一株降解多環(huán)芳烴類(lèi)有機(jī)污染物的泛菌的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株降解多環(huán)芳烴類(lèi)有機(jī)污染物的泛菌屬(Pantoea sp.)PYR16，屬于微生物和環(huán)境有機(jī)污染物修復(fù)治理領(lǐng)域，該菌株保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC NO：M2016227。本發(fā)明所公開(kāi)的菌株能高效降解多種多環(huán)芳烴，具有廣泛的環(huán)境適應(yīng)和抗重金屬能力，可定植于惡劣的環(huán)境中修復(fù)被重金屬和多環(huán)芳烴復(fù)合污染的土壤或水體。CCTCC NO：M201622720160426
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一株降解多環(huán)芳烴類(lèi)有機(jī)污染物的泛菌
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物和環(huán)境有機(jī)污染物修復(fù)治理領(lǐng)域，具體涉及一株降解多環(huán)芳烴 類(lèi)有機(jī)污染物的泛菌(Pantoea sp.)，本發(fā)明還涉及該泛菌的應(yīng)用以及一種降解多環(huán)芳烴 類(lèi)有機(jī)污染物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多環(huán)芳烴(簡(jiǎn)稱(chēng)PAHs)是指一類(lèi)由兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列的 稠環(huán)碳?xì)浠衔?，其中具?個(gè)苯環(huán)及4以上的PAHs稱(chēng)之為高分子量多環(huán)芳烴（High molecular weight-PAHs,簡(jiǎn)稱(chēng)HMff-PAHs)。多環(huán)芳經(jīng)的來(lái)源主要包括兩個(gè)方面:一方面是自 然界自身的活動(dòng)，如森林火災(zāi)、動(dòng)植物遺體腐爛、石油煤炭形成、火山噴發(fā)等;另外一個(gè)方面 是人類(lèi)污染行為，如化石燃料的不完全燃燒、城市固體廢棄物的焚燒、石油開(kāi)采、加工運(yùn)輸 以及化工生產(chǎn)和汽車(chē)尾氣的排放等。人類(lèi)活動(dòng)向環(huán)境貢獻(xiàn)了絕大多數(shù)的多環(huán)芳烴污染，是 公認(rèn)的環(huán)境多環(huán)芳烴主要污染來(lái)源。多環(huán)芳烴通常存在于石化產(chǎn)品、橡膠、塑料、潤(rùn)滑油、防 銹油以及不完全燃燒的有機(jī)化合物等物質(zhì)中，它可以通過(guò)大氣和水體的流動(dòng)，發(fā)生長(zhǎng)距離 迀移，因此廣泛分布在大氣、土壤、水體、沉積物以及植物等各種環(huán)境介質(zhì)中。由于多環(huán)芳經(jīng) 水溶性低、吸附性強(qiáng)、半衰期長(zhǎng)，使其可以持續(xù)存在于環(huán)境中數(shù)年，通常隨著芳環(huán)數(shù)和分子 量的增大，其生物可利用性越差，因此修復(fù)高分子量多環(huán)芳香相較于低分子量多環(huán)芳香烴 更加困難。多環(huán)芳烴的脂溶性使其可以通過(guò)食物鏈逐級(jí)富集到處于食物鏈末端人的體內(nèi)， 并分散到體內(nèi)組織，通過(guò)蛋白質(zhì)酮-稀醇互變異構(gòu)過(guò)程中的催化作用，導(dǎo)致蛋白的不可逆轉(zhuǎn) 變，進(jìn)而使細(xì)胞發(fā)生癌變。因此對(duì)人類(lèi)健康和生態(tài)系統(tǒng)造成巨大威脅，多環(huán)芳經(jīng)的污染修復(fù) 是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。
[0003] 傳統(tǒng)的多環(huán)芳烴污染的修復(fù)主要是依賴(lài)物理化學(xué)修復(fù)(化學(xué)氧化、客土或翻土法、 汽提、熱解吸、焚燒、填埋等方法去除或固定土壤中的污染物），這些方法往往處理成本高、 修復(fù)不徹底、容易產(chǎn)生二次污染而且不適合大規(guī)模應(yīng)用。另外，在自然界中單種污染物構(gòu)成 的環(huán)境污染雖時(shí)有發(fā)生，但事實(shí)上絕對(duì)意義上的單一污染是不存在的，污染多具伴生性和 綜合性即多種污染物形成的復(fù)合污染，由于重金屬和多環(huán)芳烴一樣能夠持續(xù)存在于土壤環(huán) 境中，因此重金屬-多環(huán)芳烴復(fù)合污染是土壤污染的主要形式。
