一種用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法及其試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法及其試劑，所述用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法包括以下步驟：將甘露醇高鹽瓊脂溶解于蒸餾水中，并進行滅菌，冷卻至 45?50℃時，加入抗生素利奈唑胺、萬古霉素或替加環(huán)素，得到含有抗生素的甘露醇高鹽瓊脂溶液；將含有抗生素的甘露醇高鹽瓊脂溶液分別倒入無菌平皿中，調(diào)整pH值，得到檢測各抗生素耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿；取糞便標本或體液標本，涂于檢測平皿平板上，培養(yǎng)2天后計數(shù)各平板各抗生素耐藥金黃色葡萄球菌總菌落數(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案操作簡單，靈敏性高，可以快速篩選出利奈唑胺、萬古霉素或替加環(huán)素耐藥金黃色葡萄球菌，為細菌耐藥防控提供基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法及其試劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植 的方法及其試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌是臨床分離的重要致病菌和定植菌之一，其中根據(jù)耐藥性將其分 為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)。近年該類細 菌臨床耐藥發(fā)展迅速，尤其以MRSA耐藥趨勢更為嚴重，美國每年MRSA感染導(dǎo)致死患者數(shù)相 當于AIDS、結(jié)核病和病毒性肝炎總和，我國MRSA感染率和MRSA分離率及多重耐菌均有增加 趨勢。2008-2015年Mohnarin資料顯示，綜合醫(yī)院MRSA分離株占金黃色葡萄球菌67.6%、ICU 中高達84.8 %。金黃色葡萄球菌居肺部感染G+球菌第一位，其中MRSA分離率26.3 % ;我國 MRSA分離株對慶大霉素、克林霉素、大環(huán)內(nèi)酯類和左氧氟沙星等抗菌藥物耐藥率基本上都 在80 %左右，對復(fù)方磺胺和利福平的耐藥率低于50%。利奈唑胺(Linezoid，LZD)、糖肽類抗 生素(萬古霉素和替考拉寧)和替加環(huán)素是金黃色葡萄球菌治療的"最后防線"和"王牌抗生 素"，近年利奈唑胺耐藥或中介分離金黃色葡萄球菌株報道逐漸增多，對替考拉寧和萬古霉 素中介或耐藥菌株亦有報道，替加環(huán)素不敏感金黃色葡萄球菌亦逐漸引起臨床關(guān)注，因此 加強這些"王牌"抗生素耐藥菌管理，篩查多重耐藥金黃色葡萄球菌定植患者成為院內(nèi)感染 控制的首要任務(wù)。
[0003] 隨著近年LZD(Linezoid，利奈唑胺)廣泛應(yīng)用于難治性G+( gram-positive)菌感染 及結(jié)核桿菌感染，其臨床耐藥問題日益突出，國內(nèi)外LZD耐藥株散發(fā)報道日漸增多，甚至不 斷有院內(nèi)暴發(fā)流行報道，該類耐藥株主要見于腸球菌和葡萄球菌。2011-2014年CHINET數(shù)據(jù) 提示LZD耐藥葡萄球菌波動在0.1 %-0.4%。
【申請人】為一所三甲醫(yī)院，2013年和2014年臨床 分離葡萄球菌LZD耐藥率為0.2%和0.7%。美國LEADER研究報告近10年葡萄球菌LZD耐藥數(shù) 據(jù)波動在0.2-0.6%。另有散在報道提示上海、北京等多家醫(yī)院均有逐漸增多的LZD耐藥株 散發(fā)病例。隨著LZD在臨床更為廣泛應(yīng)用，未來我們將面臨其嚴峻的耐藥形勢，其中快速增 加的LZD耐藥葡萄球菌耐藥株尤其引人關(guān)注。
[0004]隨著萬古霉素廣泛應(yīng)用，臨床上萬古霉素治療失敗的金黃色葡萄球菌感染病例并 不少見，隨之提出萬古霉素敏感性下降金黃色葡萄球菌和萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌 (vancomycin-resistant Staphyloccus aureus，VRSA)，使臨床治療更加困難。1997年， Hiramatsu等報道了世界上首例VISA(Mu50)，其萬古霉素MIC值為8μg/ml，隨后不久又報道 了首例分離自一位肺癌術(shù)后發(fā)生肺炎患者的痰標本菌株hVISA(Mu3)，該株萬古霉素MIC值 為3μg/ml，經(jīng)不同濃度萬古霉素平皿篩選后其MIC值可以達到Syg/mUOOS年在密西根州報 道了首例于導(dǎo)管尖端同時培養(yǎng)出VRSA和萬古霉素耐藥的的腸球菌(vancomycin-resistant E.fecalis，VRE)患者，其分離的VRSA的MIC彡32μg/ml，目前VISA和hVISA發(fā)生耐藥的機制仍 處于研究階段。隨后，hVISA感染病例在世界上許多國家陸續(xù)報道。不同國家報道的hVISA感 染發(fā)生率有很大不同，南韓0.71%，法國11.1%，土耳其17.97%，美國0.2%，中國13.1%。 早期各項研究對hVISA和VISA檢測并無統(tǒng)一標準，許多研究檢測出hVISA和VISA并沒有最后 經(jīng)PAP-AUC法確認，而且2006年CLSI對VISA進行新的界定，將萬古霉素對hVISA的MIC由原來 的8-16μg/ml修改為4-8μg/ml，所以根據(jù)新標準，hVISA和VISA發(fā)病率應(yīng)該會更高。所以我們 應(yīng)統(tǒng)一hVISA和VISA的檢測方法繼續(xù)監(jiān)測hVISA和VISA的發(fā)病率。我國目前尚無明確的VRSA 報道，但對于hVISA報道較多且明確，因此萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌在我國盡管無臨床 耐藥株報道，但關(guān)于其MIC值漂移和hVISA出現(xiàn)使得我們需要對該類耐藥細菌進行重點監(jiān) 測 。
