清洗卵子或受精卵表面的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種清洗卵子或受精卵表面的方法。具體地，本發(fā)明公開的方法包括步驟(1)將未經(jīng)處理的卵子或未經(jīng)處理的受精卵置于第一培養(yǎng)皿中，其中，所述第一培養(yǎng)皿經(jīng)標準細胞培養(yǎng)表面處理且含有第一培養(yǎng)液，所述第一培養(yǎng)液含蛋白；然后加入透明質(zhì)酸酶處理所述卵子或受精卵，從而得到經(jīng)第一次處理的卵子或受精卵；(2)將經(jīng)第一次處理的卵子或受精卵移入第二培養(yǎng)皿中，其中，所述第二培養(yǎng)皿未經(jīng)表面處理且含有第二培養(yǎng)液，所述第二培養(yǎng)液不含蛋白；然后用帶有第三培養(yǎng)液的棒狀工具撥動所述卵子或受精卵，其中，所述第三培養(yǎng)液含蛋白；使顆粒細胞和/或多余精子脫離卵子或受精卵表面，從而被徹底清除干凈。
【專利說明】
清洗卵子或受精卵表面的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生殖醫(yī)學領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種清洗卵子或受精卵表面的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 試管嬰兒技術(shù)是一項對抗不孕不育的強大技術(shù)手段。但因各種原因，從胚胎植入子宮到胎兒出生的成功率不高(通常只有40%左右）。除母親健康原因外，受精卵質(zhì)量是導致胚胎發(fā)育失敗的重要原因之一。
[0003] 早期，在試管嬰兒技術(shù)過程中，僅依靠顯微鏡下的形態(tài)觀察，從多個胚胎中挑選2-3個相對“正常”者植入母親子宮。而顯微鏡下的形態(tài)正常并無法反映染色體是否正常。錯誤地挑選形態(tài)正常而染色體異常的胚胎植入母親子宮導致了很多試管嬰兒受孕失敗。
[0004] 近年以來，人們建立了一些技術(shù)（統(tǒng)稱為Preimplantation Genetic Screen，PGS) 對體外培養(yǎng)胚胎的染色體狀態(tài)進行檢測，以篩選染色體正常的胚胎植入母親子宮，從而提高受孕成功率。各種PGS方法檢測所需的生物樣本都是從體外培養(yǎng)胚胎中獲得的一個至數(shù)個細胞，通過對這寫細胞的檢測可反映整個胚胎的染色體是否正常。胚胎活檢有極體活檢、 卵裂球活檢和囊胚滋養(yǎng)層細胞活檢。PGS檢測通常是活檢卵裂球或囊胚滋養(yǎng)層細胞。但是， 越來越多的研究表明卵裂期活檢的安全性受到質(zhì)疑，因此囊胚滋養(yǎng)層細胞活檢逐漸成為 PGS胚胎活檢的主流。
[0005] 當受精卵在體外培養(yǎng)液中生長發(fā)育5天時，胚胎是由約80-100個細胞組成的囊狀結(jié)構(gòu)，稱為囊胚。此時，可在顯微鏡下，用毛細玻璃管吸取一個至數(shù)個滋養(yǎng)層細胞進行檢測。 已有研究表明，胚胎早期體外發(fā)育過程中（第1-5日）會將少量DNA釋放入培養(yǎng)液(囊胚培養(yǎng)液）中。盡管對此機制尚不明了，但囊胚培養(yǎng)液中存在著胚胎來源的DNA提供了對胚胎染色體狀態(tài)進行無損檢測的物質(zhì)基礎(chǔ)。我們的前期發(fā)明《一種利用囊胚培養(yǎng)液檢測胚胎染色體異常的方法》(CN105368936A)正是建立了一套達成此目的技術(shù)方法(NICS)。但是，NICS方法容易受到一些常規(guī)試管嬰兒體外胚胎培養(yǎng)過程中所忽略因素的干擾。
[0006] 第一代試管嬰兒(IVF)使用大量精子對卵子進行體外受精。然而對每個卵子而言， 只有一個精子能夠有效受精，使卵子成為受精卵，其它多余的無效精子會粘附在受精卵表面，它們死亡后釋放入體外培養(yǎng)液中，因此，父源DNA會對后續(xù)的NICS檢測形成干擾。另外， 從母體提取的卵細胞表面不可避免地會附著大量母體來源的顆粒細胞，這些顆粒細胞向培養(yǎng)液中釋放，因此，母源DNA也會對NICS檢測形成干擾。