[0004] 生物修復(fù)是利用微生物來(lái)修復(fù)污染物，它不僅克服了物理化學(xué)修復(fù)處理成本高、 修復(fù)不徹底等缺陷，而且不會(huì)產(chǎn)生二次污染，對(duì)污染物具有修復(fù)效果的微生物菌劑也適合 大規(guī)模應(yīng)用。微生物修復(fù)的實(shí)質(zhì)是利用土壤微生物專(zhuān)一性代謝土壤中的有機(jī)污染物，將其 轉(zhuǎn)化為細(xì)胞其它碳基大分子和二氧化碳的過(guò)程。因此有機(jī)污染物微生物修復(fù)技術(shù)的核心是 代謝速度快，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的降解菌的篩選。而直接從環(huán)境中富集篩選土著微生物，不僅有 效避免了基因工程菌在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)生的生物安全性問(wèn)題，而且還是一種簡(jiǎn)單方便理想的 技術(shù)手段。目前人們已經(jīng)從各類(lèi)生態(tài)環(huán)境中篩選獲得一批多環(huán)芳烴降解菌，包括假單胞菌 (Pseudomonas)、節(jié)桿菌（Arthrobacter)、紅球菌（Rhodococcus)、分枝桿菌 (Mycobacterium)、芽抱桿菌（Bacillus)、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas )、氣單胞菌 (Aeromonas)、拜葉林克氏菌（Beijerinckia)、擬諾卡氏菌（Nocardioides)、解環(huán)菌 (Cycloclasticus)、伯克氏菌(Burkholderia)、叢毛單胞菌(Polaromonas)以及一些嗜熱厭 氧的菌屬如嗜油菌(Neptunomonas)、兩面神菌(Janibacter)、諾卡氏菌(Nocardia)、變性菌

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種降解多環(huán)芳烴類(lèi)有機(jī)污染物的泛菌。
[0006]
【申請(qǐng)人】從石油污染的土壤中分離獲得一株能夠快速降解多環(huán)芳烴類(lèi)污染物的菌 株，通過(guò)生理生化鑒定和核糖體16S rDNA基因序列分析將其鑒定為泛菌屬(Pantoea sp.)， 命名為?3111:〇63 8口.？￥1?16。該菌株已于2016年4月26日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi) 的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為:CCTCC Ν0:Μ 2016227。
[0007] 試驗(yàn)結(jié)果表明：
[0008] 1)該菌株具有對(duì)芘的高效降解能力，而且能降解高濃度的芘。
[0009] 2)該菌株在pH為6-10范圍內(nèi)，對(duì)芘的降解效果最好，因此適合弱酸性到堿性環(huán)境 條件下的多環(huán)芳烴污染物去除。
[0010] 3)該菌株具有廣泛的NaCl濃度適應(yīng)能力。
[0011] 4)該菌株具有廣泛的溫度適應(yīng)能力，更適合低溫條件下的多環(huán)芳烴有機(jī)污染物的 清除，有利于在我國(guó)一年四季和北方地區(qū)開(kāi)展土壤原位修復(fù)。
[0012] 5)該菌株能夠在較大范圍內(nèi)耐受重金屬的毒害作用，維持對(duì)多環(huán)芳烴類(lèi)污染物的 高效降解，具有重金屬-多環(huán)芳烴復(fù)合污染環(huán)境修復(fù)的能力。
[0013] 6)該菌株對(duì)多種PAHs如菲、芴、焚蒽、花有良好的降解功能，特別是對(duì)于4環(huán)及4環(huán) 以下的多環(huán)芳香烴降解效果顯著，這有利于該菌應(yīng)用于復(fù)合污染物污染嚴(yán)重的地區(qū)。
[0014] 7)該菌株具有廣泛的抗重金屬能力，這有利于該菌定植于惡劣的環(huán)境中修復(fù)被重 金屬和多環(huán)芳烴復(fù)合污染的土壤或水體。
[0015] 更詳細(xì)的技術(shù)方案見(jiàn)《具體實(shí)施方案》所述。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是菌株P(guān)YR16在200mg/L芘濃度下的生長(zhǎng)和降解曲線。
[0017] 圖2是菌株P(guān)YR16對(duì)不同起始芘濃度的降解曲線。
[0018] 圖3是菌株P(guān)YR16在不同pH條件下對(duì)芘的降解能力。
[0019] 圖4是菌株P(guān)YR16在不同鈉離子濃度條件下對(duì)芘的降解能力。
