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      蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因及其編碼的蛋白與應(yīng)用

      文檔序號:10589132閱讀:521來源:國知局
      蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因及其編碼的蛋白與應(yīng)用
      【專利摘要】本發(fā)明提供蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因及其編碼的蛋白與應(yīng)用。蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因AoCHI1的CDS序列如SEQ ID NO:1所示,其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本發(fā)明首次從蘆筍中克隆得到查爾酮異構(gòu)酶基因AoCHI1,該基因為植物類黃酮合成路徑中的關(guān)鍵基因之一,采用基因工程的方法,將基因AoCHI1轉(zhuǎn)化到目標(biāo)植株中,可促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株中總黃酮含量的增加,為今后利用基因工程技術(shù)改良植物品質(zhì),獲得具有高抗氧化性的藥物或食物提供了重要的理論依據(jù),具有廣闊的應(yīng)用前景和極大的經(jīng)濟(jì)價值。
      【專利說明】
      蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因及其編碼的蛋白與應(yīng)用
      技術(shù)領(lǐng)域
      [0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域,具體地說,涉及蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因及其 編碼的蛋白與應(yīng)用。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 植物活性次生代謝產(chǎn)物是其代謝途徑中特有基因群的產(chǎn)物。隨著植物功能基因組 研究的廣泛深入,獨具特色又有廣闊應(yīng)用前景的植物次生代謝合成相關(guān)功能基因的研究逐 漸成為研究的熱點。類黃酮是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物之一,具有重要的抗氧化和清除 自由基的功能,對于提高人體免疫力具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在植物類黃酮生物合成途徑 中,查爾酮異構(gòu)酶基因 CHI是極為關(guān)鍵的限速酶,控制類黃酮的合成及組分分化,是植物次 生代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一,對植物具有非常重要的生理意義。
      [0003] 蘆輿(Asparagus officinalis L.)為天門冬科天門冬屬多年生草本植物,以嫩莖 供食,具有極高的營養(yǎng)和保健價值,富含黃酮、皂苷、天冬酰胺、硒和植物多糖等多種活性成 分,能抗腫瘤、抗氧化和降血脂,被譽(yù)為"蔬菜之王"、"世界十大名菜"之一(Jaiswal et al.,2014;Nishimura et al.,2013)。同時,蘆筍加工產(chǎn)業(yè)鏈長,可生產(chǎn)出蘆筍抗癌藥、蘆筍 茶、酒和飲料等高附加值產(chǎn)品,在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用開發(fā)前景廣闊。目前,我國蘆筍種植 及加工發(fā)展迅速,已成為世界第一大生產(chǎn)和出口國,種植面積超過95,000公頃,約占全球的 43% (陳光宇,2013;張岳平等,2013)。
      [0004] 目前,國內(nèi)外關(guān)于查爾酮異構(gòu)酶的研究報道主要集中在萌蘆巴、青木香屬、苜蓿、 水稻、柑橘、桑樹、金茶花、水仙、花生等多種作物品種中。然而,蘆筍作為富含黃酮的重要保 健蔬菜作物之一,目前未有任何與蘆筍CHI基因及其編碼蛋白的相關(guān)文獻(xiàn)報道,對于蘆筍 CHI基因及其編碼的蛋白序列尚不清楚。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005] 本發(fā)明的目的是提供蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因及其編碼的蛋白。
      [0006] 本發(fā)明的另一目的是提供蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因在調(diào)控植物類黃酮生物合成中 的應(yīng)用。
      [0007] 本發(fā)明針對蘆筍中類黃酮活性物質(zhì)生物合成途徑基礎(chǔ)研究薄弱的現(xiàn)狀,首次克隆 得到蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因 AoCHIl,并進(jìn)一步分析了該基因在促進(jìn)類黃酮生物合成中的作 用。
      [0008] 本發(fā)明通過對蘆筍的全基因組高通量測序結(jié)果進(jìn)行分析,設(shè)計一對特異引物(SEQ ID N0:3-4),對蘆筍品種'井岡11Γ嫩莖樣品cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了蘆筍查爾酮異構(gòu)酶 基因 AoCHIl的CDS序列(全長621bp),基因 AoCHIl的CDS序列為:
      [0009] i)SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列;或
      [0010] ii)SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且 表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核昔酸序列;或
      [0011] iii)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID N0:1所示序列雜交且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸 序列,所述嚴(yán)格條件為在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中,在65°C 下雜交,并用該溶液洗膜;或
