一種pk15細(xì)胞的低血清培養(yǎng)方法、通過該方法獲得的pk15細(xì)胞及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種PK15細(xì)胞的低血清培養(yǎng)方法、通過該方法獲得的PK15細(xì)胞及其應(yīng)用；所述PK15細(xì)胞的低血清培養(yǎng)方法，包括：1)取貼壁培養(yǎng)的PK15細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，然后消化傳代；2)將細(xì)胞置于含3％牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行傳代；3)將細(xì)胞以體積比1:2.5的比例進(jìn)行傳代至細(xì)胞鋪滿單層；4)將細(xì)胞以體積比1:3的比例進(jìn)行傳代至細(xì)胞鋪滿單層，得到適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì)胞；所述應(yīng)用為通過PK15細(xì)胞進(jìn)行TGEV華毒株的增殖培養(yǎng)，包括：準(zhǔn)備PK15細(xì)胞；接入毒株；收集病毒液；本發(fā)明使TGEV華毒株能在低血清條件下連續(xù)至少傳代培養(yǎng)5代，均能使PK15細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變。
【專利說明】
一種PK15細(xì)胞的低血清培養(yǎng)方法、通過該方法獲得的PK15細(xì) 胞及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種PK15細(xì)胞的低血清培養(yǎng)方法、 通過該方法獲得的PK15細(xì)胞及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，在國內(nèi)動物疫苗的大生產(chǎn)中，傳代細(xì)胞的培養(yǎng)大多含有高濃度牛血清。因為 牛血清是天然培養(yǎng)基，所以其來源有限，價格連年上漲，增加了疫苗生產(chǎn)的原材料成本;牛 血清組分不明確、不穩(wěn)定，批次間的差異影響了疫苗產(chǎn)品的穩(wěn)定性；另外，血清供應(yīng)鏈存在 一定風(fēng)險，有潛在的外源病原污染風(fēng)險。因此，在疫苗生產(chǎn)中，牛血清的成本是最高的，血清 的質(zhì)量也是最為關(guān)鍵的。采用低血清系統(tǒng)培養(yǎng)動物細(xì)胞并進(jìn)行病毒生產(chǎn)繁殖，既大幅度降 低了疫苗生產(chǎn)成本，又減少了因血清短缺或質(zhì)量問題帶來的生產(chǎn)風(fēng)險。用低血清培養(yǎng)傳代 細(xì)胞并進(jìn)行疫苗生產(chǎn)是目前生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)新技術(shù)的發(fā)展方向。
[0003] 國內(nèi)有關(guān)于PK15細(xì)胞的低血清培養(yǎng)馴化的研究報道，如專利申請?zhí)?201510098627.X"低血清培養(yǎng)PK-15細(xì)胞生產(chǎn)豬圓環(huán)Π 型DBN-SX07株病毒的方法"，該專利 公開了一種利用逐步減血清的方法馴化PK15細(xì)胞，使其適應(yīng)低血清培養(yǎng)，但是沒有其在豬 傳染性胃腸炎病毒(TGEV)培養(yǎng)繁殖中應(yīng)用的說明。
[0004] 而關(guān)于豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)低血清培養(yǎng)的報道，如專利申請?zhí)?201510098147.3 "低血清培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)豬傳染性胃腸炎華毒株病毒的方法"，但是沒有用 適應(yīng)低血清系統(tǒng)的PK15細(xì)胞培養(yǎng)豬傳染性胃腸炎病毒的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種PK15細(xì)胞的低血清培養(yǎng)方 法，該方法將PK15細(xì)胞馴化至適應(yīng)低血清培養(yǎng)，大大降低了牛血清的使用量。
[0006] 實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：
[0007] -種PK15細(xì)胞的低血清培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0008] 1)取貼壁培養(yǎng)的PK15細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，然后置于含8%牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中 使用消化液對細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層;然后以體積比1:3的比例使用消化 液對細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，傳代培養(yǎng)2~3代；
[0009] 2)將經(jīng)步驟1)處理的PK15細(xì)胞置于含3%牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中以體積比 1: 2.5的比例使用消化液對細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層;然后以體積比1: 3的 比例使用消化液進(jìn)行消化傳代至細(xì)胞鋪滿單層；
[0010] 3)將經(jīng)步驟2)處理的PK15細(xì)胞置于含1~2 %牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中以體積 比1:2.5的比例使用消化液進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層；