[0005] 以往由于對萬古霉素、利奈唑胺和達托霉素的高效性和低耐藥認識，替加環(huán)素在G +菌感染領(lǐng)域的治療作用一直作為"儲備王牌"抗生素地位，近年隨著萬古霉素和利奈唑胺 耐藥G+菌逐漸增多，替加環(huán)素在G+菌(尤其是MRSA和腸球菌等)感染治療中開始發(fā)揮越來越 重要作用，其在G+菌中的耐藥問題日益引起關(guān)注，替加環(huán)素耐藥G+細菌報道亦逐漸增多。最 近全球多中心和我國細菌藥敏結(jié)果提示替加環(huán)素對多重耐藥鮑曼不動桿菌耐藥日益突出， MRSA、肺炎鏈球菌和腸球菌臨床分離株替加環(huán)素耐藥率保持在0.1-0.5%;但一項臺灣研究 表明如果按照不敏感（intermediate)標準進行統(tǒng)計，臺灣分離的44.5 %MRSA、45.9 %萬古 霉素耐藥屎腸球菌和2.8 %糞腸球菌對替加環(huán)素不敏感；另有一項大樣本腹部手術(shù)繼發(fā)糞 腸球菌腹膜炎患者研究提示盡管分離糞腸球菌未發(fā)現(xiàn)耐藥，但18.9%對替加環(huán)素不敏感 (intermediate)。綜合目前的研究報道，替加環(huán)素仍是萬古霉素和利奈唑胺耐藥糞腸球菌 和金黃色葡萄球菌治療的重要補救選擇，但其面臨嚴峻的耐藥挑戰(zhàn)，尤其是隨著其在G-菌 中更為廣泛應(yīng)用可能會導(dǎo)致篩選耐藥出現(xiàn)，目前散發(fā)報道臨床分離替加環(huán)素耐藥糞腸球菌 和金黃色葡萄球菌病例日漸增多即是這一趨勢的最好"寫照"。因此隨著替加環(huán)素在臨床更 為廣泛的應(yīng)用，未來我們將面臨其嚴峻的耐藥形勢，其中金黃色葡萄球菌和腸球菌中的耐 藥增多尤其引人關(guān)注。
[0006] 隨著耐藥金黃色葡萄球菌報道日漸增多，臨床院感工作中如何對該類多重耐藥菌 (multi-drug resistant organism，MDR0)進行院感耐藥管理成為臨床需要明確的緊迫問 題，根據(jù)我國最新公布的《多重耐藥菌醫(yī)院感染預(yù)防與控制中國專家共識》要求和院內(nèi)萬古 霉素耐藥腸球菌(Vancomycin-resistant enterococci，VRE)監(jiān)測經(jīng)驗，理論上對該類細菌 均應(yīng)采取接觸隔離處理措施。然而對于這些MDR0定植患者進行接觸隔離的臨床意義仍在深 入研究中，該類細菌包括LZD耐藥和替加環(huán)素耐藥細菌在院內(nèi)感染防控中是否也需要"享 受" VRE相同"待遇"仍有待理論支持。因此，建立方便快捷的檢測和監(jiān)測多重耐藥金黃色葡 萄球菌定植用于該類臨床研究和常規(guī)院感檢測非常有必要，但是如何將這些MDR0快速簡單 從患者標本中分離定植的耐藥株并能定量，如何動態(tài)從體內(nèi)監(jiān)測多重耐藥金黃色葡萄球菌 株定植變化，目前鮮見相關(guān)研究。常用的方法為通過血平板監(jiān)測大便標本中的菌群生長情 況，根據(jù)細菌形態(tài)學特點挑取其中葡萄球菌株，然后進行鑒定最后確定該菌株是否為利奈 唑胺或萬古霉素或替加環(huán)素耐藥葡萄球菌，但是這一過程操作復(fù)雜、陽性率低，不能有效篩 選耐藥株定植的陽性人群。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對以上技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法 及其試劑，操作簡單，陽性率高，可以迅速準確篩選出多重耐藥金黃色葡萄球菌定植人群有 利于臨床中耐藥傳播的控制和抗生素選擇，從而為細菌耐藥防控提供基礎(chǔ)。
[0008] 對此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0009] -種用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法，包括以下步驟：
[0010] 步驟S1:將甘露醇高鹽瓊脂溶解于蒸餾水中，并進行滅菌，冷卻至45-50°C時，加入 利奈唑胺、萬古霉素或替加環(huán)素，得到含有利奈唑胺、萬古霉素或替加環(huán)素的甘露醇高鹽瓊 脂溶液;然后將所述含有利奈唑胺、萬古霉素或替加環(huán)素的甘露醇高鹽瓊脂溶液倒入無菌 平皿中，調(diào)整pH值，得到利奈唑胺、利奈唑胺、萬古霉素或替加環(huán)素的耐藥金黃色葡萄球菌 定植檢測平皿；
[0011] 其中，所述含有利奈唑胺的甘露醇高鹽瓊脂溶液中，所述利奈唑胺的濃度為2~ 3ug/ml，將所述含有利奈唑胺的甘露醇高鹽瓊脂溶液倒入無菌平皿中，調(diào)整pH值為7.3-7.6，得到利奈唑胺耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿；
[0012] 所述含有萬古霉素的甘露醇高鹽瓊脂溶液中，所述萬古霉素的濃度為2.5~ 3.5ug/ml，將所述含有萬古霉素的甘露醇高鹽瓊脂溶液倒入無菌平皿中，調(diào)整pH值為7.2-7.4，得到萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿；