[0007] 盡管二代試管嬰兒采用了卵胞漿內(nèi)單精子注射方法(ICSI)對卵子進行體外受精， 避免了多余精子造成的污染問題。并且，體外受精前會對卵子表面附著的顆粒細胞做常規(guī)清洗以部分暴露卵子表面，為精子注射針提供通道，但常規(guī)清洗后的卵子表面仍會粘附有較多的顆粒細胞，對后續(xù)的NICS檢測形成干擾。
[0008] 因此，本發(fā)明建立了將卵子(針對ICSI)或受精卵(針對IVF)表面的顆粒細胞和/或多余精子徹底清除干凈，以避免干擾NICS檢測的技術(shù)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是建立在試管嬰兒（IVF及ICSI)過程中徹底清除卵子表面的顆粒細胞和/或多余精子，使后續(xù)的胚胎培養(yǎng)液適用于NICS檢測的技術(shù)方法。
[0010] 在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種清洗卵子或受精卵表面的方法，其特征在于， 包括步驟：
[〇〇11] (1)將未經(jīng)處理的卵子或未經(jīng)處理的受精卵置于第一培養(yǎng)皿中，其中，所述第一培
養(yǎng)皿經(jīng)標準細胞培養(yǎng)表面處理且含有第一培養(yǎng)液，所述第一培養(yǎng)液含蛋白；
[0012] 然后加入透明質(zhì)酸酶處理所述卵子或受精卵，從而得到經(jīng)第一次處理的卵子或受精卵；
[0013] (2)將經(jīng)第一次處理的卵子或受精卵移入第二培養(yǎng)皿中，其中，所述第二培養(yǎng)皿未經(jīng)表面處理且含有第二培養(yǎng)液，所述第二培養(yǎng)液不含蛋白；
[0014] 然后用帶有第三培養(yǎng)液的棒狀工具撥動所述卵子或受精卵，其中，所述第三培養(yǎng)液含蛋白；使顆粒細胞和/或多余精子脫離卵子或受精卵表面，從而被徹底清除干凈。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述帶有第三培養(yǎng)液的棒狀工具是指棒狀工具上蘸有第三培養(yǎng)液。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述棒狀工具為棒或棍。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述棒狀工具為玻璃的、塑料的等任何適合的材料制成的。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述蛋白為血清蛋白。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述未經(jīng)處理的卵子是從母體取出2-3小時后的卵子。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述未經(jīng)處理的受精卵是在體外受精4小時或16-20小時后的受精卵。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述第一培養(yǎng)液模擬人輸卵管液的成分，且用HEPES做緩沖成份。
[〇〇22] 在另一優(yōu)選例中，所述第一培養(yǎng)液可參照Quinn等人于1984年公開發(fā)表(《生育與不孕》（Fertil Steril ·) 1984;41:202或 1985;44:493 ·)的文獻制備。
[〇〇23]該培養(yǎng)液用HEPES做緩沖成份，在空氣中可較長時間地保持pH值的穩(wěn)定性。培養(yǎng)時無需二氧化碳氣體環(huán)境。
[〇〇24] 該培養(yǎng)液可從各商業(yè)公司（如，SAGE media)購買，也可以自行配制。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述第一培養(yǎng)液為IM培養(yǎng)液。
[〇〇26] 在另一優(yōu)選例中，所述第一培養(yǎng)皿為Falcon 353037培養(yǎng)皿、康寧公司的430166培養(yǎng)皿或塞默飛公司的150288培養(yǎng)皿。
[〇〇27]在另一優(yōu)選例中，所述第一培養(yǎng)皿為任意的市售的經(jīng)標準細胞培養(yǎng)表面處理的細胞培養(yǎng)皿。可以是任何其它公司出售的，也可以是任何形狀或尺寸的。
