一種復(fù)合菌劑及其制備與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物菌劑，具體是一種復(fù)合菌劑及其制備與應(yīng)用。解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)分別為：CGMCCNO.12306(KY?1)、CGMCCNO.12307(KY?2)、CGMCCNO.12308(KY?3)，均保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。將所述解淀粉芽孢桿菌分別經(jīng)過(guò)三級(jí)液體發(fā)酵，而后按體積比(5～1):(1～5)：(5～1)比例將發(fā)酵液混合即獲得復(fù)合菌劑。本發(fā)明依據(jù)在不同地域不同農(nóng)作物的根際土壤中獲得的三株解淀粉芽孢桿菌，KY?1、KY?2、KY?3，它們具有不同的生理功能，且彼此之間不產(chǎn)生拮抗性。CGMCCNO.1230620160324CGMCCNO.1230720160324CGMCCNO.1230820160324
【專利說(shuō)明】
一種復(fù)合菌劑及其制備與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物菌劑，具體是一種復(fù)合菌劑及其制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 土傳病害是指生活在土壤中的病原體在條件適宜時(shí)從作物根部或莖基部侵害作 物而引起的病害。常見的有猝倒病、立枯病、枯萎病、黃萎病、軟腐病、根腐病、疫病、黑腐病、 菌核病、根結(jié)線蟲病等。此類病害呈逐年加重的趨勢(shì)。每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的直接經(jīng)濟(jì)損失 達(dá)40%-60%，嚴(yán)重的達(dá)80%以上。嚴(yán)重制約設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展。
[0003]目前該病害的防治方法主要包括輪作、培育抗病品種和使用化學(xué)藥劑。其中輪作 防病被廣泛使用，但對(duì)一些特殊經(jīng)濟(jì)作物或特定地區(qū)無(wú)法達(dá)到合理輪作的要求，且有較大 的局限性;常規(guī)的抗病育種由于存在兩方面的問(wèn)題而進(jìn)展緩慢，一是利用單一的抗性基因 使得土傳病害病原菌發(fā)展成為新的小種，二是抗源材料匱乏使常規(guī)育種滿足不了生產(chǎn)上的 需要，而利用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行抗土傳病害的育種工作也尚處于探索階段?；瘜W(xué)藥劑由于 可以收到立竿見影的預(yù)期效果，也被廣泛使用，但化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期使用帶來(lái)了一系列的副 作用，破壞了生態(tài)平衡，造成次要病害猖獗，藥劑的殘留造成水源土壤的污染。
[0004] 同時(shí)由于一味追求作物高產(chǎn)，過(guò)量使用化肥，使得土壤板結(jié)、土壤地力下降，農(nóng)產(chǎn) 品品質(zhì)下降，果蔬中硝酸鹽含量超標(biāo)等問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提 高，農(nóng)產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)及安全生產(chǎn)越來(lái)越受到社會(huì)的廣泛關(guān)注。
[0005] 微生物肥料憑借其獨(dú)特的作用，逐漸被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。微生物肥料中有益微生 物能產(chǎn)生糖類物質(zhì)，占土壤有機(jī)質(zhì)的〇. 1 %，與植物粘液，礦物胚體和有機(jī)膠體結(jié)合在一起， 可以改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)土壤的物理性能和減少土壤顆粒的損失，在一定的條件下，還 能參與腐殖質(zhì)形成。改善土壤物理性狀，有利于提高土壤肥力。
[0006] 它與有機(jī)肥或者化肥合理搭配使用，實(shí)現(xiàn)平衡施肥，從而提高化肥的利用率，降低 化肥的施用量，節(jié)約成本，減少污染；
[0007] 由具有特殊功能的菌種制成的微生物肥料，不但減少農(nóng)產(chǎn)品污染，改善農(nóng)產(chǎn)品的 品質(zhì)，在土傳病害的防治方面起著非常重要的作用。
[0008] 土傳病害的防治中常用的細(xì)菌為Bacillius屬(芽孢屬）。它是一類廣泛存在于自 然界的腐生細(xì)菌，生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單，能夠形成具有較強(qiáng)抗逆能力的芽孢。目前用于植物病 害的主要有13.811131：；[118(枯草芽孢桿菌）、13.06^118(錯(cuò)樣芽胞桿菌）。
[0009] 據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料顯示，解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì) 菌，在其自身的生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生一系列的代謝物質(zhì)，這些次生代謝產(chǎn)物使得解淀粉芽孢桿 菌能夠廣泛抑制真菌和細(xì)菌的活性，并促進(jìn)植物生長(zhǎng)，防治根結(jié)線蟲。
[0010] 研究結(jié)果表明，生防芽孢桿菌的抑病、促生長(zhǎng)機(jī)理主要有四種：一、產(chǎn)生抗生素類 物質(zhì)，直接抑制病原菌生長(zhǎng);二、分泌生長(zhǎng)激素類物質(zhì)，促進(jìn)植物生長(zhǎng);三、活化養(yǎng)分，供植物 生長(zhǎng)所需；四、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性。但對(duì)于多菌株混合復(fù)配使用并沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明目的是提供一種復(fù)合菌劑及其制備與應(yīng)用。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
[0013] -種解淀粉芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)分別為： CGMCCN0.12306 (KY-1)、CGMCCN0.12307 (KY-2)、CGMCCN0.12308 (KY-3)，均保藏于中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期 為2016年3月24日。
[0014] 其中，菌株從遼寧北票陸地種植的13年生蘋果樹、遼寧新賓棚栽春茬西紅柿以及 吉林松源林下參的根際土壤中中分離篩選了三種芽孢桿菌，通過(guò)對(duì)其16S基因序列與 GenBank中的數(shù)據(jù)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)其與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)相似 性最高，為99.9%，其形態(tài)特征及生理生化特性與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amy lol iquef aciens)最相似。從而將分離出來(lái)的KY-1KY-2KY-3確認(rèn)為解淀粉芽孢桿菌。
[0015] 上述菌株的菌落型態(tài)為在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37°C，培養(yǎng)96小時(shí)，屬兼性厭氧。菌落 呈淡黃色不透明，表面粗糙，邊緣不規(guī)則，鋸齒狀，有隆起，不產(chǎn)色素。
[0016] 上述保藏的菌種接種于斜面培養(yǎng)基，于37°C恒溫靜置培養(yǎng)24h，鏡檢無(wú)雜菌且芽孢 率大于95%，并于4°C冰箱保藏。一年內(nèi)使用。
[0017] 所使用的斜面配方(重量比）：葡萄糖0.1 %~4.00 %、酵母浸粉0.01 %~1.50 %、 蛋白胨0.01 %~1.50%、牛肉膏0.01 %~1.00%、氯化鈉0.01 %~1.00%、氯化鈣0.01 %~ 1 · 00 %、磷酸氫二鈉0 · 01 %~1 · 00 %、可溶性淀粉0 · 02 %~2 · 00 %、硫酸銨0 · 01 %~ 1.00 %、硫酸錳0. lmg/L~1 Omg/L、鉬酸鈉0. lmg/L~1 Omg/L、瓊脂粉1.2 %~2.5 %、余量為 水?？?1=7.1-7.2。121°(：，滅菌3〇11^11。