[0013] 所述含有替加環(huán)素的甘露醇高鹽瓊脂溶液中，所述替加環(huán)素的濃度為0.2-0.5ug/ ml，將所述含有替加環(huán)素的甘露醇高鹽瓊脂溶液倒入無菌平皿中，調(diào)整pH值為7.3-7.4，得 到替加環(huán)素耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿；
[0014] 步驟S2:取糞便標本或體液標本，涂于步驟S1中所述利奈唑胺耐藥金黃色葡萄球 菌定植檢測平皿、萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿或替加環(huán)素耐藥金黃色葡萄 球菌定植檢測平皿的平板上，并同時涂于無抗平皿中作為對照，培養(yǎng)2天后計數(shù)無抗平皿中 的總菌落數(shù)和各抗生素平皿中的耐藥金黃色葡萄球菌的總菌落數(shù)。
[0015] 作為本發(fā)明的進一步改進，步驟S1中，所述含有利奈唑胺的甘露醇高鹽瓊脂溶液 中，所述利奈唑胺的濃度為2.5ug/ml;所述含有萬古霉素的甘露醇高鹽瓊脂溶液中，所述萬 古霉素的濃度為3ug/ml;所述含有替加環(huán)素的甘露醇高鹽瓊脂溶液中，所述替加環(huán)素的濃 度為 0.3ug/ml。
[0016] 作為本發(fā)明的進一步改進，步驟S1中，所述利奈唑胺的耐藥金黃色葡萄球菌定植 檢測平皿的pH值為7.3;
[0017] 所述萬古霉素的耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿的pH值為7.2;
[0018] 所述替加環(huán)素的耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿的pH值為7.3。
[0019] 作為本發(fā)明的進一步改進，還包括步驟S3:從步驟S2的平板上隨機挑取金黃色葡 萄球菌克隆，進行革蘭染色+凝集酶檢測，然后采用E-test方法測定菌株各抗生素MIC值;其 中，所述耐藥菌株在確定其MIC值之前，應(yīng)在無抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)3代，同時采用金黃色葡 萄球菌質(zhì)控菌株ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212和大腸桿菌14028進行質(zhì)控。
[0020] 作為本發(fā)明的進一步改進，所述糞便標本為新鮮糞便標本，或?qū)⒓S便溶于1ml的 BHI培養(yǎng)基并加入20 %甘油混勻的糞便標本；
[0021] 所述體液標本為鼻咽拭子，或?qū)⒈茄适米涌梢卜庞诤珺HI培養(yǎng)基并加入20%甘油 混勻低溫保存用于選擇性培養(yǎng)。
[0022] 作為本發(fā)明的進一步改進，所述甘露醇高鹽瓊脂包含的組分及其濃度為：蛋白胨 l〇g/L、牛肉粉 lg/L、D-甘露醇 10g/L、氯化鈉 75g/L、酚紅0.025g/L、瓊脂 13g/L，pH 值為 7.4土 0·2〇
[0023] 作為本發(fā)明的進一步改進，步驟S1還包括將所述利奈唑胺、萬古霉素或替加環(huán)素 的耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿冷卻凝固后放入四度冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0024] 本發(fā)明還公開了一種用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑，所述試劑為用于 檢測利奈唑胺耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑、用于檢測萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌定 植的試劑或用于檢測替加環(huán)素耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑;其中，所述用于檢測利奈 唑胺耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑包含無菌甘露醇高鹽瓊脂和利奈唑胺，其中所述利奈 挫胺的濃度為2~3ug/ml，pH值為7.3-7.6;所述用于檢測萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌定 植的試劑包含無菌甘露醇高鹽瓊脂和萬古霉素，其中所述萬古霉素的濃度為2.5~3.5ug/ ml，pH值為7.2-7.4;所述用于檢測替加環(huán)素耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑包含無菌甘露 醇高鹽瓊脂和替加環(huán)素，其中所述替加環(huán)素的濃度為〇. 2-0.5ug/ml，pH值為7.3-7.4。
[0025] 作為本發(fā)明的進一步改進，所述用于檢測利奈唑胺耐藥金黃色葡萄球菌定植的試 劑中，利奈唑胺的濃度為2.5ug/ml，試劑的pH值為7.3;
[0026] 所述用于檢測萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑中，萬古霉素的濃度為 3呢/1111，試劑的?!1值為7.2;