      [0012] iv)與i)、ii)或m)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的 核苷酸序列。
      [0013] 本發(fā)明還提供蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因 AoCHIl編碼的蛋白,所述蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID N0:2所示,或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列。
      [0014] 本發(fā)明還提供含有蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因 AoCHIl的表達(dá)盒、載體、工程菌及轉(zhuǎn)基 因細(xì)胞系。
      [0015] 攜帶有所述目的基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn) 化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中(Weissbach,1998,Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,第411-463頁;Geiserson和 Corey,1998,Plant Molecular Biology,2nd Edition),并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
      [0016] 使用本發(fā)明的基因片段構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時,在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸的前端可 添加任意一種增強(qiáng)啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或者植株進(jìn)行鑒定 及篩選,可對所使用的載體進(jìn)行加工,如加入具有抗性的抗生素標(biāo)記物(例如卡那霉素或潮 霉素等)。被轉(zhuǎn)化的宿主是包括煙草在內(nèi)的多種植物,培育不同黃酮含量的植物種類。
      [0017] 本發(fā)明還提供蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因 AoCHIl在調(diào)控植物類黃酮生物合成中的應(yīng) 用。
      [0018] 本發(fā)明還提供蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因 AoCHIl在提高轉(zhuǎn)基因植物總黃酮含量中的 應(yīng)用。
      [0019] 在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中,將基因 AoCHIl構(gòu)建到載體PCAMBIA2301上,用所 得重組載體轉(zhuǎn)化煙草,篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。
      [0020] 優(yōu)選地,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草,轉(zhuǎn)化所用農(nóng)桿菌為EHA105。
      [0021] 本發(fā)明進(jìn)一步提供利用上述基因工程技術(shù)獲得的改良植物(總黃酮含量增加)在 食品、保健品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
      [0022] 本發(fā)明首次從蘆筍中克隆得到查爾酮異構(gòu)酶基因 AoCHIl,該基因為植物類黃酮合 成路徑中的關(guān)鍵基因之一,采用基因工程的方法,將基因 AoCHIl轉(zhuǎn)化到目標(biāo)植株中,可促進(jìn) 轉(zhuǎn)基因植株中總黃酮含量的增加,為今后利用基因工程技術(shù)改良植物品質(zhì),獲得具有高抗 氧化性的藥物或食物提供了重要的理論依據(jù),具有廣闊的應(yīng)用前景和極大的經(jīng)濟(jì)價值,
      【附圖說明】
      [0023] 圖1為本發(fā)明實施例3中AoCHIl基因在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)量的檢測結(jié)果;其中圖1A 是煙草內(nèi)參基因 Actin的跑膠圖,1-5為5個轉(zhuǎn)基因株系,WT為對照野生型煙草,Μ為分子量大 ?。粓D1Β是轉(zhuǎn)AoCHI基因的跑膠圖,1-5為5個轉(zhuǎn)基因株系,Η 20為陰性對照,WT為對照野生型 煙草,Ρ為重組質(zhì)粒PCAMBIA2301-A〇CHI 1,Μ為分子量大小。
      [0024] 圖2為本發(fā)明實施例4中總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
      [0025] 圖3為本發(fā)明實施例4中對照野生型煙草與轉(zhuǎn)化AoCHIl基因的煙草植株總黃酮含 量圖。
      【具體實施方式】
      [0026]以下實施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明,實施例 均按照常規(guī)實驗條件,如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。 [0027] 實施例1 AoCHIl基因的克隆
      [0028]通過前期對蘆筍新品種'井岡111'(JK111)的全基因組高通量測序結(jié)果進(jìn)行分析, 設(shè)計特異引物P1正向引物:5 ' -ATGGTGATGGTGGGTGATAT-3 '和P2反向引物:5'_ CTAAGCAGAAGATAAAATGG-3'(SEQ ID N0:3-4),采用常用的CTAB法(參照《植物基因工程》,王 關(guān)林,方宏筠主編)從蘆筍品種'井岡111'中提取嫩莖總RNA,并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,利用上述 弓丨物P1和P2從RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA中擴(kuò)增出如SEQ ID NO: 1所示的蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基 因 AoCHIl的CDS序列,基因 AoCHIl的CDS序列全長621bp。
