miR-4443及其靶基因在診治軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及miR?4443及其靶基因在診治軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤中的應(yīng)用。對軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤患者及健康對照miRNA和mRNA進(jìn)行高通量測序，獲得其表達(dá)數(shù)據(jù)，生物信息學(xué)分析選取候選基因，進(jìn)而采用RT?PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及干擾實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶標(biāo)，結(jié)果表明本發(fā)明提供的miR?4443及其靶基因與軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤密切相關(guān)，為臨床診斷及預(yù)防奠定了很好的研究基礎(chǔ)，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
mi R-4443及其朝基因在診治軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及疾病診療領(lǐng)域，具體的涉及miR-4443及其靶基因在診治軟骨母細(xì)胞型 骨肉瘤中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] MicroRNAs(miRNAs)是一類長約19-23個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，大 量的研究表明microRNA是一類重要的調(diào)控因子，曾經(jīng)被認(rèn)為是非常不穩(wěn)定的miRNA卻可以 穩(wěn)定存在于血液和其他體液中，更加重要的是，細(xì)胞外miRNAs被發(fā)現(xiàn)和多種疾病密切相關(guān)， 它們可以作為諸如腫瘤等各種疾病的非侵入性生物標(biāo)志物。越來越多的研究表明，miRNA的 表達(dá)具有時序特異性和組織特異性。每種miRNA針對的數(shù)個甚至上百個潛在靶基因，在不同 的細(xì)胞或同一細(xì)胞的不同狀態(tài)下是否能發(fā)揮功能性靶標(biāo)的作用也有所不同。這些研究結(jié)果 不但說明miRNA及其靶標(biāo)具有時空動態(tài)變化的特性，而且也提示miRNA在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮作用的 復(fù)雜性。
[0003] 軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤是骨肉瘤的一個亞型，內(nèi)有較多的具明顯異型性的軟骨成 分。鑒別軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤的意義在于防止其被誤診為軟骨肉瘤，因?yàn)閮烧叩闹委熀皖A(yù) 后有顯著差別。軟骨肉瘤的治療方法主要為手術(shù)切除，預(yù)后與組織學(xué)分型和手術(shù)切除是否 完整有關(guān)，預(yù)后相對較好。而骨肉瘤除手術(shù)切除外需輔以化療，且總體預(yù)后較軟骨肉瘤差。 由于治療方法和預(yù)后的不同，鑒別軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤和軟骨肉瘤對臨床治療方案的確定 具有重要意義，特別是近年來骨肉瘤的治療強(qiáng)調(diào)術(shù)前化療以提高保肢率和生存率，術(shù)前正 確診斷顯得尤為重要。
[0004] 本發(fā)明對軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤患者及健康對照miRNA和mRNA進(jìn)行高通量測序，獲 得其表達(dá)數(shù)據(jù)，生物信息學(xué)分析選取候選基因，進(jìn)而采用RT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及干擾實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 靶標(biāo)，結(jié)果表明本發(fā)明提供的miR-4443及其靶基因與軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤密切相關(guān)，為臨 床診斷及預(yù)防奠定了很好的研究基礎(chǔ)，具有很好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種防治骨肉瘤的制劑，制劑包含：
[0006] (a)抑制劑或抑制劑組合物，抑制劑或抑制劑組合物下調(diào)mir-4443或miR-4443的 轉(zhuǎn)錄，或者阻斷mir-4443或miR-4443的活性；
[0007] (b)藥劑學(xué)上能接受的載體。
[0008] mir-4443的序列為SEQ ID NO l，miR-4443序列為SEQ ID N0 2。
[0009] 優(yōu)選的，采用反義寡核苷酸、miRNA海綿、antagomiRs、Target Masking miRNA Erasers、或多祀點(diǎn)反義寡核苷酸的方法下調(diào)mir-4443或miR-4443的轉(zhuǎn)錄，或者阻斷mir-4443或 miR-4443 的活性。
[0010] 進(jìn)一步，骨肉瘤為軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤。
[0011] 本發(fā)明的目的在于提供上述防治骨肉瘤的制劑在制備骨肉瘤治療藥物或試劑中 的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明提供一種骨肉瘤診斷試劑，骨肉瘤診斷試劑能夠檢測骨肉瘤樣本中mir-4443或miR-4443轉(zhuǎn)錄或免疫方法檢測骨肉瘤樣本中mir-4443或miR-4443調(diào)控的靶基因的 表達(dá)情況。
