一種具有轉(zhuǎn)糖苷活性耐熱β-半乳糖苷酶突變體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)糖苷活性耐熱β?半乳糖苷酶突變體，該突變體是通過對β?半乳糖苷酶BgaB催化氨基酸位點(diǎn)E303由原谷氨酸(Glu)定點(diǎn)突變?yōu)榘腚装彼?Cys)，再將半胱氨酸巰基氧化為?SOO?所得。本發(fā)明還設(shè)計所述突變體的制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明以嗜熱脂肪芽孢桿菌來源β?半乳糖苷酶BgaB為對象，采用定點(diǎn)突變體與化學(xué)修飾結(jié)合的方法，顯著加快了轉(zhuǎn)糖苷活性的功能進(jìn)化效率，并提高了低聚半乳糖的合成量，實(shí)現(xiàn)在中溫、中性環(huán)境下的低聚半乳糖合成量由野生型酶的0％提高到11.5％，突破了現(xiàn)有技術(shù)中需要在酸性環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)的局限，同時避免了在低聚半乳糖合成的同時發(fā)生底物或產(chǎn)物的水解。
【專利說明】一種具有轉(zhuǎn)糖苷活性耐熱β-半乳糖苷酶突變體及其制備方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種具有轉(zhuǎn)糖苷活性耐熱β-半 乳糖苷酶突變體，還涉及一種具有轉(zhuǎn)糖苷活性耐熱β-半乳糖苷酶突變體的制備方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 0-半乳糖苷酶（0-〖3]^〇1:〇8 1(^86)全稱為0-〇-半乳糖苷半乳糖水解酶（0-〇- galactoside galacto hydrolase，EC3.2.1.23)，具有催化乳糖水解和轉(zhuǎn)糖苷兩種功能。食 品工業(yè)多以乳糖作為底物，通過β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷作用制備低聚半乳糖(G0S)。本發(fā)明 所涉及嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的β-半乳糖苷酶BgaB屬于GH42家族，是一種具有工業(yè)應(yīng)用潛 力的耐熱型酶，可以在較高溫度溶解高濃度反應(yīng)底物乳糖，進(jìn)行乳糖水解與轉(zhuǎn)糖苷催化反 應(yīng)。但是，由于β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷活性較弱，特別是GH42家族β-半乳糖苷酶，由于進(jìn)化過 程中以乳糖作為碳源進(jìn)行代謝的機(jī)會較少，因而對乳糖利用能力普遍較低;另外，β-半乳糖 苷酶在催化底物合成低聚半乳糖的同時也會催化底物及產(chǎn)物水解反應(yīng)。半乳糖苷酶的這 種催化特點(diǎn)，嚴(yán)重制約了低聚半乳糖合成量，并成為阻礙低聚半乳糖產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的主要技 術(shù)瓶頸問題。
[0003] 近年來，雖然人們也對β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷活性進(jìn)行了基礎(chǔ)理論研究和功能改 造，但對G 0 S合成能力的分子改良方法還存在許多不足。如，中國發(fā)明專利申請C Ν 201410148999公開了一種半乳糖苷酶突變體。該突變體是通過對亮白曲霉或米曲霉β-半乳 糖苷酶基因進(jìn)行點(diǎn)飽和突變制得。由于亮白曲霉或米曲霉來源半乳糖苷酶為適酸性半 乳糖苷酶，其最適pH在ρΗ2.5~5.5，這一催化特性一定程度上限制了其作為催化劑在高溫 及中性條件下合成低聚半乳糖;另外，在突變體的基因改造及制備方法方面，該突變體酶的 獲得是通過同源建模及底物對接的方法，對可能具有催化功能的位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，并對這些 預(yù)測位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變。因此，其功能優(yōu)化突變體還需要通過對上百個突變體的酶活性進(jìn) 行篩選與活性分析后才能獲得。這種方法的主要缺陷為，突變體的成功獲得需要依靠生物 信息學(xué)及預(yù)測算法的準(zhǔn)確性，同時還需要配合高靈敏度較高的高通量篩選方法。不僅操作 繁雜而且成功率相對較低，另外，在該方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)糖苷活性的改造時，由于篩選的單向 性，不能有效的兼顧水解活性對轉(zhuǎn)糖催化效率的影響作用，導(dǎo)致篩選所得轉(zhuǎn)糖苷活性提高 突變體存在水解活性同時提高的現(xiàn)象。