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述透明質(zhì)酸酶可從任何細胞培養(yǎng)試劑供應商購得。
[〇〇29] 在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，所述處理的時間為10-60秒;較佳地，為20-40秒。 [〇〇3〇]在另一優(yōu)選例中，所述第二培養(yǎng)液的成分與第一培養(yǎng)液相同，區(qū)別僅在于第二培養(yǎng)液不含有蛋白。
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述第二培養(yǎng)液為M-IM培養(yǎng)液。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述第二培養(yǎng)皿為Falcon 351006培養(yǎng)皿、康寧公司的430589培養(yǎng)皿或塞默飛公司的150340培養(yǎng)皿。
[〇〇33]在另一優(yōu)選例中，所述第二培養(yǎng)皿為任意的市售的未經(jīng)表面處理的細胞表面膜。 可以是任何其它公司出售的，也可以是任何形狀或尺寸的。
[〇〇34]在另一優(yōu)選例中，所述第三培養(yǎng)液的成分與第一培養(yǎng)液相同，區(qū)別僅在于第三培養(yǎng)液不含緩沖成分HEPES。
[〇〇35]在另一優(yōu)選例中，所述第三培養(yǎng)液可參照Quinn等人于1984年公開發(fā)表(《生育與不孕》（Fertil Steril ·) 1984;41:202或 1985;44:493 ·)的文獻制備。
[〇〇36]所述第三培養(yǎng)液與第一培養(yǎng)液的區(qū)別在于其中沒有緩沖成份(HEPES)，所以必須在5 %二氧化碳環(huán)境(二氧化碳培養(yǎng)箱中）下使用。
[〇〇37] 該培養(yǎng)液可從各商業(yè)公司（如，SAGE media)購買，也可以自行配制。
[〇〇38]在另一優(yōu)選例中，所述第三培養(yǎng)液為GM培養(yǎng)液。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述顆粒細胞和/或多余精子從卵子或受精卵表面脫離后附于培養(yǎng)皿底部表面。
[0040] 應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例）中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【附圖說明】
[0041] 圖1顯示了剛從母體中取出的未經(jīng)處理的卵子，表面附著有大量顆粒細胞。
[0042] 圖2顯示了經(jīng)步驟3清洗處理過的卵子，其表面顆粒細胞附著明顯減少，但仍有顆粒細胞附著。
[〇〇43]圖3顯示了操作過程中顆粒細胞脫離卵子，附著于培養(yǎng)皿底。
[〇〇44]圖4顯示了經(jīng)步驟3和步驟4清洗處理過的卵子，其表面顆粒細胞被徹底清除。
[〇〇45]圖5顯示了兩個卵子透明帶上附著的顆粒細胞被徹底清除。
[〇〇46]圖6顯示了處理后的兩個卵子表面仍有顆粒細胞殘留。
【具體實施方式】
[0047] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外發(fā)現(xiàn)了一種徹底清洗卵子或受精卵表面的方法。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0048] 本文中所提及的蛋白為血清蛋白。
[0049] 清洗卵子或受精卵表面的方法
[0050] 本發(fā)明提供了一種清洗卵子或受精卵表面的方法，所述方法包括步驟：
[0051] (1)將未經(jīng)處理的卵子或未經(jīng)處理的受精卵置于第一培養(yǎng)皿中，其中，所述第一培養(yǎng)皿經(jīng)標準細胞培養(yǎng)表面處理且含有第一培養(yǎng)液，所述第一培養(yǎng)液含蛋白；
[0052] 然后加入透明質(zhì)酸酶(可從任何細胞培養(yǎng)試劑供應商購得)處理所述卵子或受精
卵一段時間（如10-60秒;較佳地，為20-40秒），從而得到經(jīng)第一次處理的卵子或受精卵； [〇〇53] (2)將經(jīng)第一次處理的卵子或受精卵移入第二培養(yǎng)皿中，其中，所述第二培養(yǎng)皿未