[0013] 進(jìn)一步，骨肉瘤診斷試劑基于高通量測序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于 探針雜交方法檢測骨肉瘤樣本中mir-4443或miR-4443的轉(zhuǎn)錄或基于免疫方法檢測骨肉瘤 樣本中mir-4443或miR-4443調(diào)控的革巴基因的表達(dá)情況，優(yōu)選采用northern雜交方法、miRNA 表達(dá)譜芯片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)檢測骨肉瘤樣 本中mir-4443或miR-4443的轉(zhuǎn)錄;采用ELISA和/或膠體金試紙條檢測骨肉瘤樣本中mir-4443或miR-4443調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況。優(yōu)選所述mir-4443或miR-4443調(diào)控的靶基因?yàn)?NABP1、CD274、ARL17A，ELI SA和/或膠體金試紙條中含有與NABP1和/或CD274和/或ARL17A蛋 白特異性結(jié)合的抗體。
[0014] 優(yōu)選的，基于定量PCR方法使用引物SEQ ID N0 3檢測骨肉瘤樣本中miR-4443的轉(zhuǎn) 錄。
[0015] 進(jìn)一步，骨肉瘤為軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤。
[0016] 優(yōu)選的，骨肉瘤樣本為外周血。
[0017] 本發(fā)明的目的在于提供上述骨肉瘤診斷試劑在制備骨肉瘤檢測試劑中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明提供mir-4443及miR-4443調(diào)控的靶基因在制備診斷或防治骨肉瘤試劑中 的應(yīng)用。
[0019] 進(jìn)一步，檢測mir-4443及miR-4443調(diào)控的靶基因的試劑在制備診斷骨肉瘤試劑中 的應(yīng)用。
[0020] 進(jìn)一步，上調(diào)mir-4443及miR-4443的靶基因的試劑在制備防治骨肉瘤試劑中的應(yīng) 用。
[0021] 進(jìn)一步，靶基因?yàn)镹ABP1和/或⑶274和/或ARL17A基因。
[0022] 進(jìn)一步，檢測mir-4443或miR-4443調(diào)控的革E1基因的制劑在制備診斷骨肉瘤試劑中 的應(yīng)用。
[0023] 優(yōu)選的，骨肉瘤為軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤。
[0024] 進(jìn)一步，診斷骨肉瘤制劑采用熒光定量PCR試劑盒、基因芯片、免疫方法檢測骨肉 瘤患者外周血中NABP1、⑶274、ARL17A基因的表達(dá)。優(yōu)選的，焚光定量PCR試劑盒中含有特異 性擴(kuò)增NABP1、CD274、ARL17A基因的引物;所述的基因芯片中包括與NABP1、CD274、ARL17A基 因的核酸序列雜交的探針。更優(yōu)選的，熒光定量PCR試劑盒內(nèi)含有特異性檢測NABP1、CD274、 ARL17A基因的上游引物和下游引物，NABP1上游引物序列為SEQ ID N0 4,下游引物序列為 SEQ ID NO 5;CD274上游引物序列為SEQ ID N0 6,下游引物序列為SEQ ID NO 7;ARL17A上 游引物序列為SEQ ID NO 8,下游引物序列為SEQ ID NO 9。
[0025] 進(jìn)一步，骨肉瘤的診斷制劑采用免疫方法檢測骨肉瘤外周血中NABP1、CD274、 ARL17A基因的表達(dá)產(chǎn)物。優(yōu)選的，免疫方法為ELISA檢測和/或膠體金檢測。進(jìn)一步，檢測 NABP1、CD274、ARL17A蛋白的ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒。試劑盒中的抗體可采用市售 的嫩8?1、0)274^此174單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步，試劑盒包括:包被祖8?1、0)274、 ARL17A抗體的固相載體，酶標(biāo)抗體，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照品，稀釋液，洗滌液，酶 反應(yīng)終止液等。
[0026] 進(jìn)一步，檢測NABP1、CD274、ARL17A蛋白的膠體金法為使用檢測試劑盒，抗體可采 用市售的NABP1、⑶2 74、ARL17 A單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步，膠體金檢測試劑盒采用 膠體金免疫層析技術(shù)或膠體金滲濾法。進(jìn)一步，膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測 區(qū)(T)噴點(diǎn)有抗NABP1、⑶274、ARL17A抗體、質(zhì)控區(qū)(C)噴點(diǎn)有免疫球蛋白IgG。
[0027] 本發(fā)明的目的在于提供上述骨肉瘤診斷制劑在制備骨肉瘤診斷工具中的應(yīng)用。 [0028] 進(jìn)一步，上調(diào)NABP1、⑶274、ARL17A基因的制劑在制備防治骨肉瘤試劑中的應(yīng)用。 [0029] 優(yōu)選的，采用構(gòu)建含上述基因的過表達(dá)載體等方式上調(diào)NABP1、CD274、ARL17A基因 的表達(dá)。
[0030] 定義：
[0031] 現(xiàn)階段檢測miRNA的表達(dá)水平的方法主要包括基于高通量測序技術(shù)、基于核苷酸 雜交和基于PCR的miRNA檢測方法。基于探針雜交技術(shù)的miRNA檢測方法是一種直接檢測法， 不需要對樣本RNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，包括northern雜交方法、miRNA表達(dá)譜芯片、核酶保護(hù)分析技 術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球的流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)。