[0018]保藏的優(yōu)良的斜面菌種，接種于液體搖瓶培養(yǎng)基中，于180rpm，3(TC~32°C，恒溫 振蕩培養(yǎng)20h~24h，得搖瓶液體菌種。
[0019] 所使用的液體搖瓶配方（重量比）：葡萄糖0.20 %~5.00 %、豆餅粉0.10 %~ 4 · 00 %、磷酸氫二鉀0 · 02 %~1 · 00 %、酵母浸粉0 · 02 %~3 · 00 %、硫酸鎂0 · 02 %~2 · 00 %、 蛋白胨0.02 %~2.00 %、蔗糖0.02 %~4.00 %、玉米漿0.02 %~4.00 %、尿素0.02 %~ 4.00%、工業(yè)鹽0.02%~1.00%、碳酸鈣0.02%~2.00%、泡敵0.1 %~0.4%，余量為水。pH =7 · 0-7 · 4。121 °C滅菌 30min。
[0020] -種復(fù)合菌劑，將上述所述解淀粉芽孢桿菌分別經(jīng)過(guò)三級(jí)液體發(fā)酵，而后按體積 比（5~1):(1~5):(5~1)比例將發(fā)酵液混合即獲得復(fù)合菌劑。
[0021] 所述復(fù)合菌劑中上述菌株分別經(jīng)三級(jí)液體發(fā)酵后的發(fā)酵液中芽孢率多90%，血球 活菌計(jì)數(shù)彡100億/ml,殘留葡萄糖彡0.6%，pH=7.0~8.0。
[0022] 將按上述比例混合的混合發(fā)酵液中加入混合發(fā)酵液體積0.1~2.0%的穩(wěn)定劑，即 獲得液體制劑。
[0023] 將按上述比例混合的混合發(fā)酵液經(jīng)降膜濃縮至混合發(fā)酵液體積的1/2-1/3，而后 加入濃縮后混合發(fā)酵液體積0.1~2.0 %的穩(wěn)定劑和濃縮后混合發(fā)酵液體積30 %~40 %的 載體，加入后充分混合，混合后噴霧干燥，即得復(fù)合菌粉劑。
[0024] 所述穩(wěn)定劑為苯甲酸鈉和/或氨基酸;載體為膨潤(rùn)土、稻殼粉、沸石粉、白炭黑、碳 酸鈣中的幾種的混合;其中，氨基酸為賴氨酸。
[0025] 一種復(fù)合菌劑的制備方法：
[0026] 將3種解淀粉芽孢桿菌的液體種子液分別按0.5%~1 %接種至一級(jí)種子罐培養(yǎng)基 內(nèi)，于30°C~32°C，罐壓= 0.02MPa~0.05MPa，通氣比=1:0.5~1:0.8，一級(jí)種子罐周期= 12h~24h，進(jìn)行一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)，至生物量多10 %，菌體形態(tài)一致，短桿狀，兩端平齊，著色均 一，pH自然回升至6.5~7.0,待用；其中，利用火焰接種法接入一定體積的無(wú)雜菌的且符合 標(biāo)準(zhǔn)的搖瓶種子液。
[0027]按照二級(jí)種子罐培養(yǎng)基配料，于二級(jí)種子罐內(nèi)滅菌，同時(shí)將導(dǎo)種管路滅菌（123°C 滅菌60min。），并用無(wú)菌空氣保壓。當(dāng)罐溫降至32°C左右時(shí)，通過(guò)無(wú)菌的移種管路接入1-15%體積的無(wú)雜菌的且符合標(biāo)準(zhǔn)的上述一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液，于30°C~32°C，罐壓=0.02MPa~ 0.05MPa，通氣比=1:0.5~1:0.8，二級(jí)種子罐培養(yǎng)周期=12h~24h，進(jìn)行二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)，至 生物量多10%，菌體形態(tài)一致，短桿狀，兩端平齊，著色均一，pH自然回升至6.5~7.0,待用； [0028]按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基配料，于發(fā)酵罐內(nèi)滅菌，同時(shí)將導(dǎo)種管路滅菌（123°C滅菌 60min。），并用無(wú)菌空氣保壓。當(dāng)罐溫降至32°C左右時(shí)，通過(guò)無(wú)菌的移種管路接入2-15%體 積的無(wú)雜菌的且符合標(biāo)準(zhǔn)的上述二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液，于30°C~32°C，罐壓= 0.04MPa~ 0.07]\0^，通氣比=1:0.8~1:1.2，通過(guò)流加濃度為20%~25%氨水控制?!1=6.5-6.7，直至 pH自然回升，同時(shí)通過(guò)流加80%的葡萄糖溶液，維持發(fā)酵過(guò)程中殘留的葡萄糖濃度多1%， 周期= 30h~72h;當(dāng)芽孢率大于90%，活菌數(shù)大于100億/ml，殘?zhí)轻?.6%，結(jié)束發(fā)酵，即分 別獲得三級(jí)發(fā)酵液。
[0029]其中，在配糖罐中配制80%的葡萄糖溶液并于115°C、20分鐘滅菌消毒，降溫至30 °C，待用;加入量為每分鐘10L~15L。
[0030]而后按照體積比=(5~1): (1~5) : (5~1)的比例，將發(fā)酵液混合即獲得復(fù)合菌 劑。
[0031 ]將按上述比例混合的混合發(fā)酵液中加入混合發(fā)酵液體積0.1-2.0 %的穩(wěn)定劑，即 獲得液體制劑。
[0032]將按上述比例混合的混合發(fā)酵液經(jīng)降膜濃縮至混合體積的1/2-1/3，而后加入濃 縮后體積〇. 1-2 %的穩(wěn)定劑，再加入濃縮后體積30 %~40 %的載體充分混合，噴霧干燥而得 復(fù)合菌粉劑。
[0033]所述穩(wěn)定劑為苯甲酸鈉和/或氨基酸;載體為膨潤(rùn)土、稻殼粉、沸石粉、白炭黑、碳 酸鈣中的幾種的混合;其中，氨基酸為賴氨酸;所述穩(wěn)定劑為苯甲酸鈉和氨基酸，兩者質(zhì)量 比為(2~5):(1~10)。
[0034]所述載體為膨潤(rùn)土、稻殼粉、沸石粉、白炭黑和碳酸鈣，按質(zhì)量比為膨潤(rùn)土 :稻殼 粉:沸石粉：白炭黑：碳酸鈣= (20~40): (2~10): (20~35):(1~10): (10~30)的比例混 合。
[0035] (1)一級(jí)及二級(jí)種子罐培養(yǎng)基配方
[0036] 葡萄糖0 · 20%~5 · 00%、豆餅粉0 · 10 %~4 · 00 %、磷酸氫二鉀0 · 02 %~1 · 00 %、酵 母浸粉0.02 %~3.00%、硫酸鎂0.02%~2.00%、蛋白胨0.02%~2.00%、蔗糖0.02%~ 4.00%、玉米漿0.02%~4.00%、尿素0.02%~4.00%、工業(yè)鹽0.02%~1.00%、碳酸鈣 0.02%~2.00%、泡敵0.1%~0.4%，余量為水。？!1=7.0-7.4。121°(：滅菌3011^11。
[0037] (2)發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方
[0038] 葡萄糖0.10 %~6.00%、豆餅粉0.10 %~4.00%、玉米粉0.10 %~4.00%、花生餅 粉0 · 10 %~4 · 00 %、棉籽餅粉0 · 10 %~4 · 00 %、玉米漿0 · 10 %~3 · 00 %、酵母浸粉0 · 10 %~ 2.00%、蛋白胨0.10%~3.00%、工業(yè)鹽0.10%~2.00%、碳酸鈣0.10%~2.00%、余量為 水。pH=6 · 5-7 · 4。121 °C滅菌 30min。
[0039] 本發(fā)明的有益效果：
[0040]本發(fā)明依據(jù)在不同地域不同農(nóng)作物的根際土壤中獲得的三株解淀粉芽孢桿菌， KY-1、KY-2、KY-3，它們具有不同的生理功能，且彼此之間不產(chǎn)生拮抗性。
[0041 ]其中，菌株ΚΥ-1在蛋黃瓊脂平板上培養(yǎng)，能夠產(chǎn)生透明的水解圈，該菌株具有解磷 解鉀功能，溶解礦物磷和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)。菌株ΚΥ-2是利用殺線蟲活性高效篩 選模型篩選而得，對(duì)多種蔬菜瓜果的根結(jié)線蟲，具有很好的防治作用，對(duì)白粉虱、棉鈴蟲、煙 青蟲，小菜蛾也有很好的趨避作用。菌株ΚΥ-3在蛋白酶篩選平板上能夠產(chǎn)生較大的透明的 水解圈，同時(shí)在以大腸桿菌和黑曲霉為鑒定菌的鑒定平板上產(chǎn)生透明的抑菌圈，對(duì)多種農(nóng) 作物的細(xì)菌性和真菌性的病害具有很好的防治作用。
[0042]本發(fā)明將上述三株解淀粉芽孢桿菌采用發(fā)酵工藝獲得微生物菌劑，菌劑由活的微 生物菌體及其代謝產(chǎn)物組成，如各種活性酶、抗菌肽、脂肽以及植物激素類，生物活性高;活 菌數(shù)高，進(jìn)入土壤后快速繁殖，增加根際土壤的微生物菌群，改善土壤的物理性質(zhì)和團(tuán)粒結(jié) 構(gòu)，緩解土壤板結(jié)，促進(jìn)有機(jī)物質(zhì)的分解，同時(shí)不斷分泌次生代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)植物的生理生 命活動(dòng)，防治土傳病害的發(fā)生與傳播，增產(chǎn)增收，改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)。在農(nóng)產(chǎn)品采摘后的儲(chǔ)藏 過(guò)程中的防病、保鮮也具有一定的功效。