[0004] 對于β-半乳糖苷酶，隨著對其結(jié)構(gòu)與功能研究的不斷發(fā)展，已知β-半乳糖苷酶氨 基酸序列數(shù)目已達(dá)上千個，分屬于糖苷水解酶GH1、GH2、GH35、GH42、GH50和GH59家族。特別 是GH42家族酶，多具有耐熱、耐酸等適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)需要的酶學(xué)特性，從而越來越受到人們 的關(guān)注。從2002年GH42家第一個三維結(jié)構(gòu)被解析開始，發(fā)展到現(xiàn)在已有4個晶體結(jié)構(gòu)被陸續(xù) 發(fā)表。
【申請人】圍繞BgaB功能位點(diǎn)開展了多年的研究，并在發(fā)明CN 201110170088.8中對BgaB 的突變體的催化氨基酸位點(diǎn)的進(jìn)行過推測，在本項(xiàng)發(fā)明中第一次通過試驗(yàn)確認(rèn)氨基酸位點(diǎn) E303為催化氨基酸位點(diǎn)。
[0005] 已有研究證明，親核氨基酸在酶結(jié)構(gòu)中的位置及類型對酶的催化活性至關(guān)重要。 如2010年0&1'代11￥.&3〇1<:13111'11等人米用同樣方法對0611111〇1]1〇11&8；1^111；[來源纖維素酶0611八 的兩個推測催化位點(diǎn)Asp392和Asp216進(jìn)行半胱氨酸替換和化學(xué)修飾。研究結(jié)果表明， Asp216并不是催化堿，同時也確認(rèn)了 Asp392的催化堿作用。類似的方法對Thermobif ida fusca來源保持型水解酶Cel5A的催化氨基酸位點(diǎn)Asp252進(jìn)行改造和化學(xué)修飾，沒有得到具 有活性的酶。以上研究結(jié)論共同表明，無論是保持型還是反轉(zhuǎn)型催化機(jī)制水解酶，通過對催 化殘基進(jìn)行半胱氨酸替換及巰基氧化，可以改變酶的催化活性，包括提高轉(zhuǎn)糖苷活性。但同 時，也并不是所有推測催化位點(diǎn)均具有以上催化作用，還需要對催化氨基酸進(jìn)行確認(rèn)。同時 該方法僅應(yīng)用于少數(shù)水解酶的功能改造及研究中，對其他水解酶的催化改變是否具有作用 均未有驗(yàn)證。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006] 基于以上研究背景，針對本領(lǐng)域基因改造理論問題及G0S合成中存在的實(shí)際技術(shù) 難題，本發(fā)明以GH42家族嗜熱脂肪芽孢桿菌來源耐熱β-半乳糖苷酶BgaB為研究對象，期望 將定點(diǎn)突變與化學(xué)修飾相結(jié)合的基因改造方法應(yīng)用于半乳糖苷酶的功能改造中，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn) 糖苷活性的高效定向改造。在本發(fā)明中，先通過試驗(yàn)確認(rèn)氨基酸位點(diǎn)Ε303為催化氨基酸位 點(diǎn)，為半乳糖苷酶的基因工程改造與應(yīng)用提供理論支持，再通過半乳糖苷酶功能進(jìn)化 方法獲得具有高轉(zhuǎn)糖苷活性β-半乳糖苷酶突變體。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)糖苷活性耐熱β-半乳糖苷酶突變體，該突 變體是通過對β-半乳糖苷酶BgaB催化氨基酸位點(diǎn)Ε303由原谷氨酸(Glu)定點(diǎn)突變?yōu)榘腚装?酸(Cys)，再將半胱氨酸巰基氧化為-S0(T所得。
[0008] 在本發(fā)明中，所述β-半乳糖苷酶BgaB是嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的耐熱β-半乳糖苷 酶BgaB。
[0009] 本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)糖苷活性耐熱β-半乳糖苷酶突變體的制備方法，其特征在于 該制備方法的步驟如下：
[0010] Α、突變體酶的構(gòu)建
[0011]以含有嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的耐熱半乳糖苷酶基因 BgaB的質(zhì)粒ρΚΚ223-3-bgaB為模板，以快速全質(zhì)粒擴(kuò)增突變法對位點(diǎn)E303構(gòu)建半胱氨酸Cys替換單點(diǎn)突變體，得到 突變體E303C;
[0012] B、突變體酶的表達(dá)與純化
[0013]將全質(zhì)粒擴(kuò)增得到的突變PCR片段經(jīng)膠回收及雙酶切后，與pKK223-3載體的雙酶 切產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞（由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種庫 Culture Collection of Food Microorganisms , Jiangnan University CCFM提供）；挑取 重組菌單克隆接種于5mL LB抗性培養(yǎng)基中，37°C下培養(yǎng)過夜，按以體積比計1%接種量將種 子液接種于含有氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)，當(dāng)0D6QQ達(dá)到0.6~1.0時，加 入誘導(dǎo)劑IPTG，20°C過夜誘導(dǎo)表達(dá)后，對發(fā)酵液進(jìn)行離心，去上清、收集菌體，再以5~10倍 體積磷酸緩沖液重懸，加入蛋白酶抑制劑后進(jìn)行超聲波破壁，得到破胞液;將破胞液進(jìn)行熱 處理去除不耐熱的雜蛋白后，離心收集上清液，得到粗酶液；
