一種復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑及其在重金屬污染土壤植物修復(fù)中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑及其在重金屬污染土壤植物修復(fù)中的應(yīng)用，由乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)和惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)組成。本發(fā)明的復(fù)合菌劑應(yīng)用于修復(fù)重金屬污染，集合幾種內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)，克服植物修復(fù)的弱點(diǎn)，促進(jìn)東南景天生長(zhǎng)，增強(qiáng)東南景天對(duì)重金屬的吸收能力，提高植物修復(fù)效率。CGMCC No.733420130319CGMCC No.1217320160303CGMCC No.729520130311CGMCC No.1217120160303CGMCC No.968520140919CGMCC No.1217220160303
【專利說(shuō)明】
一種復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑及其在重金屬污染土壤植物修復(fù)中的 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及植物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑及其在植物修復(fù) 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著工業(yè)的高速發(fā)展、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的現(xiàn)代化以及城鎮(zhèn)化的快速推進(jìn)，土壤重金屬污 染狀況日益嚴(yán)重。
[0003] 重金屬無(wú)法被微生物降解，具有移動(dòng)性差、滯留時(shí)間長(zhǎng)、隱蔽性、不可逆轉(zhuǎn)性等特 點(diǎn)，土壤一旦被重金屬污染就極難削減。土壤中的重金屬一方面可以影響植物生長(zhǎng)、細(xì)胞分 裂等多種代謝活動(dòng)，抑制作物的生長(zhǎng)從而降低農(nóng)作物產(chǎn)量。另一方面，土壤中的重金屬可以 通過(guò)土壤-作物系統(tǒng)進(jìn)入食物鏈，給人類健康帶來(lái)了巨大風(fēng)險(xiǎn)。面對(duì)過(guò)去幾年發(fā)生的幾十起 重金屬引起的群體性事件，降低土壤環(huán)境中重金屬含量，減少其對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的污染，保障生態(tài) 系統(tǒng)和人類健康已經(jīng)迫在眉睫。
[0004] 在有限的土地資源面前，重金屬污染土壤的修復(fù)成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要 任務(wù)。由于重金屬不能像有機(jī)物污染物那樣可以直接通過(guò)在植物根際或植物體內(nèi)的降解來(lái) 消除污染物，土壤中重金屬的植物修復(fù)的難度要大得多。
[0005] 植物修復(fù)(phytoremediation)是利用綠色植物轉(zhuǎn)移、容納或轉(zhuǎn)化環(huán)境中污染物的 原位修復(fù)技術(shù)，與傳統(tǒng)技術(shù)如客土法、土壤固定、土壤淋洗等物理和化學(xué)方法相比，具有高 效、環(huán)境友好、成本低、不引起二次污染等優(yōu)點(diǎn)。東南景天最初在浙江省衢州市古老Pb/Zn礦 址上發(fā)現(xiàn)，是第一個(gè)中國(guó)原生的Zn/Cd超積累植物，能夠有效地提取土壤中的Zn、Cd、Pb元 素，不僅是研究植物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和超積累Zn/Cd機(jī)理的良好模式材料，也是提升植物修復(fù)重 金屬污染技術(shù)的良好材料，其植物體中重金屬濃度是土壤中的幾倍甚至幾十倍。