一種全面下調(diào)棉花番茄紅素環(huán)化酶基因的表達載體及應用
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種全面下調(diào)棉花番茄紅素環(huán)化酶(Lyc)基因的表達載體及其應用。本發(fā)明的技術方案是分別從5對棉花Lyc基因中選取一段編碼序列串聯(lián)構建RNAi元件，通過轉基因方法在棉花中轉錄該元件，最終達到同時下調(diào)5對Lyc基因和調(diào)控棉花體內(nèi)類胡蘿卜素合成的目的。本發(fā)明的RNAi元件及載體可用于調(diào)控棉花類胡蘿卜素含量和種類。
【專利說明】
一種全面下調(diào)棉花番茄紅素環(huán)化酶基因的表達載體及應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種能全面下調(diào)棉花番茄紅素環(huán)化 酶基因，調(diào)節(jié)棉花類胡蘿卜素合成的表達載體及其應用。
【背景技術】
[0002] 類胡蘿卜素是普遍存在于植物、動物和微生物中的一類含40個碳原子骨架的萜類 物質(zhì)。由于含有共輒雙鍵，類胡蘿卜素一般呈現(xiàn)黃色和紅色，是植物重要的光合色素和光保 護劑，同時也是植物果實、花等的主要成色因子。前人研究表明，利用基因工程技術在植物 中調(diào)控類胡蘿卜素合成酶基因的表達，可以改變類胡蘿卜素途徑的流向，有目的地改變植物 體內(nèi)類胡蘿卜素的最終含量和成分，進而達到改良作物色彩和營養(yǎng)品質(zhì)的目的。如在水稻胚 乳、油菜種子和馬鈴薯塊莖中上調(diào)類胡蘿卜素合成酶基因，成功提高了這些農(nóng)產(chǎn)品的胡蘿 卜素水平和營養(yǎng)品質(zhì)棉花是世界上需求量最大的天然纖維作物，同時也是重要的油料作 物。利用基因工程技術改變棉花組織(如種子和纖維）中的類胡蘿卜素合成，是棉花纖維色彩 和棉籽營養(yǎng)品質(zhì)改良重要手段，具有廣闊的應用前景。
[0003]番茄紅素是類胡蘿卜素途徑中合成的第一個紅色色素，是成熟番茄、芒果等的主要 色素。同時番茄紅素是類胡蘿卜素的重要中間產(chǎn)物，番茄紅素在番茄紅素環(huán)化酶(Lyc)的催 化下分子末端發(fā)生環(huán)化，進而合成各種類胡蘿卜素(如葉黃素、胡蘿卜素等）。理論上，下調(diào) Lyc基因的表達可以抑制或阻斷番茄紅素轉化為其他類胡蘿卜素，從而在植物組織中降低下 游類胡蘿卜素的合成，促進番茄紅素的積累。目前，尚未見下調(diào)Lyc基因的表達進而有效調(diào)控 類胡蘿卜素合成的報道。棉花全基因組測序表明，二倍體棉(雷蒙德氏棉，DD和亞洲棉，AA)基 因組包含5個Lyc基因，而異源四倍體的陸地棉(AADD)保留了來源于不同亞基因組的5對共 10個Lyc基因（表1)。根據(jù)種名+基因名+基因組的命名原則，將陸地棉的Lyc基因分別命名為 GhLyclA/D、GhLyc2A/D、GhLyc3A/D、GhLyc4A/D和GhLyc5A/D。序列比對表明，來源于不同亞 基因組的同對基因（直系同源基因）序列高度相似(相同核苷酸>98%)，而不同的旁系同源 基因間的序列相似度較低(35~78%)。存在多個且序列差異較大的Lyc基因增加了在棉花 中抑制番茄紅素轉化為其他類胡蘿卜素的難度。本發(fā)明針對棉花的Lyc基因設計了能夠靶標 多個棉花Lyc基因的RNAi元件(LycRNAi)。棉花轉基因分析表明，該元件能全面下調(diào)陸地棉 10個Lyc基因的表達，并抑制類胡蘿卜素的合成。
[0004] 表1不同種棉花的Lyc基因


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的技術創(chuàng)新點是設計了能同時靶標10個棉花Lyc基因，并顯著抑制番茄紅 素轉化為其他類胡蘿卜素的RNAi元件。