[0043] 具體，獲得粉體的菌劑，具有較高的活菌數(shù)，適合與底肥，尤其是優(yōu)質(zhì)的農(nóng)家肥混 合使用。施入土壤后，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，繁殖速度快，在增加根際有益微生物菌群的同時(shí)，迅 速分解有機(jī)質(zhì)供植物吸收利用，提高土壤肥力，增強(qiáng)土壤滲水、保水及透氣性，促進(jìn)根系快 速生長(zhǎng)，防止土傳病害的蔓延。
[0044] 獲得液體制劑，主要用于葉面噴施，防蟲、治病，促進(jìn)葉綠素合成，增強(qiáng)光合作用， 加速植物新陳代謝和蛋白質(zhì)合成，促使作物早熟豐產(chǎn)，增加瓜果的含糖量，提高作物抗病抗 裝抗寒能力，提尚果品品質(zhì)。
[0045] 利用上述獲得的菌劑在保持生態(tài)平衡、降低成本的同時(shí)對(duì)大棚蔬菜、瓜果，大田作 物、中藥材及園林花卉等多種植物都具有很好的促生長(zhǎng)、增產(chǎn)、防病、防蟲、提高果實(shí)品質(zhì)的 作用，并且對(duì)人體安全，不污染環(huán)境。
【具體實(shí)施方式】
[0046]本發(fā)明微生物菌肥，是由三株解淀粉芽孢桿菌分別經(jīng)過(guò)三級(jí)液體發(fā)酵達(dá)到放罐標(biāo) 準(zhǔn)，再將上述發(fā)酵所得的三株解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵液混合，再經(jīng)特殊加工而成。所述的三 株解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)分別為：CGMCCN0· 12306(ΚΥ-1)、 CGMCCNO. 12307(KY-2)、CGMCCN0.12308(KY-3)，均保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2016年3月24日。
[0047] 下面結(jié)合具體實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明
[0048] 實(shí)施例1
[0049] 菌株的獲得：
[0050] 1. 土樣的采集
[0051] (1)于夏季，雨水之后。在作物根際土表下層約5厘米~10厘米的范圍內(nèi)采集土樣；
[0052] (2)選擇發(fā)病區(qū)域，但未發(fā)病的植株個(gè)體下的根際土壤；
[0053] (3)保藏于無(wú)菌透氣的塑料袋中。
[0054] 2.富集培養(yǎng)
[0055] (1)培養(yǎng)基制備
[0056]普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板g/L:牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、氯化鈉5.0、純凈水1000ml、瓊脂 粉2·0、ρΗ=7·0~7.2、制霉菌素5〇11^/1 [0057] (2) 土樣處理
[0058] 稱取土樣lg，加入到99ml的無(wú)菌水中，振蕩器振蕩15min。于無(wú)菌條件下過(guò)濾，得濾 液
[0059] (3)用無(wú)菌水將上述濾液，按照十倍梯度稀釋法，逐一稀釋至10'10'10'10一6
[0060] (4)將上述稀釋液于80°C水浴保溫lOmin，涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。每個(gè)平板加 入0. lml稀釋液。于37°C恒溫培養(yǎng)96h
[0061] (5)于無(wú)菌條件下，將每一個(gè)單菌落涂生化片，采用革蘭氏染色法進(jìn)行顯微鏡觀 察。
[0062] (6)將產(chǎn)芽孢，且為革蘭氏陽(yáng)性的菌落轉(zhuǎn)接普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，于37°C恒溫培養(yǎng) 96h(培養(yǎng)基配比同普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板g/L)
[0063] 3、劃線純化:利用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，采用平板劃線法將得到的單菌落斜面培養(yǎng) 物繼續(xù)純化，直到得到單一的典型的菌落形態(tài)。菌落形態(tài)特征為:淡黃色不透明，表面粗糙， 邊緣不規(guī)則，鋸齒狀，有隆起，不產(chǎn)色素
[0064] 4、定向篩選
[0065] (1)分解有機(jī)磷及無(wú)機(jī)磷的能力篩選
[0066] 蛋黃平板g/L:牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、氯化鈉5.0、純凈水1000ml瓊脂粉2.0、pH = 7.0~7.2，無(wú)菌蛋黃溶液10ml (1個(gè)蛋黃加入20ml無(wú)菌水制成無(wú)菌溶液）
[0067]無(wú)機(jī)磷合成培養(yǎng)基g/L:硫酸銨0.5、硫酸鎂0.3、磷酸鈣10、氯化鈉0.3、葡萄糖10g、 1 %硫酸錳lml、1 %硫酸亞鐵lml、純凈水1000ml、瓊脂20g、pH=7 · 0~7 · 5
[0068] 將純化后的所有芽孢桿菌分別點(diǎn)種于蛋黃平板和無(wú)機(jī)磷合成培養(yǎng)基平板，于37°C 恒溫培養(yǎng)96小時(shí)，選擇在兩種培養(yǎng)平板上同時(shí)產(chǎn)生透明水解圈的菌落斜面培養(yǎng)物進(jìn)行保 藏。(冷凍干燥保藏:編號(hào)為KY-1)
[0069] (2)殺線蟲活性高效篩選
[0070] 按照《微生物學(xué)報(bào)》54(5):589~594 4 May
[0071] 2014;《解淀粉芽孢桿菌殺線蟲活性高效篩選模型》施慧孫帆劉仲仲
[0072]張克勤黃曉瑋;云南大學(xué)生物資源保護(hù)于利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
[0073]文獻(xiàn)報(bào)道，進(jìn)行操作。選擇殺線蟲活性高的菌株進(jìn)行冷凍干燥保藏，編號(hào)為KY-2。
[0074] (3)真菌、細(xì)菌抗性篩選及蛋白酶活性篩選
[0075]真菌抗性篩選培養(yǎng)基g/L: PDA平板
[0076] 馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉15g、純凈水1000ml、pH = 6.0。于121°C，滅菌 30min。備用。
[0077] 將上述培養(yǎng)基降溫至40_50°C，于無(wú)菌條件下，倒入直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，每皿 加入20ml。凝固后，再在其上倒入含有黑曲霉孢子(濃度為105)的上層培養(yǎng)基5ml，迅速混 菌，凝固得真菌抗性篩選平板。
[0078]細(xì)菌抗性篩選培養(yǎng)基g/L:普通瓊脂平板
[0079] 牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、氯化鈉5.0、純凈水1000ml、瓊脂粉2.0、pH=7.0~7.2。于 121°C，滅菌30min。備用。
[0080] 將上述培養(yǎng)基降溫至40-50°C，于無(wú)菌條件下，倒入直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，每皿 加入20ml。凝固后，在再其上倒入含有大腸桿菌(濃度為10 5)的上層培養(yǎng)基5ml，迅速混菌， 凝固得細(xì)菌抗性篩選平板。
[0081] 蛋白酶活性篩選平板g/L:
[0082] 牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、氯化鈉5.0、純凈水1000ml、瓊脂粉2.0、無(wú)菌脫脂牛奶 15ml、pH=7·0~7.2。于121°C，滅菌30min。備用。
[0083] 將上述培養(yǎng)基降溫至40-50°C，于無(wú)菌條件下，倒入直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，每皿 加入20ml。凝固后，得蛋白酶篩選平板。
[0084]將純化得到的產(chǎn)芽孢的單菌落斜面培養(yǎng)物分別同時(shí)點(diǎn)種到上述三種篩選平板上， 于37°C恒溫培養(yǎng)96小時(shí)。選取在這三種篩選平板上同時(shí)產(chǎn)生透明水解圈的單菌落斜面培養(yǎng) 物進(jìn)行冷凍干燥保藏。編號(hào)為KY-3.