[0032] (1 )Northern 雜交
[0033]又稱RNA印跡技術(shù)為最經(jīng)典的檢測真核生物RNA大小，估計其豐度的實(shí)驗(yàn)方法。基 本原理如下：首先在載體(如娃片、微球或膜等)上固定miRNA樣本，再與經(jīng)過標(biāo)記的探針雜 交，洗滌多余的雜交探針后進(jìn)行信號檢測；也可以在載體上先固定與靶miRNA序列互補(bǔ)的 DNA探針，然后與經(jīng)過標(biāo)記的樣本miRNA雜交，再進(jìn)行信號檢測。信號標(biāo)記的方法包括同位素 標(biāo)記、熒光標(biāo)記和納米金標(biāo)記等。
[0034] (2)miRNA表達(dá)譜芯片
[0035]原理同樣是使用標(biāo)記探針檢測固相支持物上的目標(biāo)分子。通過設(shè)計芯片上miRNA 基因及內(nèi)參序列，可精確分析出樣品中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平?；蛐酒哂懈咄康膬?yōu) 點(diǎn)，可以一次在同一樣本中檢測出幾百個基因的全部表達(dá)。Luminex公司研制的液相芯片 (Liquid chip)又稱多功能懸浮點(diǎn)陣（Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新 一代生物芯片技術(shù)。液相芯片體系由許多小球體為主要基質(zhì)構(gòu)成，每種小球體上固定有不 同的探針分子，為了區(qū)分不同的探針，每一種用于標(biāo)記探針的球形基質(zhì)都帶有一個獨(dú)特的 色彩編號，將這些小球體懸浮于一個液相體系中，就構(gòu)成了液相芯片系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以對同 一個微量樣本中的多個不同分子同時進(jìn)行快速的定性、定量分析，這種檢測技術(shù)被稱為 FMAP(Flexible multianalyte profiling)技術(shù)。分子雜交在懸浮溶液中進(jìn)行，檢測速度極 快。
[0036] (3)核酶保護(hù)分析技術(shù)(RPA)
[0037] miRNA的檢測還可以采用核酶保護(hù)分析技術(shù)，將標(biāo)記好的探針和待測RNA樣本混 合，熱變性后雜交，未雜交的RNA和多余的探針用單鏈核酸酶消化，熱失活核酸酶后純化受 保護(hù)的RNA分子，最后通過變性PAGE電泳分離探針，顯色。這種基于液相雜交的新方法簡單 快速，靈敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。
[0038] (4)RAKE法
[0039] RAKE法（RNA primed array based Klenow emzyme)是在miRNA microarray的基 礎(chǔ)上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA與固定的DNA探針雜交的方法。RAKE可以敏感 特異地檢測miRNA，適用于大量快速的篩選所有己知的miRNA。能夠在特定的細(xì)胞和腫瘤中 檢測miRNA表達(dá)譜情況。不僅如此，RAKE法還可以從由福爾馬林固定了的石蠟包埋的組織中 分離出miRNA并對其進(jìn)行分析，為從存檔標(biāo)本中分析miRNA開啟了希望之門。
[0040] (5)原位雜交（in situ hybridization)
[0041 ] 原位雜交技術(shù)可直觀了解miRNA表達(dá)方式，是觀測miRNA時空表達(dá)的一種較簡便的 方法，常標(biāo)記方式包括地高辛、生物素、熒光標(biāo)記等。鎖定核酸基礎(chǔ)上的原位雜交(Locked Nucleic Acid(LNA)based in situ hybridization(LNA-ISH))是當(dāng)前應(yīng)用較多的探針方 式。
[0042] (6)基于微球的流式細(xì)胞術(shù)(bead-based flow cytometry)
[0043] 是一種液相芯片技術(shù)，該方法將流式細(xì)胞檢測與芯片技術(shù)有機(jī)地結(jié)合起來，兼有 通量大、檢測速度快、靈敏度高和特異性好等特點(diǎn)。
[0044] (7)實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(Real-time PCR，RT-PCR)
[0045] 熒光檢測PCR儀可對整個PCR過程中擴(kuò)增序列的累積速率繪制動態(tài)變化曲線。在反 應(yīng)混合體系中靶序列的起始濃度越大，要求獲得擴(kuò)增產(chǎn)物某特定產(chǎn)量的PCR循環(huán)數(shù)(一般用 特定閾值循環(huán)數(shù)Ct來表達(dá))越少。由于miRNA長度僅為22nt，傳統(tǒng)的qRT-PCR不適合擴(kuò)增如此 短的片段?，F(xiàn)今有幾種用于miRNA的實(shí)時定量PCR方法，如加尾法、頸環(huán)法等。頸環(huán)法是一種 理想的miRNA檢測qRT-PCR方法:首先設(shè)計特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物，以待測miRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄 合成cDNA第一鏈，該cDNA-端為莖環(huán)狀引物，莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開便增加了 cDNA的長度，隨后 以合成的cDNA為模板設(shè)計引物進(jìn)行實(shí)時定量PCR擴(kuò)增。qRT-PCR具有特異性高、靈敏度好、快 速簡單等多種優(yōu)點(diǎn)。
[0046] (8)測序法