[0014]將上述粗酶液用鎳親和柱純化分離后收集洗脫液，然后用50mM pH 7.0磷酸緩沖 液透析去除咪唑，再用聚乙二醇包埋濃縮制得未經(jīng)氧化的突變體酶；
[0015] C、突變體酶的氧化
[0016] 將步驟B得到的未經(jīng)氧化的突變體酶進(jìn)行氧化反應(yīng)，氧化反應(yīng)體系如下：100yL 0.25M pH6.5磷酸鹽緩沖溶液、0~300mM ΚΙ溶液、ΙΟμΜ Br、3yM突變體酶，在溫度25°C條件 下處理30h，得到所述轉(zhuǎn)糖苷活性耐熱β-半乳糖苷酶突變體。
[0017] 在本發(fā)明中，步驟Α中，全質(zhì)粒擴(kuò)展產(chǎn)物可直接用于轉(zhuǎn)化表達(dá)，然而，優(yōu)選地進(jìn)行基 因構(gòu)建可以防止載體發(fā)生突變干擾正常表達(dá)。
[0018] 在本發(fā)明中，步驟A中PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2min;95°C變性30s;63°C~65°C 30s ;68°C7min，進(jìn)行16個循環(huán)，最后68°C延伸15min;
[0019] ?〇?反應(yīng)體系為：(1町？8(2111]\〇541^、10\1(00?1118 81^.541^、1(00?1118 141^、]\%5〇4 2 yL、上游引物1.5yL、下游引物1.5yL、模板lyL、去離子水33yL，總體積50yL。其中，引物序列 如下所示，
[0020] E303C上游引物：
[0021 ] 5 ' -GTCAACCGTTTATTTTGATGTGCCAGGTAACCTCACATGTTAA-3 ' E303C 下游引物：
[0022] 5 '-TTAACATGTGAGGTTACCTGGCACATCAAAATAAACGGTTGAC-3，
[0023]根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，步驟B中超聲波破壁的工作條件為：功率400W循環(huán)工 作，每個循環(huán)包括工作Is和停止9s，總破壁時間為30min。
[0024] 優(yōu)選地，步驟B中，用鎳親和柱純化分離后收集洗脫液的過程如下：向4mL鎳親和柱 加入5倍柱體積去離子水至柱頂端自然洗脫后用2~3倍體積的Binding buffer自然洗脫； 再將經(jīng)0.22μπι濾膜過濾的粗酶液上柱，慢流使樣品與柱充分結(jié)合，待樣品流干后分別用6倍 柱體積的Washing buffer連續(xù)梯度洗脫(共3次)洗脫雜蛋白質(zhì)，最后用4倍Elution buffer 洗脫目的蛋白，收集洗脫液；
[0025] 所述Binding buffer含20mM咪唑；所述Washing buffer分別含咪唑20mM、80mM、 100mM;所述Elution buffer含250mM咪挫。
[0026] 根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，步驟C中ΚΙ溶液為200-300mM，即突變體氧化反應(yīng)體系 組成濃度為0.25M pH6.5磷酸鹽緩沖溶液100yL、0.2-0.3M KI溶液、10μΜ Br、3yM突變體酶。
[0027] 本發(fā)明還涉及上述轉(zhuǎn)糖苷活性耐熱β-半乳糖苷酶突變體在生產(chǎn)低聚半乳糖中的 用途。
[0028]研究結(jié)果表明，β-半乳糖苷酶的氨基酸位點(diǎn)Glul48和Glu303為催化活性位點(diǎn)。其 中，將Ε303位點(diǎn)通過半胱氨酸替換，并采用200-300mM ΚΙ對突變體酶進(jìn)行氧化處理，將半胱 氨酸巰基氧化為_S0(T，可將野生型酶在乳糖初始濃度為350mM，55°C，30h下低聚半乳糖合 成量由0%提高到11.5%，顯著提高轉(zhuǎn)糖苷催化活性，增加了產(chǎn)物G0S合成量。
[0029] 針對目前基于半理性分子設(shè)計對酶進(jìn)行功能改造這種方法中存在的不足，本發(fā)明 以嗜熱脂肪芽孢桿菌來源半乳糖苷酶BgaB為對象，采用定點(diǎn)突變體與化學(xué)修飾結(jié)合的方 法，無需依靠氨基酸位點(diǎn)功能預(yù)測、省去了突變體庫高通量功能篩選的繁雜過程，顯著加快 了轉(zhuǎn)糖苷活性的功能進(jìn)化效率，并提高了低聚半乳糖的合成量，實(shí)現(xiàn)在中溫、中性環(huán)境下的 低聚半乳糖合成量由野生型酶的〇%提高到11.5%，突破了現(xiàn)有技術(shù)中需要在酸性環(huán)境下 進(jìn)行反應(yīng)的局限，同時避免了在低聚半乳糖合成的同時發(fā)生底物或產(chǎn)物的水解。