      [0029] 具體步驟如下:
      [0030] (1)向離心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取緩沖液[2 % (W/V)CTAB, NaCl 1.4mol/L,EDTA(乙二胺四乙酸)20mmol/L,Tris.HCl 100mmol/L,2%(W/V)PVP]和 10 % β-巰基乙醇,在水浴鍋中預(yù)熱;
      [0031] (2)將蘆筍嫩莖用液氮冷卻研磨,加入提取液中,混勻,65°C水浴10分鐘;
      [0032] (3)加入等體積的氯仿:異戊醇(體積比24:1)混合液,顛倒混勻,靜置10min,4°C 12000g離心 10min;
      [0033] (4)取上清,重復(fù)步驟(3);
      [0034] (5)取上清,加入終濃度為2mol/L的LiCl,冰浴10-12小時,11000rpm,4°C離心 15min,棄上清,用75%乙醇清洗沉淀兩次,溶于適量的DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水中待用; [0035] (6)從蘆筍品種'井岡111'中提取嫩莖總RNA為模板,利用反轉(zhuǎn)錄酶(購自Thermo Fisher Scientif ic公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈,反應(yīng)條件為:65°C5min,42°C 50min,70〇C10min;
      [0036] (7)利用上述引物P1和P2從RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA中擴(kuò)增出蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基 因 AoCHIl的CDS序列;
      [0037] 反應(yīng)條件:94Γ 預(yù)變性 4111丨11;941€3〇86(3,551€3〇86(3,72。(:1.5111丨11,33個循環(huán) ;721€ 延伸10min。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物連入pMD18-T載體(購自寶生物工程大連有限公司),轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性克隆并測序,獲得所需的全長基因。從陽性克隆中提取攜帶 有基因 AoCHIl⑶S序列的質(zhì)粒,命名為pMD18-AoCHI質(zhì)粒。
      [0038] 實施例2 AoCHIl基因超量表達(dá)載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化
      [0039] 為了更好地分析基因 AoCHIl的生物學(xué)功能,進(jìn)一步將該基因在煙草中實現(xiàn)超量表 達(dá),從轉(zhuǎn)基因植株總黃酮含量的表型特征來驗證基因 AoCHIl的生物學(xué)功能。具體步驟如下:
      [0040] 首先將實施例1中得到的pMD18-AoCHI質(zhì)粒用BamH I和Κηρ I雙酶切,回收目的片 段;同時,用同樣的方法酶切攜帶雙煙草花葉病毒啟動子35S的遺傳轉(zhuǎn)化載體 PCAMBIA2301。酶切完畢,用包含AoCHIl基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA2301載體做連接 反應(yīng),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(購自寶生物工程大連有限公司)。通過酶切篩選陽性克隆,獲得重 組載體,命名為pCAMB IA2301 -AoCHI 1。
      [0041] 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入到煙草中,經(jīng)過侵染、共培養(yǎng)、篩選 同時具有卡那霉素抗性和潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化苗,再通過生根、練苗移栽等常規(guī)步驟(參照J(rèn). 薩姆布魯克, EF弗里奇,T曼尼阿蒂斯著;黃培堂,王嘉璽等譯;分子克隆實驗指南(第三版); 北京,科學(xué)出版社;2002版),得到轉(zhuǎn)基因植株。
      [0042] 本實施例中使用的主要試劑和遺傳轉(zhuǎn)化方法如下:
      [0043] (1)主要試劑
      [0044]所用到的培養(yǎng)基配方和植物激素的縮寫表示如下:1/2MS,MS培養(yǎng)基的配制參照 Murashige T · and F · Skoog · Physiol .Plant, 1962,15: 473-497 公開的方法。6_BA( 6-BenzylaminoPurine,6_節(jié)氨基噪呤);NAA(Naphthalene acetic acid,萘乙酸);Kan (1^1^1115^;[11,卡那霉素);06;1^(06;1^0丨31;[1116,頭孢霉素)。其中,卡那霉素和頭孢霉素米用0.25 μπι濾膜過濾方法滅菌,在上述除Kan和Cef成分以外的培養(yǎng)基經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌20min 后,待培養(yǎng)基冷卻至50_60°C時,在超凈工作臺上加入相應(yīng)的抗生素。
      [0045] (2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化
      [0046] 1)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
      [0047]首先,在帶有對應(yīng)抗性選擇的固體LB培養(yǎng)基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/ L氯化鈉 、Kan 100mg/L、瓊脂1.5g/L)上預(yù)培養(yǎng)攜帶有目的基因 AoCHIl的農(nóng)桿菌EHA105 48 小時,培養(yǎng)溫度28 °C;挑取預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌單菌落,接種于對應(yīng)抗性選擇的液體LB培養(yǎng)基 (10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化鈉 、Kan 100mg/L)中,于28°C200rpm搖床培養(yǎng)過 夜,至菌液濃度OD600值約為0.6。
      [0048] 2)葉盤轉(zhuǎn)化法
