一種制備、分離以及純化聚谷氨酸的工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于氨基酸生產(chǎn)領(lǐng)域，公開了一種制備、分離以及純化聚谷氨酸的工藝，其包括如下步驟：步驟1）制備玉米秸稈水解液，步驟2）制備米糠提取物，步驟3）制備廢棄菌體水解液，步驟4）濃縮母液，步驟5）制備發(fā)酵培養(yǎng)基，步驟6）發(fā)酵制備聚谷氨酸，步驟7）分離和純化。本發(fā)明工藝成本低廉，操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)酸效率和純度高。
【專利說明】
一種制備、分離以及純化聚谷氨酸的工藝
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于氨基酸生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及一種制備、分離以及純化聚谷氨酸的工藝。
【背景技術(shù)】
[0003] 聚谷氨酸(簡(jiǎn)稱PGA)是谷氨酸單體以γ-位上的酰胺鍵聚合而形成的同質(zhì)多肽。它 具有水溶性，可生物降解，不含毒性，可廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、化妝品、保健、水處理、廢水處 理、衛(wèi)生用品、醫(yī)療等領(lǐng)域，例如可以用作為增稠劑、冷凍保護(hù)劑、緩釋劑、藥物載體、生物粘 合劑、保濕劑、生物可降解纖維、高吸水性樹脂、生物絮凝劑和重金屬離子吸收劑等。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)研究聚谷氨酸發(fā)酵工藝主要集中在菌株改進(jìn)，對(duì)于發(fā)酵培養(yǎng)基的改進(jìn)較 為罕見。開發(fā)成本低廉，而且產(chǎn)酸量高的培養(yǎng)基，最大限度地降低企業(yè)成本是我們研究的方 向?；谏鲜黾夹g(shù)問題，發(fā)展先進(jìn)的酶法和化學(xué)法的水解新技術(shù)，制備高產(chǎn)率的碳源與可利 用性氮源極有可能取得突破性進(jìn)展。
[0005] 玉米是北方地區(qū)種植的主要糧食作物，玉米秸桿作為農(nóng)業(yè)廢棄物，一般簡(jiǎn)單粉碎 處理或者燃燒處理，既不能充分利用，也容易造成環(huán)境污染。研究顯示，玉米秸桿含有30%以 上的碳水化合物、2%_4%的蛋白質(zhì)和05%_1%的脂肪，既可青貯，也可直接飼喂。就食草動(dòng)物而 言，2kg的玉米秸桿增重凈能相當(dāng)于lkg的玉米籽粒，特別是經(jīng)青貯、黃貯、氨化及糖化等處 理后，可提高利用率，效益將爭(zhēng)更可觀。據(jù)研究分析，玉米秸桿中所含的消化能為2235.8kJ/ kg，且營(yíng)養(yǎng)豐富，總能量與牧草相當(dāng)。我們需要對(duì)玉米秸桿進(jìn)行精細(xì)加工處理，使其具有良 好的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)發(fā)酵培養(yǎng)基成本高，分離純化工藝繁瑣等缺陷，提 供了一種制備、分離以及純化聚谷氨酸的工藝。
[0008] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的： 一種制備、分離以及純化聚谷氨酸的工藝，其包括如下步驟:步驟1)制備玉米秸桿水解 液，步驟2)制備米糠提取物，步驟3)制備廢棄菌體水解液，步驟4)濃縮母液，步驟5)制備發(fā) 酵培養(yǎng)基，步驟6)發(fā)酵制備聚谷氨酸，步驟7)分離和純化。
[0009] 具體地，所述工藝包括如下步驟： 步驟1)制備玉米秸桿水解液:將玉米秸桿投入到粉碎機(jī)中粉碎，過100目篩，然后添加 兩倍重量的濃度為5M的鹽酸，200rpm攪拌水解6小時(shí)，最后添加氨水，調(diào)節(jié)溶液的pH為6.9-7.1，即得； 步驟2)制備米糖提取物： 將米糠鋪成lcm厚度的平層，然后紫外線照射8min，再投入到容器中，添加兩倍重量的 水浸泡1小時(shí)，隨后添加占米糠1%重量份的α-淀粉酶，升溫至70°C，保持70°C水解1小時(shí)，然 后100°C滅酶，最后將酶解液濃縮至膏狀，即得； 步驟3)制備廢棄菌體水解液:利用微生物發(fā)酵制得谷氨酸發(fā)酵液，過濾收集廢棄菌體， 