫水活化30min后均勻拌 入發(fā)酵料液。
[0012] 作為原理，本發(fā)明在糖化過程中，同時加入糖化酶與纖維素酶或由果膠酶、纖維素 酶、植酸酶三種酶制劑所組成的復合酶，即在糖化階段，通過酶制劑與雙酶的復合作用，增 加淀粉原料中鏈狀低聚糖含量，為糖化酶進一步水解提供更多的靶位目標和作用點；糖化 酶的作用位點是從非還原末端外切淀粉酶的α-l，4-葡萄糖苷鍵和α-l，6-葡萄糖苷鍵，增加 發(fā)酵料液中葡萄糖含量，從而提高原料出酒率。
[0013] 本發(fā)明的有益效果和進步是：
[0014] 本發(fā)明放棄了普魯蘭酶，除效果良好的果膠酶、纖維素酶和植酸酶之外，在選擇價 格相對低廉的酶制劑過程中，并與雙酶法的原料出酒率22.79 % (淀粉出酒率36.39 % )比 較，分別實驗和分析了木聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶等單一酶與雙酶復合對木薯原料出酒率 的影響。其中，18U/g木聚糖酶與雙酶復合的木薯原料出酒率為27.03%，提高約4.24% ;果 膠酶添加量為141]/^與雙酶復合，原料的出酒率為29%，提高約6.21%;纖維素酶101]/^木薯 粉與雙酶復合，原料的出酒率為30.32 %，提高約7.53% ;其余酶制劑對木薯原料出酒率沒 有提高或甚少。與雙酶法比較，以上果膠酶、纖維素酶或植酸酶與雙酶復合對木薯的出酒率 都有所促進，其中，纖維素酶l〇U/g木薯粉與雙酶復合提高較顯著。
[0015] 其次，本發(fā)明通過正交試驗確定了用復配的纖維素酶、果膠酶、植酸酶與雙酶復合 提高出酒率的最佳配方，其木薯的淀粉出酒率為50.79 %，原料出酒率是31.49 %，與雙酶法 的淀粉出酒率36.39%，原料出酒率22.79%相比較，本發(fā)明的原料出酒率提高了8.7%。
[0016] 再有，本發(fā)明在酒精發(fā)酵過程中的液化溫度為70°C，比雙酶法工藝的液化溫度80 ~90°C降低10~20°C，可節(jié)約煤耗，提高減排量。
[0017] 與纖維素酶、果膠酶及植酸酶的組合與雙酶復合比較，纖維素酶的出酒率稍低于 后者，但纖維素酶屬于前者的組合之一種，用量少，且纖維素酶l〇U/g木薯粉市售價格僅為 纖維素酶、果膠酶、植酸酶組合的1/2~1/3,更具有明顯的積極意義。
[0018] 如表10,根據(jù)生產(chǎn)原料價格可變成本和固定成本以規(guī)模經(jīng)濟條件比較本發(fā)明與雙 酶法的財務(wù)效益，采用雙酶法和本發(fā)明復合酶的投資回報率分別是13.15%和15.11%，投 資回收期分別是7.6年和6.6年，后者的投資回報率比前者高1.96%，投資回收期減少1年， 本發(fā)明復合酶工藝的經(jīng)濟效益優(yōu)于雙酶法工藝。
[0019] 因此，本發(fā)明在提高薯類原料出酒率的同時，具有環(huán)保、低廉的積極意義。
[0020] 以下結(jié)合具體實例說明本
【發(fā)明內(nèi)容】
。具體實例包括但不限制本發(fā)明的保護范圍：
【具體實施方式】
[0021 ]以下實施例中，原料為新鮮木薯自然風干、粉碎后的木薯，主要組成成分如表1所 不。
[0022]表1木薯原料的主要成分
[0023]
[0024]所述木薯原料的出酒率計算方法為：
[0027]其中，無水酒精的質(zhì)量先通過酒精計測出酒度，然后根據(jù)酒精計溫度濃度換算表 計算出無水酒精的質(zhì)量。
[0028]同時，原料出酒率與淀粉出酒率之間，按照62.6%換算原料出酒率量計算：
[0029] 原料出酒率=淀粉出酒率X62.62%…（1)
[0030] 以下各表中淀粉出酒率與原料出酒率之間關(guān)系均按(1)式換算。