[0047] 大部分已知的miRNA都是通過cDNA克隆測序發(fā)現(xiàn)和鑒定的。該法需要先構(gòu)建miRNA 的cDNA文庫，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物隨后克隆到表達(dá)載體上測序。Takada開發(fā)了一種改 進(jìn)的擴(kuò)增克隆法(miRNA amp 1 if i cat ion prof i ling，mRAP)，mRAP 法先在 miRNA的 3 ' 端連上 接頭，然后用與接頭互補(bǔ)的反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄。因?yàn)樘囟ǖ姆崔D(zhuǎn)錄酶具有末端脫氧核苷酸 轉(zhuǎn)移酶活性，一些核苷酸(主要是脫氧胞苷酸)會連接到反轉(zhuǎn)錄出的cDNA鏈的3 '末端。當(dāng)5 ' 端接頭與cDNA鏈的poly (C)粘性末端退火后，加入一對共用引物即可實(shí)現(xiàn)對cDNA的PCR擴(kuò) 增。由于mRAP高度靈敏，可以直接用克隆和測序技術(shù)檢測少量組織中miRNA的表達(dá)量。標(biāo)簽 序列克隆法是一種在在基因表達(dá)系列分析（SAGE)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了檢測效率更高的 miRAGE(miRNA SAGE)克隆法，該法通過生成大的串聯(lián)子，通過單個測序反應(yīng)可檢測多個 miRNA，明顯提高了檢測效率。
[0048] 高通量測序（High-throughput sequencing)又稱下一代測序技術(shù)（next generation sequencing)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進(jìn)行序列測定，極大提高了測序效率。這類大規(guī)模測序技術(shù)極大的提高了多個物種遺 傳信息的解讀速度，為獲取所有miRNA的序列信息，解密miRNA圖譜提供了保證。同時高通量 測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度 測序（deep sequencing)。高通量測序平臺的代表是羅氏公司（Roche)的454測序儀(Roch GSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer)和 ABI的SOLiD測序儀（ABI SOLiD sequencer)。
[0049] 免疫檢測方法是以一種抗體或多種抗體作為分析試劑，對待測物進(jìn)行定量或定性 分析的檢測方法。其基本原理是抗體和抗原之間的相互作用。為提高抗原和抗體檢測的敏 感性，將已知抗體或抗原標(biāo)記上易顯示的物質(zhì)，通過檢測標(biāo)記物，反映有無抗原抗體反應(yīng)， 從而間接測出微量的抗原或抗體。常用的標(biāo)記物有酶、熒光素、放射性同位素、膠體金及電 子致密物質(zhì)等。這種抗原或抗體標(biāo)記上顯示物所進(jìn)行的特異性反應(yīng)稱為免疫標(biāo)記技術(shù) (immunolabelling technique)。目前應(yīng)用最廣的免疫檢測技術(shù)主要有:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，膠體金免疫層析法等。
[0050] 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理是將抗原或抗體與底物(酶)結(jié)合，使其保持免疫反應(yīng)和酶 的活性。把標(biāo)記的抗原或抗體與包被于固相載體上的配體結(jié)合，再使之與相應(yīng)的無色底物 作用而顯示顏色，根據(jù)顯色深淺程度目測或用酶標(biāo)儀測定0D值判定結(jié)果。
[0051] 膠體金試紙條一般由樣品墊、金標(biāo)墊、層析膜、吸水墊四部分組成。層析材料有硝 化纖維膜(NC)、聚酯膜、尼龍膜和PVDF膜等，根據(jù)試驗(yàn)需要可選擇不同要求的膜，其中NC膜 最為常用，使用前可根據(jù)試驗(yàn)具體情況確定是否需要活化或處理，多數(shù)情況下無需處理，即 可直接使用。將金標(biāo)蛋白溶液均勻噴涂在金標(biāo)墊上，于室溫下晾干備用。NC膜可捕獲一定量 的包被(抗體)和二抗作為檢測線和質(zhì)控線。最后將樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水紙依次固定 于PVC板，即成試紙條。
[0052] 基于RNA的microRNA功能獲得性技術(shù)即通過外源性補(bǔ)充miRNAs合成的前體物質(zhì)來 升高miRNAs的水平。例如，可以人工合成與內(nèi)源性miRNA序列一致的短發(fā)夾樣RNA(short hairpin RNA，shRNA)，由聚合酶II或III做啟動子，以病毒為載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，被Dicer酶修飾 后載入RISC發(fā)揮作用，相當(dāng)于升高pre-miRNA的水平，作用效果穩(wěn)定而持久。
[0053]基因特異性miR Mimics技術(shù)該技術(shù)避免了miRNA與基因的非特異性作用。這種人 工合成的與靶基因3'UTR互補(bǔ)結(jié)合的特異性寡核苷酸鏈，能夠起到與miRNA相同的轉(zhuǎn)錄后調(diào) 節(jié)作用。
[0054] 包含在本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的藥劑學(xué)上許可的載體為在制劑時通常利用的載 體，該載體包含乳糖（lactose)、右旋糖(dextrose)、鹿糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘 露醇(mannitol )、淀粉、阿拉伯橡膠、磷酸|丐、藻酸鹽(alginate)、凝膠(gelatin)、娃酸|丐、 微晶纖維素、聚乙稀吡略燒酮化〇17￥；[117]^71'1'〇1丨(1〇116)、纖維素(0611111〇86)、水、糖衆(zhòng)、甲 基纖維素 (methyl cellulose)、羥基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羥基苯 甲酸丙酯（propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸儀（stearic acid magnesium)及礦物 油(mineral oil)等，但并非局限于此。
