利用rs4818多態(tài)性檢測(cè)奎硫平和利培酮用藥效果的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用rs4818多態(tài)性檢測(cè)奎硫平和利培酮用藥效果的試劑盒，SNP rs4818位于SEQ ID NO：1所示序列的第790位，該位點(diǎn)為C。本發(fā)明采用Taqman?MGB探針技術(shù)對(duì)COMT基因的第四號(hào)外顯子SNP位點(diǎn)及其頻率分布情況進(jìn)行了檢測(cè)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了COMT基因的第四號(hào)外顯子第21944位C→G多態(tài)性，即其所編碼的蛋白質(zhì)序列中第136位氨基酸Leu(L)→Leu(L)多態(tài)。
【專利說明】
利用rs4818多態(tài)性檢測(cè)奎硫平和利培酮用藥效果的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及的是基因技術(shù)領(lǐng)域的核酸及其引物和檢測(cè)方法，具體涉及一種利用 rs4818多態(tài)性檢測(cè)奎硫平和利培酮用藥效果的試劑盒，特別是一種分離核酸、一種等位基 因特異性的核酸引物和C0MT基因第四號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 奎硫平(Quetiapine)化學(xué)名為11-{4-[2-(2-(羥乙氧基）乙基-1-哌嗪]}二苯并 [13，幻[1，4]硫氮雜草1/2富馬酸鹽，分子式〇2此飩()23_1/2〇4114()4。喹硫平是一種新型的抗精 神病藥，對(duì)多巴胺、5-羥色胺等多種神經(jīng)遞質(zhì)受體均有相互作用。臨床研究表明奎硫平不僅 對(duì)精神分裂癥陽性癥狀有效，對(duì)陰性癥狀也有一定效果。也可以減輕與精神分裂癥有關(guān)的 情感癥狀如抑郁、焦慮及認(rèn)知缺陷癥狀。常見不良反應(yīng)為頭暈、嗜睡、直立性低血壓、心悸、 口干、食欲不振和便秘。亦可引起體重增加、腹痛，無癥狀性ALP增高與血總膽固醇和甘油三 酯增高。雖然與經(jīng)典的抗精神病藥相比，喹硫平所致的藥物不良反應(yīng)雖然較少，耐受性較 好，但是一旦發(fā)生會(huì)造成神經(jīng)系統(tǒng)、肝膽系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷。利培酮 (Risperidone)化學(xué)名為 3-[2-[4-(6_ 氟-1,2-苯并異噁唑-3-基)-1-哌啶]乙基]-6,7,8,9-四氫-2-甲基-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮，分子式為C23H27FN402，是苯異惡唑的衍生物， FDA批準(zhǔn)的第二代抗精神病藥物。它是一種多巴胺拮抗劑，有抗血清素、抗腎上腺、抗組胺的 功能，能與多種受體結(jié)合產(chǎn)生拮抗或者反向激動(dòng)作用。大腦邊緣系統(tǒng)中多巴胺D2受體的阻 斷能改善精神分裂癥的陽性癥狀，包括幻覺、妄想、語言和行為障礙。研究表明，奎硫平和利 培酮的藥效和藥物副作用有明顯的個(gè)體差異，原因是其代謝受到遺傳因素及環(huán)境因素的影 響，但遺傳因素是最主要的原因。因此開發(fā)更多的與奎硫平/利培酮代謝相關(guān)的分子標(biāo)記物 從而對(duì)患者實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療是非常有必要的。
[0003] COMT(Catechol-O-methyltransferase)基因位于人類第 22號(hào)染色體ql 1 · 21上，在 不同的細(xì)胞中被翻譯成不同長(zhǎng)度的蛋白。在大腦的神經(jīng)細(xì)胞中，C0MT基因表達(dá)為膜結(jié)合的 兒茶酚-0-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白；大腦中的兒茶酚-0-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白主要分布在前額葉皮質(zhì) 區(qū)，它可以保證神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺等在一個(gè)穩(wěn)定的水平上。在肝、腎及血液等器官中表達(dá)為 可溶性的兒茶酚-〇-甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白，它可以催化甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移到兒茶酚胺 上，此類物質(zhì)包括神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素等。C0MT基因在代謝治療高血 壓、哮喘、帕金森疾病的兒茶酚藥物方面起著重要的作用。由于奎硫平與多巴胺、5-羥色胺 等多種神經(jīng)遞質(zhì)受體均有相互作用，因此尋找奎硫平和利培酮代謝與C0MT基因多態(tài)性的關(guān) 系是現(xiàn)有技術(shù)急需解決的難題。