經(jīng)表面處理且含有第二培養(yǎng)液，所述第二培養(yǎng)液不含蛋白；
[0054] 然后用帶有第三培養(yǎng)液的棒狀工具撥動所述卵子或受精卵，其中，所述第三培養(yǎng)液含蛋白；使顆粒細胞和/或多余精子脫離卵子或受精卵表面，從而被徹底清除干凈。
[0055] 其中，所述顆粒細胞和/或多余精子從卵子或受精卵表面脫離后附于培養(yǎng)皿底部表面。
[0056] 所述棒狀工具為棒或棍類似工具。所述棒狀工具可以為玻璃的、塑料的等任何適合的材料制成的。所述帶有第三培養(yǎng)液的棒狀工具是指棒狀工具上蘸有第三培養(yǎng)液。
[〇〇57] 未經(jīng)處理的卵子或未經(jīng)處理的受精卵
[〇〇58] 所述未經(jīng)處理的卵子可以是從母體取出2-3小時后的卵子。
[0059]所述未經(jīng)處理的受精卵可以是在體外受精4小時或16-20小時后的受精卵。
[0000]第一培養(yǎng)液
[0061 ]所述第一培養(yǎng)液模擬人輸卵管液的成分，且用HEPES做緩沖成份。該培養(yǎng)液用 HEPES做緩沖成份，在空氣中可較長時間地保持pH值的穩(wěn)定性。培養(yǎng)時無需二氧化碳氣體環(huán)境。
[〇〇62] 所述第一培養(yǎng)液可參照Quinn等人于1984年公開發(fā)表（《生育與不孕》（Fertil
Steri 1.) 1984; 41: 202或1985;44:493.)的文獻制備。也可從各商業(yè)公司（如，SAGE media) 購買。
[0063] 在另一優(yōu)選例中，所述第一培養(yǎng)液為IM培養(yǎng)液。
[0064] 第一培養(yǎng)皿
[〇〇65]所述第一培養(yǎng)皿為任意的市售的經(jīng)標準細胞培養(yǎng)表面處理的細胞培養(yǎng)皿?？梢允侨魏纹渌境鍪鄣?，也可以是任何形狀或尺寸的。
[〇〇66] 在另一優(yōu)選例中，所述第一培養(yǎng)皿為Falcon 353037培養(yǎng)皿、康寧公司的430166培
養(yǎng)皿或塞默飛公司的150288培養(yǎng)皿。
[〇〇67]第二培養(yǎng)液
[0068] 所述第二培養(yǎng)液的成分與第一培養(yǎng)液相同，區(qū)別僅在于第二培養(yǎng)液不含有蛋白。
[0069] 在另一優(yōu)選例中，所述第二培養(yǎng)液為M-IM培養(yǎng)液。
[0070] 第二培養(yǎng)皿
[0071] 所述第二培養(yǎng)皿為任意的市售的未經(jīng)表面處理的細胞表面膜?？梢允侨魏纹渌境鍪鄣?，也可以是任何形狀或尺寸的。
[〇〇72] 在另一優(yōu)選例中，所述第二培養(yǎng)皿為Falcon 351006培養(yǎng)皿、康寧公司的430589培
養(yǎng)皿或塞默飛公司的150340培養(yǎng)皿。
[〇〇73] 第三培養(yǎng)液
[〇〇74]所述第三培養(yǎng)液的成分與第一培養(yǎng)液相同，區(qū)別僅在于第三培養(yǎng)液不含緩沖成分 HEPES。所述第三培養(yǎng)液與第一培養(yǎng)液的區(qū)別在于其中沒有緩沖成份(HEPES )，所以必須在 5 %二氧化碳環(huán)境(二氧化碳培養(yǎng)箱中）下使用。
[〇〇75]在另一優(yōu)選例中，所述第三培養(yǎng)液可參照Quinn等人于1984年公開發(fā)表(《生育與不孕》(Ferti 1 Steri 1.) 1984; 41:202或1985; 44:493.)的文獻制備或可從各商業(yè)公司（如， SAGE media)購買。
[0076]在另一優(yōu)選例中，所述第三培養(yǎng)液為GM培養(yǎng)液。
[〇〇77]本發(fā)明技術(shù)方案的有益效果是：
[0078] 1.徹底清除卵子(或受精卵）表面的顆粒細胞，避免了試管嬰兒（IVF及ICSI)過程中NICS檢測可能遭受的顆粒細胞和/或多余精子污染。
[0079] 2.避免了胚胎透明帶剝除的操作，簡化了技術(shù)操作步驟，避免了透明帶剝除操作可能帶來的胚胎損傷風險。
[0080] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0081] 實施例1.