濾液用于提取谷氨酸，提取谷氨酸后的母液備用;將上述廢棄菌體烘干，粉碎機(jī)粉碎成粉末 狀，然后置于反應(yīng)罐中，加入5mol/L的鹽酸，在60°C溫度下攪拌水解24小時(shí)，攪拌速度為 300轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)終止后用氨水中和殘余鹽酸，控制溶液的pH為7.0，即得； 步驟4)濃縮母液:將步驟3)所得母液濃縮至谷氨酸含量為13g/L的濃縮液； 步驟5)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:按照重量百分比取各原料備用，其中：玉米秸桿水解液20%，廢 棄菌體水解液15%，葡萄糖4%，米糠提取物0.5%，貝殼粉0.01%，硫酸鎂0.01%，磷酸二氫鉀 0.01%，其余為步驟4)所得濃縮液； 將玉米秸桿水解液，廢棄菌體水解液，葡萄糖，米糠提取物，貝殼粉，硫酸鎂以及磷酸二 氫鉀依次添加到濃縮液中，攪拌均勻，然后在溫度108-1HTC、維持時(shí)間15分鐘進(jìn)行滅菌處 理，再降溫至30°C，制得發(fā)酵培養(yǎng)基； 步驟6)發(fā)酵制備聚谷氨酸:培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108 獲得種子液，然后按照9%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，連續(xù)發(fā)酵42小時(shí)，得到聚谷氨酸發(fā) 酵液； 步驟7)分離和純化:往聚谷氨酸發(fā)酵液中加入相同體積的異丙醇，2000轉(zhuǎn)/min攪拌 5min，然后靜置15min，離心收集沉淀，加入占沉淀五倍重量的純凈水溶解沉淀，然后加入納 米硅藻土，攪拌均勻后進(jìn)行板框過濾，收集濾液，調(diào)整濾液pH為中性，再加入占濾液0.5 %質(zhì) 量分?jǐn)?shù)的氯化鈉，攪拌均勻，再緩慢加入與濾液相同體積的異丙醇，2000轉(zhuǎn)/min攪拌15min， 再加入占濾液兩倍體積的異丙醇，500轉(zhuǎn)/min攪拌3min，然后置于4°C條件5小時(shí)，產(chǎn)品逐漸 析出，經(jīng)干燥、粉碎得到聚谷氨酸。
[0010]所述貝殼粉的粒徑為1〇〇目 本發(fā)明取得的有益效果主要包括： 本發(fā)明直接水解廢棄的菌體作為發(fā)酵原料，提供了豐富的氯化銨以及氨基酸氮源，可 作為微生物發(fā)酵養(yǎng)料。
[0011]對(duì)玉米秸桿廢棄物進(jìn)行了粉碎和水解處理，使得氮、磷、鉀、鈣、鎂以及纖維素多糖 等得到有效利用;米糠屬于農(nóng)業(yè)廢棄物，其含有大量的蛋白質(zhì)，脂肪，糖以及維生素等，但是 菌株利用率較低，通過生化處理后，提高了各養(yǎng)分的浸出率，菌株利用率大大提高； 利用谷氨酸生產(chǎn)結(jié)晶母液(含少量谷氨酸和大量銨鹽)建立不外加谷氨酸的聚谷氨酸 生產(chǎn)新工藝，既降低生產(chǎn)成本，又能提高谷氨酸發(fā)酵與聚谷氨酸聯(lián)產(chǎn)的總體生產(chǎn)效率； 通過水解廢棄菌體蛋白和利用結(jié)晶母液，開辟了聚谷氨酸生產(chǎn)廉價(jià)氮源提高的新策 略，并結(jié)合玉米秸桿水解液等農(nóng)業(yè)廢棄物的聯(lián)合應(yīng)用，開創(chuàng)了一條利用非糧和廢棄生物量 水解的碳氮源生產(chǎn)聚氨基酸的創(chuàng)新技術(shù)，大大降低了成本，提高了企業(yè)利潤(rùn)。
[0012] 本發(fā)明技術(shù)工藝用異丙醇取代了傳統(tǒng)的其他有機(jī)溶劑，不僅可以提高產(chǎn)率，而且 大大降低生產(chǎn)成本;其生產(chǎn)的γ-聚谷氨酸產(chǎn)品收率高、質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單可行。
[0013]
【具體實(shí)施方式】 以下將采用具體的實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋，但是不應(yīng)當(dāng)看作是對(duì)本發(fā)明創(chuàng) 新精神的限制。