[0004] 對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的檢索，未發(fā)現(xiàn)有本發(fā)明的C0MT基因第四號(hào)外顯子SNP rs4818為奎硫 平和利培酮分子標(biāo)記物的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用rs4818多態(tài)性檢測(cè)奎硫 平和利培酮用藥效果的試劑盒，同時(shí)涉及一種分離核酸、一種等位基因特異性的核酸引物。 本發(fā)明通過關(guān)聯(lián)分析找到了COMT基因第四號(hào)外顯子上的SNP rs4818可以作為奎硫平和利 培酮的分子標(biāo)記物。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供一種分離的含單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸，所述核苷酸 的序列如SEQ ID N0:1所示，所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)位于第790位，rs4818為C-G。
[0008] 第二方面，本發(fā)明提供一種所述的核苷酸在制備檢測(cè)奎硫平和利培酮用藥效果的 試劑盒中的用途。
[0009] 第三方面，本發(fā)明提供一種分離的核苷酸，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO: 1所 示，且第790位為C。
[0010] 第四方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)奎硫平和利培酮用藥效果的試劑盒，所述試劑盒 包括:根據(jù)如SEQ ID N0:1所示序列的第790位的上下游設(shè)計(jì)的引物對(duì)，探針。
[0011] 優(yōu)選地，所述引物對(duì)為：
[0012] 正向引物：5 ' -ACGCCGTGATTCAGGAGCA-3 '
[0013] 反向引物：5 ' -TTCACGCCAGCGAAATCCA-3 '
[0014]優(yōu)選地，所述探針為：
[0015] 正向 5，-FAM-AGGCTCATCACCATCGAGA-NFQ-MGB-3，
[0016] 反向5 ' -VIC-AGGCTGATCACCATCGAGA-NFQ-MGB-3 '。
[0017]第五方面，本發(fā)明提供一種所述的試劑盒的非診斷目的使用方法，其特征在于，包 括如下步驟：
[0018] 步驟一，提取樣品DNA;
[0019]步驟二，利用所述引物進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0020] 步驟三，采用Taqman-MGB分型方法，結(jié)合探針，檢測(cè)樣品中是否存在如SEQ ID N0: 1所示的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4818。
[0021] 優(yōu)選地，步驟三包括如下步驟:采用ABI7700熒光定量PCR儀，對(duì)所取樣品的位點(diǎn) rs4818進(jìn)行分型，檢測(cè)第790位否存在單核苷酸多態(tài)性。
[0022]優(yōu)選地，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為50_150bp。
[0023] 優(yōu)選地，所述引物的長(zhǎng)度為15_25bp。
[0024] 優(yōu)選地，步驟二中，所述擴(kuò)增的具體條件如下:反應(yīng)體系總體積為5μ1，其中： 2 XMaster Mix 2. 5M-1? 40 XTaqraan genotype assay 1, 25Pl, DNA 模板 5-lOng,
[0025] ΙΟρΜ SEQ ID So. 3 0. 2μ1；? 10pM SEQ ID No. 4 0. 2μ1, 雙蒸水 補(bǔ)足至.5_u.l;.