[0055] 本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物除了上述成分以外還可以包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香 味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。藥劑學(xué)上許可的適合的載體和制劑詳細(xì)記載于雷明登氏 藥學(xué)全書。
[0056] 本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物能通過口服或非口服進(jìn)行給藥，作為非口服給藥時，能通 過靜脈內(nèi)注射，鼻腔內(nèi)注射，局部注射，腦室內(nèi)注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，經(jīng)皮 給藥等方式進(jìn)行給藥。
[0057]本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的適合的給藥劑量根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年 齡、體重、性別、病態(tài)、食物、給藥時間、給藥途徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏性之類的因素而可以 進(jìn)行多種處方，通常，熟練的醫(yī)生能夠容易地決定及處方對所希望的治療或預(yù)防有效的給 藥劑量。
[0058]本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物根據(jù)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易實(shí)施 的方法，利用藥劑學(xué)上能接受的載體和/或賦形劑來進(jìn)行制劑化，從而能夠以單位用量形態(tài) 制備或者內(nèi)裝在多容量容器內(nèi)來制備。此時，劑型是油性或者水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或 乳化液形態(tài)，或者也可以是浸膏劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或者膠囊劑形態(tài)，還可以包括分散 劑或者穩(wěn)定劑。
【附圖說明】
[0059] 圖1是RT-PCR檢測軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤中miR-4443相對表達(dá)水平圖 [0060]圖2是RT-PCR檢測軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤中基因相對表達(dá)水平圖
【具體實(shí)施方式】
[0061] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實(shí)施檢測。
[0062] 實(shí)施例1樣品的收集及總RNA提取
[0063] 3例軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤患者，臨床信息見表1，10名健康對照。軟骨母細(xì)胞型骨肉 瘤患者組3例及對照組10人要求空腹至少12h，于次日清晨7:00~8:00室溫下，抽取10ml靜 脈血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，提取外周血單個核細(xì)胞TOMCs，加入lml Trizol試劑 (Invitrogen公司），充分混勻，-80°C保存標(biāo)本，以用于RNA提取。所有的血樣和病理結(jié)果應(yīng) 真實(shí)可靠，研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情同意。
[0064] 表1軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤患者臨床信息
[0065]
[0066] RNA提取標(biāo)準(zhǔn)：RNA純度：0D260/280 蘭 1 · 8，28S/18S 蘭 1; RNA完整性：RIN值蘭 7 · 0。 RNA完整性檢測方法:Agilent 2100(RNA 6000Nano kit)、瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖凝膠濃 度：1 %瓊脂糖膠；電壓:5V/cm;時間：20min)。
[0067]實(shí)施例2文庫構(gòu)建、測序及數(shù)據(jù)分析
[0068] mRNA文庫構(gòu)建:真核生物mRNA 3'末端具有ployA尾的結(jié)構(gòu)，利用帶有Oligo(dT)的 磁珠富集mRNA，高溫片段化后，以其為模板，合成cDNA。經(jīng)過磁珠純化、末端修復(fù)、3 '末端加 堿基A、加測序接頭后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建mRNA文庫。根據(jù)RNA樣本檢測結(jié)果，對軟骨母細(xì)胞 型骨肉瘤患者與正常對照組進(jìn)行mRNA文庫構(gòu)建。
[0069] sRNA文庫構(gòu)建:實(shí)驗(yàn)采用Illumina TruSeq Small RNA試劑盒構(gòu)建文庫，在總RNA 中回收長度18_30nt RNA，通過RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄成單鍵cDNA，cDNA擴(kuò)增后，回收cDNA產(chǎn)物，建成 小RNAs文庫。根據(jù)RNA樣本檢測結(jié)果，對軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤患者與正常對照組進(jìn)行sRNA文 庫構(gòu)建。