[0085] 5、液體培養(yǎng)特征
[0086] 液體培養(yǎng)基g/L:牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、氯化鈉5 · 0、純凈水1000ml、pH = 7 · 0~ 7.2。于121°0，滅菌3〇111；[11。備用。
[0087]在無(wú)菌條件下，取ΚΥ-1、ΚΥ-2、ΚΥ-3的斜面培養(yǎng)物2cm2,接入100ml上述液體培養(yǎng)基 中，靜置培養(yǎng)。結(jié)果：
[0088]靜置時(shí)有菌膜形成;革蘭氏染色為陽(yáng)性。顯微鏡檢為桿狀，內(nèi)生芽孢，呈橢圓形，兩 端鈍圓，芽孢囊不膨大，中生到次端生，有運(yùn)動(dòng)型。
[0089] 6、生化特性
[0090]水解淀粉和明膠，乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V-P)陰性、硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性，以及苯丙 氨酸脫氨酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)均為陰性。
[0091] 實(shí)施例2 [0092]復(fù)合菌劑的制備：
[0093] 1.三株解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)過(guò)程包括以下步驟
[0094] 1)固體斜面菌種的制備
[0095]將3種保藏的菌種分別接種于斜面培養(yǎng)基，于37°C恒溫靜置培養(yǎng)24h，鏡檢無(wú)雜菌 且芽孢率大于95%，并于4°C冰箱保藏。一年內(nèi)使用。
[0096] 所使用的斜面配方(重量比）：葡萄糖0.1%、酵母浸粉0.5%、蛋白胨0.1%、牛肉膏 0.5 %、氯化鈉0.02 %、氯化鈣0.01 %、磷酸氫二鈉0.04 %、可溶性淀粉1.4 %、硫酸銨 0.01 %、硫酸錳0 . lmg/L、鉬酸鈉0 . lmg/L、瓊脂粉1.5 %、余量為水。pH = 7.1。121°C，滅菌 30min〇
[0097] 2)搖瓶液體菌種的制備
[0098]將上述獲得保藏的優(yōu)良的3種菌種的新鮮斜面培養(yǎng)物，分別接種于液體搖瓶培養(yǎng) 基中，接種量為2cm2/100ml。于180rpm，30 °C~32°C，恒溫振蕩培養(yǎng)21h，分別獲得各自搖瓶 液體菌種。
[0099]所使用的液體搖瓶配方（重量比）：葡萄糖2.00 %、豆餅粉2.00%、磷酸氫二鉀 0.04 %、酵母浸粉0.5 %、硫酸鎂0.02 %、蛋白胨0.2 %、蔗糖2.00 %、玉米漿1.00 %、尿素 0.2%、工業(yè)鹽0.02%、碳酸鈣0.02%、泡敵0.1%，余量為水。口!1=7.4。121°(：滅菌 30min。 [0100] 3)所述的三級(jí)液體發(fā)酵時(shí)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為重量比
[0101] (1) 一級(jí)及二級(jí)種子培養(yǎng)基配方
[0102] 葡萄糖2.00 %、豆餅粉2.00 %、磷酸氫二鉀0.04%、酵母浸粉0.5 %、硫酸鎂 0 · 02 %、蛋白胨0 · 2 %、蔗糖2 · 00 %、玉米漿1 · 00 %、尿素0 · 2 %、工業(yè)鹽0 · 02 %、碳酸鈣 0.02%、泡敵0.1%，余量為水。ρΗ=7·4。
[0103] 121 °C，滅菌30min。
[0104] (2)發(fā)酵培養(yǎng)基配方
[0105] 葡萄糖3.00%、豆餅粉4.00%、玉米粉2.00%、花生餅粉0.50 %、棉籽餅粉0.10 %、 玉米漿0.55、酵母浸粉0.75 %、蛋白胨0.16 %、工業(yè)鹽0.34、碳酸鈣0.23 %、余量為水。pH = 6 · 5。121 °C滅菌 30min。
[0106] 4)三級(jí)液體發(fā)酵包括以下步驟：
[0107] 將上述獲得的3種搖瓶液體菌種分別進(jìn)行三級(jí)液體發(fā)酵，具體如下：
[0108] (1)一級(jí)種子罐種子制備
[0109] 按照一級(jí)種子罐培養(yǎng)基配料，于一級(jí)種子罐內(nèi)滅菌。當(dāng)罐溫降至32°C左右時(shí)，培養(yǎng) 基體積約為200L，利用火焰接種法接入1000ml的無(wú)雜菌的且符合標(biāo)準(zhǔn)的搖瓶種子液。培養(yǎng) 條件:溫度30°(：~32°(：，罐壓=0.0210^~0.0510^，通氣比=1 :0.5~1:0.6;三株菌種的培 養(yǎng)周期分別為:KY-1 14.5h、KY-2 12.5h、KY-l 16.5h。
[0110] (2)二級(jí)種子罐種子制備
[0111] 按照二級(jí)種子罐培養(yǎng)基配料，于二級(jí)種子罐內(nèi)滅菌，同時(shí)將導(dǎo)種管路滅菌（123°C 滅菌60min。），并用無(wú)菌空氣保壓。當(dāng)罐溫降至32°C左右時(shí)，培養(yǎng)基體積約為2000L，通過(guò)無(wú) 菌的移種管路接入200L的無(wú)雜菌的且符合標(biāo)準(zhǔn)的一級(jí)種子罐種子液。培養(yǎng)條件:溫度30°C ~32°C，罐壓= 0.03MPa~0.05MPa，通氣比=1:0.5~1:0.6;三株菌種的培養(yǎng)周期分別為： KY-1 12h、KY-2 13h、KY-3 12h。
[0112] (3)發(fā)酵罐制備
[0113] 按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基配料，于發(fā)酵罐內(nèi)滅菌，同時(shí)將導(dǎo)種管路滅菌（123°C滅菌 60min。），并用無(wú)菌空氣保壓。當(dāng)罐溫降至32°C左右時(shí)，培養(yǎng)基體積約為20000L，通過(guò)無(wú)菌的 移種管路接入2000L的無(wú)雜菌的且符合標(biāo)準(zhǔn)的二級(jí)種子罐種子液。培養(yǎng)條件:溫度30°C~32 。(：，罐壓=0 · 04MPa~0 · 07MPa，通氣比=1:0 · 8~1:1 · 2。通過(guò)流加氨水控制pH=6 · 5-6 · 7，同 時(shí)通過(guò)流加80%的葡萄糖溶液，控制殘?zhí)嵌? %，直至pH自然回升(pH多7.5)，停止流加氨水 和葡萄糖溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，直到芽孢率大于90 %，結(jié)束發(fā)酵。其中，菌種KY-1發(fā)酵：周期= 38h，活菌數(shù)(平板計(jì)數(shù)）=145.2億/ml，殘?zhí)?0.23 %，放罐體積=28.3T;菌種KY-2發(fā)酵:周 期=33h，活菌數(shù)(平板計(jì)數(shù)）=107.4億/ml，殘?zhí)?0.13 %，放罐體積=25.7T;菌種KY-3發(fā) 酵:周期=40.5h，活菌數(shù)(平板計(jì)數(shù)）=115.6億/ml，殘?zhí)?0.22 %，放罐體積=26.4T。
[0114] 5)新型復(fù)合菌肥的制作
[0115] (1)液體制劑:將上述發(fā)酵所得的符合放罐標(biāo)準(zhǔn)的三株解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵液， 按等體積的比例混合，總體積約6T?；旌虾蠹尤牖旌弦嚎傮w積0.5 %的穩(wěn)定劑，檢測(cè)活菌數(shù) (平板計(jì)數(shù)）= 122.8億/ml。灌裝、入庫(kù)。其中，穩(wěn)定劑為苯甲酸鈉和氨基酸，二者的質(zhì)量比為 2:1，氨基酸為賴氨酸；
[0116] (2)粉劑制備:將上述發(fā)酵所得的符合放罐標(biāo)準(zhǔn)的剩余三株解淀粉芽孢桿菌的發(fā) 酵液，按等體積的比例混合，經(jīng)降膜濃縮設(shè)備適當(dāng)濃縮，加入濃縮后混合液總體積0.5 %的 穩(wěn)定劑，再加入濃縮后混合液總體積32% %載體充分混合，噴霧干燥而得。檢測(cè)活菌數(shù)(平 板計(jì)數(shù)）= 235.8億/ml，包裝，入庫(kù)。所述載體為膨潤(rùn)土、稻殼粉、沸石粉、白炭黑和碳酸鈣， 按質(zhì)量比20:30:20:20:10比例混合。其中，穩(wěn)定劑為苯甲酸鈉和氨基酸，二者的質(zhì)量比為2: 1，氨基酸為賴氨酸。
[0117] 實(shí)施例3
[0118] 與實(shí)施例2不同之處在于
[0119] 1、固體斜面菌種的制備
[0120]保藏的菌種接種于斜面培養(yǎng)基，于37°C恒溫靜置培養(yǎng)24h，鏡檢無(wú)雜菌且芽孢率大 于95%，并于4°C冰箱保藏。一年內(nèi)使用。