[0007] 本發(fā)明的技術方案是同時下調(diào)5對棉花番茄紅素環(huán)化酶（Lyc)基因的RNAi元件 (LycRNAi)，所述的5對Lyc基因為GhLyc 1 A/D、GhLyc2A/D、GhLyc3A/D、GhLyc4A/D和GhLyc5A/ D〇
[0008] 具體的，所述RNAi元件包含由1個內(nèi)含子序列隔開的2個反向重復序列，每一重復 序列包含分別來源于5對棉花Lyc基因的編碼序列。
[0009] 具體的，所述的RNAi元件具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。
[0010] SEQ ID No.6靶向5對棉花Lyc基因的LycRNAi元件(其中下劃線所示為間隔序列）：

[0012]本發(fā)明還提供了同時下調(diào)5對棉花Lyc基因的植物表達載體，包含所述的RNAi元 件，該RNAi元件在植物體內(nèi)轉錄。
[0013] 具體的，調(diào)控所述RNAi元件的啟動子為組成型啟動子。
[0014] 具體的，所述的啟動子為CaMV35S啟動子，具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。 [0015]具體的，所述的植物表達載體具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
[0016]本發(fā)明還提供了含有所述載體的宿主細胞。
[0017]優(yōu)選的，所述的宿主細胞為根癌農(nóng)桿菌。
[0018] 本發(fā)明還提供了調(diào)控棉花類胡蘿卜素的物質(zhì)，其特征在于:其主要活性成分為所述 載體，或者所述的宿主細胞。
[0019] 本發(fā)明還提供了所述的RNAi元件，所述的植物表達載體，或所述的宿主細胞在調(diào) 控棉花類胡蘿卜素含量和/或種類中的用途。
[0020] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明通過研究和分析，確定在棉花中表達所述RNAi元件可 以有效抑制棉花10個Lyc基因的表達水平并降低類胡蘿卜素的合成。該RNAi元件及相關載體 可用于調(diào)控棉花類胡蘿卜素含量和種類，并在棉籽營養(yǎng)品質(zhì)或纖維色彩的轉基因改良方面 有著廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0021] 圖1: Ly cRNAi的表達載體T-DNA區(qū)的基因結構圖
[0022] 2X35S，增強型花椰菜花葉病毒35S啟動子;D1-D5,棉花Lyc基因序列，兩個反向重 復的D1-D5串聯(lián)序列及間隔序列構成LycRNAi元件;LycRNAi，番前紅素環(huán)化酶Lyc基因的沉 默元件;GUS:NPTII，葡萄糖酸苷酶和新霉素磷酸轉移酶融合基因；T-Border(right)，T-DNA 右邊界;T-Border (1 ef t)，T-DNA左邊界。Nos，農(nóng)桿菌胭脂堿基因終止子;35S，花椰菜花葉病 毒35S啟動子。
[0023] 圖2:pLGN-35S-LycRNAi表達載體構建流程
[0024]具體實驗方法見操作過程實施例2 JX35S，增強型花椰菜花葉病毒35S啟動子； D1-D5，棉花Lyc基因序列；LycRNAi，番茄紅素環(huán)化酶Lyc基因的沉默元件;GUS:NPTII，葡萄 糖酸苷酶和新霉素磷酸轉移酶融合基因；T-Border (right)，T-DNA右邊界；T-Border (left)，T-DNA左邊界。Nos，農(nóng)桿菌胭脂堿基因終止子;Kanamycin(R)，卡那霉素抗性基因； 35S，花椰菜花葉病毒35S啟動子。相關酶切位點及位置在各個載體上標出。