[0070] 測序:運(yùn)用llumina Hiseq2500/Miseq第二代高通量測序技術(shù)對mRNA和miRNA進(jìn)行 測序，通過去接頭、去低質(zhì)量、去污染等過程完成數(shù)據(jù)的處理，得到最終數(shù)據(jù)。
[0071] 通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析軟件對miRNA及mRNA原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正后進(jìn)行t-test得 至丨JP值，然后利用Fisher檢驗(yàn)合并P值，篩選差異表達(dá)miRNA及mRNA。設(shè)定p值<0.01且log 2 $〇1(1_(3113]^6)1101'1]^1丨26(1的絕對值^:3作為顯著性閾值，共篩選出11個差異表達(dá)的1]1丨1^^， 其中表達(dá)水平上調(diào)的miRNA 5個，表達(dá)水平下調(diào)的miRNA 6個。分析過程中設(shè)定P值<0.05， 共篩選出929個差異表達(dá)的mRNA，其中表達(dá)水平上調(diào)的基因455個，表達(dá)水平下調(diào)的基因474 個。其中，表達(dá)上調(diào)明顯的miR-4443-5p納入我們的研究范圍。
[0072] 實(shí)施例3Real-time PCR檢測軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤組織中miR-4443-5p和NABP1、 CD274、ARL17A基因的表達(dá) [0073] 1樣品米集：
[0074] 19例軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤腫瘤患者和36例健康對照的外周血均來自醫(yī)院(采集時 間2014年3月-2015年12月）。
[0075] 2 總 RNA 提?。?br>[0076]相關(guān)實(shí)驗(yàn)物品的去Rnase的處理：
[0077] ①將所有玻璃器皿應(yīng)用前均用DEPC沖洗侵泡，120°C高壓20min，180°C高溫烤干2 小時以上。
[0078]②將塑料器皿（如：EP管/槍頭）使用前需用0.1 % DEPC水侵泡過夜，后控干液體， 120°C高壓20min，烤箱烤干備用。
[0079] 白細(xì)胞分離
[0080] (1)取2ml抗凝外周血(采血時間不超過3h);
[0081] (2)加入等體積無菌PB S于外周血中充分混合，形成細(xì)胞懸液；
[0082] (3)加入4ml淋巴細(xì)胞分離液于另一離心管；
[0083] ( 4 )吸取4m 1細(xì)胞懸液沿管壁輕輕加入到淋巴細(xì)胞分離液表面。離心 1500rpm20min；
[0084] (5)用吸管輕輕吸出界面層入另一離心管中。無菌冷PBS洗2次，最后1次洗滌可以 將細(xì)胞懸液移入EP管中，離心去上清，用于提取RNA。
[0085] RNA 提取
[0086] (1)先加 lml Trizol于EP管中，若凍存細(xì)胞直接加入Trizol，不需解凍，吹打裂解 后室溫靜置5-10min;
[0087] (2)加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置2-3min，在4°C下1 2000轉(zhuǎn)離心15min;
[0088] (3)小心吸出上清水相約600ul移入另一離心管，加入500:1異丙醇，顛倒混勻，室 溫靜置l〇min;
[0089] (4)4Γ1 2000g離心1 Omin，棄上清液，底部可見白色物質(zhì)；
[0090] (5)加入lml 75%冷乙醇旋轉(zhuǎn)洗滌，清洗異丙醇；
[0091] (6)4°C7500g離心5min，去除乙醇后晾5-10min，半透明即可，以20ulDEPC水溶解 RNA。取3u 1RNA樣本，于1.5 %瓊脂糖凝膠中電泳；lulRNA樣品于紫外分光光度計檢測濃度， 以A260/280在1.8-2.0視為RNA樣本合格。
[0092] 3逆轉(zhuǎn)錄
[0093] mRNA 逆轉(zhuǎn)錄：
[0094] 取lyg總RNA作為模板RNA，米用SuperScripl/K. Ill Reverse Transcriptase (invitrogen，貨號18080-044)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。獲得的cDNA 保存放-20 °C冰箱備用。
[0095] miRNA 逆轉(zhuǎn)錄：
[0096] RT體系的配制：lyg總RNA作為模板RNA;5XmiScript HiSpec Buffer 4μ1;10Χ Nucleics Mix 2μ1 ；miScript Reverse Transcriptase Mix 2μ1;滅菌水補(bǔ)平至20μ1 〇ABI 9700型PCR儀上37°C保溫60min使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完全后，95°C5min終止反應(yīng)。加入80μ1 Nuc 1 ease-free Η20稀釋至100μ1儲存在-20 °C冰箱備用。
[0097] 4熒光定量PCR
[0098] 引物設(shè)計：
[0099] NABP1 引物（NM_001031716):
[0100] 正向引物：5'-AGGTCATCAGTCATTAGTTAG-3'SEQ ID NO 4
[0101] 反向引物：5'-AGTGGTGGCATTAGATTC-3'SEQ ID NO 5
[0102] 擴(kuò)增產(chǎn)物長度109bp。
[0103] CD274 引物（NM_001267706):
[0104] 正向引物：5'-GTCTATTCCTAAGTCCTAAC-3'SEQ ID NO 6
[0105] 反向引物：5'-GGTATCATCTCTGCCTAT-3'SEQ ID NO 7
[0106] 擴(kuò)增產(chǎn)物長度105bp。
[0107] ARL17A 引物（NM_001113738):
[0108] 正向引物：5'-TCGGTGACAACATATCTG-3'SEQ ID NO 8