盡管東南 景天在生長(zhǎng)速率和生物量上相比多數(shù)重金屬超積累植物要有些優(yōu)勢(shì)，但其修復(fù)土壤重金屬 污染的效率還是受到生長(zhǎng)慢、生物量小、適應(yīng)性弱和土壤重金屬可給性的限制，因此，如何 促進(jìn)東南景天生長(zhǎng)、抗逆、提高生物量和對(duì)土壤重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、積累重金屬能力，這對(duì) 于應(yīng)用東南景天修復(fù)重金屬污染土壤的實(shí)際應(yīng)用具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種內(nèi)生細(xì)菌菌劑，此菌劑能夠集合幾種內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)，克服植 物修復(fù)的弱點(diǎn)，有效促進(jìn)東南景天的生長(zhǎng)，增強(qiáng)東南景天對(duì)重金屬的吸收能力，提高植物修 復(fù)效率。
[0007] 一種復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑，由乙酸|丐不動(dòng)桿菌(厶(^1161：0匕&(^61^&1(30&061：；[(3118)、焚 光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、巨大芽抱桿菌（Bacillusmegaterium)、嗜麥芽寡 養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia)、短小芽胞桿菌（Bacillus pumilus)和惡臭假 單胞菌（Pseudomonas putida)組成。
[0008] 以上六株內(nèi)生細(xì)菌均保存到位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微 生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏信息如下：
[0009] 乙酸|丐不動(dòng)桿菌(六(^1161：(^&(^61^&1(3〇&〇61:;[(3118)于2013年3月19日保藏，分類命 名為乙酸|丐不動(dòng)桿菌(六(：；[1161：0&&(^61^&1(30&061：；[(3118)，菌株號(hào)為3&81113，保藏編號(hào)為06]\^〇 如.7334。該菌株在公開號(hào)為01^ 103266073六的發(fā)明專利申請(qǐng)文獻(xiàn)中公開。
[00?0] 焚光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)于2016年3月3日保藏，分類命名為焚 光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，菌株號(hào)為SM05,保藏編號(hào)為CGMCC No. 12173。 [0011 ]巨大芽孢桿菌(1^〇;[11118111683丨61'；[11111)于2013年3月11日保藏，分類命名為巨大芽 孢桿菌(Bacillusmegaterium)，菌株號(hào)為SAN1，保藏編號(hào)為CGMCC No.7295。該菌株在公開 號(hào)為CN 103275891A的發(fā)明專利申請(qǐng)文獻(xiàn)中公開。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 (3七61101：1'(^110111011&81]1&11：(^11；[11&)于2016年3月3日保藏，分類命名為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 (Stenotrophomonasmaltophilia)，菌株號(hào)為SMN1，保藏編號(hào)為CGMCC No. 12171。
[0012] 短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)于2014年9月19日保藏，分類命名為短小芽胞 桿菌(Bacillus pumilus)，菌株號(hào)為SrN7,保藏編號(hào)為CGMCC No.9685。該菌株在公開號(hào)為 CN104862255A的發(fā)明專利申請(qǐng)文獻(xiàn)中公開。
[0013] 惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)于2016年3月3日保藏，分類命名為惡臭假單 胞菌(Pseudomonas putida)，菌株號(hào)為SMN6,保藏編號(hào)為CGMCC No. 12172。
[0014] 本發(fā)明的復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑命名為植物促生復(fù)合菌劑PLSaOl。