[0030] 本發(fā)明基于催化氨基酸位點(diǎn)的構(gòu)建方法適用于所有采用保持型(Retaining)催化 機(jī)制β-半乳糖苷酶進(jìn)行轉(zhuǎn)糖苷活性改造。 【【附圖說明】】
[0031]圖1半乳糖分子與β-半乳糖苷酶BgaB活性口袋結(jié)合模型；
[0032]圖2野生性及突變酶的蛋白質(zhì)凝膠電泳圖（SDS-PAGE);
[0033] 其中，WT表示野生型β-半乳糖苷酶，泳道1為E303A，泳道2為E303C
[0034] 圖3 ΚΙ氧化處理對E303C突變體活性的影響；
[0035] 其中:Α.ΚΙ濃度對突變體酶活的影響;Β.氧化時間對突變體酶活的影響
[0036] 圖4野生型及突變體酶反應(yīng)產(chǎn)物的薄層色譜圖（TLC);
[0037] 其中，
[0038]圖5野生型酶及0X-E303C突變體催化乳糖反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖譜；
[0039]其中，Α.野生型酶催化乳糖水解產(chǎn)物;B. 0X-E303C突變體催化乳糖水解產(chǎn)物;C、初 始底物。 【【具體實(shí)施方式】】
[0040]在本發(fā)明中如無特別聲明，用于表示濃度的"％"均為重量百分比。
[0041 ] 實(shí)施例1
[0042] 1.E303C突變體的構(gòu)建
[0043]通過對BgaB進(jìn)行分子模擬及半乳糖、乳糖分子與酶的對接，預(yù)測了 β-半乳糖苷酶 催化關(guān)鍵位點(diǎn)及參與底物結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)為Glul48和Glu303(如圖1)。其中，根據(jù)序 列比對Glu303為親核(Nucleophile)氨基酸的同源位點(diǎn)。在保持型和反轉(zhuǎn)型催化機(jī)制水解 酶中，催化殘基對酶的活性起到關(guān)鍵作用。由此，推測Glu303位點(diǎn)可能對β-半乳糖酶BgaB催 化活性具有調(diào)控作用，因此將Glu303氨基酸位點(diǎn)作為研究和改造目標(biāo)位點(diǎn)。
[0044] 對此，以含有嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的耐熱β-半乳糖苷酶基因 bgab的質(zhì)粒 pKK223-3-bgaB為模板(該質(zhì)粒由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種庫(Culture Collection of Food Microorganisms Jiangnan University CCFM)提供，或參考中國發(fā)明專利申請 CN 102250856A，或參見文獻(xiàn)Dong YN等人，Enhancement of the hydrolysis activity of beta-galactosidase from Geobacillus stearothermophilus by saturation mutagenesis . JDairy Sci 2011,94(3):1176-1184)，采用快速全質(zhì)粒擴(kuò)增突變法（ QuickChange:⑩site-directed mutagenesis protocol)針對選擇位點(diǎn)構(gòu)建Cys和Ala替 換單點(diǎn)突變體，分別構(gòu)建了單點(diǎn)突變體E303C和E303A。引物設(shè)計如表1所示。
[0045] 表丨定點(diǎn)突變引物核酸序列
[0047]突變PCR反應(yīng)體系組成如表2所示：
[0048] PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性2min; 95°C變性30s;63°C~65°C，30s;68°C7min，16個 循環(huán)，最后68°C延伸15min。
[0049] 表2突變PCR反應(yīng)體系
[0051]通過序列與結(jié)構(gòu)比對推測得知E303位點(diǎn)的催化作用，因此E303A突變體可作為 E303C的對照，是以無側(cè)鏈基團(tuán)的Ala氨基酸替換E303位點(diǎn)所得，相當(dāng)于E303位點(diǎn)缺失突變 體。因此，E303A突變體活性變化可用于驗(yàn)證E303位點(diǎn)的催化關(guān)鍵點(diǎn)作用。
[0052] 2.突變體的表達(dá)與純化
[0053]擴(kuò)增得到的PCR片段經(jīng)回收后，與pKK223-3載體連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài) 細(xì)胞（由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種庫Culture Collection of Food Microorganisms,Jiangnan University CCFM提供）。