[0014] 實(shí)施例1 一種制備、分離以及純化聚谷氨酸的工藝，其包括如下步驟： 步驟1)制備玉米秸桿水解液:將玉米秸桿投入到粉碎機(jī)中粉碎，過100目篩，然后添加 兩倍重量的濃度為5M的鹽酸，200rpm攪拌水解6小時(shí)，最后添加氨水，調(diào)節(jié)溶液的pH為6.9-7.1，即得； 步驟2)制備米糖提取物： 將米糠鋪成lcm厚度的平層，然后紫外線照射8min，紫外線強(qiáng)度為lOOOuw/cm2,再投入 到容器中，添加兩倍重量的水浸泡1小時(shí)，隨后添加占米糠1%重量份的淀粉酶(36U/mg， Sigma公司），升溫至70°C，保持70°C水解1小時(shí)，然后100°C滅酶，最后將酶解液濃縮至膏狀， 即得； 步驟3)制備廢棄菌體水解液:利用微生物發(fā)酵制得谷氨酸發(fā)酵液，過濾收集廢棄菌體， 濾液用于提取谷氨酸，提取谷氨酸后的母液備用;將上述廢棄菌體烘干，粉碎機(jī)粉碎成粉末 狀，然后置于反應(yīng)罐中，加入5mol/L的鹽酸，以沒過原料為準(zhǔn)，在60°C溫度下攪拌水解24小 時(shí)，攪拌速度為300轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)終止后用氨水中和殘余鹽酸，控制溶液的pH為7.0，即得； 步驟4)濃縮母液:將步驟3)所得母液濃縮至谷氨酸含量為13g/L的濃縮液； 步驟5)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:按照重量百分比取各原料備用，其中：玉米秸桿水解液20%，廢 棄菌體水解液15%，葡萄糖4%，米糠提取物0.5%，貝殼粉0.01%，硫酸鎂0.01%，磷酸二氫鉀 0.01%，其余為步驟4)所得濃縮液； 將玉米秸桿水解液，廢棄菌體水解液，葡萄糖，米糠提取物，貝殼粉，硫酸鎂以及磷酸二 氫鉀依次添加到濃縮液中，攪拌均勻，然后在溫度108-1HTC、維持時(shí)間15分鐘進(jìn)行滅菌處 理，再降溫至30°C，制得發(fā)酵培養(yǎng)基； 所述貝殼粉的粒徑為100目； 步驟6)發(fā)酵制備聚谷氨酸:培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108 獲得種子液，然后按照9% (體積比）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，連續(xù)發(fā)酵42小時(shí)，得到聚 谷氨酸發(fā)酵液;發(fā)酵過程中的溫度控制在30°C，pH控制在6.9-7.0,控制葡萄糖濃度不低于 20g/L; 步驟7)分離和純化:往聚谷氨酸發(fā)酵液中加入相同體積的異丙醇，2000轉(zhuǎn)/min攪拌 5min，然后靜置15min，離心收集沉淀，加入占沉淀五倍重量的純凈水溶解沉淀，然后加入粒 徑為1 〇〇nm娃藻土0.5kg/m3，攪拌均勾后進(jìn)行板框過濾，收集濾液，調(diào)整濾液pH為中性，再加 入占濾液0.5 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化鈉，攪拌均勻，緩慢加入與濾液相同體積的異丙醇，2000轉(zhuǎn)/ min攪拌15min，再加入占濾液兩倍體積的異丙醇，500轉(zhuǎn)/min攪拌3min，然后置于4 °C條件5 小時(shí)，產(chǎn)品逐漸析出，經(jīng)干燥、粉碎得到聚谷氨酸。
[0015] 產(chǎn)品純度檢測(cè):聚谷氨酸收率可達(dá)到65%以上，成品純度為95%以上。
[0016] 實(shí)施例2 實(shí)施例2采用發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖35g/L、玉米漿20g/L、酵母膏15g/L、谷氨酸鈉18g/ L、硫酸銨8g/L、磷酸二氫鉀0.1g/L、七水硫酸鎂0.1g/L、硫酸亞鐵0.1mg/L;其他工藝同實(shí)施 例1〇
[0017] 實(shí)施例3 本發(fā)明實(shí)施例1-2發(fā)酵液中的聚谷氨酸產(chǎn)量，具體結(jié)果見表1:
結(jié)論:本發(fā)明實(shí)施例1組和實(shí)施例2產(chǎn)酸量相差不大，本發(fā)明實(shí)施例1組略高;通過成本 核驗(yàn)本發(fā)明實(shí)施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基成本僅占實(shí)施例2培養(yǎng)基成本的50%左右，并且實(shí)現(xiàn)了變 廢為寶，節(jié)約了企業(yè)投入，提高了企業(yè)凈收入。