[0011 ] 4)將經(jīng)步驟3)處理的PK15細(xì)胞置于含1~2 %牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中以體積 比1:3的比例使用消化液進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層;得到適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15 細(xì)胞。
[0012]作為優(yōu)選，其中對PK15細(xì)胞的每一次消化傳代過程中，所使用的消化液均為EDTA-胰酶消化液;所述EDTA-胰酶消化液為含有質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.25 %的規(guī)格1: 250的胰酶和 0.02%的EDTA的Hank ' s液;所述的規(guī)格1:250的胰酶為每克胰酶中含有250個活力單位的胰 蛋白酶。
[0013] 作為優(yōu)選，所述步驟4)中，重復(fù)消化傳代并培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層的過程2~3次，得 到適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì)胞。
[0014] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì)胞，該P(yáng)K15細(xì)胞能適 應(yīng)低血清培養(yǎng)。
[0015] 實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：
[0016] 一種適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì)胞，經(jīng)過上述的方法得到。
[0017]作為優(yōu)選，所述適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì)胞在低血清MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中可以傳 代培養(yǎng)至少50代。
[0018] 本發(fā)明的第三個目的在于提供一種適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì)胞的應(yīng)用，將PK15細(xì) 胞應(yīng)用于TGEV華毒株的增殖培養(yǎng)，使TGEV華毒株能在低血清條件下連續(xù)至少傳代培養(yǎng)5代， 均能使PK15細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變，第3代、第4代和第5代毒的病毒含量均eioMTCIDso/mL。
[0019] 實現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：
[0020] 一種適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì)胞的應(yīng)用，將如上所述的PK15細(xì)胞應(yīng)用于TGEV華毒 株的增殖培養(yǎng)。
[0021] 作為優(yōu)選，所述的TGEV華毒株的增殖培養(yǎng)包括以下步驟：
[0022] I)準(zhǔn)備PK15細(xì)胞:將PK15細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿單層后，傾去培養(yǎng)液上清；
[0023] Π )接入毒株：以體積比為1 %的接毒量將TGEV華毒株接入PK15細(xì)胞中，加入維持 液;然后置于溫度為37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0024] m)收集病毒液:培養(yǎng)48~72h至PK15單層細(xì)胞中80%以上出現(xiàn)病變，反復(fù)凍融收 獲病毒液，獲得經(jīng)增殖培養(yǎng)的TGEV華毒株。
[0025]作為優(yōu)選，步驟Π )中，所述維持液為含0.1~0.5%牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液。 [0026]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0027] 1、本發(fā)明將PK15細(xì)胞馴化至適應(yīng)低血清培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液中只需含1~2%牛血 清，大大降低了牛血清的使用量；
[0028] 2、本發(fā)明提供的適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì)胞能在低血清培養(yǎng)系統(tǒng)中連續(xù)傳代培 養(yǎng)至少50代；
[0029] 2、本發(fā)明將PK15細(xì)胞應(yīng)用于TGEV華毒株的增殖培養(yǎng)，使TGEV華毒株能在含0.1~ 0.5 %牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中連續(xù)至少傳代培養(yǎng)5代，均能使PK15細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變，第3 代、第4代和第5代毒的病毒含量均蘭lO^TCIDM/mL;
[0030] 3、本發(fā)明中病毒的接毒方式均為細(xì)胞單層接毒，不吸附直接加入維持液;既節(jié)省 了病毒培養(yǎng)操作時間，也簡化了病毒培養(yǎng)工序，同時降低了病毒培養(yǎng)過程中污染的風(fēng)險。
【附圖說明】
[0031] 圖1為實施例1PK15細(xì)胞在低血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)至第5代的細(xì)胞形態(tài)圖；
[0032]圖2為實施例1PK15細(xì)胞在低血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)至第20代的細(xì)胞形態(tài)圖；