[0054]嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的野生型β_半乳糖苷酶及突變體酶的C-端均融合有6 X His標(biāo)簽用于純化。分別挑選含有野生型β-半乳糖苷酶與突變體E303C和E303A的重組大腸 桿菌單克隆接種于5mL含有100yg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)過夜。 按1% (體積比）接種量將飽和種子液接種于200mL添加有氨芐青霉素（100yg/mL，購自上海 生工)的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)。當(dāng)0D6QQ達(dá)到0.6~1.0時，加入誘導(dǎo)劑IPTG (終濃度 達(dá)ImM)。20"€過夜誘導(dǎo)表達(dá)后，將發(fā)酵液于3000rpm下離心20min，去上清、收集菌體。用5~ 10倍體積lOOmM磷酸緩沖液(pH7.0)重懸，加入蛋白酶抑制劑（1 X Cocktai 1)后，采用VCX500 超聲波破碎儀(Sonics&Materials)超聲波破壁。破壁工作條件為:工作ls，停9s，總工作時 間為30min。將破胞液55°C熱處理30min去除不耐熱的雜蛋白后，采用5415R/5804R冷凍離心 機(jī)(Eppendorff) 12000rpm離心20min收集上清，分別得到野生型β-半乳糖苷酶及突變體酶 Ε303Α和E303C的粗酶液。
[0055] LB液體培養(yǎng)基配方:蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉 10g/L，余量為水。
[0056] LB抗性培養(yǎng)基:在LB培養(yǎng)基中加入氨卞青霉素至終濃度為100yg/mL，用于重組菌 的培養(yǎng)和篩選。
[0057] 將野生型、單點(diǎn)突變體酶E303A和E303C的粗酶液分別進(jìn)行鎳親和柱（Ni- Chelating Column，購自Qingen公司）純化：向4mL鎳親和柱加入5倍柱體積去離子水至柱頂 端自然洗脫后用2~3倍體積的Binding buffer(含咪唑濃度20mM)自然洗脫;再將經(jīng)0.22μπι 濾膜過濾的粗酶液上柱，慢流使樣品與柱充分結(jié)合，待樣品流干后分別用6倍柱體積的 Washing buffer(分別含咪唑濃度20mM、80mM、100mM)連續(xù)梯度洗脫洗脫雜蛋白質(zhì)，最后用4 倍Elution buffer(含250mM咪唑）洗脫目的蛋白，收集洗脫液。然后用50mM磷酸緩沖液(pH 7.0)透析除去咪唑，再用聚乙二醇包埋濃縮，分別制得純化的野生型β_半乳糖苷酶及突變 體酶蛋白Ε303Α和E303C樣品。
[0058]米用Basic 041BR蛋白質(zhì)電泳儀（Bio-Rad Laboratories)SDS_PAGE，經(jīng)Geldoc 2000凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)，顯示野生型及突變體酶均得到大小為70kDa 單一的蛋白條帶（如圖2所示）。表明突變體酶E303A和E303C的分子量相對野生型酶均并未 發(fā)生明顯改變。
[0059] 3.耐熱β-半乳糖苷酶比酶活測定
[0000] 按中性乳糖酶的酶活檢測方法Gist-Bracades法測定野生型耐熱β-半乳糖苷酶、 突變體酶Ε303Α和E303C的酶活并略有改動。
[0061 ]以O(shè)NPG(鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)為底物，一個中性乳糖酶單位定義為:在溫 度70°C、pH6.5條件下，每分鐘水解產(chǎn)生Ιμπιο?的oNP(鄰硝基苯酚)所需的酶量為一個中性乳 糖酶活性單位(NLU或U)。
[0062] 分別取0. lmL酶液和0.9mL磷酸鹽緩沖液(pH=6.5)加入10mL離心管中，混合，調(diào)溫 至70°C。加5. OmL 0.25%的oNPG，混勻，同時開始計時。反應(yīng)10min后迅速取出置于冰水浴中 并加入2.OmL 5%Na2C03終止反應(yīng)。室溫下用分光光度計(420nm，UV-2100可見分光光度計， 購自尤尼柯上海儀器有限公司）以空白值為參比測定樣品吸光度。
[0063] 空白值:將0 . lmL酶液、0.9mL磷酸鹽緩沖液(pH = 6.5)和2. OmL Na2C03混合后加 5 · OmL底物溶液，于420nm處測定吸光度。
[0064]按以下公式計算酶活：
[0066]其中：
[0067] E420-420nm處的吸光度值;Ew-0. lmL所用酶液含酶的重量(g) ;8-反應(yīng)總體積； 10一反應(yīng)時間(min);4.45-在實(shí)驗(yàn)條件下Ιμπιο? oNP/mL的吸光度值。