[0020] 圖5是菌株P(guān)YR16在不同溫度條件下對(duì)芘的降解能力。
[0021] 圖6是菌株P(guān)YR16對(duì)不同重金屬離子存在條件下對(duì)芘的降解能力。
[0022]圖7是菌株P(guān)YR16對(duì)不同種類(lèi)多環(huán)芳香烴的降解能力。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明。應(yīng)該說(shuō)明的是，本發(fā)明的實(shí)施例僅限 于對(duì)于本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，而沒(méi)有限制作用。實(shí)施例中所涉及的有關(guān)篩選方法、緩沖液配制和 常見(jiàn)培養(yǎng)基配方等可參照趙斌，何紹江主編的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》以及《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所 描述的內(nèi)容(參見(jiàn)J.薩姆布魯克等，2002,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等(譯），科學(xué) 出版社，北京）。本發(fā)明中所涉及的其他各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，文中沒(méi)有特 別說(shuō)明的部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請(qǐng)日之前的各種常用工具書(shū)、科 技文獻(xiàn)或相關(guān)的說(shuō)明書(shū)、手冊(cè)等予以實(shí)施。
[0024]實(shí)施例1PYR16菌株的分離鑒定
[0025]采用來(lái)自長(zhǎng)慶油田長(zhǎng)期受石油污染的土壤為篩選土壤，具體篩選方案如下：
[0026] 1)取10g 土壤，加入到含有200mg//L芘的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基MSM中，28°C震蕩培養(yǎng)15天， 再以10%的接種量接到上述含有200mg/L芘的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基MSM培養(yǎng)基中；連續(xù)轉(zhuǎn)接5次。 [0027] 2)取0.1ml步驟1)所得到的富集培養(yǎng)液，涂布到含芘的MSM固體平板上，28 °C靜止 培養(yǎng)15天后，將平板上長(zhǎng)出來(lái)的菌落轉(zhuǎn)接到含芘的MSM固體平板上，繼續(xù)培養(yǎng)生長(zhǎng)，直到平 板上出現(xiàn)單一的菌落。
[0028] 3)挑取含芘的MSM固體平板上生長(zhǎng)出來(lái)的單菌落，接種到含有200mg//L芘的MSM液 體培養(yǎng)基中，28 °C震蕩培養(yǎng)15天，獲得本發(fā)明的菌株。
[0029] 進(jìn)一步對(duì)菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。
[0030] 首先，對(duì)菌株的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了初步的觀察，結(jié)果表明，該菌株為革蘭氏陰性 菌，短桿狀。
[0031] 同時(shí)，發(fā)明人分離獲得菌株的基因組DNA，然后以細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物 27F和1492R引物對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增;將獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果如序列表 SEQ ID NO: 1所示。然后，利用NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)菌株16S rRNA基因序列進(jìn)行了BLAST分 析，結(jié)果表明菌株的16S rRNA基因序列與泛菌屬的同源性高達(dá)99%，結(jié)合革蘭氏染色和形 態(tài)學(xué)觀察，發(fā)明人將該菌株命名為Pantoea sp. PYR16。
[0032] 實(shí)施例2PYR16菌株對(duì)芘的降解特征