[0027] 所述用于檢測替加環(huán)素耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑中，替加環(huán)素的濃度為 0 · 3ug/ml，試劑的pH值為7 · 3。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0029] 采用本發(fā)明的技術(shù)方案，操作簡單，檢驗快速，且具有極高的靈敏性，可以快速篩 選出利奈唑胺耐藥金黃色葡萄球菌、萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌、替加環(huán)素耐藥金黃色 葡萄球菌，從而為院感防治提供有力武器;能迅速準確篩選出耐藥金黃色葡萄球菌定植人 群，有利于臨床中耐藥傳播的控制和指導(dǎo)抗生素選擇，從而為細菌耐藥防控提供基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0030] 圖1是本發(fā)明實施例1中宿主于某的糞便樣品采用平板篩選萬古霉素不敏感金黃 色葡萄球菌生長圖片，右邊為無抗對比樣品，左邊為含LZD濃度為2.5ug/ml的樣品。
[0031] 圖2是本發(fā)明實施例6中宿主謝某的糞便樣品采用平板篩選萬古霉素不敏感金黃 色葡萄球菌生長圖片，右邊為無抗對比樣品，左邊為含萬古霉素濃度為3.Oug/ml的樣品。
[0032] 圖3是本發(fā)明實施例10中宿主林某的糞便樣品采用平板篩選替加環(huán)素不敏感金黃 色葡萄球菌生長圖片，右邊為無抗對比樣品，左邊為含替加環(huán)素濃度為〇.3ug/ml的樣品。
【具體實施方式】
[0033]下面對本發(fā)明的較優(yōu)的實施例作進一步的詳細說明。
[0034] 實施例1
[0035] -種用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法，本例針對于檢測利奈唑胺耐藥金 黃色葡萄球菌定植的方法，包括以下步驟：
[0036]稱取甘露醇高鹽瓊脂109.Og，加入1000ml蒸餾水中，加熱溶解并不停攪拌煮沸1分 鐘，并于121°C高壓滅菌15分鐘，冷至45-50°C左右時，加入利奈唑胺，所述利奈唑胺的濃度 為2.5ug/ml，得到含有利奈唑胺的甘露醇高鹽瓊脂溶液;其中，所述甘露醇高鹽瓊脂的配方 為蛋白胨l〇g/L、牛肉粉lg/L、D-甘露醇10g/L、氯化鈉75g/L、酚紅0.025g/L、瓊脂13g/L， 7.4pH值為7.4 ± 0.2。將所述含有利奈唑胺的甘露醇高鹽瓊脂溶液倒入直徑9cm的無菌平皿 (20ml/皿），分別采用鹽酸或NaOH調(diào)整培養(yǎng)基的pH值為7.3、7.4、7.5和7.6,并以pH值為7.0、 7.1、7.2、7.7、7.8、7.9和8.0作為對比例，對這些檢測平皿樣本進行分析，將其冷卻凝固有 放入四度冰箱保存?zhèn)溆?，分別每7天取出平板觀察平板中LZD耐藥金黃色葡萄球菌生長能力 的差別，觀察藥物穩(wěn)定性。
[0037]步驟S2:取患者0.5g新鮮糞便，或鼻咽拭子采取鼻咽部分泌物;可將新鮮標本用于 耐藥菌的篩選培養(yǎng)或取〇.5g糞便標本溶于lml的BHI培養(yǎng)基并加入20%甘油混勻保存用于 選擇性培養(yǎng)，鼻咽拭子可也放于含BHI培養(yǎng)基并加入20%甘油混勻低溫保存用于選擇性培 養(yǎng)。取5mg糞便或咽拭子分泌物標本均勻涂于各利奈唑胺濃度樣品的甘露醇高鹽瓊脂的平 板上，葡萄球菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)2天后計數(shù)總菌落數(shù)，并同時涂于無抗平板作為對 照，計數(shù)其中的生長數(shù)，繼之計算〇.5g糞便的平板含的總金黃色葡萄球菌數(shù)，如果細菌量 多，可采用稀釋為1〇-1〇_ 9倍數(shù)倍比稀釋方法進行計數(shù)，通過無抗平板計算〇.5g糞便總金黃 色葡萄球菌數(shù)量，在含抗生素平皿篩選抗生素不敏感金黃色葡萄球菌數(shù)量與總金黃色葡萄 球菌比值作為相對定量，其中，無抗平皿和含抗平皿接種相同量的糞便標本。
[0038]步驟S3:分別在無抗和含有抗生素利奈唑胺的平皿隨機挑取金黃色葡萄球菌克隆 15株，做個革蘭染色+凝集酶檢測，繼之采用E-test方法測定菌株各抗生素MIC值，采用細菌 鑒定儀(梅尼埃)和16SrRNA測序方法鑒定細菌亞群，初步比較抗生素利奈唑胺不敏感葡萄 球菌篩選的穩(wěn)定性和最佳條件情況。為了保證耐藥菌株穩(wěn)定性，耐藥菌株在確定其MIC值之 前，應(yīng)在無抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)3代，同時采用金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株ATCC29213、糞腸球 菌ATCC29212和大腸桿菌14028進行質(zhì)控。
[0039] 實施例2
[0040]在實施例1的基礎(chǔ)上，本例中，所述利奈唑胺的濃度為2ug/ml，其他同實施例1。
[0041 ] 實施例3
[0042]在實施例1的基礎(chǔ)上，本例中，所述利奈唑胺的濃度為3ug/ml，其他同實施例1。
[0043] 對比例1
[0044] 在實施例1的基礎(chǔ)上，本例中，所述利奈唑胺的濃度為Oug/ml，即不添加利奈唑胺， 其他同實施例1。
[0045] 對比例2
[0046] 在實施例1的基礎(chǔ)上，本例中，所述利奈唑胺的濃度為1.5ug/ml，其他同實施例1。
[0047] 對比例3
[0048]在實施例1的基礎(chǔ)上，本例中，所述利奈唑胺的濃度為3.5ug/ml，其他同實施例1。
[0049] 實施例4
[0050] 針對上述實施例1~3和對比例1~3,取2份糞便標本用于平皿篩選效果評估后，培 養(yǎng)2天后挑取50個克隆，進行MIC值測定，結(jié)果如表1和圖1所示，可見，含LZD為2.0、2.5和 3.0ug/ml濃度的甘露醇高鹽瓊脂平皿能較好的將LZD不敏感金黃色葡萄球菌(MIC值>4ug/ ml)篩選出來，其中LZD含量為2.5ug/ml的甘露醇高鹽瓊脂平皿篩選細菌MIC值符合要求，可 以較好的將LZD不敏感(intermediate和resistant)細菌均篩選出來，篩選效果最好。由圖1 可見，其中宿主于某的糞便標本在LZD和無抗平板均有較好生長，可以直接從平皿中獲得耐 藥菌生長情況并進行耐藥金黃色葡萄球菌的相對定量分析。