[0018] 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不 限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接 導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備、分離以及純化聚谷氨酸的工藝，其包括如下步驟:步驟1)制備玉米秸桿水 解液，步驟2)制備米糠提取物，步驟3)制備廢棄菌體水解液，步驟4)濃縮母液，步驟5)制備 發(fā)酵培養(yǎng)基，步驟6)發(fā)酵制備聚谷氨酸，步驟7)分離和純化。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于，所述工藝包括如下步驟： 步驟1)制備玉米秸桿水解液:將玉米秸桿投入到粉碎機(jī)中粉碎，過100目篩，然后添加 兩倍重量的濃度為5M的鹽酸，200rpm攪拌水解6小時(shí)，最后添加氨水，調(diào)節(jié)溶液的pH為6.9-7.1，即得； 步驟2)制備米糖提取物： 將米糠鋪成Icm厚度的平層，然后紫外線照射8min，再投入到容器中，添加兩倍重量的 水浸泡1小時(shí)，隨后添加占米糠1%重量份的α-淀粉酶，升溫至70°C，保持70°C水解1小時(shí)，然 后HKTC滅酶，最后將酶解液濃縮至膏狀，即得； 步驟3)制備廢棄菌體水解液:利用微生物發(fā)酵制得谷氨酸發(fā)酵液，過濾收集菌廢棄菌 體，濾液用于提取谷氨酸，提取谷氨酸后的母液備用；將上述廢棄菌體烘干，粉碎機(jī)粉碎成 粉末狀，然后置于反應(yīng)罐中，加入5mol/L的鹽酸，在60°C溫度下攪拌水解24小時(shí)，攪拌速度 為300轉(zhuǎn)/min，反應(yīng)終止后用氨水中和殘余鹽酸，控制溶液的pH為7.0，即得； 步驟4)濃縮母液:將步驟3)所得母液濃縮至谷氨酸含量為13g/L的濃縮液； 步驟5)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:按照重量百分比取各原料備用，其中：玉米秸桿水解液20%，廢 棄菌體水解液15%，葡萄糖4%，米糠提取物0.5%，貝殼粉0.01%，硫酸鎂0.01%，磷酸二氫鉀 0.01%，其余為步驟4)所得濃縮液； 將玉米秸桿水解液，廢棄菌體水解液，葡萄糖，米糠提取物，貝殼粉，硫酸鎂以及磷酸二 氫鉀依次添加到濃縮液中，攪拌均勻，然后在溫度108-1HTC、維持時(shí)間15分鐘進(jìn)行滅菌處 理，再降溫至30°C，制得發(fā)酵培養(yǎng)基； 步驟6)發(fā)酵制備聚谷氨酸:培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108 獲得種子液，然后按照9%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，連續(xù)發(fā)酵42小時(shí)，得到聚谷氨酸發(fā) 酵液； 步驟7)分離和純化：往聚谷氨酸發(fā)酵液中加入相同體積的異丙醇，2000轉(zhuǎn)/min攪拌 5min，然后靜置15min，離心收集沉淀，加入占沉淀五倍重量的純凈水溶解沉淀，然后加入納 米硅藻土，攪拌均勻后進(jìn)行板框過濾，收集濾液，調(diào)整濾液pH為中性，再加入占濾液0.5 %質(zhì) 量分?jǐn)?shù)的氯化鈉，攪拌均勻，再緩慢加入與濾液相同體積的異丙醇，2000轉(zhuǎn)/min攪拌15min， 再加入占濾液兩倍體積的異丙醇，500轉(zhuǎn)/min攪拌3min，然后置于4°C條件5小時(shí)，產(chǎn)品逐漸 析出，經(jīng)干燥、粉碎得到聚谷氨酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的工藝，其特征在于，所述貝殼粉的粒徑為100目。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK105950676SQ201610558410
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月16日
【發(fā)明人】丁兆堂, 王均成, 張傳森, 盧松, 李曉永, 王皓, 吳明殷
【申請(qǐng)人】?jī)?nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司