[0031] 以下實施例中，α-淀粉酶活力為1萬U/g，最適作用溫度60~70°C，可適用于高達90 °C的液化過程，在pH6.0~7.0時較穩(wěn)定，最適pH6.0，pH5.0以下失活嚴重;糖化酶的酶活力 10萬U/g，作用溫度范圍為40~65°C，最適作用溫度范圍為58~60°C，pH有效范圍為3.0~ 5.5，最適pH范圍為4.0~4.5。果膠酶的酶活力為10萬U/g，其作用pH為3.5~6.5，最適pH是 5.5~6.0之間，最適使用溫度是55~60°C;纖維素酶酶活力為5萬U/g，使用溫度為30°C~60 °C，最佳溫度是50°C，使用pH范圍是4.0~5.5，最佳為4.8。植酸酶酶活為5萬U/g，最適作用 pH值為2.5~5.5。上述所有酶制劑均由江蘇銳陽生物科技有限公司生產(chǎn)。
[0032](一)木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶與雙酶復合對木薯出酒率的影響 [0033] 1 · 1果膠酶的最佳添加量
[0034]添加果膠酶和雙酶作比較，結(jié)果如表2所示。其中，對照組為雙酶法;在雙酶法的基 礎(chǔ)上，糖化階段同時加入糖化酶和果膠酶為實驗組。α-淀粉酶按10U/g木薯粉添加，糖化酶 按200U/g添加，果膠酶按6、10、14、18、22U/g木薯粉添加。
[0035]實施例1:將木薯粉與水按3:1混勻，加入α-淀粉酶，溫度升至70 °C，保持30min;再 把溫度下降至60°C，同時加入糖化酶和果膠酶，保持60min;按0.2 %添加酵母，在32°C條件 下恒溫發(fā)酵72h，過濾、蒸餾，計算出原料出酒率。
[0036]表2:不同果膠酶添加量對木薯原料出酒率的影響
[0037]
[0038] 從表中可以看出，添加果膠酶可以明顯提高木薯原料的出酒率，當果膠酶添加量 小于14U/g木薯粉時，木薯原料出酒率與果膠酶添加量成正比；當果膠酶添加量為14U/g時， 出酒率達到最高29% ;果膠酶添加量大于14U/g木薯粉，出酒率逐漸降低。
[0039] 1 · 2纖維素酶的最佳添加量
[0040]添加纖維素酶和雙酶法作比較，結(jié)果如表3所示。其中，對照組為雙酶法;在雙酶法 的基礎(chǔ)上，糖化階段同時加入糖化酶和纖維素酶為實驗組。α-淀粉酶按10U/g木薯粉添加， 糖化酶按200U/g木薯粉添加，纖維素酶分別按8、10、12、14、16U/g木薯粉添加。
[0041 ]實施例2:將木薯粉與水按3:1混勻，加入α-淀粉酶，溫度升至70 °C，保持30min;再 把溫度下降至60°C，同時加入糖化酶和纖維素酶，保持60min;按0.2%添加酵母，在32°C條 件下恒溫發(fā)酵72h，過濾、蒸餾，計算出原料出酒率。
[0042] 表3:不同纖維素酶添加量對木薯原料出酒率的影響
[0043]
[0044] 從表中可以看出，添加纖維素酶在一定范圍內(nèi)可以提高木薯原料的的出酒率，纖 維素酶添加量為l〇U/g時，木薯原料的出酒率最高，達到30.32%，該值與纖維素酶、果膠酶、 植酸酶與雙酶復配組合的木薯原料出酒率31.49%相比，數(shù)值接近，且為單一酶制劑。
[0045] 1 · 3植酸酶的最佳添加量
[0046] 添加植酸酶和傳統(tǒng)雙酶作比較，結(jié)果如表4所示。其中，對照組為雙酶法;在雙酶法 的基礎(chǔ)上，糖化階段同時加入糖化酶和植酸酶為實驗組。α-淀粉酶按10U/g木薯粉添加，糖 化酶按200U/g添加，植酸酶按4、8、12、16、20U/g木薯粉添加。
[0047]實施例3:將木薯粉與水按3:1混勻，加入α-淀粉酶，溫度升至70 °C，保持30min;再 把溫度下降至60°C，同時加入糖化酶和植酸酶，保持60min;按0.2 %添加酵母，在32°C條件 下恒溫發(fā)酵72h，過濾、蒸餾，計算出原料出酒率。
[0048]表4:不同植酸酶添加量對木薯原料出酒率的影響
[0050]從表中可以看出，木薯原料的出酒率與是否添加植酸酶有明顯關(guān)系，添加植酸酶 可提高木薯原料的出酒率。植酸酶添加量為4U/g和20U/g時，木薯原料的出酒率最高，達到 27.36%?？紤]成本，實際生產(chǎn)選擇按4U/g木薯粉添加。