[0033]圖3為實施例1PK15細(xì)胞在低血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)至第50代的細(xì)胞形態(tài)圖；
[0034]圖4為實施例2PK15細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變的形態(tài)圖；
[0035]圖5為實施例3PK15細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變的形態(tài)圖；
[0036]圖6為實施例4PK15細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變的形態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0037]下面，結(jié)合附圖以及【具體實施方式】，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0038] 1、一種PK15細(xì)胞的低血清培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0039] 1)取貼壁培養(yǎng)的PK15細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，然后置于含8%牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中 使用EDTA-胰酶消化液對細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層;然后以體積比1: 3的比 例使用Η)ΤΑ-胰酶消化液對細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，傳代培養(yǎng)2~3代；
[0040] 2)將經(jīng)步驟1)處理的ΡΚ15細(xì)胞置于含3%牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中以體積比 1: 2.5的比例使用EDTA-胰酶消化液對細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層;然后以體 積比1:3的比例使用EDTA-胰酶消化液進(jìn)行消化傳代至細(xì)胞鋪滿單層；
[0041 ] 3)將經(jīng)步驟2)處理的ΡΚ15細(xì)胞置于含1~2 %牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中以體積 比1:2.5的比例使用EDTA-胰酶消化液進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層；
[0042] 4)將經(jīng)步驟3)處理的ΡΚ15細(xì)胞置于含1~2 %牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中以體積 比1:3的比例使用EDTA-胰酶消化液進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層；
[0043] 5)重復(fù)進(jìn)行步驟4) 2次;得到適應(yīng)低血清培養(yǎng)的ΡΚ15細(xì)胞。
[0044] 該ΡΚ15細(xì)胞在低血清MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中可以傳代培養(yǎng)至少50代。
[0045]所述進(jìn)行消化傳代的體積比為母代細(xì)胞與子代細(xì)胞的比例，即將1體積的母代細(xì) 胞擴(kuò)增為對應(yīng)比例的子代細(xì)胞。
[0046]所述EDTA-胰酶消化液為含有質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.25%的規(guī)格1: 250的胰酶和 0.02%的EDTA的Hank ' s液，所述的規(guī)格1:250的胰酶為每克胰酶中含有250個活力單位的胰 蛋白酶。
[0047] MD611細(xì)胞培養(yǎng)液是使用Merck MD系列干粉低血清培養(yǎng)基(貨號:FC00041，原產(chǎn)品 代碼:MD611 -050)制得，在使用前需要配成溶液。具體步驟如下：
[0048] a、按照質(zhì)量體積比為12.48g/L稱取適量MD611干粉培養(yǎng)基，配制1L細(xì)胞培養(yǎng)液； [0049] b、在容器中加入900mL注射用水，水溫20~30°C，攪拌溶解；
[0050] c、加入質(zhì)量體積比為2.29g/L量的碳酸氫鈉，完全溶解后，加注射用水至總?cè)芤后w 積1L;
[0051 ] d、用0.22μπι濾膜過濾除菌，溶液在2~8°C下密閉避光保存；
[0052] e、使用時，若有需要，用飽和氫氧化鈉調(diào)溶液將pH調(diào)至7.2~7.4。
[0053] 2、將通過上述方法得到的PK15細(xì)胞應(yīng)用于TGEV華毒株的增殖培養(yǎng)，包括以下步 驟：
[0054] I)準(zhǔn)備PK15細(xì)胞:將PK15細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿單層后，傾去培養(yǎng)液上清；
[0055] Π )接入毒株：以體積比為1%的接毒量將TGEV華毒株接入PK15細(xì)胞中，加入含0.1 ~0.5 %牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液;然后置于溫度為37°C，5 % C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0056] m)收集病毒液:培養(yǎng)48~72h至PK15單層細(xì)胞中80%以上出現(xiàn)病變，反復(fù)凍融收 獲病毒液，獲得經(jīng)增殖培養(yǎng)的TGEV華毒株。
[0057] 實施例1