[0068] 4.蛋白質(zhì)含量測定
[0069] 采用BCA法測定野生型耐熱β-半乳糖苷酶、突變體酶E303A和E303C的蛋白質(zhì)含量。 BCA蛋白定量試劑盒購自北京莊盟生物基因科技有限公司。
[0070] 測定步驟如下：
[0071] (1)試劑Α:含1%BCA二鈉鹽、2%無水碳酸鈉、0.16%酒石酸鈉、0.4%氫氧化鈉、 0.95 %碳酸氫鈉，將上述液體混合后調(diào)pH至11.25。
[0072] (2)試劑B:4%硫酸銅。
[0073] (3)BCA工作液:試劑A 100mL+試劑B 2L，混合。
[0074] (4)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取150mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸餾水中，即為 1.5mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。反應(yīng)體系如3所示，
[0075]表3BCA法測定蛋白質(zhì)含量
[0077] (5)待測樣品
[0078] 將上述各管混勻后于37°C保溫30分鐘，用562nm波長比色測定吸光度值。以蛋白質(zhì) 含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用測定管光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相 應(yīng)的蛋白質(zhì)含量，再計算出待測樣品中蛋白質(zhì)濃度(g/L)。
[0079] 比較野生型耐熱β-半乳糖苷酶、突變體酶E303A和E303C的比酶活，結(jié)果如表4所 不。
[0080] 表4野生型及突變體酶以O(shè)NPG為底物的轉(zhuǎn)糖苷活性比較分析
[0082]結(jié)果表明，作為對照的突變體E303A未檢測到水解活性，而突變體E303C的比酶活 較野生型大幅降低，僅為野生型酶活的0.6%，這一試驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)了 E303在催化過程中具有 關(guān)鍵作用，與試驗(yàn)假設(shè)相符。
[0083] 5.E303C巰基側(cè)鏈的氧化
[0084]根據(jù)分子對接的預(yù)測結(jié)果，所有參與底物結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)中無半胱氨酸，因此 對E303C突變體進(jìn)行氧化，以研究其巰基氧化對酶活性的影響，并以野生型酶的氧化體作為 對照。
[0085] 為了獲得最佳氧化條件，選擇濃度范圍為0-300mM KI對E303C突變體及野生型酶 進(jìn)行氧化處理(反應(yīng)體系為l〇〇yL，含0.25M磷酸鹽緩沖溶液(pH6.5)，ΙΟμΜ Br，KI濃度為0-300mM，余量為水。分別向反應(yīng)體系中加入野生型和突變體酶3μΜ，25Γ處理），得到經(jīng)過氧化 的野生型和經(jīng)過氧化的E303C突變體0X-E303C。
[0086] ΚΙ濃度及處理時間對野生型及0X-E303C突變體酶活性影響如圖3所示。
[0087]結(jié)果表明，隨著ΚΙ濃度的增大，其對野生型酶(WT)活性的影響并不顯著，野生型酶 活保持在34.1-37.2U/mg。表明ΚΙ氧化處理對野生型酶的水解活性影響極弱。而巰基氧化突 變體0X-E303C酶活性隨KI濃度的增大而增加。當(dāng)KI濃度為200mM時，突變體酶活最高，達(dá)到 3.85U/mg;當(dāng)KI濃度繼續(xù)增大時，酶活略有降低，并維持不變。以上試驗(yàn)結(jié)果表明巰基氧化 能夠顯著降低突變體酶0X-E303C的水解活性，且200mM KI處理可以得到穩(wěn)定的酶活。因此， 選擇以200mM ΚΙ作為氧化處理濃度。
[0088] 由圖3Β可知，當(dāng)處理時間達(dá)到8天時，0x-E303C活性達(dá)到最大，為3.98U/mg。而在相 同處理?xiàng)l件下，野生型(WT)酶活隨處理時間的延長酶活變化不顯著。
[0089] 6.轉(zhuǎn)糖苷活性的定性分析
[0090] 為了對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，反應(yīng)混合物采用薄層色譜(TLC)進(jìn)行分離。在標(biāo)準(zhǔn) 反應(yīng)條件下，以乳糖為底物的反應(yīng)體系，乳糖濃度為350mM，酶用量150mM。取lh反應(yīng)混合產(chǎn) 物(4μ〇滴加在TLC平板上進(jìn)行薄層色譜分析。
[0091] 其中，薄層色譜(TLC)分析方法如下：
[0092] (1)制備顯色劑
[0093] 3，5-二羥基甲苯和硫酸：取0.25g的3，5-二羥基甲苯溶于400mL水中溶解，加入 10mL的濃硫酸，轉(zhuǎn)移到500mL的容量瓶中，水洗燒杯2-3次，把洗液倒入容量瓶中，定容備用。 [0094] 苯胺-二苯胺和磷酸:稱取4g二苯胺、4mL苯胺，量取20mL85 %磷酸共溶于200mL丙 酮中備用。