[0026] PCR反應(yīng)條件：94°C2mins; 40 X (94°C30s; 58°C30s，72°C30s)72°C 1 Omins。
[0027] 第六方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)所述核苷酸的SNP位點(diǎn)的引物對(duì)，所述引物對(duì) 為：
[0028] 正向引物：5 ' -ACGCCGTGATTCAGGAGCA-3 '
[0029] 反向引物：5 ' -TTCACGCCAGCGAAATCCA-3 '。
[0030] 第七方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)所述核苷酸的SNP位點(diǎn)的探針，所述探針為：
[0031] 正向 5，-FAM-AGGCTCATCACCATCGAGA-NFQ-MGB-3，
[0032]
[0033]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:本發(fā)明為研究C0MT基因多態(tài)性與 臨床用藥安全的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為臨床用藥個(gè)體化提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為基于藥物基 因組學(xué)理念的新藥研發(fā)提供指導(dǎo)依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常照常規(guī)條件，例如Sambrook等 人的分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中 所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0035]本發(fā)明采用的樣品來自上海市精神衛(wèi)生中心的995個(gè)精神分裂癥患者，年齡18~ 60歲。全體參與者均由患者及家屬在正式的知情同意書上同意簽字。
[0036]本發(fā)明采用Taqman-MGB探針技術(shù)對(duì)C0MT基因的第四號(hào)外顯子SNP位點(diǎn)及其頻率分 布情況進(jìn)行了檢測(cè)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 C0MT基因的第四號(hào)外顯子第21944位C-G多態(tài)性(對(duì)應(yīng)SEQ ID N0:1的第790位），即其所編碼的蛋白質(zhì)序列中第136位氨基酸Leu(L)4Leu(L)多態(tài)。 [0037]具體方法如下：
[0038] 在C0MT基因第四號(hào)外顯子上的SNP rs4818上下游設(shè)計(jì)Taqman-MGB引物，擴(kuò)增產(chǎn)物 長(zhǎng)度50-150bp;在上下游引物之間設(shè)計(jì)Taqman-MGB探針，探針長(zhǎng)15-25bp。然后用ABI7700熒 光定量PCR儀對(duì)所取樣品C0MT基因 SNP位點(diǎn)rs4818進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)⑶MT基因第四號(hào)外顯子 SNP(即第21944位C-G多態(tài)性）。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該SNP導(dǎo)致第136位氨基酸由Leu(L)-Leu(L)。
[0039] C0MT基因第四號(hào)外顯子的cDNA序列列于SEQ ID N0:1，其所編碼的氨基酸序列列 于SEQ ID Ν0:2<Χ0ΜΤ基因第四號(hào)外顯子的基因組序列可以從GenBank(ID:1312)中獲得。
[0040] 本發(fā)明有大量的分析技術(shù)可用于檢測(cè)C0MT基因第四號(hào)外顯子中所述位點(diǎn)是否存 在單核苷酸多態(tài)性。這些技術(shù)包括(但并不限于）：DNA測(cè)序、雜交測(cè)序;酶促錯(cuò)配切割、異源 雙鏈分析、點(diǎn)雜交、寡核苷酸陣列(DNA芯片）、Mini-sequencing、分子信標(biāo)等，變性高效液相 色譜法（DHPLC)。另一方面，本發(fā)明的檢測(cè)方法被用于評(píng)估個(gè)體C0MT基因第四號(hào)外顯子 SNPrs4818多態(tài)性與奎硫平和利培酮代謝的關(guān)系。用于本發(fā)明的測(cè)試樣品沒有特別限制，對(duì) 于檢測(cè)SNP而言，可以是從血液、組織等樣品中抽提出的DNA或mRNA。對(duì)于C0MT基因第四號(hào)外 顯子活性而言，可以任何含有C0MT基因第四號(hào)外顯子的樣品，如血液等。
[0041] 本發(fā)明為研究我國(guó)人群中C0MT基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為 臨床用藥個(gè)體化提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為基于藥物基因組學(xué)理念的新藥研發(fā)提供指導(dǎo)依 據(jù)。
[0042]更具體地，本發(fā)明是通過如下方法實(shí)現(xiàn)的：
[0043] 一種核酸的分離和測(cè)序
[0044] 引物設(shè)計(jì)：
[0045] 采用Primer 5.0軟件，以GenBank數(shù)據(jù)庫C0MT基因（ID:1312)第四號(hào)外顯子以及外 顯子與內(nèi)含子接合部位序列為模板設(shè)計(jì)一對(duì)引物，由Invitrogen公司合成。
[0046] 引物信息：
[0047]擴(kuò)增C0MT基因第四號(hào)外顯子SNP位點(diǎn)的DNA序列引物信息：
[0048] 正向引物（SEQ ID No.3):5'-ACGCCGTGATTCAGGAGCA-3'
[0049] 反向引物（SEQ ID No.4):5'-TTCACGCCAGCGAAATCCA-3'
[0050] Taqman-MGB 探針
[0051] 正向5，-FAM-AGGCTCATCACCATCGAGA(SEQIDNo·5)-NFQ-MGB-3，
[0052] 反向5，-VIC-AGGCTGATCACCATCGAGA(SEQIDNo·6)-NFQ-MGB-3，
[0053] PCR擴(kuò)增條件：（體系各項(xiàng)試劑除DNA外均由ABI公司提供）
[0054] 反應(yīng)體系總體積為5μ1，其中 2 X Mas ter Mix 2. 5:μΙ， 40XTaqman genotype assay 1, 25)^1, DNA 模板 5-1.0n:g:，