      [0049] a.剪取早花煙草無菌苗上部完全展開的幼嫩葉片,將葉片剪成1.5cm XI. 5cm大小 形狀,放入無菌燒杯中;
      [0050] b.將處于對數(shù)生長期的農(nóng)桿菌稀釋到0D6QQ值約為0.8,倒入燒杯,浸潤葉盤,間或 振蕩30min;
      [0051] c.將步驟b中的葉片取出,轉(zhuǎn)移至滅好菌的濾紙上吸干;然后放置在共培養(yǎng)培養(yǎng)基 (共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方:MS培養(yǎng)基、6-BA 2 · 25mg/L、NAA 0 · 3mg/L、蔗糖30 · 0g/L和瓊脂8 · 0g/L, pH值6.0)上暗培養(yǎng)3天,培養(yǎng)溫度為28 °C ;
      [0052] d. 3天后,將葉片轉(zhuǎn)入抗性篩選誘導(dǎo)培養(yǎng)基,光照和暗培養(yǎng)交替(光照強(qiáng)度1000-150011,光照/黑暗:1611/811)下培養(yǎng),進(jìn)行1^11抗性芽的篩選分化,培養(yǎng)溫度為28 <€,約一個 月在葉盤邊緣誘導(dǎo)出綠色芽點,約15天左右繼代一次;
      [0053] e .抗性芽長大后,從外植體上切下,轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基,在光照和暗培養(yǎng)交替(光 照強(qiáng)度1000-15001X,光照/黑暗:16h/8h)下培養(yǎng),進(jìn)行Kan抗性苗的篩選,培養(yǎng)溫度為28°C, 約一個月后,轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基,約15天繼代一次;
      [0054] f.將篩選得到的抗性苗轉(zhuǎn)入如上所述的生根選擇培養(yǎng)基上(生根選擇培養(yǎng)基配 方:MS培養(yǎng)基、Kan 100mg/L、Cef 400mg/L、蔗糖30 · 0g/L和瓊脂8 · 0g/L,pH值6 · 0)使其生根, 在光照和暗培養(yǎng)交替(光照強(qiáng)度1000-15001x,光照/黑暗:16h/8h)下培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為28 Γ。
      [0055] 3)移栽
      [0056]生根健壯后煉苗2天,洗掉轉(zhuǎn)基因煙草植株根上的殘留培養(yǎng)基,將具有良好根系的 幼苗轉(zhuǎn)入溫室,同時在最初一周內(nèi)保持水分濕潤。
      [0057]本實施例共獲得15個株系的PCR檢測結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒(或稱轉(zhuǎn)化質(zhì)粒) pCAMB IA2301 -AoCHI 1的T0代轉(zhuǎn)基因煙草。
      [0058] 實施例3 AoCHIl基因轉(zhuǎn)基因 T0代在田間的RT-PCR檢測
      [0059]為了驗證轉(zhuǎn)基因煙草總黃酮含量的改變是否與轉(zhuǎn)入的AoCHIl基因有關(guān),采用RT-PCR方法對部分轉(zhuǎn)基因煙草植株中AoCHIl基因表達(dá)進(jìn)行了檢測,結(jié)果見圖1。具體步驟如下:
      [0060] 采用TRIZ0L試劑(購自寶生物工程大連有限公司)從轉(zhuǎn)基因煙草1-5號株系中提取 植株的總RNA(提取方法參照TRIZ0L試劑說明書操作),利用反轉(zhuǎn)錄酶(購自Thermo Fisher Scientific公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈,反應(yīng)條件為65°C5min,42°C50min,70°C 10min。先用內(nèi)參基因 Actin對反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行檢測和濃度調(diào)整,根據(jù)內(nèi)參基因 Actin 的序列設(shè)計一對引物P5正向引物(5 ' -CTTGAAACAGCAAAGACCAGC-3 ')和P6反向引物(5 ' -CATCCTATCAGCAATGCCCG-3 '),進(jìn)行PCR檢測,反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min; 94°C30sec,55°C 30sec,72°C30sec,25個循環(huán);72°C延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1A所 示,內(nèi)參基因 Actin在對照野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草植株中均能擴(kuò)出,并且亮度一致。然后, 根據(jù)AoCHI 1基因的序列,利用引物P1和P2,進(jìn)行RT-PCR檢測,反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min; 94°〇3〇86(:,55 1€3〇86(3,72°(:1.51^11,33個循環(huán);72°(:延伸1〇1^11。擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電 泳結(jié)果表明(圖1B),5個轉(zhuǎn)基因株系煙草內(nèi)均檢測到AoCHIl基因的表達(dá)。
      [0061] 實施例4轉(zhuǎn)AoCHIl煙草植株總黃酮的提取及測定
      [0062] (1)總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
      [0063]選用蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品(經(jīng)測試蘆丁在510nm處有明顯的吸收峰)。精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品 50mg,其純度為91.7%(精確至0.00018),用60%乙醇溶解,并40°(:水浴加熱,室溫下配成 50mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,待用。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.4,1.5,2.5,5,7.5,1 OmL分別置于50mL容量瓶中,加 10mL 30% 乙醇和0 · 7mL的5%NaN02搖勻,6min后,加入0 · 7mL的 10%A1 (N〇3)3,6min后再加入 51111^的4%似0!1混勾,用30%乙醇定容至5〇1111^,30~40°(^水浴中顯色3〇111;[11,在510111]1處測定 吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(單位mg/ml)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 (表1,圖2)。