[0109] 反向引物：5'-ATAGCAAGGATGACTGAAC-3'SEQ ID NO 9
[0110] 擴(kuò)增產(chǎn)物長度197bp。
[0111] mRNA的RT-PCR體系的配制：
[0113] mRNAs的表達(dá)檢測每次設(shè)置3個平行管反應(yīng)，以actin作為內(nèi)參。
[0114] 擴(kuò)增程序?yàn)?95°10min，45 個循環(huán)(95°C15s，55°C60s)。
[0115] miRNA的RT-PCR體系的配制：
[0116]
[0117] miRNAs的表達(dá)檢測每次設(shè)置3個平行管反應(yīng)，以snRNA U6作為內(nèi)參。
[0118] 擴(kuò)增程序：95°C lOmin; 40個循環(huán)（95°C 10s，55°C 30s)。
[0119] 5統(tǒng)計學(xué)分析
[0120] 實(shí)時定量PCR擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效 率相近，極限平而無上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴(kuò)增效率較高;樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶 解曲線都是單峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴(kuò)增;根據(jù)qRT-PCR的相對定量公式:2_ 厶(^\100%，比較11^1?-4443、祖8?1、〇)274^虬174基因在軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤組和正常組 中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示:qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，其中miR-4443在軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤組 表達(dá)水平明顯高于正常對照組，約是對照的九倍(具體見圖1)，而NABP1、⑶274、ARL17A在軟 骨母細(xì)胞型骨肉瘤組中的表達(dá)水平低于正常對照，分別約為對照組的十分之四、十分之二 和十分之三(具體見圖2)，以上結(jié)果驗(yàn)證了高通量轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)的整合分析的結(jié)果。
[0121] 實(shí)施例4miR-4443與NABP1、CD274、ARL17A靶基因關(guān)系驗(yàn)證
[0122] 一、材料準(zhǔn)備：
[0123] ( - )標(biāo)本來源
[0124] 人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63購自中科院上海細(xì)胞研究所。
[0125] (二)主要試劑
[0126] Lipofectamine?2000Transfection Reagent(Invitrogen)〇
[0127] NABP1、CD274、ARL17A 引物設(shè)計(見實(shí)施例 3):
[0128] miR-4443序列發(fā)給合成公司，請其化學(xué)合成miR-4443mimics及非特異性對照。 [0129](三)主要溶液 [0130] 1、細(xì)胞培養(yǎng)液
[0131] DMEM培養(yǎng)基+10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清。
[0132] 2、PBS (平衡鹽溶液）
[0133] 在800ml蒸餾水中溶解8g NaCl，0.25g KCl，1.44g Na2HP04和0.24g KH2P04用HC1 調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高壓滅菌，室溫保存。
[0134] 3、0· 25 %胰蛋白酶消化液
[0135] 0.25g胰蛋白酶加入100ml去離子水中，濾器過濾滅菌，分裝備用。
[0136] 二、實(shí)驗(yàn)方法
[0137] 1、細(xì)胞傳代
[0138] (1)將長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去，加入0.25 %胰蛋白酶液lml，覆蓋 細(xì)胞層，瓶口消毒，加蓋；
[0139] (2)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變化，隨著時間的推移，原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形， 細(xì)胞間質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙加大，在還未漂起時將胰酶棄去，加入5ml含10%胎牛血清的培養(yǎng) 液終止消化；
[0140] (3)細(xì)胞計數(shù):取上述細(xì)胞懸液0.5ml，適當(dāng)稀釋后滴入血細(xì)胞計數(shù)板內(nèi)，按白細(xì)胞 計數(shù)法數(shù)四角四大格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，計數(shù)時僅計數(shù)細(xì)胞核和細(xì)胞漿完整的細(xì)胞，成堆的細(xì)胞 按一個細(xì)胞計算，將4大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)按下列公式換算成每毫升細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)： 細(xì)胞總數(shù)/ml = 4大格細(xì)胞總數(shù)/4 X 104 X稀釋倍數(shù)；