[0025]圖3:陸地棉A/D基因組中Ly c基因 RT-PCR引物的擴增驗證及表達分析 [0026] 4，10個棉花1^(3基因的特異引物在陸地棉(61!)、雷蒙德氏棉(6〇和亞洲棉(6&)中 的擴增驗證。B，LycRNAi轉基因棉花不同轉化子葉片中Lyc基因（GhLyclA/D、GhLyc2A/D、 GhLy c3A/D、GhLy c4A/D和GhLyc5A/D)的表達水平;WT代表非轉基因棉花，數(shù)字顯示不同的轉 化子。
[0027]圖4:野生型(WT)棉花及LycRNAi轉基因植株葉片類胡蘿卜素含量(mg/g)的變化。WT 為野生型葉片，數(shù)字顯示不同轉化子。
【具體實施方式】
[0028] 下述為實驗操作中所用到的常規(guī)操作：
[0029] 1.DNA 的提取
[0030] 基因組DNA采用植物基因組DNA快速提取試劑盒(Aidlab)提取，詳細步驟見說明 書。
[0031] 2.RNA 的提取
[0032] RNA采用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒(Aidlab)提取，詳細步驟見說明書。
[0033] 3.DNA片段的PCR擴增
[0034] 擴增體系如下：l〇XEx PCR buffer(Mg2+free)2.5yL，2.5mmol/L dNTPs 2yL， 25mmol/L MgCl2 2yL，引物l(5ymol/L)lyL，引物2(5ymol/mL)lyL，Ex Taq DNA聚合酶 1U，基 因組DNA約60ng，加入ddH20至25yL。
[0035] 擴增程序為：94Γ，5min; 94°C，30sec，56°C，30sec，72°C，1 · 5min，35個循環(huán)；72°C 延伸lOmin。
[0036] 4.DNA片段的回收、連接和克隆
[0037] 使用BioFlux膠回收試劑盒回收DNA片段。使用T4 DNA ligase進行DNA片段連接。 回收的片段與pUCm-T(上海生工)載體建立如下連接體系：10 X T4 DNA連接緩沖液lyL，載體 DNA片段lyL，外源連接產(chǎn)物DNA片段lyL，T4 DNA連接酶lyL，用雙蒸水補足體積至10yL。載體 DNA片段與外源連接產(chǎn)物DNA片段摩爾比為1:3，16°C連接12h。之后將連接產(chǎn)物轉化大腸桿 菌DH5a。獲得的抗性克隆經(jīng)液體培養(yǎng)過夜，用BioFlux質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，酶切驗證 后，在Invitrogen公司測序。
[0038] 5XUS組織化學染色
[0039] 由于實驗室采用的表達載體具有⑶S報告基因 ，一般用⑶S組織化學染色檢測跟蹤 轉基因。具體方法:取少量轉基因棉花葉片(有傷口）置于96孔板中，加入GUS染液[0. lmo 1 /L K3Fe(CN)6,0.1mol/L K4Fe(CN)6,0.01mol/L Na2EDTA,500mg/L X-Gluc,1 %Triton X-100 (v/v)，0.14mo 1 /L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)]，在37 °C恒溫條件下放置2h左右，再用75 %乙醇脫 色。植株葉片可被GUS染液染成特異藍色的植株為轉基因陽性。
[0040] 實施例1沉默元件的獲得
[0041] 如前所述陸地棉含有5對Lyc基因，直系同源基因之間相似性極高（>98%)，而旁 系同源基因的核苷酸序列相似性較低，為完全抑制棉花中Lyc基因，我們從5個Lyc基因上各 選取一段序列（SEQ ID No. 1~5)，通過不對稱PCR方法將5個序列串聯(lián)，并最終形成含有間 隔序列的反向重復序列，即LycRNAi元件（SEQ ID No.6)。該沉默元件可祀定5對10個Lyc序 列從而通過RNAi機制下調(diào)番茄紅素環(huán)化酶Lyc基因的表達水平。