[0058] 一種PK15細(xì)胞的低血清培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0059] 1)取貼壁培養(yǎng)的PK15細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，然后置于含8%牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中 使用EDTA-胰酶消化液對細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層;然后以體積比1: 3的比 例使用Η)ΤΑ-胰酶消化液對細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，傳代培養(yǎng)3代；
[0060] 2)將經(jīng)步驟1)處理的ΡΚ15細(xì)胞置于含3%牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中以體積比 1: 2.5的比例使用EDTA-胰酶消化液對細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層;然后以體 積比1:3的比例使用EDTA-胰酶消化液進(jìn)行消化傳代至細(xì)胞鋪滿單層；
[0061 ] 3)將經(jīng)步驟2)處理的ΡΚ15細(xì)胞置于含1~2 %牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中以體積 比1:2.5的比例使用EDTA-胰酶消化液進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層；
[0062] 4)將經(jīng)步驟3)處理的ΡΚ15細(xì)胞置于含1~2 %牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中以體積 比1:3的比例使用EDTA-胰酶消化液進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層；
[0063] 5)重復(fù)進(jìn)行步驟4) 2次;得到適應(yīng)低血清培養(yǎng)的ΡΚ15細(xì)胞。
[0064] 將步驟5)得到的ΡΚ15細(xì)胞以體積比1:3~5在1~2%牛血清的Merck MD611細(xì)胞培 養(yǎng)液中傳代至50代，觀察每一代的細(xì)胞形態(tài);其中PK15細(xì)胞在低血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)至第5代 的細(xì)胞形態(tài)如圖1所示;第20代的細(xì)胞形態(tài)如圖2所示;第50代的細(xì)胞形態(tài)如圖3所示；馴化 后的PK15細(xì)胞在含1~2 %牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中生長時，細(xì)胞密度達(dá)到4.9~6.71 X 105個/mL;馴化后的PK15細(xì)胞在低血清MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中至少可以傳代培養(yǎng)50代。
[0065] 實施例2
[0066]將通過實施例1得到的PK15細(xì)胞應(yīng)用于TGEV華毒株的增殖培養(yǎng)，包括以下步驟： [0067] I)準(zhǔn)備PK15細(xì)胞:將PK15細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿單層后，傾去培養(yǎng)液上清；
[0068] Π )接入毒株：以體積比為1 %的接毒量將TGEV華毒株接入H(15細(xì)胞中，加入含 0.5 %牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液;然后置于溫度為37°C，5 % C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0069] ΙΠ )收集病毒液:培養(yǎng)48~72h至PK15單層細(xì)胞中80%以上出現(xiàn)病變，反復(fù)凍融收 獲病毒液，將此病毒液作為第1代種毒aFl;
[0070] IV)重復(fù)步驟I)~m)將aFl接入新的PK15細(xì)胞并收集病毒液，得到第2代種毒aF2;
[0071] V)不斷重復(fù)步驟I)~ΙΠ )將上一代的種毒馴化得到下一代的種毒；獲得aF3~ aF5 ：
[0072] 測定種毒aF3、aF4、aF5的病毒含量值，使用含0.5%牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液作 為病毒稀釋液，測毒價所用的細(xì)胞為病毒培養(yǎng)用PK15細(xì)胞，測量3次取平均值，病毒含量值 如表1所示：
[0073]表1實施例2病毒含量值
[0075] PK15細(xì)胞的病變細(xì)胞情況如圖4所示，PK15細(xì)胞均能發(fā)生病變。
[0076] 實施例3
[0077]本實施例的特點在于:步驟Π )中加入含0.3%牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液;其余步 驟和參數(shù)與實施例2相同。獲得種毒&?1、&?2、&?3 4?4、&?5，測定&?3、&?44?5的病毒含量 值，使用含0.3%牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液作為病毒稀釋液，測毒價所用的細(xì)胞為病毒培 養(yǎng)用PK15細(xì)胞，測量3次取平均值，病毒含量值如表2所示：
[0078]表2實施例3病毒含量值
[0081 ] PK15細(xì)胞的病變細(xì)胞情況如圖5所示，PK15細(xì)胞均能發(fā)生病變。
[0082] 實施例4
[0083]本實施例的特點在于:步驟Π )中加入含0.1 %牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液;其余步 驟和參數(shù)與實施例2相同。獲得種毒cFl、cF2、cF3、cF4、cF5，測定cF3、cF4、cF5的病毒含量 值，使用含0.1%牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液作為病毒稀釋液，測毒價所用的細(xì)胞為病毒培 養(yǎng)用PK15細(xì)胞，測量3次取平均值，病毒含量值如表3所示：