[0015] 本菌劑所涉及的6株內(nèi)生菌株均篩選自表面滅菌的超積累植物東南景天莖部和葉 片。采用常規(guī)的內(nèi)生菌分離方法，整株?yáng)|南景天去除不新鮮的葉片，自來(lái)水沖洗干凈，然后 將每一部份分別用70%酒精浸3min，無(wú)菌水洗3次，0.5%HgCl 2浸泡lmin，然后用無(wú)菌水沖 洗5次以上，并將最后一次洗滌用的無(wú)菌水涂LB平板以確認(rèn)植株表面的無(wú)菌狀態(tài)。
[0016] 準(zhǔn)備LB固體培養(yǎng)基。在潔凈超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌手術(shù)刀(火焰灼燒滅菌后冷卻） 切割植物樣本薄片，并將薄片平鋪在培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基約9個(gè)(如圖1所示），用 封口膜封好培養(yǎng)皿倒置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周。用接種環(huán)挑下東南景天切片周圍的菌 斑，反復(fù)劃線三次分離出單一菌落，分別接種于LB試管斜面，4°C保存(可保存2個(gè)月）。
[0017] 鑒定所篩選得到的內(nèi)生細(xì)菌的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其中6株內(nèi)生細(xì)菌能夠耐較高濃度 重金屬、能耐產(chǎn)生IAA和ACC脫氨酶，相互之間沒有生長(zhǎng)拮抗因素，$ij做簡(jiǎn)單，按常規(guī)復(fù)合菌 劑混合方法將上述六株菌株混合得到復(fù)合菌劑，復(fù)合菌劑中各菌種數(shù)量穩(wěn)定，能夠組成效 果良好的內(nèi)生菌復(fù)合菌劑。
[0018] 組成復(fù)合菌劑的6株內(nèi)生細(xì)菌相互之間無(wú)拮抗作用，生長(zhǎng)速度一致，正常接種和培 養(yǎng)即可獲得，例如:每株細(xì)菌取菌液20yL，加入到100mL液體LB(每1000mL培養(yǎng)基含:氯化鈉 1 〇g，酵母粉5g，蛋白胨10g，pH為7.2)培養(yǎng)基中，150rpm，35 °C，48h，即可得到菌劑菌液，測(cè)定 菌液得到每一株細(xì)菌濃度均不小于l〇8CFU。
[0019] 組成復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑的6株細(xì)菌的理化性質(zhì)如表1所示：
[0020] 表1復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑的組成及與促生相關(guān)的理化性質(zhì)
[0022] "+"表示具備相應(yīng)能力；表示不具備相應(yīng)能力。
[0023] 本發(fā)明還提供一種所述復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑在植物修復(fù)重金屬污染中的應(yīng)用。
[0024] 優(yōu)選地，所述重金屬為Pb、Zn、和Cd中的至少一種。
[0025]優(yōu)選地，所述植物為東南景天。
[0026] 當(dāng)所述植物為東南景天時(shí)，一種應(yīng)用方式為:采用水培法對(duì)東南景天進(jìn)行快速繁 殖，在第4周內(nèi)向培養(yǎng)液中加入所述復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑。
[0027] 進(jìn)一步地，所述營(yíng)養(yǎng)液為：K2S〇4,〇.7mmol/L;KCl，0. lmmol/L;Ca(N03)2 · 4H2〇， 2mmol/L;MgS〇4 · 7H2〇,0 · 5mmol/L;KH2P〇4,〇 · 1 mmol /T^HgRO?，ΙΟμηιοΙ/L;MnS〇4 · H20,0 · 5μ mol/L;ZnS〇4 · 7H2〇，lymol/L;(NH4)4Mo〇24 · 4H20,0.01ymol/L;FeS〇4 · 7H2〇溶解于煮沸的20 μ mol/L Na2，EDTA溶液中，20ymol/L，用NaOH或HC1 調(diào)整營(yíng)養(yǎng)夜pH 5.8。
[0028] 所述快速繁殖方法為:剪取東南景天新生的枝條，每條約10cm長(zhǎng)，只留下枝條頂端 的5~8片葉片，將其插入到0.1倍水培營(yíng)養(yǎng)液中，溫度為23~25°C，光照條件為200~300μΕ/ m2 · s，待3周后枝條生長(zhǎng)出少許的根，再用1倍上述營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，并向營(yíng)養(yǎng)液中通氣。每3~4 天更換一次營(yíng)養(yǎng)液。