[0042] 首先，用陸地棉基因組DNA為模板分別擴增出5個Lycl~5編碼序列及間隔序列 (Lyc2序列包含一段編碼序列及臨接的內(nèi)含子序列），引物為LyclF/R、Ly C2F/R、LyC3F/R、 Lyc4F/R、Lyc5F/R(表2)，方法同上述常規(guī)試驗操作的DNA片段擴增。進一步用上述DNA片段 回收方法回收擴增的Lycl~5片段。
[0043] 表2 LycRNAi元件擴增引物序列
[0045]第二，利用不對稱重疊 PCR方法將回收的5個Lyc片段串聯(lián)。
[0046] 首先將Lycl和Lyc4、Lyc5和Lyc3串聯(lián)。構建4個擴增體系如下：
[0047] (1)回收的 Lycl 片段約 5ng，2yL 引物 LyclF，lyL 引物 LyclR;
[0048] (2)回收的 Lyc3 片段約 5ng，lyL 引物 Lyc3F，2yL 引物 Lyc3R;
[0049] (3)回收的 Lyc4 片段約 5ng，lyL 引物 Lyc4F，2yL 引物 Lyc4R;
[0050] (4)回收的 Lyc5 片段約 5ng，2yL 引物 Lyc5F，lyL 引物 Lyc5R;
[0051 ] 擴增體系其余成分同常規(guī)擴增體系。擴增程序為:94°C，5min; 94°C，30sec，56°C， 3〇86〇，72°(：，3〇86(3,30個循環(huán);72°(：延伸31^11。分別將體系1和體系3混合、體系2和體系4混 合，56°C，lmin，72°C，3min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，目的條帶Lycl+Lyc4和Lyc5+ Lyc3分別回收。
[0052]然后以Lycl+Lyc4和Lyc2為模板，進行Lycl+Lyc4與Lyc2的串聯(lián)。構建2個擴增體系 如下：
[0053] (5)回收的 Lycl+Lyc4 片段約 5ng，2yL 引物 LyclF，lyL 引物 Lyc4R。
[0054] (6)回收的 Lyc2 片段約 5ng，lyL 引物 Lyc2F，2yL 引物 Lyc2R。
[0055] 擴增體系其余成分同常規(guī)擴增體系。擴增程序為:94°C，5min;94°C，30sec，56°C， 30sec，72°C，30sec，30個循環(huán)；72°C延伸3min。將體系5和體系6混合，56°C，lmin，72°C， 3min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后，回收目的條帶Lycl+Lyc4+Lyc2。
[0056] 進一步以Lyc5+Lyc3和Lycl+LyC4+LyC2為模板完成5個Lyc基因片段的串聯(lián)。構建 如下兩個擴增體系：
[0057] (7)回收的 Lyc5+Lyc3 片段約 5ng，2yL 引物 Lyc5F，lyL 引物 Lyc3R;
[0058] (8)回收的 Lycl+Lyc4+Lyc2 片段約 5ng，lyL 引物 LyclF，2yL 引物 Lyc2R。
[0059] 擴增體系其余成分同常規(guī)擴增體系。擴增程序為:94°C，5min; 94°C，30sec，56°C， 30sec，72°C，30sec，30個循環(huán)；72°C延伸3min。將體系5和體系6混合，56°C，lmin，72°C， 3min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后，回收目的條帶Lyc5+Lyc3+Lycl+Lyc4+Lyc2。
[0060] 在設計引物時，Lyc2引物的擴增片段包含了 Lyc2的編碼序列以及臨近的內(nèi)含子序 列。該內(nèi)含子用作間隔序列，有利于兩個反向重復序列形成雙鏈RNA。
[0061] SEQ ID N0.1:Lycl編碼序列：