[0055] ΙΟρΜ SEQ ID No. 3 G. 2μ1? 10pM SEQ ID No：, 4 0,2W, 雙蒸水 補(bǔ)足至5ul;
[0056] PCR 反應(yīng)條件：94Γ2π?η8;40Χ(94Γ308;58Γ308,72Γ308)72Γ?0π?η8。
[0057] 上述PCR反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，置于ABI7700熒光定量PCR儀中，可以讀出各個(gè)樣品 中C0MT基因第四號(hào)外顯子SNPr s4818多態(tài)性。比較發(fā)現(xiàn)C0MT基因第四號(hào)外顯子SNP有多態(tài)性 (即第21944位C-G)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該SNP導(dǎo)致第136位氨基酸由L eU(L)-LeU(L);關(guān)聯(lián)分析 發(fā)現(xiàn)C0MT基因第四號(hào)外顯子SNPr s4818的C基因型與G基因型患者用奎硫平治療前后的P值 為0.007(見表1)，用利培酮治療前后的P值為0.039(見表2)，兩種藥物治療前后都有顯著的 個(gè)體差異。
[0058] C0MT基因⑶S及其多態(tài)性位點(diǎn)的⑶S序列如SEQ ID N0.1所示;C0MT基因⑶S及其多 態(tài)性位點(diǎn)的氨基酸序列如SEQ N0.2所示。
[0059] 以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影 響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
[0060] 表 1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離的含單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)位于第790位，rs4818為C-G。2. -種如權(quán)利要求1所述的核苷酸在制備檢測(cè)奎硫平和利培酮用藥效果的試劑盒中的 用途。3. -種分離的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID N0:1所示，且第790位 為C。4. 一種檢測(cè)奎硫平和利培酮用藥效果的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:根據(jù)如 SEQ ID NO: 1所示序列的第790位的上下游設(shè)計(jì)的引物對(duì)，探針。5. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述引物對(duì)為： 正向引物:5 ' -ACGCCGTGATTCAGGAGCA-3 ' 反向引物：5 ' -TTCACGCCAGCGAAATCCA-3 '6. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是，所述探針為： 正向 5 ' -FAM-AGGCTCATCACCATCGAGA-NFQ-MGB-3 ' 反向5 '-VIC-AGGCTGATCACCATCGAGA-NFQ-MGB-3 '。7. -種如權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)所述的試劑盒的非診斷目的使用方法，其特征在于，包 括如下步驟： 步驟一，提取樣品DNA; 步驟二，利用所述引物進(jìn)行擴(kuò)增，得擴(kuò)增產(chǎn)物； 步驟三，采用Taqman-MGB分型方法，結(jié)合探針，檢測(cè)樣品中是否存在如SEQ ID N0:1所 示的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs4818。8. 如權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征是，步驟三包括如下步驟:采用ABI7700熒光定 量PCR儀，對(duì)所取樣品的位點(diǎn)rs4818進(jìn)行分型，檢測(cè)第790位否存在單核苷酸多態(tài)性。9. 如權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征是，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為50-150bp。10. 如權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征是，所述引物的長(zhǎng)度為15-25bp。11. 如權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征是，步驟二中，所述擴(kuò)增的具體條件如下：反 應(yīng)體系總體積為5μ1，其中： 2 XMaster Mix 2. 5μ1, 40Χ Taqman genotype assay 1. 25Μ?. DNA 模板 5-IQng， ΙΟρΜ SEQ ID Nq, 3 ：〇, 2P-1, ΙΟρΜ SEQ ID No. 4 0* 2.μ1, 雙蒸水 補(bǔ)足至5u]_; PCR反應(yīng)條件：94 °C 2mins; 40 X (94 °C 30s; 58 °C 30s，72 °C 30s) 72 °C lOmins。12. -種用于檢測(cè)如權(quán)利要求1所述核苷酸的SNP位點(diǎn)的引物對(duì)，其特征在于，所述引物 對(duì)為： 正向引物:5 ' -ACGCCGTGATTCAGGAGCA-3 ' 反向引物：5'-TTCACGCCAGCGAAATCCA-3'。13.-種用于檢測(cè)如權(quán)利要求1所述核苷酸的SNP位點(diǎn)的探針，其特征在于，所述探針 為： 正向 5 ' -FAM-AGGCTCATCACCATCGAGA-NFQ-MGB-3 ' 反向5 '-VIC-AGGCTGATCACCATCGAGA-NFQ-MGB-3 '。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105950724SQ201610297944
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月6日
【發(fā)明人】秦勝營(yíng), 周偉, 徐青青, 施燁, 沈陸, 賀林
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)