[0084] 表3實施例4病毒含量值
[0086] PK15細(xì)胞的病變細(xì)胞情況如圖6所示，PK15細(xì)胞均能發(fā)生病變。
[0087]對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各 種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種PKl5細(xì)胞的低血清培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 取貼壁培養(yǎng)的PK15細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，然后置于含8%牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中使用 消化液對細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層;然后以體積比1:3的比例使用消化液對 細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，傳代培養(yǎng)2~3代； 2) 將經(jīng)步驟1)處理的PKl 5細(xì)胞置于含3 %牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中以體積比1: 2.5 的比例使用消化液對細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層;然后以體積比1:3的比例使 用消化液進(jìn)行消化傳代至細(xì)胞鋪滿單層； 3) 將經(jīng)步驟2)處理的PKl 5細(xì)胞置于含1~2 %牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中以體積比1: 2.5的比例使用消化液進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層； 4) 將經(jīng)步驟3)處理的PKl 5細(xì)胞置于含1~2 %牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中以體積比1: 3的比例使用消化液進(jìn)行消化傳代，培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層;得到適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì) 胞。2. 如權(quán)利要求1所述的PK15細(xì)胞的低血清培養(yǎng)方法，其特征在于：其中對PK15細(xì)胞的每 一次消化傳代過程中，所使用的消化液均為EDTA-胰酶消化液;所述EDTA-胰酶消化液為含 有質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為〇. 25 %的規(guī)格1:250的胰酶和0.02 %的EDTA的Hank ' s液;所述的規(guī)格1: 250的胰酶為每克胰酶中含有250個活力單位的胰蛋白酶。3. 如權(quán)利要求1所述的PK15細(xì)胞的低血清培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟4)中，重復(fù) 消化傳代并培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層的過程2~3次，得到適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì)胞。4. 一種適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì)胞，其特征在于:經(jīng)過權(quán)利要求1-3任一的方法得到。5. 如權(quán)利要求4所述的適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì)胞，其特征在于:所述適應(yīng)低血清培養(yǎng) 的PK15細(xì)胞在低血清MD611細(xì)胞培養(yǎng)液中可以傳代培養(yǎng)至少50代。6. -種適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于:將如權(quán)利要求4所述的PK15細(xì) 胞應(yīng)用于TGEV華毒株的增殖培養(yǎng)。7. 如權(quán)利要求6所述的適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于:所述的TGEV華 毒株的增殖培養(yǎng)包括以下步驟： I)準(zhǔn)備PK15細(xì)胞:將PK15細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿單層后，傾去培養(yǎng)液上清； Π )接入毒株：以體積比為1 %的接毒量將TGEV華毒株接入PK15細(xì)胞中，加入維持液;然 后置于溫度為37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； ΙΠ )收集病毒液:培養(yǎng)48~72h至PKl5單層細(xì)胞中80 %以上出現(xiàn)病變，反復(fù)凍融收獲病 毒液，獲得經(jīng)增殖培養(yǎng)的TGEV華毒株。8. 如權(quán)利要求7所述的適應(yīng)低血清培養(yǎng)的PK15細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于:步驟Π )中，所 述維持液為含〇. 1~〇. 5 %牛血清的MD611細(xì)胞培養(yǎng)液。
【文檔編號】C12N7/00GK105950540SQ201610374968
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】何玲, 陳瑞愛, 唐滿華, 梁桂益
【申請人】廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司