[0063] SEQ ID NO.2:Lyc2編碼序列及臨接內(nèi)含子序列，下劃線部分即為內(nèi)含子序列：
[0071]最后用直接擴增發(fā)夾RNA的方法5以片段LyC5+LyC3+Lycl+Ly C4+LyC2為模板擴增 獲得含間隔序列的5個Lyc片段的反向重復序列。反應體系中含回收的Lyc5+Lyc3+Lycl + Lyc4+Lyc2約5ng，2yL引物Lyc5F，lyL引物Lyc2R，其余成分同常規(guī)擴增體系。擴增程序為:94 °(：，5111丨11;94°(：，3〇86(3,56°(：，3〇86(3,72°(：，1111丨11，35個循環(huán) ；72°(：延伸3111丨11。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂 糖電泳后，回收約1873bp的目的條帶，按常規(guī)方法回收、克隆和測序驗證，最終獲得LycRNAi 元件（圖lhLycRNAi元件依次包括Lyc5+Lyc3+Lycl+Lyc4+Lyc2(編碼序列及相鄰的部分內(nèi) 含子序列)+Lyc2反向重復序列+Lyc4反向重復序列+Lycl反向重復序列+Lyc3反向重復序列 +Lyc5反向重復序列。
[0072] 實施例2 LycRNAi表達載體的構建
[0073] LycRNAi元件構建入植物表達載體pLGN-nos的流程見圖SwLGN-nos載體是由傳統(tǒng) 的植物表達載體PBI121改造而來的一個雙元植物表達載體。其T-DNA區(qū)段(T-DNA左右邊界 之間區(qū)域，圖2)替換為組成型的35S啟動子控制報告基因 GUS和標記基因 Nptll的融合基因 表達盒，以及另外的一個由35S啟動子控制的表達盒。
[0074] LycRNAi載體構建過程為：用Hindm和BamHI將35S啟動子從克隆載體上切下，連接 到用Hindm和BamHI酶切的pLGN-nos載體上構建pLGN-35S載體。進一步用EcoRI和BamHI將 LycRNAi元件從克隆載體上切下，插入到pLGN-35S載體的相應位點上，即獲得最終的表達載 體?11^-353-1^^?嫩1。所有限制性內(nèi)切酶均購自1?〇(*6公司，按照使用說明書操作。0嫩片段 的回收、連接和大腸桿菌轉化按前述常規(guī)操作方法進行。參考Bio-RAD MicroPulser用戶說 明書，將上述載體通過電激轉化法導入農(nóng)桿菌LBA4404。
[0075]實施例3棉花的遺傳轉化
[0076]通過根癌農(nóng)桿菌介導的方法進行上述表達載體的棉花遺傳轉化，所用培養(yǎng)基配方 見表3。具體方法如下:對野生型陸地棉冀棉14號飽滿棉花種子進行脫殼，將少量(約20~40 顆)去殼后的種子置于滅菌后的100mL三角瓶中，先用75%酒精清洗種子lmin，輕輕倒出酒 精再加入0.1%升汞滅菌約12min(不斷搖動三角瓶進行滅菌），輕輕倒出升汞，加入無菌水 充分漂洗，約漂洗10次，最后一次三角瓶中留有適量無菌水。置于搖床(30 °C、1 OOrpm)上，每 隔8小時更換一次無菌水，待胚根長出lcm左右（約36~48h)，將胚根輕輕插進萌發(fā)培養(yǎng)基 中，30°C暗培養(yǎng)至下胚軸伸長到3cm左右(約48h)。在進行種子的伸長培養(yǎng)期間活化農(nóng)桿菌， 以備浸染所用。浸染前約20h，將攜帶遺傳轉化載體的農(nóng)桿菌單菌落接種于含有50mg/L卡那 霉素(Km)和125m g//L鏈霉素(Sm)的液體YEB培養(yǎng)基中，置于28°C搖床(200rpm)，培養(yǎng)約20h后 測量菌液的0D值（0D6qq)，0D6qq在0.8~1 ·0適宜轉化。收集活化后的農(nóng)桿菌液，8000rpm離 lmin，棄上清后用含有共培養(yǎng)液體培養(yǎng)基(含100μ mol/L乙酰丁香酮）的按1:1體積比重懸菌 體后收集重懸液于l〇〇mL三角瓶，置于搖床(30°C、100rpm)培養(yǎng)約20min。