[0051 ]表1糞便標本中利奈唑胺耐藥金黃色葡萄球菌在不同利奈唑胺濃度篩選 [0052]和鑒定情況(每個平板挑取50克隆，含抗平皿如生長不足50則全部克隆挑取鑒定）
[0054] 針對LZD含量為2.5ug/ml的甘露醇高鹽瓊脂平皿的不同pH值的平板耐藥菌進行對 比，結(jié)果如表2所示，從表2中可見，pH值為7.3-7.6時，平板耐藥菌生長穩(wěn)定，提示該PH范圍 內(nèi)值LZD活性穩(wěn)定。在pH值為7.3的含LZD為2.5ug/ml平皿可以在常溫下保持活性3天，4度冰 箱中可保持35天，結(jié)果如表3所示。同時該方法用于鼻咽部拭子篩選耐藥金黃色葡萄球菌取 得同樣效果。
[0055] 表2利奈唑胺不敏感金黃色葡萄球菌篩選不同pH值的結(jié)果表
[0056]
[0057]表3含2.5ug/ml利奈唑胺平板存放不同時間點其活性觀察結(jié)果(常溫和4度）
[0058]
[0059] 實施例5
[0060] 針對健康宿主78例健康人宿主糞便LZD耐藥金黃色葡萄球菌定植情況研究，采用 無抗和含LZD濃度2.5ug/ml的甘露醇高鹽瓊脂平皿培養(yǎng)2天后計數(shù)總菌落數(shù)，計算0.5g糞便 標本金黃色葡萄球菌總數(shù)，結(jié)果顯示，所有78例患者中27例糞便培養(yǎng)出金黃色葡萄球菌。對 照方法采用常規(guī)的血培養(yǎng)平板培養(yǎng)糞便標本，根據(jù)形態(tài)確定葡萄球菌，繼之進行藥敏檢測， 提示著78例患者僅5例檢測到金黃色葡萄球菌定植。說明該方法與其他普通常規(guī)方法相比 具有較好的優(yōu)越性。
[0061] 我們采用的LZD耐藥檢測"一步法"平皿使用后在78例患者中檢測出27例糞便有金 黃色葡萄球菌生長，其中含有LZD不敏感菌株7例;常規(guī)方法0例檢出LZD耐藥株定植。因此本 方法具有極高的靈敏性直接篩選出利奈唑胺耐藥金黃色葡萄球從而為院感防治提供有力 武器。
[0062] 由于葡萄球菌球菌含有多個亞群，因此該方法是否能篩選出人體不同的葡萄球菌 亞群需要進一步驗證。我們同時對無抗和LZD篩選平板生長的細菌亞群進行了初步分析，在 該平皿中生長2天，篩選的細菌100%為金黃色葡萄球菌，但3天時準確率為65 %，有較多表 皮葡萄球菌生長。因此根據(jù)這一結(jié)果分析我們建立的篩選方法通過控制時間可以較好的將 LZD不敏感金黃色葡萄球菌較好的篩選出來。
[0063] 實施例6
[0064] -種用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法，本例針對于檢測萬古霉素耐藥金 黃色葡萄球菌定植的方法，包括以下步驟：
[0065]稱取甘露醇高鹽瓊脂109.0g，加入1000ml蒸餾水中，加熱溶解并不停攪拌煮沸1分 鐘，并于121°C高壓滅菌15分鐘，冷至45-50°C左右時，加入萬古霉素，所述萬古霉素的濃度 為3ug/ml，得到含有萬古霉素的甘露醇高鹽瓊脂溶液;其中，所述甘露醇高鹽瓊脂的配方為 蛋白胨10g/L、牛肉粉lg/L、D-甘露醇10g/L、氯化鈉75g/L、酚紅0.025g/L、瓊脂13g/L，7.4pH 值為7.4 ±0.2。將所述含有萬古霉素的甘露醇高鹽瓊脂溶液倒入直徑9cm的無菌平皿 (20ml/皿），分別采用鹽酸或NaOH調(diào)整培養(yǎng)基的pH值為7.2、7.3和7.4，并以？!1值為7.0、7.1、 7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0作為對比例，對這些檢測平皿樣本進行分析，將其冷卻凝固有 放入四度冰箱保存?zhèn)溆茫謩e每7天取出平板觀察平板中萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌生 長能力的差別，觀察藥物穩(wěn)定性。
[0066]步驟S2:取患者0.5g新鮮糞便，或鼻咽拭子采取鼻咽部分泌物;可將新鮮標本用于 耐藥菌的篩選培養(yǎng)或取〇.5g糞便標本溶于lml的BHI培養(yǎng)基并加入20%甘油混勻保存用于 選擇性培養(yǎng)，鼻咽拭子可也放于含BHI培養(yǎng)基并加入20%甘油混勻低溫保存用于選擇性培 養(yǎng)。取5mg糞便或咽拭子分泌物標本均勻涂于各萬古霉素樣品的甘露醇高鹽瓊脂的平板上， 葡萄球菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后計數(shù)總菌落數(shù)，并同時涂于無抗平板作為對照，計數(shù)其中 的生長數(shù)，繼之計算〇.5g糞便含的總金黃色葡萄球菌數(shù)，如果細菌量多，可采用稀釋為10-ΠΓ 9倍數(shù)倍比稀釋方法進行計數(shù)，通過無抗平板計算〇. 5g糞便總金黃色葡萄球菌數(shù)量，在含 抗生素平皿篩選抗生素不敏感金黃色葡萄球菌數(shù)量與總金黃色葡萄球菌比值作為相對定 量，其中，無抗平皿和含抗平皿接種相同量的糞便標本。
[0067] 步驟S3:分別在無抗和含有抗生素萬古霉素的平皿隨機挑取金黃色葡萄球菌克隆 15株，做個革蘭染色+凝集酶檢測，繼之采用E-test方法測定菌株各抗生素MIC值，采用細菌 鑒定儀(梅尼埃)和16SrRNA測序方法鑒定細菌亞群，初步比較抗生素萬古霉素不敏感葡萄 球菌篩選的穩(wěn)定性和最佳條件情況。為了保證耐藥菌株穩(wěn)定性，耐藥菌株在確定其MIC值之 前，應(yīng)在無抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)3代，同時采用金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株ATCC29213、糞腸球 菌ATCC29212和大腸桿菌14028進行質(zhì)控。