[0121] 所使用的斜面配方(重量比）：葡萄糖0.1%、酵母浸粉0.5%、蛋白胨0.3%、牛肉膏 0.3 %、氯化鈉0.2 %、氯化鈣0.01 %、磷酸氫二鈉0.02%、可溶性淀粉2.0 %、硫酸銨0.01 %、 硫酸錳0 · 4mg/L、鉬酸鈉0 · 2mg/L、瓊脂粉2 · 0%，余量為水。pH=7 · 1。121°C，滅菌30min。
[0122] 2、搖瓶液體菌種的制備
[0123] 保藏的優(yōu)良的斜面菌種，接種于液體搖瓶培養(yǎng)基中，于180rpm，3(TC~32°C，恒溫 振蕩培養(yǎng)23h，得搖瓶液體菌種。
[0124] 所使用的液體搖瓶配方（重量比）：葡萄糖3.30 %、豆餅粉1.80%、磷酸氫二鉀 0.04 %、酵母浸粉0.5 %、硫酸鎂0.04 %、蛋白胨0.5 %、蔗糖1.60 %、玉米漿1.10 %、尿素 0.12%、工業(yè)鹽0.22%、碳酸鈣0.42%、泡敵0.1%，余量為水。pH=7.4，121°C滅菌30min。
[0125] 3、所述的三級(jí)液體發(fā)酵時(shí)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為重量比
[0126] (1)-級(jí)及二級(jí)種子罐配方
[0127] 葡萄糖3.30 %、豆餅粉1.80 %、磷酸氫二鉀0.04%、酵母浸粉0.5 %、硫酸鎂 0.04%、蛋白胨0.5%、蔗糖1.60%、玉米漿1.10%、尿素0.12%、工業(yè)鹽0.22%、碳酸鈣 0.42%、泡敵0.1%，余量為水<^!1=7.4，121°(：滅菌3〇1^11。
[0128] (2)發(fā)酵罐配方
[0129] 葡萄糖4 · 50%、豆餅粉2 · 80%、玉米粉2 · 50%、花生餅粉0 · 50 %、棉籽餅粉0 · 16 %、 玉米漿0.35、酵母浸粉0.75 %、蛋白胨0.16 %、工業(yè)鹽0.34、碳酸鈣0.25 %、余量為水。pH = 7 · 0，121 °C滅菌 30min。
[0130] 所述三級(jí)液體發(fā)酵包括以下步驟：
[0131] 將上述獲得的3種搖瓶液體菌種分別進(jìn)行三級(jí)液體發(fā)酵，具體如下：
[0132] (1)一級(jí)種子罐種子制備
[0133] 按照一級(jí)種子罐培養(yǎng)基配料，于一級(jí)種子罐內(nèi)滅菌。當(dāng)罐溫降至32°C左右時(shí)，培養(yǎng) 基體積約為190L，利用火焰接種法接入1000ml的無(wú)雜菌的且符合標(biāo)準(zhǔn)的搖瓶種子液。培養(yǎng) 條件:溫度30°(：~32°(：，罐壓=0.0210^~0.0510^，通氣比=1:0.5~1:0.6，三株菌種的培 養(yǎng)周期分別為:KY-1 12h、KY-2 13.5h、KY-3 17h。
[0134] (2)二級(jí)種子罐種子制備
[0135] 按照二級(jí)種子罐培養(yǎng)基配料，于二級(jí)種子罐內(nèi)滅菌，同時(shí)將導(dǎo)種管路滅菌（123°C 滅菌60min。），并用無(wú)菌空氣保壓。當(dāng)罐溫降至32°C左右時(shí)，培養(yǎng)基體積約為2000L，通過(guò)無(wú) 菌的移種管路接入190L的無(wú)雜菌的且符合標(biāo)準(zhǔn)的一級(jí)種子罐種子液。培養(yǎng)條件:溫度30°C ~32°C，罐壓= 0.03MPa~0.05MPa，通氣比=1:0.5~1:0.6，三株菌種的培養(yǎng)周期分別為： KY-1 12h、KY-2 12.5h、KY-3 12h。
[0136] (3)發(fā)酵罐制備
[0137] 按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基配料，于發(fā)酵罐內(nèi)滅菌，同時(shí)將導(dǎo)種管路滅菌（123°C滅菌 60min。），并用無(wú)菌空氣保壓。當(dāng)罐溫降至32°C左右時(shí)，培養(yǎng)基體積約為22000L，通過(guò)無(wú)菌的 移種管路接入2000L的無(wú)雜菌的且符合標(biāo)準(zhǔn)的二級(jí)種子罐種子液。培養(yǎng)條件:溫度30°C~32 。(：，罐壓=0 · 04MPa~0 · 07MPa，通氣比=1:0 · 8~1:1 · 2。通過(guò)流加氨水控制pH=6 · 5-6 · 7，同 時(shí)通過(guò)流加80 %的葡萄糖溶液，控制殘?zhí)轻? %，直至pH自然回升（回升到pH彡7.5 )，停止流 加氨水和葡萄糖溶液。當(dāng)芽孢率大于90 %，結(jié)束發(fā)酵。菌種KY-1發(fā)酵:周期=47.5h。活菌數(shù) (平板計(jì)數(shù)）=105.2億/ml，殘?zhí)?0.43 %。放罐體積=24.3T。菌種KY-2發(fā)酵:周期=39h?；?菌數(shù)(平板計(jì)數(shù)）=101 · 4億/ml，殘?zhí)?0 · 23 %。放罐體積=28 · 7T。菌種KY-3發(fā)酵：周期= 60.5h?；罹鷶?shù)(平板計(jì)數(shù)）=125.3億/ml，殘?zhí)?0.22 %。放罐體積=25.4T。
[0138] 4、新型復(fù)合菌肥的制作
[0139] (1)液體制劑:將上述發(fā)酵所得的符合放罐標(biāo)準(zhǔn)的三株解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵液， 按等體積的比例混合，混合后加入混合液總體積約(6T)加入混合液總體積0.8 %的穩(wěn)定劑， 檢測(cè)活菌數(shù)(平板計(jì)數(shù)）= 100.2億/ml。灌裝、入庫(kù)。其中，穩(wěn)定劑為苯甲酸鈉和氨基酸，二者 的質(zhì)量比為3:2，氨基酸為賴氨酸；
[0140] (2)粉劑制備:將上述發(fā)酵所得的符合放罐標(biāo)準(zhǔn)的剩余三株解淀粉芽孢桿菌的發(fā) 酵液，按等體積的比例混合，經(jīng)降膜濃縮設(shè)備適當(dāng)濃縮，加入濃縮后混合液總體積0.8 %的 穩(wěn)定劑，再加入濃縮后混合液總體積37%載體充分混合(膨潤(rùn)土、稻殼粉、沸石粉、白炭黑、 氨基酸、碳酸鈣），噴霧干燥而得。檢測(cè)活菌數(shù)(平板計(jì)數(shù)）=212.2億/ml，包裝，入庫(kù)。所述載 體為膨潤(rùn)土、稻殼粉、沸石粉、白炭黑、氨基酸、碳酸鈣，按質(zhì)量比25:5:30:10:30比例混合， 氨基酸為賴氨酸；其中，穩(wěn)定劑為苯甲酸鈉和氨基酸，二者的質(zhì)量比為3: 2，氨基酸為賴氨 酸。
[0141] 實(shí)施例4
[0142] 所述的三株解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)過(guò)程包括以下步驟
[0143] 1、固體斜面菌種的制備
[0144] 保藏的菌種接種于斜面培養(yǎng)基，于37°C恒溫靜置培養(yǎng)24h，鏡檢無(wú)雜菌且芽孢率大 于95%，并于4°C冰箱保藏。一年內(nèi)使用。
[0145] 所使用的斜面配方(重量比）：葡萄糖0.9%、酵母浸粉0.5%、蛋白胨0.5%、牛肉膏 0.5 %、氯化鈉0.2 %、氯化鈣0.01 %、磷酸氫二鈉0.04%、可溶性淀粉2.0 %、硫酸銨0.01 %、 硫酸猛〇· lmg/L、鉬酸鈉0· lmg/L、瓊脂粉1.8%，余量為水。pHiiHSrC，滅菌30min。
[0146] 2、搖瓶液體菌種的制備
[0147] 保藏的優(yōu)良的斜面菌種，接種于液體搖瓶培養(yǎng)基中，于180rpm，3(TC~32°C，恒溫 振蕩培養(yǎng)24h，得搖瓶液體菌種。
[0148] 所使用的液體搖瓶配方（重量比）：葡萄糖4.3 %、豆餅粉3.2 %、磷酸氫二鉀 0.04 %、酵母浸粉0.5 %、硫酸鎂0.02 %、蛋白胨0.25 %、蔗糖2.50 %、玉米漿1.20 %、尿素 0.2%、工業(yè)鹽0.02%、碳酸鈣0.2%、泡敵0.1%，余量為水?？?1=7.4。121°(：滅菌30min。
[0149] 3、所述的三級(jí)液體發(fā)酵時(shí)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為重量比
[0150] (1)-級(jí)及二級(jí)種子罐配方
[0151] 葡萄糖4.3 %、豆餅粉3.2 %、磷酸氫二鉀0.04 %、酵母浸粉0.5 %、硫酸鎂0.02 %、 蛋白胨0.25 %、蔗糖2.50 %、玉米漿1.20 %、尿素0.2 %、工業(yè)鹽0.02 %、碳酸鈣0.2 %、泡敵 0· 1%，余量為水?？?1=7.4。121°〇滅菌30min。
[0152] (2)發(fā)酵罐配方
[0153] 葡萄糖4.50%、豆餅粉3.40%、玉米粉1.55%、花生餅粉1.00 %、棉籽餅粉0.50 %、 玉米漿0.35 %、酵母浸粉0.55 %、蛋白胨0.56 %、工業(yè)鹽0.34 %、碳酸鈣0.20 %、余量為水。 pH=7 · 5。121 °C滅菌 30min。
[0154] 所述三級(jí)液體發(fā)酵包括以下步驟
[0155] (1)一級(jí)種子罐種子制備