[0029]營(yíng)養(yǎng)液中所述復(fù)合菌劑的接種量為104~108CFU，接種1月后對(duì)東南景天根系掃描 測(cè)量，發(fā)現(xiàn)l〇4CFU根系總長(zhǎng)度和根尖數(shù)量顯著低于其它處理，105~108CFU間差異不顯著，根 據(jù)經(jīng)濟(jì)性原則，選擇最低l〇 5CFU作為接種濃度。
[0030]按此種方法處理東南景天，生長(zhǎng)1個(gè)月后與不接種PLSaOl的對(duì)照相比，接種菌劑 PLSaOl的東南景天生長(zhǎng)更加旺盛，根系更加發(fā)達(dá)。收集東南景天的根系測(cè)量其重量和長(zhǎng)度， 接種PLSaOl后根系的總重量增加200%以上，根系總長(zhǎng)度增加近300%。由于東南景天生長(zhǎng) 期較短，地上部的生物量未體現(xiàn)出顯著的差異。
[0031 ]當(dāng)植物為東南景天時(shí)，另一種應(yīng)用方式為:將在營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好的東南景天根 系浸入所述復(fù)合內(nèi)生菌的菌劑中3~5h，繼續(xù)水培一周后移植到礦山土盆栽中。
[0032] 優(yōu)選地，所述東南景天在礦山土盆栽中生長(zhǎng)時(shí)間為4~6月。
[0033] 盆栽中的土壤為重金屬污染的礦山土壤，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述礦山土的理化性質(zhì) 如表3所示。
[0034] 按此方法處理東南景天，接種PLSaOl后，東南景天地上部生物量明顯增加。將東南 景天收獲后，對(duì)地上部和地下部（即根部）的生物量進(jìn)行稱重和分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照處理相比， 接種PLSaOl后，東南景天的地上部和地下部的生物量均有不同程度的顯著增加，其中，地上 部生物量的增加59 %，地下部生物量增加61 %，說(shuō)明內(nèi)生細(xì)菌菌劑PLSaOl能夠顯著促進(jìn)東 南景天地上部和地下部的生長(zhǎng)。
[0035] 本發(fā)明的復(fù)合內(nèi)生菌劑還可用用于連續(xù)修復(fù)重金屬污染土壤，優(yōu)選地，所述應(yīng)用 包括:取東南景天頂端枝條在營(yíng)養(yǎng)液中生根培養(yǎng)，將所述復(fù)合內(nèi)生菌劑接種至東南景天的 根系中，將接種復(fù)合內(nèi)生菌劑后的東南景天種植于重金屬?gòu)?fù)合污染礦山土壤中。
[0036] 在接種復(fù)合內(nèi)生菌劑后的東南景天初次栽種的一個(gè)生長(zhǎng)季內(nèi)不用再次接種內(nèi)生 菌，之后每個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)接種一次，第一次刈割從栽種后的第二個(gè)生長(zhǎng)季開始，收獲地上部， 收割時(shí)地上部保留莖4~8cm左右，以后每個(gè)生長(zhǎng)季收獲一次。
[0037] 接種后的東南景天剛栽種時(shí)生長(zhǎng)較慢，每年的9~12月及3~6月為其生長(zhǎng)季。即一 年收獲2季，多年連續(xù)種植，實(shí)現(xiàn)連續(xù)收割，高效連續(xù)修復(fù)。
[0038]所述東南景天在土壤中的種苗密度為每平方米種植70~100株。
[0039] 之后沒個(gè)生長(zhǎng)季對(duì)東南景天進(jìn)行接種的方法為:接種時(shí)，將洗去培養(yǎng)基的內(nèi)生細(xì) 菌復(fù)合菌劑PLSaOl與有機(jī)肥或營(yíng)養(yǎng)土作為基質(zhì)混合，保持菌體濃度為10 8CFU基質(zhì)，濕度60 ~70%，挖溝深施(也可雨天灑施），挖溝深施用量為0.12~0.15kg/m2。
[0040] 按此種應(yīng)用方法，接種內(nèi)生菌后，東南景天的成活率接近100%，通常不接種內(nèi)生 菌植株存活率為71.0~90.1%，且在野外生長(zhǎng)的東南景天接種后受收割造成苗株死亡率顯 著減小50%以上，苗株再次生長(zhǎng)更加旺盛。在野外生長(zhǎng)的東南景天接種內(nèi)生菌3個(gè)月后，同 樣的生物量地上部吸收重金屬Zn、Cd量分別提高了 18.7%和47.48%。
【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1A和圖1B是劃線確定細(xì)菌各菌株間的拮抗關(guān)系的結(jié)果圖。
[0042] 圖2是接種與未接種條件下東南景天根系的生長(zhǎng)情況對(duì)照?qǐng)D。