[0068] 實施例7
[0069] 在實施例6的基礎(chǔ)上，本例中所述萬古霉素的濃度為2.5ug/ml，其他同實施例6。
[0070] 實施例8
[0071] 在實施例6的基礎(chǔ)上，本例中所述萬古霉素的濃度為3.5ug/ml，其他同實施例6。
[0072] 對比例4
[0073] 在實施例6的基礎(chǔ)上，本例中所述萬古霉素的濃度為Oug/ml，即不添加萬古霉素， 其他同實施例6。
[0074] 對比例5
[0075]在實施例6的基礎(chǔ)上，本例中，所述萬古霉素的濃度分別為0.5、1.0、1.5、2ug/ml， 其他同實施例6。
[0076] 實施例9
[0077] 針對上述實施例6~8和對比例4~5，取3份糞便標本用于平皿篩選效果評估后，培 養(yǎng)2天后挑取50個克隆，進行MIC值測定，結(jié)果如表4和圖2所示，可見，含萬古霉素為2.5、3.0 和3.5ug/ml濃度的甘露醇高鹽瓊脂平皿能較好的將萬古霉素不敏感金黃色葡萄球菌(MIC 值>4ug/ml)篩選出來，其中萬古霉素含量為3.0ug/ml的甘露醇高鹽瓊脂平皿篩選細菌MIC 值更優(yōu)，可以較好的將萬古霉素不敏感(intermediate和resistant)細菌均篩選出來，篩選 效果最好。由圖2可見，其中宿主謝某的糞便標本在萬古霉素和無抗平板均有較好生長，從 含萬古霉素平皿可直接讀出是否含有該類抗生素耐藥金黃色葡萄球菌并進行半定量，方法 簡單方便。
[0078] 表4糞便標本中萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌在不同萬古霉素濃度篩選和鑒定情 況(每個平板挑取50克隆，含抗平皿中生長不足50可全部克隆挑取鑒定）
[0080]針對萬古霉素含量為3.Oug/ml的甘露醇高鹽瓊脂平皿的不同pH值的平板耐藥菌 進行對比，結(jié)果如表5所示，從表5中可見，pH值為7.2-7.4時，平板耐藥菌生長穩(wěn)定，提示該 pH范圍內(nèi)值萬古霉素活性穩(wěn)定。在pH值為7.2的含萬古霉素為3ug/ml平皿可以在常溫下保 持活性5天，4度冰箱中可保持62天，結(jié)果如表6所示。同時該方法用于鼻咽部拭子篩選耐藥 金黃色葡萄球菌取得同樣效果。
[0081 ]表5萬古霉素不敏感金黃色葡萄球菌篩選不同pH條件下的結(jié)果表(含3ug/ml萬古 霉素平皿，糞便標本）
[0082]
[0083]表6含3ug/ml萬古霉素平板存放不同時間點其活性觀察(常溫和4度）
[0085] 實施例10
[0086] -種用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法，本例針對于檢測替加環(huán)素耐藥金 黃色葡萄球菌定植的方法，包括以下步驟：
[0087]稱取甘露醇高鹽瓊脂109.0g，加入1000ml蒸餾水中，加熱溶解并不停攪拌煮沸1分 鐘，并于121°C高壓滅菌15分鐘，冷至45-50°C左右時，加入替加環(huán)素，所述替加環(huán)素的濃度 為0.3ug/ml，得到含有替加環(huán)素的甘露醇高鹽瓊脂溶液;其中，所述甘露醇高鹽瓊脂的配方 為蛋白胨l〇g/L、牛肉粉lg/L、D-甘露醇10g/L、氯化鈉75g/L、酚紅0.025g/L、瓊脂13g/L， 7.4pH值為7.4± 0.2。將所述含有替加環(huán)素的甘露醇高鹽瓊脂溶液倒入直徑9cm的無菌平皿 (20ml/皿），分別采用鹽酸或NaOH調(diào)整培養(yǎng)基的pH值為7.3和7.4,并以pH值為7.0、7.1、7.2、 7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0作為對比例，對這些檢測平皿樣本進行分析，將其冷卻凝固有 放入四度冰箱保存?zhèn)溆?，分別每7天取出平板觀察平板中替加環(huán)素耐藥金黃色葡萄球菌生 長能力的差別，觀察藥物穩(wěn)定性。
[0088]步驟S2:取患者0.5g新鮮糞便，或鼻咽拭子采取鼻咽部分泌物;可將新鮮標本用于 耐藥菌的篩選培養(yǎng)或取〇.5g糞便標本溶于lml的BHI培養(yǎng)基并加入20%甘油混勻保存用于 選擇性培養(yǎng)，鼻咽拭子可也放于含BHI培養(yǎng)基并加入20%甘油混勻低溫保存用于選擇性培 養(yǎng)。取5mg糞便或咽拭子分泌物標本均勻涂于各替加環(huán)素樣品的甘露醇高鹽瓊脂的平板上， 金黃色葡萄球菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后計數(shù)總菌落數(shù)，以同時涂于無抗平板作為對照，計 數(shù)其中的生長數(shù)，繼之計算〇.5g糞便含的總金黃色葡萄球菌數(shù)，如果細菌量多，可采用稀釋 為10-ΠΓ 9倍數(shù)倍比稀釋方法進行計數(shù)，通過無抗平板計算0.5g糞便總金黃色葡萄球菌數(shù) 量，在含抗生素平皿篩選抗生素不敏感金黃色葡萄球菌數(shù)量與總金黃色葡萄球菌比值作為 相對定量，其中，無抗和含抗平皿接種相同量的糞便標本。
[0089]步驟S3:分別在無抗和含有抗生素替加環(huán)素的平皿隨機挑取金黃色葡萄球菌克隆 15株，做個革蘭染色+凝集酶檢測，繼之采用E-test方法測定菌株各抗生素MIC值，采用細菌 鑒定儀(梅尼埃)和16SrRNA測序方法鑒定細菌亞群，初步比較抗生素替加環(huán)素不敏感葡萄 球菌篩選的穩(wěn)定性和最佳條件情況。為了保證耐藥菌株穩(wěn)定性，耐藥菌株在確定其MIC值之 前，應(yīng)在無抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)3代，同時采用金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株ATCC29213、糞腸球 菌ATCC29212和大腸桿菌14028進行質(zhì)控。