[0156] 按照一級(jí)種子罐培養(yǎng)基配料，于一級(jí)種子罐內(nèi)滅菌。當(dāng)罐溫降至32°C左右時(shí)，培養(yǎng) 基體積約為180L，利用火焰接種法接入1000ml的無(wú)雜菌的且符合標(biāo)準(zhǔn)的搖瓶種子液。培養(yǎng) 條件:溫度30°C~32°C，罐壓= 0.02MPa~0.05MPa，通氣比=1:0.5~1:0.6<^!1自然。三株菌 種的培養(yǎng)周期分別為:KY-1 16h、KY-2 13h、KY-3 15h。
[0157] (2)二級(jí)種子罐種子制備
[0158] 按照二級(jí)種子罐培養(yǎng)基配料，于二級(jí)種子罐內(nèi)滅菌，同時(shí)將導(dǎo)種管路滅菌（123°C 滅菌60min。），并用無(wú)菌空氣保壓。當(dāng)罐溫降至32°C左右時(shí)，培養(yǎng)基體積約為1500L，通過(guò)無(wú) 菌的移種管路接入180L的無(wú)雜菌的且符合標(biāo)準(zhǔn)的一級(jí)種子罐種子液。培養(yǎng)條件:溫度30°C ~32°C，罐壓= 0.03MPa~0.05MPa，通氣比=1:0.5~1:0.6<^!1自然。三株菌種的培養(yǎng)周期 分別為:KY-1 13h、KY-2 15h、KY-3 15h。
[0159] (3)發(fā)酵罐制備
[0160] 按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基配料，于發(fā)酵罐內(nèi)滅菌，同時(shí)將導(dǎo)種管路滅菌（123°C滅菌 60min。），并用無(wú)菌空氣保壓。當(dāng)罐溫降至32°C左右時(shí)，培養(yǎng)基體積約為23000L，通過(guò)無(wú)菌的 移種管路接入1500L的無(wú)雜菌的且符合標(biāo)準(zhǔn)的二級(jí)種子罐種子液。培養(yǎng)條件:溫度30°C~32 。(：，罐壓=0 · 04MPa~0 · 07MPa，通氣比=1:0 · 8~1:1 · 2。通過(guò)流加氨水控制pH=6 · 5-6 · 7，同 時(shí)通過(guò)流加80 %的葡萄糖溶液，控制殘?zhí)嵌? %，直至pH自然回升，停止流加氨水和葡萄糖 溶液。當(dāng)芽孢率大于90 %，結(jié)束發(fā)酵。菌種KY-1發(fā)酵:周期=48h?；罹鷶?shù)(平板計(jì)數(shù)）=141.2 億/ml，殘?zhí)?0.23 %。放罐體積=25.3T。菌種KY-2發(fā)酵：周期=53h。活菌數(shù)(平板計(jì)數(shù)）= 157.2億/ml，殘?zhí)?0.11 %。放罐體積=27.7T。菌種KY-3發(fā)酵:周期=46.5h?；罹鷶?shù)(平板 計(jì)數(shù)）= 165.0億/ml，殘?zhí)? 0.22%。放罐體積= 26.4T。
[0161] 4、新型復(fù)合菌肥的制作
[0162] (1)液體制劑:將上述發(fā)酵所得的符合放罐標(biāo)準(zhǔn)的三株解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵液， 按等體積的比例混合，混合后加入混合液總體積約(6T)加入混合液總體積1.0 %的穩(wěn)定劑， 檢測(cè)活菌數(shù)(平板計(jì)數(shù)）= 118.8億/ml。灌裝、入庫(kù)。其中，穩(wěn)定劑為苯甲酸鈉和氨基酸，二者 的質(zhì)量比為5:1，氨基酸為賴氨酸；
[0163] (2)粉劑制備:將上述發(fā)酵所得的符合放罐標(biāo)準(zhǔn)的剩余三株解淀粉芽孢桿菌的發(fā) 酵液，按等體積的比例混合，經(jīng)降膜濃縮設(shè)備適當(dāng)濃縮，加入濃縮后混合液總體積1.0 %的 穩(wěn)定劑，再加入濃縮后混合液總體積35%載體充分混合(膨潤(rùn)土、稻殼粉、沸石粉、白炭黑、 氨基酸、碳酸鈣），噴霧干燥而得。檢測(cè)活菌數(shù)(平板計(jì)數(shù)）=233.2億/ml，包裝，入庫(kù)。所述載 體為膨潤(rùn)土、稻殼粉、沸石粉、白炭黑、氨基酸、碳酸鈣，按質(zhì)量比35:10:15:20:30比例混合， 氨基酸為賴氨酸；其中，穩(wěn)定劑為苯甲酸鈉和氨基酸，二者的質(zhì)量比為5:1，氨基酸為賴氨 酸。
[0164] 應(yīng)用例
[0165] 利用上述實(shí)施例獲得菌劑在北票市五間房鎮(zhèn)科技示范園26號(hào)棚(98米）內(nèi)施用，作 物為西紅柿，品種為歐盾粉紅，使用時(shí)間：2015年秋茬，全程使用。
[0166] 方案設(shè)計(jì)依據(jù)
[0167] 1、測(cè)土結(jié)果(TC-100 土壤養(yǎng)分速測(cè)儀）
[0169] 2、番茄需肥規(guī)律
[0170] (1)番茄生命周期內(nèi)中對(duì)1?、1(、0&、1%5種元素吸收比例大約為1 :0.26:1.8:0.74: 〇. 18(質(zhì)量比）；
[0171] (2)分析番茄整個(gè)植株體內(nèi)氮素、磷素、鉀素的質(zhì)量比例為1:0.4:2
[0172] (3)番茄不同生育時(shí)期對(duì)養(yǎng)分的吸收量不同，一般隨生育期的延長(zhǎng)而增加。在幼苗 期以氮營(yíng)養(yǎng)為主，在第一穗果開始結(jié)果時(shí)，對(duì)氮、磷、鉀的吸收量迅速增加，氮在三要素中占 50%，而鉀只占32% ;到結(jié)果盛期和開始收獲期，氮只占36%，而鉀已占50%，結(jié)果期磷的吸 收量約占15%。番茄需鉀的特點(diǎn)是從坐果開始一直呈直線上升，果實(shí)膨大期吸鉀量約占全 生育期吸鉀總量的70%以上。直到采收后期對(duì)鉀的吸收量才稍有減少。
[0173] (4)番茄氮、磷、鉀施肥量的比例應(yīng)為1:1:2
[0174] 3、施肥方案：（每畝使用）
[0176] 試驗(yàn)方案具體實(shí)施
[0177] (1)底肥/畝:上述施肥方案中硅鈣鎂60斤、復(fù)合肥160斤、農(nóng)家糞5方
[0178] (2)種苗處理:種植前先用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑粉劑500g提前用紅糖 發(fā)酵2小時(shí)以上，用水稀釋500倍后蘸根，移栽種苗；
[0179] (2)定植:本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑粉劑500克和本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù) 合菌劑液體制劑5公斤混合，而后提前用紅糖發(fā)酵2小時(shí)以上，隨緩苗水滴灌。加速生根，控 制死苗率，控制節(jié)間生長(zhǎng)。
[0180] (3)葉面噴施/畝
[0181] 第一穗果坐住后:采用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑液體制劑60ml和90斤水混 合，而后葉面噴施，7-10天一次，直到采收結(jié)束。
[0182 ] (4)每次澆水時(shí)，每畝用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑粉劑500克和本發(fā)明解淀 粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑液體制劑5公斤，間隔10-15天澆灌一次直到采收一共使用6次。
[0183] 4、使用效果：
[0185] (1)生長(zhǎng)同步，坐果率高：往年4~5盆果都坐不住，即使坐果果實(shí)也少，不整齊。 2015年在常規(guī)用肥基礎(chǔ)上使用復(fù)合菌劑，秧子長(zhǎng)勢(shì)好，又綠又壯，而且成熟的比較集中，果 實(shí)比較實(shí)成，最多的坐果是6盆果，少的是5盆果，果實(shí)整齊，大小均勻。
[0186] (2)抗病性:減少病蟲害的發(fā)生。往年的潰瘍病沒(méi)有再出現(xiàn)，農(nóng)用使用次數(shù)減少。
[0187] (3)改良土壤:土質(zhì)明顯疏松，踩上去感覺土壤有彈力
[0188] (4)提尚廣量和廣品品質(zhì)，增加收?:和2014年相比廣量提尚了30%，西紅柿品相 好，大部分做為邊貿(mào)商品出售，價(jià)格同比高0.2元/斤，收入比去年增加了 20000元左右。 [0189]由上述可知施入土壤后，三株解淀粉芽孢桿菌在適宜的條件下復(fù)活后，快速繁殖， 一邊分解有機(jī)質(zhì)提供植物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一邊分泌植物細(xì)胞分裂素等，促進(jìn)植物根 系的生長(zhǎng)，加速營(yíng)養(yǎng)的吸收，同時(shí)分泌的短肽、小分子蛋白、有機(jī)酸以及高活性的酶類，有效 抑制了根際病原菌及寄生蟲的繁殖，起到了生根、促根、護(hù)根、健根的作用。對(duì)于作物而言， 根好啥都好
