一種生產(chǎn)豬細(xì)小病毒vp2蛋白的重組菌株的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組菌株，本發(fā)明提供的表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的巴斯德畢赤酵母菌X33?VP2，其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2016098。本發(fā)明構(gòu)建了帶有豬細(xì)小病毒VP2蛋白基因的高效表達(dá)載體，獲得了在畢赤酵母菌中的高效表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組菌株，該表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白。這為工業(yè)化生產(chǎn)豬細(xì)小病毒亞單位疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。CCTCC NO: M 201609820160309
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種生產(chǎn)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組菌株
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種生產(chǎn)豬細(xì)小病毒VP2蛋白 的重組菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一，可 導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔及母豬不育和新生仔豬大量死亡。我國(guó)自20世 紀(jì)80年代后相繼從各地分離到PPV，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)一些豬群中該病的血清學(xué)陽(yáng)性率可達(dá)85% 以上。PPV常呈隱性感染存在，尤其是低劑量持續(xù)感染的現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生。該病毒除引起母豬 的繁殖障礙，還可與其他病原體協(xié)同作用引起多種疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。豬 細(xì)小病毒血清型單一、具有較高的免疫原性，疫苗接種是控制PPV感染的有效措施。
[0003]完整的病原體含有許多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主產(chǎn)生保護(hù)性應(yīng)答。其 中某些抗原還能引起過(guò)敏，免疫抑制和其他副作用，這是使用完整的病原體做疫苗的缺陷。 并且目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用的滅活苗生產(chǎn)制備抗原過(guò)程繁瑣，而弱毒疫苗現(xiàn)也有接種疫苗發(fā)病情況 存在。而用亞單位疫苗則可以解決這個(gè)問(wèn)題，尤其是這種疫苗除了具有抗原穩(wěn)定性高，純度 高，特異性強(qiáng)，敏感性高，不產(chǎn)生其他不相關(guān)抗體，免疫效果檢測(cè)方法方便準(zhǔn)確外，還十分易 于生產(chǎn)。不用動(dòng)物體或是胚體生產(chǎn)，不會(huì)帶有組織殘留物，但安全性高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組菌株及其應(yīng)用，為大規(guī) 模工業(yè)化生產(chǎn)中能生產(chǎn)出高效、安全、價(jià)廉的優(yōu)良亞單位疫苗和診斷試劑服務(wù)。
[0005] 本發(fā)明提供的表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的巴斯德畢赤酵母菌X33_VP2(Pichia pastoris X33-VP2)，已經(jīng)于2016年3月9日保藏于位于中國(guó)武漢、武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:Μ 2016098。
[0006] 將上述豬細(xì)小病毒VP2蛋白基因克隆入帶有高效表達(dá)Α0Χ啟動(dòng)子的畢赤酵母菌中， 在甲醇的作用下，豬細(xì)小病毒VP2蛋白獲得高效表達(dá)。
[0007] 上述方法中所述的誘導(dǎo)劑為終濃度0.55%的甲醇，所生產(chǎn)的豬細(xì)小病毒VP2蛋白， 其分子量約為64kD。
[0008] 本發(fā)明構(gòu)建了帶有豬細(xì)小病毒VP2蛋白基因的高效表達(dá)載體，獲得了在畢赤酵母 菌中的高效表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組菌株，該表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白。這為工業(yè)化生 產(chǎn)豬細(xì)小病毒亞單位疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例豬細(xì)小病毒VP2蛋白基因 PCR的擴(kuò)增鑒定圖，
[0010]圖2是本發(fā)明的VP2蛋白的blast比較圖；
[0011]圖3是本發(fā)明實(shí)施例重組菌發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳檢定圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行具體說(shuō)明。
[0013] 實(shí)施例1:豬細(xì)小病毒(PPV)VP2基因的篩選
[0014] 2010年在山東省多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)了豬細(xì)小病毒病的癥狀，而發(fā)病個(gè)體豬之前已經(jīng) 注射了已有的細(xì)小病毒疫苗，推測(cè)感染的病毒發(fā)生了變異；因此從發(fā)病個(gè)體中進(jìn)行豬細(xì)小 病毒的篩選;最終篩選出了豬細(xì)小病毒PPV1。
[0015] 為驗(yàn)證篩選的病毒的抗原性，使用了包含篩選的PPV1毒株在內(nèi)的5個(gè)不同來(lái)源的 病毒株作為抗原制備疫苗，免疫SPF豬后用篩選的病毒液進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明相比于其 它豬細(xì)小病毒疫苗，其本身制備的疫苗具有更好的免疫效果(P<〇.05)，因此確定其發(fā)生了 遺傳上的變異。