[0043]圖3是土培實(shí)驗(yàn)下接種內(nèi)生菌菌劑對(duì)東南景天長(zhǎng)勢(shì)的影響圖。
[0044]圖4接種菌劑PLSaOl對(duì)東南景天根上部和根系生物量的影響。
[0045]圖5接種菌劑PLSaOl對(duì)東南景天根上部和根系Zn濃度的影響。
[0046]圖6接種菌劑PLSaOl對(duì)東南景天根上部和根系Cd濃度的影響。
[0047]圖7接種菌劑PLSaOl對(duì)東南景天根上部和根系Zn積累量的影響。
[0048]圖8接種菌劑PLSaOl對(duì)東南景天根上部和根系Cd積累量的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 實(shí)施例1促東南景天生物修復(fù)復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑的總體特性
[0050] 將制成的菌劑取200yL接種至100mL培養(yǎng)基中，35°C培養(yǎng)36h，得到的菌劑一部分用 以保藏，在1.5mL無(wú)菌離心管中加入300yL滅菌甘油和700yL對(duì)數(shù)期菌液，-80°C保存(可保存 2年），剩余的液態(tài)菌劑進(jìn)行關(guān)鍵生理生化指標(biāo)的鑒定。
[0051 ] 1、致病性鑒定
[0052]將上述菌液接種到新鮮的破損葉面（東南景天，煙草，油菜），以無(wú)菌水作對(duì)照，未 發(fā)現(xiàn)葉片病害特征;用無(wú)菌注射器抽取l〇〇yL菌液注射到新鮮健康的洋蔥莖內(nèi)，以無(wú)菌水作 對(duì)照，30 °C培養(yǎng)一周，未發(fā)現(xiàn)洋蔥有病害特征。
[0053] 2、植物促生細(xì)菌間拮抗實(shí)驗(yàn)
[0054]通過(guò)劃線實(shí)驗(yàn)測(cè)定各促生細(xì)菌之間是否存在明顯拮抗關(guān)系。如圖1A和圖1B中的黑 色線框所示，我們?cè)诖偕鷦┑倪x擇時(shí)，發(fā)現(xiàn)有些細(xì)菌間存在著明顯的拮抗關(guān)系，這時(shí)需要 根據(jù)促生效果的好壞去除促生效果較差的菌種。
[0055] 3、耐Zn/Cd 特點(diǎn)
[0056] 向含 Zn/Cd 的 LB 培養(yǎng)基(分別含有濃度梯度:Zn(l、2、4、5、8、10、12、15、20、25、30、 35或40mM)或Cd(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.0或5. OmM))中接種10yL對(duì)數(shù)期菌液，37 °C培養(yǎng)36小時(shí)，觀察內(nèi)生細(xì)菌在不同Zn/Cd濃 度下生長(zhǎng)情況。將培養(yǎng)得到的菌液分別稀釋1〇5~1〇9倍，根據(jù)細(xì)菌群落形態(tài)判斷各菌種在菌 液中數(shù)量比例;對(duì)于無(wú)法通過(guò)菌落形態(tài)判別的細(xì)菌，則通過(guò)二者對(duì)重金屬耐性、產(chǎn)IAA以及 產(chǎn)ACC脫氨酶等不同特點(diǎn)進(jìn)行試管培養(yǎng)并判斷二者在細(xì)菌群落中的比例。
[0057] 4、產(chǎn)ACC脫氨酶能力
[0058]當(dāng)將促生根際菌定植到種皮或是植物根系時(shí)，會(huì)合成并分泌生長(zhǎng)激素 IAA，新合成 的IAA將會(huì)被植物體吸收形成內(nèi)源生長(zhǎng)素，從而刺激植物細(xì)胞的分裂與延長(zhǎng)。與此同時(shí)，IAA 會(huì)激發(fā)ACC合成酶的活性，將S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)化成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸。ACC脫氨酶是測(cè) 定根際促生菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)能力的指標(biāo)之一。
[0059] 參考Honma Μ和Shimomura T(Honma M&Shimomura T.Metabolism of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid.AgricBiolChem，1978，42:1825-1831)建立的以 測(cè)定酮丁酸來(lái)檢測(cè)內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)ACC脫氨酶的活性的方法。
[0060] 5、產(chǎn)IAA 能力