將下胚軸切成長約 lcm的小段，置于重懸液中并在搖床(30°C、100rpm)上浸染50min，棄液體再取出下胚段輕輕 放入固體共培養(yǎng)基表面，暗培養(yǎng)48h左右。暗培養(yǎng)后將下胚段轉入固體篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng) (30°C、16h光照/8h黑暗，下同）15天后再轉入固體下胚段生長培養(yǎng)基，每隔15d左右繼代一 次至愈傷組織明顯形成，將愈傷組織轉到固體愈傷培養(yǎng)基上培養(yǎng)。將狀態(tài)良好的胚性愈傷 轉入液體懸浮培養(yǎng)基中并置于搖床(30°C、100rpm)上懸浮培養(yǎng)10d左右，通過篩網(wǎng)過濾將細 小體胚鋪于體胚伸長培養(yǎng)基中至綠色體胚長出，將綠色體胚挑至體胚伸長培養(yǎng)基中繼續(xù)培 養(yǎng)至長約lcm左右，插入生根培養(yǎng)基中直至幼苗長出。以上操作需在嚴格的無菌條件下完 成。
[0077]將篩選出的⑶S陽性轉基因小苗種植于腐質(zhì)土中溫室煉苗2周后轉種至大缽培養(yǎng)。 在溫室中常規(guī)管理，并對植株生理性狀及葉片中Lyc基因表達量以及類胡蘿卜素含量進行分 析。
[0078]表3根癌農(nóng)桿菌介導的棉花遺傳轉化用培養(yǎng)基
[0080] MS :Murashige&Skoog，1962; B5 :Gamborg，1986 ;Gelrite: Sigma，貨號：G1910; SH: Schenk&Hildebrandt，1972。
[0081] 實施例4轉基因棉花葉片中Lyc基因轉錄水平的檢測
[0082] 首先設計針對10個棉花Lyc基因的基因特異定量PCR引物，并用常規(guī)PCR方法檢測 引物特異性。如前所述，同對直系同源基因序列差異小，因此重點檢查基因特異引物能否區(qū) 分同對直系同源基因 （GhLyc 1A和D、GhLyc2A和D、GhLyc3A和D、GhLyc4A和D，以及GhLyc5A和 D)。用常規(guī)方法提取陸地棉冀棉14(AADD)、雷蒙德氏棉(DD)和亞洲棉(AA)的基因組DNA。用2 XTaq Mix(Aidlab)擴增基因組DNA以檢查引物特異性。擴增體系2XTaq Mix 12.5yL，上下 游引物（5nmol/L)各lyL，基因組DNA約100ng，加入ddH2〇至25yL。擴增程序為：94°C，5min; 94 °(：，3〇86(3,56°(：，3〇86(3,72°(：，1.51^11，30個循環(huán);72°(：延伸1〇111丨11。擴增產(chǎn)物在含溴乙錠的瓊 脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察照相。所有定量PCR引物序列見表4。
[0083] 表4定量PCR引物序列
[0085]提取WT及轉基因棉花葉片的RNA，逆轉錄合成cDNA，然后進行熒光定量PCR。具體操 作步驟為：用反轉錄試劑盒(MBI公司）合成cDNA，操作與按試劑盒說明書一致。定量PCR在 CFX96定量PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad)上進行，在25yL的反應體系包括12.5yL 2XSuper Mix (Bio-Rad)，上下游引物各lyL(5ymol/mL)和lyL-鏈cDNA。溫度循環(huán)參數(shù)為95°C預變性 211^11 ;95°(：，1〇86(3,57°(：，2〇86(3，擴增40循環(huán)。用棉花六(^1114基因作內(nèi)標。用定量?0?儀自帶 的分析軟件Bio-Rad CFX Manager 3.0計算各個基因的相對表達量。