[0051 ](二)通過正交試驗確定纖維素酶、果膠酶、植酸酶的組合最佳配比
[0052]以上通過各單一酶制劑為因素針對木薯乙醇的實驗得到了單一酶制劑的最佳使 用量?？紤]木薯粉的各種成分及含量與多種酶制劑復合之間存在相互作用，為提高體系中 還原糖含量，充分降解木薯中的淀粉和纖維素，提高出酒率，以下考察多因素正交實驗設(shè)計 方法，優(yōu)化復合酶制劑的配比，以獲得生產(chǎn)中使用的復合酶制劑。正交試驗因子水平見表5， 統(tǒng)計分析結(jié)果見表6和表7。
[0053] 表5:正交試驗因子水平
[0056]表6:正交試驗設(shè)計與結(jié)果分析

[0061] 從表6~7的數(shù)據(jù)可以看出，復合酶的最佳配比是A2B2C2組合，即果膠酶、纖維素 酶、植酸酶分別按14、10、8U/g木薯粉。按此配比添加復合酶，木薯原料出酒率可以達到 31.46 %，比較雙酶法的原料出酒率22.79 %，本發(fā)明的原料出酒率提高了 8.67 %。
[0062](三)本發(fā)明纖維素酶、果膠酶、植酸酶的組合復配雙酶與單純雙酶法的財務(wù)效益 比較
[0063]由于本發(fā)明單一的纖維素酶的原料價格僅為纖維素酶、果膠酶、植酸酶的組合的 1/2~1/3,以下財務(wù)效益分析主要以后者為例，前者的可變成本將低于后者，即前者的利潤 進一步尚于后者的利潤。
[0064] 生產(chǎn)原料單價見表8:
[0065] 表8生產(chǎn)原料單價表
[0066]
[0067]根據(jù)表8的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，計算得到兩種工藝的成本如表9所示。
[0068]表9不同發(fā)酵工藝的成本分析(單位:元）

[0071]根據(jù)某項目產(chǎn)品成本、銷售收入、稅前銷售利潤進行匯總，以規(guī)模經(jīng)濟條件綜合分 析項目的財務(wù)效益(如表10)，得到的增量效益。
[0072]表10企業(yè)各財務(wù)指標分析
[0074]根據(jù)計算，采用雙酶法和本發(fā)明復合酶的投資回報率分別是13.15%和15.11%， 投資回收期分別是7.6年和6.6年。就投資回報率和投資回收期來講，本發(fā)明復合酶工藝制 備木薯酒精的經(jīng)濟效益優(yōu)于雙酶法工藝，后者的投資回報率比前者高1.96%，投資回收期 減少1年。
【主權(quán)項】
1. 以纖維素酶及其復合酶協(xié)同雙酶法提高木薯原料出酒率的方法，包括以下步驟： (1) 將木薯粉與水按3:1混勾，加入α-淀粉酶，升溫至70°C，保持30min;所述的α-淀粉酶 為中溫發(fā)酵α_淀粉酶，添加量為10000 U/g木薯粉； (2) 降溫至60°C，添加糖化酶和纖維素酶，保持60 min;所述的纖維素酶按10U/g木薯粉 添加;糖化酶按200U/g木薯粉添加； (3 )酵母活化后，按0.2%添加酵母，32 °C恒溫發(fā)酵72h，過濾、蒸餾。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:所述步驟(2)降溫至60°C，添加糖化酶和由果 膠酶14U/g木薯粉、纖維素酶10U/g木薯粉、植酸酶8U/g組成的復合酶，保持60min。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是:所述步驟(3)酵母的活化方法為按5~10倍 35°C溫水活化30min后均勻拌入發(fā)酵料液。
【文檔編號】C12G3/02GK105950384SQ201610531610
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月7日
【發(fā)明人】尹芳, 張無敵, 許國芹, 柳靜, 王昌梅, 趙興玲, 劉士清, 楊紅
【申請人】云南師范大學