[0090] 實施例11
[0091] 在實施例10的基礎(chǔ)上，本例中所述替加環(huán)素的濃度為0.2ug/ml，其他同實施例10。 [0092] 實施例12
[0093]在實施例10的基礎(chǔ)上，本例中所述替加環(huán)素的濃度為0.4ug/ml，其他同實施例10。 [0094] 實施例13
[0095]在實施例10的基礎(chǔ)上，本例中所述替加環(huán)素的濃度為0.5ug/ml，其他同實施例10。
[0096] 對比例6
[0097]在實施例10的基礎(chǔ)上，本例中所述替加環(huán)素的濃度為Oug/ml，即不添加替加環(huán)素， 其他同實施例10。
[0098] 對比例7
[0099]在實施例10的基礎(chǔ)上，本例中，所述替加環(huán)素的濃度分別為0.6、0.7、0.8ug/ml，其 他同實施例10。
[0100] 實施例14
[0101] 針對上述實施例10~13和對比例6~7,取3份糞便標本挑取50個克隆用于平皿篩 選效果評估后，培養(yǎng)2天后，進行MIC值測定，結(jié)果如表7和圖3所示，可見，含替加環(huán)素為0.2、 0.3、0.4和0.5ug/ml濃度的甘露醇高鹽瓊脂平皿能較好的將替加環(huán)素不敏感金黃色葡萄球 菌(MI C值>4ug/ml)篩選出來，同時進行了大于0.5ug/ml濃度的實驗，大于0.5ug/ml的MI C為 耐藥。本實驗中，替加環(huán)素含量為〇.3ug/ml的甘露醇高鹽瓊脂平皿篩選細菌MIC值更優(yōu)，可 以較好的將替加環(huán)素不敏感(intermediate和resistant)細菌均篩選出來，篩選效果最好。 由圖3可見，其中宿主林某的糞便標本在替加環(huán)素和無抗平板均有較好生長，可以從平皿中 直接獲得是否含有該類抗生素耐藥金黃色葡萄球菌并進行相對定量分析。
[0102] 表7糞便標本中替加環(huán)素耐藥金黃色葡萄球菌在不同替加環(huán)素濃度篩選和鑒定情 況(每個平板挑取50克隆，含抗生長不足50全部挑取鑒定）
[0104] 針對替加環(huán)素含量為〇.3ug/ml的甘露醇高鹽瓊脂平皿的不同pH值的平板耐藥菌 進行對比，結(jié)果如表8所示，從表8中可見，pH值為7.3-7.4時，平板耐藥菌生長穩(wěn)定，提示該 pH范圍內(nèi)值替加環(huán)素活性穩(wěn)定。在pH值為7.3的含替加環(huán)素為0.3ug/ml平皿可以在常溫下 保持活性5天，4度冰箱中可保持69天，結(jié)果如表9所示。同時該方法用于鼻咽部拭子篩選耐 藥金黃色葡萄球菌取得同樣效果。
[0105] 表8替加環(huán)素不敏感金黃色葡萄球菌篩選不同pH值條件下的結(jié)果表(含0.3ug/ml 替加環(huán)素平皿，糞便標本）
[0106]
[0107]表9含0.3ug/ml替加環(huán)素平板存放不同時間點其活性觀察(常溫和4度）
[0109]金黃色葡萄球菌選擇性培養(yǎng)基較多，但目前臨床使用的仍然主要以非選擇性培養(yǎng) 皿血培養(yǎng)皿為主，在臨床標本篩選過程中血培養(yǎng)皿具有顯著的優(yōu)勢，細菌生長譜廣，而且可 以獲得較為穩(wěn)定的結(jié)果，然而對于院感檢測該類培養(yǎng)基使用較為不利，院感檢測主要用于 靶向性檢測各種耐藥細菌，對于敏感細菌并不關(guān)注，尤其是危重病人，迅速準確篩選出多重 耐藥金黃色葡萄球菌定植人群有利于臨床中耐藥傳播的控制和指導(dǎo)抗生素選擇，從而為細 菌耐藥防控提供基礎(chǔ)。
[0110]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當視為屬于本發(fā)明的 保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法，其特征在于:包括以下步驟： 步驟SI:將甘露醇高鹽瓊脂溶解于蒸餾水中，并進行滅菌，冷卻至45-50Γ時，加入利 奈唑胺、萬古霉素或替加環(huán)素，得到含有利奈唑胺、萬古霉素或替加環(huán)素的甘露醇高鹽瓊脂 溶液，然后將所述含有利奈唑胺、萬古霉素或替加環(huán)素的甘露醇高鹽瓊脂溶液倒入無菌平 皿中，調(diào)整pH值，得到利奈唑胺、利奈唑胺、萬古霉素或替加環(huán)素的耐藥金黃色葡萄球菌定 植檢測平皿； 其中，所述含有利奈唑胺的甘露醇高鹽瓊脂溶液中，所述利奈唑胺的濃度為2~3ug/ml， 所述利奈唑胺的耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿的pH值為7.3-7.6; 所述含有萬古霉素的甘露醇高鹽瓊脂溶液中，所述萬古霉素的濃度為2.5~3.5ug/ml， 所述萬古霉素的耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿的pH值為7.2-7.4; 所述含有替加環(huán)素的甘露醇高鹽瓊脂溶液中，所述替加環(huán)素的濃度為〇. 2-0.5ug/ml， 所述替加環(huán)素的耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿的pH值為7.3-7.4; 步驟S2:取糞便標本或體液標本，涂于步驟Sl中所述利奈唑胺、利奈唑胺、萬古霉素或 替加環(huán)素的耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿的平板上，并同時涂于無抗平皿中作為對 照，培養(yǎng)2天后計數(shù)無抗平皿中的總菌落數(shù)和各抗生素平皿中的耐藥金黃色葡萄球菌的總 菌落數(shù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法，其特征在于:步驟 Sl中，所述含有利奈唑胺的甘露醇高鹽瓊脂溶液中，所述利奈唑胺的濃度為2.5ug/ml;所述 含有萬古霉素的甘露醇高鹽瓊脂溶液中，所述萬古霉素的濃度為3ug/ml;所述含有替加環(huán) 素的甘露醇高鹽瓊脂溶液中，所述替加環(huán)素的濃度為〇. 