[0033]以芘為唯一碳源，利用MSM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，發(fā)明人對(duì)PYR16菌株對(duì)芘的降解 能力進(jìn)行了測(cè)試。首先，從-80°C取出保藏的菌株，然后接種到R2A固體培養(yǎng)基中活化1天;挑 取單菌落接種到5毫升R 2A液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D6QQ = 0.5;然后取0.5ml菌液接種到25ml含 有200mg//L的芘的MSM培養(yǎng)基中，置于28°C震蕩培養(yǎng)。上述降解體系中，PYR16菌株的接入量 約為10 5-106左右。每隔24小時(shí)取出一瓶培養(yǎng)物，分別測(cè)定OD600值，并利用丙酮/正己烷（1:1) 萃取三角瓶中所有殘留的芘，然后利用GC-FID進(jìn)行芘含量分析。每次取三瓶進(jìn)行平行分析。 [0034]如圖1所示，接種PYR16菌株后第15天，培養(yǎng)基中的芘被降解70%以上，到第20天， 降解體系中82%以上的芘都被完全去除。這充分說(shuō)明本發(fā)明所提供的菌株具有快速、徹底 去除芘的能力。
[0035]進(jìn)一步的，發(fā)明人測(cè)試了PYR16菌株對(duì)不同起始濃度的芘的降解速率和降解效果。 如圖2所示，低濃度的芘（小于200mg/L)，PYR16菌株20天即可降解芘達(dá)80%以上；而當(dāng)起始 芘濃度提高到800mg/L的時(shí)候，接種PYR16菌株后20天即可完成約80%以上的去除率。這表 明，本發(fā)明所提供的PYR16菌株具有快速去除高濃度芘的能力。
[0036]實(shí)施例3pH、鈉離子和溫度對(duì)PYR16菌株芘降解能力的影響 [0037]首先將MSM培養(yǎng)基用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)整為pH分別為4、5、6、7、8、9、10，然后 按照實(shí)施例2的操作方法接種105-106左右的PYR16菌株，28°C震蕩培養(yǎng)10天后分析培養(yǎng)體系 中殘留芘的濃度。如圖3所示，在pH為6-10范圍內(nèi)，PYR16菌株均能夠維持對(duì)芘的降解效果， 但是當(dāng)pH低于6的時(shí)候，其降解能力將得到顯著抑制。因此，本發(fā)明所提供的芘降解菌的合 適處理環(huán)境的pH應(yīng)該調(diào)整為6-10之間，并且，當(dāng)處理樣品的pH調(diào)整為6-10的時(shí)候，PYR16菌 株都能維持對(duì)芘物質(zhì)的34%以上的降解效率。因此本發(fā)明所提供菌株適合弱酸性到堿性環(huán) 境條件下的多環(huán)芳烴污染物去除。
[0038]類(lèi)似的，發(fā)明人在上述MSM培養(yǎng)基中添加 NaCl，使其濃度分別為0 %、1%、2 %、3 %、 4%、5%、6%、7%、8%，然后按照實(shí)施例2的操作方法接種105-106左右的PYR16菌株，28°C震 蕩培養(yǎng)10天后分析培養(yǎng)體系中殘留芘的濃度。如圖4所示，當(dāng)培養(yǎng)體系中的NaCl濃度小于 3%的時(shí)候，降解率可以維持在35%以上；當(dāng)NaCl濃度提高至丨」8%左右的時(shí)候，PYR16對(duì)芘的 降解率仍然維持在30 %左右。
[0039]此外，發(fā)明人按照實(shí)施例2的操作方法接種105-106左右的PYR16菌株，然后分別置 于4°C、16°C、28°C、37 °C、42°C震蕩培養(yǎng)10天，然后分析培養(yǎng)體系中殘留芘的濃度。如圖5所 示，在28 °C、37 °C培養(yǎng)溫度下，PYR16菌株對(duì)芘的降解速率能夠維持在65 %以上，其中37 °C的 培養(yǎng)溫度下，上述菌種能夠維持最佳降解效果;而一旦溫度提升到42°C，其降解效率將下降 到60%左右。這表明本發(fā)明所提供的PYR16菌株生長(zhǎng)適應(yīng)溫度較廣且更適合低溫條件下的 環(huán)境芘污染物的清除，這將有利于在我國(guó)一年四季和北方地區(qū)開(kāi)展土壤芘污染原位修復(fù)。 [0040]實(shí)施例4重金屬離子對(duì)PYR16的芘降解效果的影響
[00411按照實(shí)施例2所述接種方法，將PYR16接種到含有200mg//L芘的MSM培養(yǎng)基中，同時(shí) 分別加入150mg/L硫酸錳、75mg/L硫酸錳、250mg/L硫酸銅、125mg/L硫酸銅，28°C震蕩培養(yǎng)21 天后，分別分析降解體系中殘留的芘的濃度。如圖6所示:75mg/L的硫酸錳對(duì)于PYR16菌株的 芘降解能力幾乎沒(méi)有抑制，而150mg/L的硫酸錳存在條件下，PYR16對(duì)200mg/L芘的降解率接 近40 %左右;而PYR16降解能力受到硫酸銅的影響更大，在125mg/L硫酸銅存在條件下，菌株 PYR16菌株仍然能夠維持25%左右的降解率，而當(dāng)硫酸銅濃度提高到250mg//L的時(shí)候，其降 解率下降到16%左右。這表明本發(fā)明所提供的PYR16菌株能夠在較大范圍內(nèi)耐受重金屬的 毒害作用，維持對(duì)多環(huán)芳烴類(lèi)污染物的高效降解能力，具有重金屬-多環(huán)芳烴復(fù)合污染環(huán)境 修復(fù)的能力。