[0016] 根據(jù)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的抗原特性和氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，primer 1:5 ' -GCGGTACCATGTCTGAAAATGTTGAAGAAC-3 '，含ΚρηΙ位點(diǎn)；
[0017] primer 2:5'-GCGGCCGCCTAATATAATTTTCTTGGAAT-3'，含Notl位點(diǎn)。取PPV株病毒基 因作為模板，PCR擴(kuò)增目的片段，產(chǎn)物回收連接PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化和篩選陽(yáng)性克隆pMD18-T-VP2,經(jīng)序列測(cè)定（圖1為豬細(xì)小病毒VP2基因 PCR的擴(kuò)增鑒定圖）；其核苷酸序列為SEQ ID N0:2,編碼的蛋白的序列為SEQ ID N0:1。與NCBI中公開(kāi)的豬細(xì)小病毒VP2基因相比，最高的 同源性為96%;在存在579氨基酸的情況下，表明本發(fā)明的豬細(xì)小病毒VP2蛋白與已公開(kāi)的 蛋白存在不少于23個(gè)氨基酸的差異(圖2)。
[0018] 實(shí)施例2:重組豬細(xì)小病毒VP2蛋白的制備
[0019]包括以下步驟:a.構(gòu)建表達(dá)載體;b.構(gòu)建表達(dá)菌株;c .重組VP2蛋白的誘導(dǎo)和提取 純化。具體如下:將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒PMD18-T-VP2和表達(dá)載體pPICZa載體分別用ΚρηΙ和Notl雙 酶切產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒回收，分別獲得約1.7kb和 3.3kb片段，在16°C定向連接構(gòu)建pPICZa-VP2表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定正確后;將質(zhì)粒線性化 后，電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)菌株X33-VP2，并提取表達(dá)菌株X33-VP2基因組，使用引物primer 1和primer 2進(jìn)行PCR鑒定正確，于2016年3月9日保藏于中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2016098;進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，挑取含X33-VP2的單克 隆菌落接種于BMGY液體培養(yǎng)基，30 °C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體，用適量的BMMY懸浮后， 加入0.55 %甲醇，30°C誘導(dǎo)96小時(shí)。4°C，9000rpm離心5min，保留上清液，加入40%的硫酸銨 沉淀后，12000rpm離心5min收集蛋白沉淀，用PBS重溶蛋白。加入蛋白電泳上樣緩沖液，沸水 煮8分鐘后，用12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE鑒定（圖3是重組菌發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢定圖，圖中1、2、為VP2蛋白表達(dá)產(chǎn)物沉淀，Μ為分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。
[0020] 實(shí)施例3:疫苗的制備
[0021] 將生產(chǎn)豬細(xì)小病毒VP2蛋白的畢赤酵母表達(dá)菌株X33-VP2株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC Μ 2016098。
[0022] 1.制苗用菌液的制備將X33-VP2菌種接種于含博萊霉素的ΥΗ)液體培養(yǎng)基中，30°C 振蕩培養(yǎng)16~18小時(shí)。然后劃線接種于加有博萊霉素的Yro固體培養(yǎng)基，選取典型菌落2~3 個(gè)混合于少量Yro液體培養(yǎng)基中，置30°C搖床中振蕩培養(yǎng)18小時(shí)，定量分裝，經(jīng)純粹檢驗(yàn)后， 作為一級(jí)種子。取一級(jí)種子接種于BMGY液體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)16~18小時(shí)，經(jīng)鏡檢 后，置2~8°C保存，作為二級(jí)種子。
[0023] 2.制苗用蛋白的制備按發(fā)酵罐容積60% (V/V)加入BMGY不完全液體培養(yǎng)基，同時(shí) 按培養(yǎng)基〇. 1 % (V/ν)加入消泡劑，通入高溫蒸汽滅菌30分鐘，待培養(yǎng)基溫度降至32°C，加入 YNB和生物素，接種豬細(xì)小病毒VP2蛋白生產(chǎn)用畢赤酵母X33-VP2二級(jí)種子液，發(fā)酵罐參數(shù)設(shè) 置分別為攪拌速度800r/min，溫度30 °C，維持D0值(溶氧量)在20%。培養(yǎng)24小時(shí)后的菌液補(bǔ) 加甲醇，甲醇的補(bǔ)加速度為2ml/h/L誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)，按照以上發(fā)酵控制參數(shù)及工藝誘導(dǎo)表達(dá) 120小時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)菌液經(jīng)管式離心機(jī)10000r/min離心30分鐘，收獲的上清，加入硫酸銨沉 淀蛋白后，按12000r/min離心30分鐘收獲沉淀，加入適量的生理鹽水溶解蛋白沉淀。
[0024] 3.滅活將蛋白液置于滅活瓶?jī)?nèi)，計(jì)量加入10%甲醛溶液，隨加隨搖，使其充分混 合，甲醛溶液的最終濃度為0.1 %。加甲醛溶液后倒入另一滅活瓶中，以避免瓶口附近粘附 的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時(shí)后取出，置2~8°C保存。
[0025] 4.半成品檢驗(yàn)