3ug/ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法，其特征在于:步驟 Sl中，所述利奈唑胺的耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿的pH值為7.3; 所述萬古霉素的耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿的pH值為7.2; 所述替加環(huán)素的耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿的pH值為7.3。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法，其特征在于:還包 括步驟S3:從步驟S2的平板上隨機挑取金黃色葡萄球菌克隆，進行革蘭染色+凝集酶檢測， 然后采用E-test方法測定菌株各抗生素 MIC值;其中，所述耐藥菌株在確定其MIC值之前，應(yīng) 在無抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)3代，同時采用金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株ATCC29213、糞腸球菌 ATCC29212和大腸桿菌14028進行質(zhì)控。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4任意一項所述的用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法，其特 征在于:所述糞便標本為新鮮糞便標本，或?qū)⒓S便溶于Iml的BHI培養(yǎng)基并加入20%甘油混勻 的糞便標本； 所述體液標本為鼻咽拭子，或?qū)⒈茄适米涌梢卜庞诤珺HI培養(yǎng)基并加入20%甘油混勻低 溫保存用于選擇性培養(yǎng)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法，其特征在于，所述 甘露醇高鹽瓊脂包含的組分及其濃度為:蛋白胨10 g/L、牛肉粉I g/L、D-甘露醇10 g/ L、氯化鈉 75 g/L、酚紅 0.025 g/L、瓊脂 13 g/L，pH值為7.4±0.2。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的方法，其特征在于:步驟 Sl還包括將所述利奈唑胺、萬古霉素或替加環(huán)素的耐藥金黃色葡萄球菌定植檢測平皿冷卻 凝固后放入四度冰箱保存?zhèn)溆谩?. -種用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑，其特征在于:所述用于檢測耐藥金 黃色葡萄球菌定植的試劑為用于檢測利奈挫胺耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑、用于檢測 萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑或用于檢測替加環(huán)素耐藥金黃色葡萄球菌定植 的試劑； 其中，所述用于檢測利奈唑胺耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑包含無菌甘露醇高鹽瓊 脂和利奈唑胺，其中所述利奈唑胺的濃度為2~3ug/ml，pH值為7.3-7.6; 所述用于檢測萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑包含無菌甘露醇高鹽瓊脂和 萬古霉素，其中所述萬古霉素的濃度為2.5~3.5ug/ml，pH值為7.2-7.4; 所述用于檢測替加環(huán)素耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑包含無菌甘露醇高鹽瓊脂和 替加環(huán)素，其中所述替加環(huán)素的濃度為〇. 2-0.5ug/ml，pH值為7.3-7.4。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于檢測耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑，其特征在于:所述 用于檢測利奈唑胺耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑中，利奈唑胺的濃度為2.5ug/ml，試劑 的pH值為7.3; 所述用于檢測萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑中，萬古霉素的濃度為3ug/ ml，試劑的pH值為7.2; 所述用于檢測替加環(huán)素耐藥金黃色葡萄球菌定植的試劑中，替加環(huán)素的濃度為〇.3ug/ ml，試劑的pH值為7.3。
【文檔編號】C12Q1/14GK105950701SQ201610340904
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】余治健, 鄧啟文, 程航, 鄭金鑫, 陳重
【申請人】深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院