[〇〇82] 一、試劑和耗材
[0083] 1.試劑
[0084] 1.1含80U/ml的透明質(zhì)酸酶的HEPES-HTF培養(yǎng)液（Hyaluronidase 80U/ml in HEPES-HTF)(規(guī)格：SAGE，產(chǎn)品號:ART4007-A)
[0085] 1 · 2 M-IM培養(yǎng)液：Quinn，s Advantage含HEPES培養(yǎng)液（Quinn，s Advantage Medium with HEPES)(規(guī)格：SAGE，產(chǎn)品號：ART-l〇23)
[0086] 1 · 3 IM培養(yǎng)液：Quinn ’ s Advantage加蛋白受精培養(yǎng)液（Quinn ’ s AdvantageTM Protein Plus Fertilization(TIF)Medium)(規(guī)格：SAGE，產(chǎn)品號：ART_1520)
[0087] 1 · 4 GM培養(yǎng)液：Quinn ’ s Advantage加蛋白卵裂培養(yǎng)液（Quinn ’ s Advantage Protein Plus Cleavage Medium)(規(guī)格：SAGE，產(chǎn)品號：ART_1526)
[0088] 2.耗材
[0089] 2.1 Falcon 351006培養(yǎng)皿
[0090] 2.2 Falcon 363037培養(yǎng)皿
[0091] 2.3巴斯德吸管
[0092] 3.操作時機
[0093] ICSI的卵子清除顆粒細胞處理是在取卵后2 — 3小時。
[0094] 剛從母體中取出的未經(jīng)處理的卵子，表面附著有大量顆粒細胞，如圖1所示。
[〇〇95] 4.操作程序：
[〇〇96] 4.1在卵子清洗前，準備好剝卵用吸管（100-120μπι)，移卵用吸管（180-200μπι)及一
根末端燒圓的小玻棒。
[0097] 4.2
[〇〇98] 在1個Falcon 353037(聚苯乙烯材質(zhì)，標準細胞培養(yǎng)表面處理)培養(yǎng)皿中加入lml 頂培養(yǎng)液(ART-1520);
[0099] 1個Falcon 351006(聚苯乙烯材質(zhì)，無處理)培養(yǎng)皿中加入2ml不含蛋白的M-IM培養(yǎng)液(ART-1023)。
[0100] 4.3把從母體中取出的未經(jīng)處理的卵子先放入含有頂培養(yǎng)液(ART-1520)的Falcon 353037培養(yǎng)皿中，再加入lml 80U/ml的透明質(zhì)酸酶的HEPES-HTF培養(yǎng)液，反復吹吸，持續(xù)30 秒。在這一步驟中，因培養(yǎng)液中含有帶負電的蛋白質(zhì)，中和了顆粒細胞表面的正電荷。同時， 聚苯乙烯材質(zhì)的培養(yǎng)皿經(jīng)細胞培養(yǎng)表面處理后，其表面成親水的電荷中性狀態(tài)。因此，卵子與其表面附著的顆粒細胞會懸浮在液體培養(yǎng)液中。透明質(zhì)酸酶的消化作用弱化了顆粒細胞與卵子之間的粘附作用。在吹打的沖洗作用下，部分顆粒細胞即可脫離與卵子的附著。
[0101] 經(jīng)上述步驟3清洗處理過的卵子，其表面顆粒細胞附著明顯減少，但仍有顆粒細胞附著。如圖2所示。
[0102] 4.4將表面粘附有剩余顆粒細胞的卵子移入含有不含血清蛋白的M-IM培養(yǎng)液 (ART-1023)的Falcon 351006培養(yǎng)皿中。此時，因培養(yǎng)液中不存在蛋白質(zhì)的負電中和作用， 顆粒細胞帶有正電荷。同時，F(xiàn)alcon 351006培養(yǎng)皿為未經(jīng)處理聚苯乙烯材質(zhì)，其表面為疏水的負電狀態(tài)。因此，卵子與其表面附著的顆粒細胞就會粘附于培養(yǎng)皿底部表面(如圖3所示）。此時，用蘸過含蛋白GM培養(yǎng)液(ART-1526)的玻璃小棒(含蛋白培養(yǎng)液的作用是中和玻璃棒表面的負電荷，避免細胞黏附于玻璃棒上)不斷撥動卵子，使卵子在培養(yǎng)皿底部表面滾動。在滾動過程中，卵子表面的剩余顆粒細胞就會粘附于培養(yǎng)皿底部表面與卵子脫離，持續(xù)推動卵子滾動，直至其表面的顆粒細胞被徹底清除干凈。
[0103] 經(jīng)上述步驟3和4清洗處理過的卵子，其表面顆粒細胞被徹底清除，如圖4所示。
[0104] 4.5去除完顆粒細胞后，用吸管(先吸一點含蛋白的培養(yǎng)液)把卵子轉(zhuǎn)移到GM培養(yǎng)液中，放入37°C，5%C02，5%02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隨后即可進入常規(guī)的單精子注射(ICSI)、胚胎體外培養(yǎng)(IVF及ICSI)和NICS檢測流程。
[0105] 實施例2
[0106] 采用實施例1的方法，不同之處在于用受精卵代替卵子。而IVF清除受精卵表面顆粒細胞和多余精子的處理時間是在加精4小時(短時受精)或16 — 20小時(常規(guī)受精)之后。
[0107] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IVF受精卵表面的顆粒細胞和多余精子可以被徹底清除。
[〇1〇8] 實施例3