[0086]檢測結果如附圖3A，所有定量PCR引物均能明顯區(qū)分不同（亞)基因組來源的直系 同源基因，即A-特異引物只能從含有A(亞)基因組的DNA(陸地棉和亞洲棉）中擴增出相應片 段，而D-特異引物只能從含有D(亞）基因組的DNA(陸地棉和雷蒙德氏棉）中擴增出相應片 段。這顯示所有定量PCR引物均有很好的特異性。
[0087]進一步用這些引物檢測野生型和LycRNAi轉基因棉花葉片中的10個Lyc基因的表 達水平。結果顯示（附圖3B)，LycRNAi轉基因棉花葉片中，所有Lyc基因的表達水平均較野生 型對照明顯下降。這顯示本發(fā)明提供的LycRNAi元件及其表達載體可以全面地下調(diào)棉花Lyc 基因的表達。
[0088]實施例5轉基因棉花葉片類胡蘿卜素含量測定
[0089] 參考蕭浪濤的方法6測定轉基因棉花及野生型葉片的類胡蘿卜素含量。首先選取植 株同一生長位置的葉片(一般為倒四葉），直徑為〇.6cm的打孔器于葉片各部位打孔取樣，稱 取O.lg左右(m)，加入10mL95%乙醇進行避光萃取12~24h;取200yL于酶標板中，分別測定 665nm、649nm和470nm處的吸光值（A665、A649和A470)。
[0090] 色素含量按如下公式計算：
[0091] 葉綠素 &((^) = 13.95八665-6.88八649;葉綠素 13(仏）=24.96八649-7.32八665 ;
[0092] 類胡蘿卜素 (Cx) = (1000A47〇-2.05Ca-114.8Cb)/245;
[0093] 類胡蘿卜素含量= CxX10-2/m(mg/g)。
[0094] 如附圖4，LycRNAi轉基因棉花葉片中的類胡蘿卜素含量均較野生型明顯降低，顯示 LycRNAi元件在棉花中的表達可以最終影響轉基因棉花體內(nèi)類胡蘿卜素的合成。
[0095] 參考文獻
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【主權項】
1. 同時下調(diào)5對棉花番茄紅素環(huán)化酶Lyc基因的RNAi元件LycRNAi，其特征在于:所述的 5 對 Lyc 基因為 GhLyclA/D、GhLyc2A/D、GhLyc3A/D、GhLyc4A/t^PGhLyc5A/D。2. 如權利要求1的RNAi元件，其特征在于:所述RNAi元件包含由1個內(nèi)含子序列隔開的2 個反向重復序列，每一重復序列包含分別來源于5對棉花Lyc基因的編碼序列。3. 如權利要求1或2所述的RNAi元件，其特征在于:所述的RNAi元件具有如SEQ ID No.6 所示的核苷酸序列。4. 同時下調(diào)5對棉花Lyc基因的植物表達載體，其特征在于:包含權利要求1或2所述的 RNAi元件。5. 如權利要求4所述的載體，其特征在于：調(diào)控所述RNAi元件的啟動子為組成型啟動 子。6. 如權利要求5所述的載體，其特征在于:所述的啟動子為CaMV35 S啟動子，具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。7. 如權利要求4~6任一項所述的載體，其特征在于:所述的植物表達載體具有如SEQ IDNo. 8所示的核苷酸序列。8. 含有權利要求4~6任一項所述的載體的宿主細胞。其特征在于:所述的宿主細胞為 根癌農(nóng)桿菌。9. 轉基因調(diào)控棉花類胡蘿卜素合成的物質(zhì)，其特征在于:其主要活性成分為權利要求3 ~6任一項所述載體，或者權利要求7或8所述的宿主細胞。10. 權利要求1~3任一項所述的RNAi元件，權利要求4~7任一項所述的載體，或權利要 求8或9所述的宿主細胞在調(diào)控棉花類胡蘿卜素含量和/或種類中的用途。
【文檔編號】A01H5/00GK105950620SQ201610270261
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】肖月華, 王肖, 姚丹, 王毅, 羅明, 侯磊, 裴炎
【申請人】西南大學