[0061 ]吲哚乙酸(IAA)是一種能夠調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的植物生長(zhǎng)激素。
[0062]米用 Salkowski 比色法(Sarwar&Kremer.Determination of bacterially derived auxins using a microplate method.Letters in Applied Microbiology， 2008，20:282-285)測(cè)定分離物產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素類物質(zhì)IAA的能力。
[0063] 6、分泌嗜鐵素能力的測(cè)定
[0064] 嗜鐵素是由微生物在低鐵條件下合成的一類小分子量、能特異螯合鐵離子的螯合 物，分泌嗜鐵素的細(xì)菌可用于防治真菌病害。
[0065] 利用CAS平板法（Schwyn&Neilands.Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.Analytical Biochemistry，1987,160: 47-56)檢測(cè)細(xì)菌分泌嗜鐵素的能力。
[0066] 通過(guò)檢測(cè)，本菌劑具有耐Zn/Cd能力、產(chǎn)ACC脫氨酶能力、產(chǎn)IAA能力、分泌嗜鐵素能 力，且菌劑對(duì)重金屬的最低耐性要明顯大于單個(gè)菌株對(duì)重金屬的最低耐性，分泌IAA的能力 和ACC的能力也明顯增強(qiáng)。該菌劑的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)參見下表2。
[0067]表2內(nèi)生細(xì)菌菌劑與促進(jìn)修復(fù)相關(guān)的生理生化指標(biāo)
[0069] 6、內(nèi)生細(xì)菌復(fù)合菌劑PLSaOl在植物體內(nèi)的定殖情況
[0070]將生根的東南景天根系在菌液中浸泡4h，然后轉(zhuǎn)移至正常水培營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)1周， 分別取植物的根、莖、葉各2g，用磷酸鹽緩沖液研磨植物組織，吸取并稀釋10倍，100倍和 1000倍，取200yL涂固體LB培養(yǎng)平板，避光倒置過(guò)夜培養(yǎng)24h，根據(jù)內(nèi)生菌群落特征統(tǒng)計(jì)各內(nèi) 生細(xì)菌的數(shù)量，對(duì)于群落特征相似的細(xì)菌，可通過(guò)其耐重金屬的能力、產(chǎn)IAA、ACC脫氨酶的 能力的不同區(qū)別驗(yàn)證。
[0071 ]實(shí)施例2內(nèi)生細(xì)菌復(fù)合菌劑對(duì)東南景天生長(zhǎng)和重金屬土壤修復(fù)的影響
[0072] 營(yíng)養(yǎng)液組成為：K2SO4，0 · 7mmol/L;KC1，0 · lmmol/L; Ca(N〇3)2 · 4H2〇，2mmol/L; MgS〇4 · 7H2〇，0 · 5mmol/L ;KH2P〇4，0 . lmmol/L ;H3B〇3，10ymol/L ;MnS〇4 · H2O，0 · 5ymol/L; ZnS〇4 · 7H2〇，lymol/L;(NH4)4Mo〇24 · 4H20,0.01ymol/L;FeS〇4 · 7H20溶解于煮沸的20ymol/L Na2 · EDTA溶液中，20ymol/L。用NaOH或HC1 調(diào)整營(yíng)養(yǎng)夜pH 5.8)
[0073] (1)水培環(huán)境
[0074] 采用水培法對(duì)東南景天進(jìn)行快速繁殖。剪取東南景天新生的枝條，每條約10cm長(zhǎng)， 只留下枝條頂端的5~8片葉片，將其插入到0.1倍水培營(yíng)養(yǎng)液中，溫度為23~25°C，光照條 件為200~300μΕ/πι 2 · s，待3周后枝條生長(zhǎng)出少許的根，再用1倍上述營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，并向營(yíng)養(yǎng) 液中通氣。每3~4天更換一次營(yíng)養(yǎng)液。在第4周向營(yíng)養(yǎng)液中加入內(nèi)生細(xì)菌菌劑的菌體(離心 收集對(duì)數(shù)期菌體，無(wú)菌水洗滌3次），接種量為每毫升營(yíng)養(yǎng)液中的菌體為10 5CFU，之后換營(yíng)養(yǎng) 液不再接種。
[0075] 生長(zhǎng)1個(gè)月后觀察東南景天的生長(zhǎng)情況，如圖2所示，與不接種PLSaOl的對(duì)照相比， 接種菌劑PLSaOl的東南景天生長(zhǎng)更加旺盛，根系更加發(fā)達(dá)。收集東南景天的根系測(cè)量其重 量和長(zhǎng)度，接種PLSaOl后根系的總重量增加200%以上，根系總長(zhǎng)度增加近300%。由于東南 景天生長(zhǎng)期較短，地上部的生物量未體現(xiàn)出顯著的差異。