[0109] 采用實施例1的方法，不同之處在于使用康寧公司的培養(yǎng)皿，并根據(jù)文獻(Fertil Steri 1.1984;41:202，1985;44:493.)中的配方自制培養(yǎng)液。
[0110] 用含人血清白蛋白及HEPES的HTF培養(yǎng)液(根據(jù)文獻自配)和經(jīng)標準細胞培養(yǎng)表面處理的培養(yǎng)皿（購自：康寧；產(chǎn)品號：430166)代替含lml IM培養(yǎng)液(ART-1520)的Falcon 353037(聚苯乙烯材質(zhì)，標準細胞培養(yǎng)表面處理)培養(yǎng)皿；
用不含蛋白，但含有HEPES的HTF培養(yǎng)液(根據(jù)文獻自配)和未經(jīng)表面處理的培養(yǎng)皿 (購自：康寧；產(chǎn)品號：430589)代替含2ml不含蛋白的M-IM培養(yǎng)液(ART-1023)的Falcon 351006(聚苯乙烯材質(zhì)，無處理)培養(yǎng)皿。
[0112] 結(jié)果表明：兩個卵子透明帶上附著的顆粒細胞被徹底清除，如圖5所示。
[0113] 對比例1
[0114] 采用實施例1的方法，不同之處在于在步驟4.4中用頂培養(yǎng)液代替了不含蛋白的M-IM培養(yǎng)液。
[0115] 結(jié)果導致顆粒細胞與培養(yǎng)皿底粘附不牢，無法從卵子表面脫離。處理后的兩個卵子表面仍有顆粒細胞殘留，如圖6所示。
[0116] 本發(fā)明的優(yōu)點是在對卵子、受精卵或胚胎不產(chǎn)生任何損傷，不觸動透明帶的情況下提供了一種徹底清除卵子表面顆粒細胞和/或多余精子的方法。其要點在于利用細胞表面、培養(yǎng)液成份(蛋白質(zhì)）和細胞培養(yǎng)皿底部表面的電荷關(guān)系將顆粒細胞和/或多余精子從卵子(或受精卵)表面粘除。
[0117]在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種清洗卵子或受精卵表面的方法，其特征在于，包括步驟： (1) 將未經(jīng)處理的卵子或未經(jīng)處理的受精卵置于第一培養(yǎng)皿中，其中，所述第一培養(yǎng)皿 經(jīng)標準細胞培養(yǎng)表面處理且含有第一培養(yǎng)液，所述第一培養(yǎng)液含蛋白； 然后加入透明質(zhì)酸酶處理所述卵子或受精卵，從而得到經(jīng)第一次處理的卵子或受精 卵； (2) 將經(jīng)第一次處理的卵子或受精卵移入第二培養(yǎng)皿中，其中，所述第二培養(yǎng)皿未經(jīng)表 面處理且含有第二培養(yǎng)液，所述第二培養(yǎng)液不含蛋白； 然后用帶有第三培養(yǎng)液的棒狀工具撥動所述卵子或受精卵，其中，所述第三培養(yǎng)液含 蛋白；使顆粒細胞和/或多余精子脫離卵子或受精卵表面，從而被徹底清除干凈。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述未經(jīng)處理的卵子是從母體取出2-3小時 后的卵子。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述未經(jīng)處理的受精卵是在體外受精4小時 或16-20小時后的受精卵。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培養(yǎng)液模擬人輸卵管液的成分，且 用HEPES做緩沖成份。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培養(yǎng)皿為Falcon 353037培養(yǎng)皿、康 寧公司的430166培養(yǎng)皿或塞默飛公司的150288培養(yǎng)皿。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述處理的時間為10-60秒。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二培養(yǎng)液的成分與第一培養(yǎng)液相同， 區(qū)別僅在于第二培養(yǎng)液不含有蛋白。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二培養(yǎng)皿為Falcon 351006培養(yǎng)皿、康 寧公司的430589培養(yǎng)皿或塞默飛公司的150340培養(yǎng)皿。9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三培養(yǎng)液的成分與第一培養(yǎng)液相同， 區(qū)別僅在于第三培養(yǎng)液不含緩沖成分HEPES。10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述顆粒細胞和/或多余精子從卵子或受精 卵表面脫離后附于培養(yǎng)皿底部表面。
【文檔編號】C12N5/075GK105950546SQ201610584345
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月22日
【發(fā)明人】蔡立義, 陸思嘉
【申請人】上海序康醫(yī)療科技有限公司