[0095]苯胺-二苯胺-丙酮:稱取4g二苯胺、4mL苯胺溶解于200mL丙酮中。
[0096] (2)制備展開劑
[0097]低聚半乳糖易溶于水，極性較大，本發(fā)明通過對展開劑進(jìn)行選擇及溶劑系統(tǒng)比例 優(yōu)化，獲得最優(yōu)展開系統(tǒng)為(體積比）正丁醇：乙醇:水=5:3:2。
[0098] (3)薄層條件
[0099]取20mL配制好的展開劑倒入放層析缸中，蓋上磨口玻璃蓋。取出硅膠預(yù)制板，利用 鉛筆和直尺在距離底部1厘米處劃一道直線，沿直線用毛細(xì)管點(diǎn)樣器點(diǎn)樣，點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑不 超過5厘米。將點(diǎn)好樣的硅膠板放入層析缸中，跑樣一個小時，跑樣結(jié)束后用吹風(fēng)機(jī)把硅膠 板吹干。用噴瓶將顯色劑以霧狀噴在硅膠板上，至整個板面均勻噴濕為止。隨后，將硅膠板 置于80°C的鼓風(fēng)干燥箱中烘干lOmin，拿出硅膠板觀察顯色情況。
[0100] 結(jié)果如圖4所示。
[0101] 圖4為野生型酶及突變體酶反應(yīng)產(chǎn)物的薄層色譜分析圖。其中，左1為對照，左2為 0X-E303C，左3為E303C，左4為野生型酶。由圖可知，只有突變體0X-E303C的反應(yīng)產(chǎn)物中出現(xiàn) 了轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物色斑，而突變體E303C和野生型酶產(chǎn)物在相應(yīng)位置均未出現(xiàn)產(chǎn)物色斑。試驗(yàn)結(jié) 果表明，0X-E303C突變體提高了野生型酶的轉(zhuǎn)糖苷催化能力。
[0102] 7.轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物的液相色譜分析(HPLC)
[0103]對前述的野生型酶和0X-E303C的轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物的定量比較分析，并與底物進(jìn)行對 比。以乳糖為底物的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)體系包括500mM乳糖和92mU酶。取30h反應(yīng)混合產(chǎn)物20μ L，采用95°C5min終止反應(yīng)。將反應(yīng)體系進(jìn)行梯度稀釋后，分別進(jìn)行高效液相色譜分析。
[0104] 色譜參考條件:柱溫35°C;流動相為乙腈-水(65+35，￥八）；流速1.〇111171^11;進(jìn)樣量 20yL〇
[0105] 圖5中各峰值面積數(shù)值如下：
[0106] A野生型酶產(chǎn)物的峰面積數(shù)值表
[0108] B OX-E303C產(chǎn)物的峰面積數(shù)值表
[0110] C底物的峰面積數(shù)值表
[0112] 由液相色譜結(jié)果可知，圖5A的野生型酶的反應(yīng)產(chǎn)物中，乳糖全部被水解為半乳糖 和葡萄糖，二者在液相中很難被完全分離，顯示為一個峰。
[0113] 而圖5B的0X-E303C催化反應(yīng)體系中，形成了新的產(chǎn)物峰，分子量大于單糖和雙糖。 其具體聚合度通過液相暫不能確定，但可以表明其應(yīng)為大于二糖的低聚糖，同時由于其水 解能力低于野生型酶，在體系中殘留了一部分乳糖。根據(jù)圖5B和圖5C液相色譜的產(chǎn)物峰面 積(722499)與初始底物樣品峰面積(83087)計算，得知G0S產(chǎn)物量為11.5 %。
[0114] 結(jié)果表明突變體0X-E303C可將野生型酶在乳糖初始濃度為350mM，55°C，30h下低 聚半乳糖合成量由〇%提高到11.5%，顯著提高轉(zhuǎn)糖苷催化活性，增加了產(chǎn)物G0S合成量，優(yōu) 于其他現(xiàn)有技術(shù)。
[0115] 基于以上研究，本發(fā)明以GH42家族嗜熱脂肪芽孢桿菌來源耐熱β-半乳糖苷酶BgaB 為研究對象，將定點(diǎn)突變與化學(xué)修飾相結(jié)合的基因改造方法，首次成功應(yīng)用于半乳糖苷 酶的功能改造中。在本發(fā)明中第一次通過試驗(yàn)確認(rèn)氨基酸位點(diǎn)Ε303為催化氨基酸位點(diǎn)，為 β-半乳糖苷酶的基因工程改造與應(yīng)用提供理論支持。更提出了一種高效的β-半乳糖苷酶功 能進(jìn)化方法，并獲得了具有高轉(zhuǎn)糖苷活性β-半乳糖苷酶突變體。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有轉(zhuǎn)糖苷活性耐熱β-半乳糖苷酶突變體，其特征在于該突變體是通過對β-半 乳糖苷酶BgaB催化氨基酸位點(diǎn)Ε303由原谷氨酸(Glu)定點(diǎn)突變?yōu)榘腚装彼?Cys )，再將半胱 氨酸巰基氧化為-SOO-所得。