[0076] (2)土培環(huán)境
[0077]采用土培法種植東南景天。將在營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)均勻良好的東南景天根系浸入菌劑 中約4h，繼續(xù)水培一周后，移植到礦山土盆栽當(dāng)中，礦山土的理化性質(zhì)見表3,保持土壤55% 左右的濕度，生長(zhǎng)時(shí)間為4~6月，共2個(gè)月。
[0078]由圖3可見，接種PLSaOl后，東南景天地上部生物量明顯增加。將東南景天收獲后， 對(duì)地上部和地下部（即根部）的生物量進(jìn)行稱重和分析，發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照處理相比，接種PLSaOl 后，東南景天的地上部和地下部的生物量均有不同程度的顯著增加，其中，地上部生物量的 增加59%，地下部生物量增加61% (如圖4所示），說(shuō)明菌劑PLSaOl能夠顯著促進(jìn)東南景天地 上部和地下部的生長(zhǎng)。
[0079]表3試驗(yàn)所用礦山土的基本理化性質(zhì)
[0082]進(jìn)一步對(duì)東南景天根部和地上部的重金屬量的分析和積累量進(jìn)行測(cè)定和分析，Zn 和Cd的檢測(cè)采用常規(guī)方法。如圖5~8所示，接種PLSaOl后，東南景天地上部和地下部的重金 屬濃度和積累量均顯著增加，其中，地上部和根部Zn含量濃度分別增加30%和41%，地上部 Cd的含量濃度增加54%，根部Cd濃度增大量不明顯；對(duì)照組東南景天地上部Zn的積累量為 304.3mg，根部Zn的積累量為5.6mg，接種內(nèi)生菌PLSaOl后，東南景天地上部Zn的積累量可達(dá) 到627.7mg，提高了 106 %，根部Zn的積累量也達(dá)到12.7mg，提高了 126 %。同時(shí)，接種PLSaO 1 后，東南景天地上部CM的積累量達(dá)到了41.2mg，提尚了 144%，根部積累提尚73%。
[0083]與未接種PLSaOl處理相比，植物-微生物修復(fù)技術(shù)體系顯著提高了東南景天生物 量(P〈0.01)和地上部重金屬Cd濃度(P〈0.01)。
[0084] 另外，我們還通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室條件下，不接種內(nèi)生菌植株存活率約為71.0~ 90.1%，而接種內(nèi)生菌后，使東南景天插苗成活率達(dá)96.8~99.5%。由于礦山土土質(zhì)貧瘠， 若在礦山土壤中增加20%左右營(yíng)養(yǎng)土菌劑(腐爛水草，濃度為10 7~108/g的菌劑PLSaOl)后， 生物量更提高至94.7~136.2%。
[0085] 實(shí)施例4促東南景天生物修復(fù)內(nèi)生細(xì)菌的應(yīng)用
[0086] 東南景天苗株快速繁殖(參照實(shí)施例3的方法）：取東南景天頂端枝條在營(yíng)養(yǎng)液中 生根45天左右。LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)PLSaOl菌劑，無(wú)菌水洗去培養(yǎng)基，按10 5CFU接種到生 根苗筐中，通氣培養(yǎng)1周。此時(shí)東南景天內(nèi)生菌將定殖在根內(nèi)部，與根系形成共生關(guān)系。
[0087] 扦插繁殖:東南景天接種內(nèi)生菌1周后，內(nèi)生菌將定殖在其根內(nèi)部，將東南景天苗 株種植于重金屬?gòu)?fù)合污染礦山土壤中，種苗密度為每平方米種植70~100株。剛栽種時(shí)生長(zhǎng) 較慢，每年的9~12月及3~6月為其生長(zhǎng)季。在初次栽種一個(gè)生長(zhǎng)季內(nèi)不用再次接種內(nèi)生 菌，以后每個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)接種一次，接種時(shí)，將洗去培養(yǎng)基的Sasm3菌液與有機(jī)肥或營(yíng)養(yǎng)土作 為基質(zhì)混合，保持菌體濃度為l〇 8CFU基質(zhì)，濕度60~70%，挖溝深施（也可雨天灑施），挖溝 深施用量為0.12~0.15kg/m2,生長(zhǎng)兩個(gè)季度后，會(huì)生長(zhǎng)出更多的新植株。
[0088] 刈割收獲:第一次刈割從接種后的第二個(gè)生長(zhǎng)季開始，待生物量最大時(shí)刈割，收獲 地上部，收割時(shí)地上部保留莖4~8cm左右，以后每個(gè)生長(zhǎng)季收獲一次，即一年收獲2季，多年 連續(xù)種植，實(shí)現(xiàn)連續(xù)收割，高效連續(xù)修復(fù)。