[0026] (1)無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。
[0027] (2)蛋白含量測(cè)定按Bradf ord法檢測(cè)蛋白含量。
[0028] (3)滅活檢驗(yàn)將滅活后的蛋白液取少量接種YPD固體培養(yǎng)基，置于置30°C繼續(xù)培養(yǎng) 72小時(shí)。觀察無(wú)菌落生長(zhǎng)，判滅活檢驗(yàn)合格。
[0029]實(shí)施例2:亞單位滅活疫苗的制備
[0030] 經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)合格后的半成品VP2蛋白抗原進(jìn)行疫苗制備（以下配制中各液體成分按 體積比計(jì)）。
[0031] (1)油相制備取獸用白油95份，硬脂酸鋁1份，置于油相制備罐中加熱至80°C后，再 加司本一80 5份，至溫度達(dá)到115°C時(shí)，維持30min，冷卻后備用。
[0032] (2)水相制備將豬細(xì)小病毒VP2蛋白使用生理鹽水稀釋成150yg/0.1ml。取滅菌后 的5份吐溫-80，加入配液罐中，同時(shí)加入制苗用蛋白液95份，攪拌20~30min，使吐溫-80完 全溶解。
[0033] (3)乳化取油相2份放于高速剪切機(jī)內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水 相1份，以l〇〇〇〇r/min，乳化5分鐘。乳化后，取10ml，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水 相應(yīng)不超過(guò)0.5ml。
[0034] 實(shí)施例3、疫苗成品檢驗(yàn)
[0035] (1)性狀
[0036] 外觀疫苗應(yīng)為乳白色乳劑，無(wú)雜質(zhì)并且外包裝應(yīng)合格。
[0037] 劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均應(yīng)不擴(kuò) 散。
[0038] 穩(wěn)定性吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng) 不超過(guò)0.5ml。
[0039]黏度按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。
[0040] (2)裝量檢查按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。
[0041 ] (3)無(wú)菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。
[0042] (4)安全檢驗(yàn)用50日齡仔豬5只，每只頸部皮下注射疫苗1.0ml，同時(shí)設(shè)對(duì)照5只，在 相同的條件下飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14日，記錄試驗(yàn)豬采食、飲水及臨床情況。應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引 起的任何局部和全身不良反應(yīng)。
[0043] (5)效力檢驗(yàn)初產(chǎn)母豬5只，每只頸部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日齡初 產(chǎn)母豬作為不免疫作對(duì)照。母豬配種后，懷孕至38-40天時(shí)攻毒，結(jié)果從接種亞單位疫苗的 母豬的血漿中沒(méi)有分離到病毒，而對(duì)照母豬的血漿中則分離到病毒。攻毒40天后宰殺，接種 母豬共懷65頭胎豬，從它們的臟器中均沒(méi)有分離到病毒，而對(duì)照母豬共懷60頭胎豬，其中有 31頭的臟器分離到病毒。結(jié)果表明，用豬細(xì)小病毒VP2蛋白亞單位疫苗免疫母豬能夠抵抗病 毒的攻擊，不出現(xiàn)臨床癥狀，胎豬病毒分離均為陰性。對(duì)照組，出現(xiàn)輕微的臨床癥狀，胎豬病 毒分離陽(yáng)性率超過(guò)50%，表明豬細(xì)小病毒亞單位滅活疫苗能夠提供有效的保護(hù)。
[0044] 對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明，用目前市場(chǎng)上出售的豬細(xì)小病疫苗進(jìn)行免疫，再用本發(fā)明篩選的 PPV1株進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn);結(jié)果表明目前市場(chǎng)上出售的疫苗的免疫效果遠(yuǎn)低于本發(fā)明的VP2蛋 白疫苗的效果;推測(cè)是由于PPV1株的VP2蛋白疫苗發(fā)生變異導(dǎo)致目前疫苗的免疫效果不好。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種巴斯德畢赤酵母菌，其特征在于，所述的巴斯德畢赤酵母菌的保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2016098。2. 權(quán)利要求1所述的巴斯德畢赤酵母菌，其特征在于，所述的巴斯德畢赤酵母菌是將豬 細(xì)小病毒VP2蛋白基因克隆入帶有高效表達(dá)AOX啟動(dòng)子的畢赤酵母菌中制備的。3. 如權(quán)利要求2所述的巴斯德畢赤酵母菌其特征在于，所述的豬細(xì)小病毒VP2蛋白基因 的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。4. 權(quán)利要求1所述的巴斯德畢赤酵母菌在重組表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白中的應(yīng)用。5. -種重組表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白中的方法，其特征在于，所述的方法是將權(quán)利要求 1所述的巴斯德畢赤酵母菌在在甲醇的誘導(dǎo)作用下來(lái)重組表達(dá)豬細(xì)小病毒VP2蛋白。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的甲醇添加的終濃度為0.55 %。
【文檔編號(hào)】C12R1/84GK105950492SQ201610369589
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月28日
【發(fā)明人】劉新文, 范根成, 胡瀟, 宮曉, 李陸梅, 劉蕾
【申請(qǐng)人】青島易邦生物工程有限公司