[0141] (4)根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，用DMEM完全培養(yǎng)液進(jìn)一步稀釋為每毫升含3 X105個細(xì)胞 濃度，分裝于培養(yǎng)瓶中（8ml/每瓶），放置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.miRNA瞬時轉(zhuǎn)染 [0142] 采用陽離子脂質(zhì)體法進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，操作按照Lipofectamin?2000試劑說明書進(jìn) 行。轉(zhuǎn)染前24h將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種到12孔板中，細(xì)胞計數(shù)約2 X104,常規(guī)培養(yǎng)至轉(zhuǎn) 染當(dāng)天，細(xì)胞融合度為5〇-60%時進(jìn)行試驗(yàn)。將2〇11]\1/4〇11]\1/8〇11]\1111丨1?財111丨111丨(3加入到 lOOulDMEM培養(yǎng)基中，輕柔混勻；另用lOOulDMEM培養(yǎng)基稀釋2ulLipofectamin?2000脂質(zhì)體， 輕柔混勻，室溫孵育5min;混合DMEM-脂質(zhì)體與DMEM-miRNAs，室溫孵育20min，以形成轉(zhuǎn)染復(fù) 合物;然后將上述混合物加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，培養(yǎng)6h后更換完全培養(yǎng)基。其中，非 特異性序列作為陰性對照。培養(yǎng)48h后提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
[0143] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0144] 將miR-4443mimi cs轉(zhuǎn)染至人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63中，48h后提取細(xì)胞總RNA，空白對 照為未轉(zhuǎn)入miRNA的人骨肉瘤細(xì)胞株細(xì)胞，非特異性序列作為陰性對照。定量PCR檢測靶基 因嫩8?1、0)274、4此174的11^祖的水平變化。結(jié)果顯示嫩8?1、0)274^此174表達(dá)水平均有不 同程度的下調(diào)，表明嫩8?1、0)274^此174都是11^-4443的目標(biāo)靶基因，其中0)274下調(diào)表達(dá) 最為顯著，可能是miR-4443優(yōu)先調(diào)控的革E標(biāo)基因。
[0145] 雖然已參考各種優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可進(jìn)行各 種變化，并且可用等同物替代其組件而不背離本發(fā)明的基本范圍。此外，可進(jìn)行許多改動來 使特定情況或材料適合于本發(fā)明的教導(dǎo)而不背離其基本范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種防治骨肉瘤的制劑，制劑包含： (a) 抑制劑或抑制劑組合物，抑制劑或抑制劑組合物下調(diào)mir-4443或miR-4443的轉(zhuǎn)錄， 或者阻斷mir-4443或miR-4443的活性； (b) 藥劑學(xué)上能接受的載體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，骨肉瘤為軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，采用反義寡核苷酸、miRNA海綿、 antagomiRs、Target Masking miRNA Erasers、或多革El點(diǎn)反義寡核苷酸的方法下調(diào)mir-4443 或 miR-4443 的轉(zhuǎn)錄 ，或者阻斷 mir-4443 或 miR-4443 的活性。4. 權(quán)利要求1-3所述的制劑在制備骨肉瘤治療藥物或試劑中的應(yīng)用。5. -種骨肉瘤診斷試劑，其特征在于，所述試劑檢測骨肉瘤樣本中mir-4443或miR-4443轉(zhuǎn)錄或免疫方法檢測骨肉瘤樣本中mir-4443或miR-4443調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑，其特征在于，骨肉瘤樣本為外周血。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑，其特征在于，骨肉瘤診斷試劑基于高通量測序方法或基 于定量PCR方法或基于探針雜交方法檢測骨肉瘤樣本中mir-4443或miR-4443的轉(zhuǎn)錄或基于 免疫方法檢測骨肉瘤樣本中mir-4443或miR-4443調(diào)控的靶基因的表達(dá)情況，優(yōu)選采用 northern雜交方法、miRNA表達(dá)譜芯片、核酶保護(hù)分析技術(shù)、RAKE法、原位雜交、基于微球的 流式細(xì)胞術(shù)檢測骨肉瘤樣本中mir-4443或miR-4443的轉(zhuǎn)錄;采用ELISA或膠體金試紙條檢 測骨肉瘤樣本中mir-4443或miR-4443調(diào)控的革El基因的表達(dá)情況。優(yōu)選所述mir-4443SmiR-4443調(diào)控的靶基因?yàn)镹ABPl、0)274、4此17441^13六或膠體金試紙條中含有與財8?1和/或 CD274和/或ARL17A蛋白特異性結(jié)合的抗體。8. 權(quán)利要求5-7所述的試劑在制備骨肉瘤檢測試劑中的應(yīng)用。 9. mir-4443及miR-4443調(diào)控的靶基因在制備診斷或防治骨肉瘤試劑中的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，靶基因?yàn)镹ABPl和/或CD274和/或ARL17A 基因。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950716SQ201610271797
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】馬翠, 劉陽, 向常娟, 楊承剛
【申請人】固安博健生物技術(shù)有限公司