[0089] 統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，接種內(nèi)生菌后，東南景天的成活率接近100%，通常不接種內(nèi)生菌植株 存活率為71.0~90.1%，且在野外生長(zhǎng)的東南景天接種后受收割造成苗株死亡率顯著減小 50%以上，苗株再次生長(zhǎng)更加旺盛。在野外生長(zhǎng)的東南景天接種內(nèi)生菌3個(gè)月后，同樣的生 物量地上部吸收重金屬Zn、Cd量分別提高了 18.7%和47.48%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑，其特征在于，由乙酸鈣不動(dòng)桿菌 (Acinetobactercalcoaceticus)、焚光假單胞菌(Pseudomonas f Iuorescens)、巨大芽抱桿 菌（Bacillusmegaterium)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia)、短小芽胞 桿菌(Bacillus pumilus)和惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)組成。2. 如權(quán)利要求1所述復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑在重金屬污染植物修復(fù)中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于，所述重金屬為Pb、Zn、和Cd中的至少一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于，所述植物為東南景天。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括:采用水培法對(duì)東南景天進(jìn)行 快速繁殖，在第4周內(nèi)向培養(yǎng)液中加入所述復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于，所述復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑的接種量為IO5~ IO8CFU07. 根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括:將在營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好的東 南景天根系浸入所述復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑中3~5h，繼續(xù)水培一周后移植到礦山土盆栽中。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，所述東南景天在礦山土盆栽中生長(zhǎng)時(shí)間為4 ~6月。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括:取東南景天頂端枝條在營(yíng)養(yǎng) 液中生根培養(yǎng)，將所述復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑接種至東南景天的根系中，將接種復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌 菌劑后的東南景天種植于重金屬?gòu)?fù)合污染礦山土壤中。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于，在接種復(fù)合內(nèi)生細(xì)菌菌劑后的東南景天初 次栽種的一個(gè)生長(zhǎng)季內(nèi)不用再次接種此菌劑，之后每個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)接種一次，第一次刈割從 栽種后的第二個(gè)生長(zhǎng)季開始，收獲地上部，收割時(shí)地上部保留莖4~8cm左右，以后每個(gè)生長(zhǎng) 季收獲一次。
【文檔編號(hào)】C12R1/39GK105950502SQ201610328945
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月17日
【發(fā)明人】陳寶, 徐曉萌, 潘風(fēng)山, 馮英, 吳飛飛, 楊肖娥
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)