      [0064]表1總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
      [0066] (2)樣品的制備及總黃酮的測定
      [0067] 根據(jù)RT-PCR結(jié)果,選擇對轉(zhuǎn)基因植株AoCHI-2、AoCHI-3、AoCHI-5的總黃酮進(jìn)行提 取和測定,具體方法如下:煙草葉60°C過夜烘干,研磨成粉末。精密稱取樣品粉末0.4g,置于 大試管中,加入5mL30 %乙醇,于70 °C下超聲振蕩0.5h后,4500r/min離心15min,過濾至lOmL 的容量瓶中,用30 %乙醇溶液定容至1 OmL,將1 OmL過濾液移至50mL的容量瓶中,加入0.7mL 的5%NaN02搖勻,6min后加入0.7mL的1〇%厶10〇3)3,611^11后再加入511^的4%他〇!1混勻,用 30%乙醇定容至5〇11^,30~40 <€水浴中顯色3〇111;[11,在510111]1處測定吸光值,結(jié)果如圖3所示。 結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株AoCHI-2、AoCHI-3和AoCHI-5的總黃酮含量比對照野生型煙草(WT)有 大巾畐提尚。
      [0068]雖然,上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述,但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上,可以對之作一些修改或改進(jìn),這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此,在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn),均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。 [0069] 參考文獻(xiàn)
      [0070] l、Jaiswal Y,Liang Z,Ho A,Chen H,and Zhao Z.A comparative rissue-specific metabolite analysis and determination of protodioscin content in asparagus species used in traditional Chinese medicine and ayurveda by use of laser microdissection,UHPLC-QT0F/MS and LC-MS/MS[J].Phytochem Anal.,2014,25 (6):514-528.
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      【主權(quán)項】
      1. 蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因 AoCHI 1,其特征在于,基因 AoCHI 1的⑶S序列為: i) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列;或 ii) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達(dá) 相同功能蛋白質(zhì)的核昔酸序列;或 iii) 在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 1所示序列雜交且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序 列,所述嚴(yán)格條件為在含〇. 1 % SDS的O. I X SSPE或含0.1 % SDS的O. I X SSC溶液中,在65 °C下 雜交,并用該溶液洗膜;或 iv) 與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷 酸序列。2. 蘆筍查爾酮異構(gòu)酶基因 AoCHIl編碼的蛋白,其特征在于,所述蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示,或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的 氨基酸序列。3. 含有權(quán)利要求1所述基因 AoCHIl的表達(dá)盒。4. 含有權(quán)利要求1所述基因 AoCHIl或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒的載體。5. 含有權(quán)利要求1所述基因 AoCHIl、權(quán)利要求3所述表達(dá)盒或權(quán)利要求4所述載體的工 程菌。6. 權(quán)利要求1所述基因 AoCHI 1在調(diào)控植物類黃酮生物合成中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1所述基因 AoCHIl在提高轉(zhuǎn)基因植物總黃酮含量中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用,其特征在于,所述植物包括煙草。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用,其特征在于,將基因 AoCHIl構(gòu)建到載體pCAMBIA2301上, 用所得重組載體轉(zhuǎn)化煙草,篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用,其特征在于,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草, 優(yōu)選所用農(nóng)桿菌為EHA105。
      【文檔編號】C12N15/82GK105950644SQ201610479498
      【公開日】2016年9月21日
      【申請日】2016年6月23日
      【發(fā)明人】張岳平, 陳光宇, 瞿華香, 羅紹春, 趙萍, 周勁松, 湯泳萍, 尹玉玲
      【申請人】江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所
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