[0190] 本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑液體制劑的葉面噴施，使得果肉及果皮細(xì)胞等速 分裂，膨果快，裂果明顯減少。同時(shí)改善口感，酸甜可口。沒(méi)有出現(xiàn)畸形果。
[0191] 有益微生物的添加，改善了土壤的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)及微生態(tài)環(huán)境，保水保肥，培肥土壤地 力，為作物的生長(zhǎng)營(yíng)造了有利條件。
[0192] 應(yīng)用例2
[0193] 利用上述實(shí)施例獲得菌劑在遼寧凌源東遠(yuǎn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)基地20號(hào)大棚內(nèi)施用，作物為 青椒(甜椒），使用時(shí)間：2015年9月16日~2016年4月30日。
[0194] 施肥依據(jù)：
[0195] 1、測(cè)土結(jié)果(TC-100 土壤養(yǎng)分速測(cè)儀）
[0201] 2、青椒(甜椒)的需肥規(guī)律
[0202] (1)與番茄、茄子相比，甜椒的需肥特性與它們很相似，也是吸鉀量最高，其次是 氮，磷最低。甜椒在蔬菜中屬高氮、中磷、高鉀類型，需肥總量較多。
[0203] (2)甜椒的生長(zhǎng)期長(zhǎng)，但根系不發(fā)達(dá)，根量少，入土淺，不耐旱也不耐澇。它的需肥 量大于番茄和茄子，而且耐肥能力強(qiáng)。每生產(chǎn)1噸甜椒，其養(yǎng)分吸收量為N4.91千克、P 2051.19 千克、K2O6.02千克，其吸收比例為1:0.2:1.2
[0204] (3)甜椒的鈣營(yíng)養(yǎng)也不應(yīng)忽視，一旦缺鈣容易使果實(shí)發(fā)生臍腐病，從而導(dǎo)致果實(shí)質(zhì) 量大大降低
[0205] 施肥方案/畝
[0206]
[0207]試驗(yàn)方案具體實(shí)施
[0208] 1、底肥:上述施肥方案中硅鈣鎂30公斤/畝和復(fù)合肥150kg/畝。
[0209] 使用方法:將以上肥料均勻撒入土壤，深翻，旋耕，起壟，灌足底墑水，待栽。（間隔 3-5天后，栽苗。）
[0210] 2、定植:用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑粉劑500克/畝和本發(fā)明解淀粉芽孢桿 菌復(fù)合菌劑液體制劑5公斤/畝，提前發(fā)酵3小時(shí)以上，用水按500倍溶解稀釋，隨緩苗水沖施 或滴灌。加速生根，控制死苗率，控制節(jié)間生長(zhǎng)。
[0211] 3、第一穗果坐住后：葉面噴施:本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑液體制劑用水稀 釋600倍，葉面噴施，10天一次，直到采收結(jié)束前。
[0212] 4、每次澆水時(shí)，用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑液體制劑5公斤/畝，沖施或滴 灌，本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑液體制劑最少使用3次。
[0213] 5、其他大棚受凍害后的補(bǔ)救方案:每個(gè)受害大棚，使用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù) 合菌劑粉劑和本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑液體制劑混合，而后用水進(jìn)行400倍稀釋，聯(lián) 合沖施，間隔7天一次，連續(xù)3次。
[0214]使用背景：
[0215] 2016年1月份，當(dāng)?shù)貧鉁剌^往年同期偏低4°C~5°C，室外達(dá)零下23°C.2016年1月20 日上午9點(diǎn)左右，園區(qū)突然停電6個(gè)小時(shí)以上，護(hù)棚簾無(wú)法放下。十多天的低溫，再加上停電 影響，導(dǎo)致凍害大面積發(fā)生，對(duì)照組的近80個(gè)大棚的青椒秧苗已沒(méi)有生長(zhǎng)點(diǎn)，花少。比去年 同期減產(chǎn)約三分之二。每天出貨只有20噸左右。而實(shí)驗(yàn)處理組的青椒秧苗沒(méi)有受到絲毫的 凍害影響，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，碩果累累。于是我們用同樣的處理方法，對(duì)發(fā)生凍害的對(duì)照組的80個(gè) 大棚進(jìn)行補(bǔ)救，10天后，生長(zhǎng)點(diǎn)重新分化，開花結(jié)果。彌補(bǔ)了損失。
[0216]使用效果：
[0217] 上述實(shí)施例獲得的本發(fā)明解淀粉復(fù)合菌劑的實(shí)際應(yīng)用，充分驗(yàn)證了其抗逆性，尤 其是抗寒性。
[0218]
[0219]試驗(yàn)棚20號(hào)大棚的綜合表現(xiàn)：
[0220] 1、移栽后緩苗期短，生根快，成活率高。
[0221 ] 2、生長(zhǎng)期枝粗葉茂，能夠抗凍害、抗重茬，抑制細(xì)菌病害。
[0222] 3、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，花勻果多。
[0223] 4、果大均勻、商品率高，提高產(chǎn)量，增加效益。
[0224]綜上所述施用上述本發(fā)明獲得的解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑具有如下特點(diǎn)：
[0225] 1、基肥:甜椒由于生長(zhǎng)期長(zhǎng)，根系較弱，為了定植后及時(shí)促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)和后期植株 多坐果，使用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑液體制劑的粉劑和液體制劑的500倍水稀釋 液蘸根，定植后又作為緩苗水使用。一來(lái)，加速解淀粉芽孢桿菌活菌的繁殖，二來(lái)，復(fù)合菌固 體粉劑中的代謝產(chǎn)物可以殺死幼苗根部攜帶的病原菌，液體制劑中的植物免疫修復(fù)劑，可 以修復(fù)在分苗過(guò)程中受傷的根部細(xì)胞，使受傷的創(chuàng)面快速愈合，防止病原菌的侵入。起到了 生根、促根、護(hù)根、健根的作用，所以，秧苗的成活率明顯提高。
[0226] 2、追肥："上噴"三株復(fù)合菌液體制劑；"下灌"本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑液 體制劑的粉劑和液體制劑的400倍水稀釋液，最少3次以上。三株功能性解淀粉芽孢桿菌的 活菌，遇到適宜的條件迅速繁殖，產(chǎn)生抑菌殺蟲促生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物，快速降低根劑土壤中的 有害微生物，促進(jìn)根系發(fā)育，誘導(dǎo)作物產(chǎn)生抗逆性，所以，生長(zhǎng)期枝粗葉茂，能夠抗凍害、抗 重茬，抑制細(xì)菌病害。這也是"補(bǔ)救方案"的原理所在。
[0227] 應(yīng)用例3
[0228]利用上述實(shí)施例獲得的菌劑，在遼寧新民柳河溝蘋果園施用，作物為寒富蘋果，蘋 果樹現(xiàn)狀:樹齡6年，2015年的果已套袋，有部分果樹出現(xiàn)了根腐病，葉片卷曲。根腐病嚴(yán)重 的10棵樹已瀕臨死亡，園主已經(jīng)決定放棄治療。
[0229] -、針對(duì)10顆病樹的治療方案：
[0230] 1、根治根腐病
[0231] (1)清創(chuàng)病灶:剝掉腐爛處的樹皮，將變色壞死的"木質(zhì)部"挖掉。
[0232] (2)病樹處理:將本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑液體制劑經(jīng)水稀釋的300倍稀釋 液，取遠(yuǎn)離病區(qū)的深層土壤(30厘米以下，盡量減少病原菌的數(shù)量），和成泥巴，粘在已經(jīng)清 創(chuàng)的患處，然后用潔凈的透氣性良好的布條纏住，等待愈合。
[0233] (3)同時(shí)，利用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑的粉劑和液體制劑的混合物經(jīng)水 稀釋的400倍稀釋液進(jìn)行灌根。連續(xù)2次，間隔7-10天
[0234] 二、針對(duì)正常生長(zhǎng)的果樹:提升果實(shí)品質(zhì)的方案
[0235] 在果實(shí)膨大期和著色期聯(lián)合使用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑液體制劑經(jīng)水 稀釋的300倍稀釋，結(jié)合常規(guī)使用的葉面噴施用肥進(jìn)行噴施。間隔7-10天，連續(xù)噴施2-3次