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的β_半乳糖苷酶突變體，其特征在于所述β_半乳糖苷酶為嗜熱 脂肪芽孢桿菌來源的耐熱β-半乳糖苷酶BgaB。3. -種轉(zhuǎn)糖苷活性耐熱β_半乳糖苷酶突變體的制備方法，其特征在于該制備方法的步 驟如下： Α、突變體酶的構(gòu)建 以含有嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的耐熱β-半乳糖苷酶BgaB基因的質(zhì)粒pKK223-3-bgaB為 模板，以全質(zhì)粒擴(kuò)增突變法對E303位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，將谷氨酸（Glu)突變?yōu)榘腚装彼?(Cys)，得到突變體E303C; B、 突變體酶的表達(dá)與純化 將全質(zhì)粒擴(kuò)增得到的定點(diǎn)突變PCR片段經(jīng)膠回收及雙酶切后，與PKK223-3載體的雙酶 切產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞;挑取重組菌單克隆接種于5mL LB抗性 培養(yǎng)基中，37 °C下培養(yǎng)過夜，按以體積比計1 %接種量將種子液接種于含有氨節(jié)青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD6qq達(dá)到0.6~1.0時，加入誘導(dǎo)劑IPTG，20 °C過夜誘導(dǎo)表 達(dá)后，對發(fā)酵液進(jìn)行離心，去上清、收集菌體，再以5~10倍體積磷酸緩沖液重懸，加入蛋白 酶抑制劑后進(jìn)行超聲波破壁，得到破胞液;將破胞液進(jìn)行熱處理去除不耐熱的雜蛋白后，離 心收集上清液，得到粗酶液； 將上述粗酶液用鎳親和柱純化分離后收集洗脫液，然后用50mMpH 7.0磷酸緩沖液透析 去除咪唑，再用聚乙二醇包埋濃縮制得未經(jīng)氧化的突變體酶； C、 突變體酶的氧化 將步驟B得到的突變體酶進(jìn)行氧化處理，氧化反應(yīng)體系為0.25M pH6.5磷酸鹽緩沖溶液 100yL、0~300mM KI溶液、ΙΟμΜ Br、3yM突變體酶，在溫度25°C條件下處理30h，得到所述β- 半乳糖苷酶突變體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟A中擴(kuò)增引物為： E303C上游引物： 5 '-GTCAACCGTTTATTTTGATGTGCCAGGTAACCTCACATGTTAA-3' E303C下游引物： 5 '-TTAACATGTGAGGTTACCTGGCACATCAAAATAAACGGTTGAC-3， PCR 反應(yīng)條件為：94°C 預(yù)變性 2min;95°C 變性 30s;63°C ~65°C30s;68°C7min，進(jìn)行 16 個 循環(huán)，最后68°C延伸15min; PCR反應(yīng)體系為：dNTPs(2mM)5yL、10XK0D plus Buf.5yL、K0D plus lyL、MgS〇4 2yL、上 游引物1.5yL、下游引物1.5yL、模板IyL、去離子水33yL，總體積50yL。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟B中超聲波破壁的工作條件為：功 率400W，總破壁時間為30min，其中超聲破壁工作ls，停止9s。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟B中，用鎳親和柱純化分離后收集 洗脫液的過程如下：向4mL鎳親和柱加入5倍柱體積去離子水至柱頂端自然洗脫后用2~3倍 體積的Binding buffer自然洗脫;再將經(jīng)0.22μηι濾膜過濾的粗酶液上柱，慢流使樣品與柱 充分結(jié)合，待樣品流干后分別用6倍柱體積的Washing buffer連續(xù)梯度洗脫洗脫雜蛋白質(zhì)， 最后用4倍Elution buffer洗脫目的蛋白，收集洗脫液。 所述Binding buffer含20mM咪唑；所述Washing buffer分別含咪唑20mM、80mM、IOOmM; 所述Elution buffer含250mM咪挫。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟C中KI溶液為200-300mM。8. 權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)糖苷活性耐熱β-半乳糖苷酶突變體或根據(jù)權(quán)利要求3-7中任 一項(xiàng)制備方法得到的轉(zhuǎn)糖苷活性耐熱半乳糖苷酶突變體在生產(chǎn)低聚半乳糖中的用途。
【文檔編號】C12P19/14GK105950589SQ201610580177
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月21日
【發(fā)明人】陳海琴, 董藝凝, 陳衛(wèi), 趙建新, 陳永泉, 張灝
【申請人】江南大學(xué)