[0042] 實(shí)施例5PYR16菌株對(duì)不同種類(lèi)PAHs的降解效果
[0043]按照實(shí)施例2所述接種方法，將PYR16分別接種到含有200mg/L菲、200mg/L芘、 200mg/L芴和200mg/L熒蒽的MSM培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)一周后，分別分析降解體系中殘留 的芘的濃度。如圖7所示:在相同的培養(yǎng)條件下PYR16對(duì)菲的降解率達(dá)到了98%以上，幾乎將 菲降解完全，對(duì)芴和芘的降解效果也比較好，降解率分別達(dá)到了 60%和35%，而對(duì)于生物可 利用性極低的熒蒽也降解了 23%，這也進(jìn)一步說(shuō)明了多環(huán)芳香烴苯環(huán)數(shù)的增加其對(duì)生物的 毒性越大，降解過(guò)程會(huì)更加復(fù)雜，降解周期也會(huì)相對(duì)較長(zhǎng)?？傮w來(lái)說(shuō)菌株P(guān)YR16對(duì)多種PAHs 有良好的降解功能，特別是對(duì)于4環(huán)及4環(huán)以下的多環(huán)芳香烴降解效果顯著，這有利于該菌 應(yīng)用于復(fù)合污染物污染嚴(yán)重的地區(qū)。
[0044] 實(shí)施例6PYR16菌株對(duì)不同種類(lèi)重金屬離子抗性
[0045]從_80°C取出保藏的菌株，然后接種到R2A固體培養(yǎng)基中活化1天;挑取單菌落接種 到5毫升R2A液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D6QQ = 0.5。在2毫升滅菌離心管中分別配置含有50mg/L、 100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L五個(gè)濃度梯度的重金屬溶液(配置液為：10*10 6的重金 屬母液和R2A培養(yǎng)基），然后將培養(yǎng)好的PYR16菌液按照2%的接種量接入該種重金屬溶液 中，置于28°C搖床培養(yǎng)，每?jī)商煊^察一次并記錄其生長(zhǎng)狀況。由下表1可知PYR16對(duì)MnCl2和 CuS〇4有較大耐受能力，在分別含有150mg/LMnCl2和250mg/LCuS〇4的培養(yǎng)基中仍然能生長(zhǎng)， 其對(duì)K 2Cr〇4和Cd(N03)2的最大抑制生長(zhǎng)濃度也有100mg/L，這能與不同重金屬對(duì)與PYR16代 謝有機(jī)物相關(guān)酶系的作用機(jī)制不同有關(guān)。表明該菌株具有廣泛的抗重金屬能力，這有利于 該菌定植于惡劣的環(huán)境中修復(fù)被重金屬和多環(huán)芳烴污染的土壤或水體。
[0046]表1菌株P(guān)YR16在不同重金屬濃度下的生長(zhǎng)情況
[0048] 注:+能生長(zhǎng);一不能生長(zhǎng)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株降解多環(huán)芳烴類(lèi)有機(jī)污染物的泛菌屬(Pantoea sp. )PYR16，其特征在于:保藏 在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為:CCTCC N0:M 2016227。2. 權(quán)利要求1所述的泛菌屬PYR16在降解多環(huán)芳烴類(lèi)有機(jī)污染物中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述多環(huán)芳烴類(lèi)有機(jī)污染物為菲、芴、熒 蒽、芘。4. 一種降解多環(huán)芳烴類(lèi)有機(jī)污染物的方法，包括向被污染的樣品中接種權(quán)利要求1所 述的泛菌屬PYR16的步驟。5. -種用于降解多環(huán)芳烴類(lèi)有機(jī)污染物的微生物菌劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述 的泛菌屬PYRl 6。
【文檔編號(hào)】B09C1/10GK105950501SQ201610325152
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月17日
【發(fā)明人】黃巧云, 陳雯莉, 汪豪杰, 汪方奎, 李偲, 胡甜, 楊陽(yáng)
【申請(qǐng)人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)