[0236] 三、使用效果：
[0237] 1、瀕臨死亡的10棵蘋果樹神奇般地起死回生。不僅重新生根發(fā)葉，而且長(zhǎng)勢(shì)很好， 開花結(jié)果。
[0238] 2、其他正常的果樹，在技術(shù)人員指導(dǎo)下，在果實(shí)膨大期和著色期聯(lián)合使用本發(fā)明 解淀粉復(fù)合菌劑液體制劑經(jīng)水稀釋的300倍稀釋，結(jié)合常規(guī)使用的葉面噴施用肥進(jìn)行噴施。 果大均勻，色澤一致，果表鮮亮，口感脆甜，抗氧化，耐儲(chǔ)存，受到客戶的一致好評(píng)，爭(zhēng)相購(gòu) 買。
[0239] 施用上述實(shí)施例獲得復(fù)合菌劑后瀕臨死亡的10棵蘋果樹神奇般地起死回生，具體 如下：
[0240] (1)根腐病發(fā)病機(jī)理:該病常與慪根癥狀相似，屬真菌病害。病菌在土壤中和病殘 體上過(guò)冬，一般多在3月下旬至4月上旬發(fā)病，5月進(jìn)入發(fā)病盛期。發(fā)病的根莖：
[0241] (2)本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑中含有的三株功能性解淀粉芽孢桿菌的活菌 液體制劑，具有快速修復(fù)受損細(xì)胞的功能，能使清創(chuàng)后的病灶處受損的植物細(xì)胞恢復(fù)正常 的生理功能；另外含有的三株解淀粉芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物，有效抑制了病原菌的侵入，為新 生細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造了安全的環(huán)境。
[0242] (3) "治標(biāo)"更要"治本"：根腐病實(shí)際是真菌性的土傳病害，由于根部腐爛，吸收水 分和養(yǎng)分的功能逐漸減弱，最后全株死亡。主要表現(xiàn)為整株葉片發(fā)黃、枯萎。所以，只有根除 "根腐病"的病原菌，才能從根本上杜絕根腐病的發(fā)生。利用本發(fā)明解淀粉復(fù)合菌劑液體制 劑的粉劑和液體制劑混合的，經(jīng)水稀釋的400倍稀釋液進(jìn)行灌根。連續(xù)2次，間隔7-10天。其 中有益的活的解淀粉芽孢桿菌的芽孢在土壤中，遇到適宜的萌發(fā)的條件(溫度、濕度、空氣、 有機(jī)質(zhì))大量的快速繁殖，分泌抑制細(xì)菌性和真菌性的代謝產(chǎn)物(短肽、小分子蛋白質(zhì)、有機(jī) 酸、高活性酶類等），以此作為其有利的武器與土傳病害的病原菌進(jìn)行"殊死搏斗"，為作物 根系的發(fā)育創(chuàng)造了有利環(huán)境。抑制根系腐爛的惡化。
[0243] 并且在果實(shí)膨大期和著色期聯(lián)合使用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌復(fù)合菌劑液體制劑 經(jīng)水稀釋的300倍稀釋液，結(jié)合常規(guī)葉面噴施用肥進(jìn)行噴施。間隔7-10天，連續(xù)噴施2-3次。 提升果實(shí)品質(zhì)。
[0244] 采用上述實(shí)施例獲得復(fù)合菌劑，因其含有豐富的高活性代謝產(chǎn)物，能夠?；ū９?， 提高坐果率;能夠加快果肉及果皮細(xì)胞等速分裂，配合葉面噴施，快速吸收利用微量元素， 提高肥料的利用率，進(jìn)而提升果實(shí)品質(zhì)，具有單果重量增加、色澤鮮艷、抗氧化、改善口感的 功效。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種解淀粉芽孢桿菌，其特征在于：解淀粉芽孢桿菌（B a C i I I u S amy Io liquefac iens)分別為：CGMCCNO · 12306 (KY-I)、CGMCCNO · 12307 (KY-2)、 CGMCCN0.12308 (KY-3 )，均保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址： 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2016年3月24日。2. -種復(fù)合菌劑，其特征在于:將權(quán)利要求1所述解淀粉芽孢桿菌分別經(jīng)過(guò)三級(jí)液體發(fā) 酵，而后按體積比（5~1):(1~5):(5~1)比例將發(fā)酵液混合即獲得復(fù)合菌劑。3. 按權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌劑，其特征在于:所述復(fù)合菌劑中上述菌株分別經(jīng)三級(jí)液 體發(fā)酵后的發(fā)酵液中芽孢率彡90 %，血球活菌計(jì)數(shù)彡100億/ml，殘留葡萄糖彡0.6 %，pH = 7 · 0~8·0〇4. 按權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌劑，其特征在于:將按上述比例混合的混合發(fā)酵液中加入 混合發(fā)酵液體積0.1~2.0 %的穩(wěn)定劑，即獲得液體制劑。5. 按權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌劑，其特征在于:將按上述比例混合的混合發(fā)酵液經(jīng)降膜 濃縮至混合發(fā)酵液體積的1/2-1/3，而后加入濃縮后混合發(fā)酵液體積0.1~2.0 %的穩(wěn)定劑 和濃縮后混合發(fā)酵液體積30 %~40 %的載體，加入后充分混合，混合后噴霧干燥，即得復(fù)合 菌粉劑。6. 按權(quán)利要求4或5所述的復(fù)合菌劑，其特征在于：所述穩(wěn)定劑為苯甲酸鈉和/或氨基 酸;載體為膨潤(rùn)土、稻殼粉、沸石粉、白炭黑和碳酸鈣;其中，氨基酸為賴氨酸。7. -種權(quán)利要求2所述的復(fù)合菌劑的制備方法，其特征在于： 將3種解淀粉芽孢桿菌的液體種子液分別按0.5%~1 %接種至一級(jí)種子罐培養(yǎng)基內(nèi)， 于30°C~32°C，罐壓= 0.02MPa~0.05MPa，通氣比=1:0.5~1:0.8，一級(jí)種子罐周期=1211 ~24h下進(jìn)行一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)至生物量多10%，菌體形態(tài)一致，短桿狀，兩端平齊，著色均一， pH自然回升至6.5~7.0,待用； 將上述一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液按1-15%接種至二級(jí)種子罐培養(yǎng)基內(nèi)，于30°C~32°C，罐壓= 0.02MPa~0.05MPa，通氣比=1:0.5~1:0.8，二級(jí)種子罐培養(yǎng)周期=12h~24h下進(jìn)行二級(jí) 發(fā)酵培養(yǎng)至生物量多10%，菌體形態(tài)一致，短桿狀，兩端平齊，著色均一，pH自然回升至6.5 ~7.0,待用； 將上述二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)液2-15%接種至發(fā)酵罐培養(yǎng)基內(nèi)，于30°C~32°C，罐壓=0.04MPa ~0.07MPa，通氣比=1:0.8~1:1.24!1 = 6.5-6.7;待口!1自然回升4!1 = 7.0~8.0流加80% 的葡萄糖溶液，周期= 30h~72h，即分別獲得三級(jí)發(fā)酵液;在配糖罐中配制80%的葡萄糖溶 液并于115°C、20分鐘滅菌消毒，降溫至30°C后，加入量為每分鐘IOL~15L，而后按照體積比 (5~I): (1~5): (5~1)比例將發(fā)酵液混合即獲得復(fù)合菌劑。8. 按權(quán)利要求7所述的復(fù)合菌劑的制備方法，其特征在于:將按上述比例混合的混合發(fā) 酵液中加入混合發(fā)酵液體積0.1-2.0%的穩(wěn)定劑，即獲得液體制劑。9. 按權(quán)利要求7所述的復(fù)合菌劑的制備方法，其特征在于:將按上述比例混合的混合發(fā) 酵液經(jīng)降膜濃縮至混合體積的1/2-1/3，而后加入濃縮后體積0.1-2 %的穩(wěn)定劑，再加入濃 縮后體積30 %~40 %的載體充分混合，噴霧干燥而得復(fù)合菌粉劑。10. 按權(quán)利要求8或9所述的復(fù)合菌劑的制備方法，其特征在于:所述穩(wěn)定劑為苯甲酸鈉 和/或氨基酸;載體為膨潤(rùn)土、稻殼粉、沸石粉、白炭黑和碳酸鈣;其中，氨基酸為賴氨酸。
【文檔編號(hào)】A01P21/00GK105950519SQ201610559353
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月15日
【發(fā)明人】張傳軍, 張曉紅, 張中親, 白玉紅, 李冰潔
【申請(qǐng)人】北京康緣益生生物科技有限公司