基于分裂式識別模式結(jié)合級聯(lián)信號放大策略檢測microRNA的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于分裂式識別模式結(jié)合級聯(lián)信號放大策略設(shè)計的檢測miRNA的試劑和檢測方法，所述檢測miRNA的試劑包含具有粘性末端的發(fā)夾識別探針、輔助識別探針和具有G四倍體互補序列和切刻酶識別位點的鎖式DNA?？梢詫崿F(xiàn)將目標(biāo)miRNA從同源性序列中準(zhǔn)確的區(qū)分出來，方法的選擇性好，靈敏度高，方法的檢測限為3.2pM。本發(fā)明還進行了血清中的加標(biāo)回收實驗，回收率范圍為96％?102％。結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測試劑和檢測方法對于臨床診斷和疾病治療方面miRNA的檢測具有較大的應(yīng)用潛力。
【專利說明】
基于分裂式識別模式結(jié)合級聯(lián)信號放大策略檢測m i croRNA的 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于分裂式識別模式結(jié)合級聯(lián)信號放大策略檢測microRNA的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA分子，具有18-24個堿基的長度，通過對 靶基因 mRNA進行切割或者抑制翻譯調(diào)控基因的表達。此調(diào)控功能使得miRNA在許多生理學(xué) 過程中發(fā)揮重要的作用，例如細胞的增殖、迀移和凋亡。最近研究表明miRNA的異常表達與 癌癥的引發(fā)和發(fā)展密切相關(guān)。miRNA已經(jīng)被作為生物標(biāo)志物用于癌癥的診斷和治療。因此， 特異和靈敏的檢測miRNA對于臨床診斷和疾病治療至關(guān)重要。
[0003] miRNA同族成員之間具有序列相似、序列短、豐度低、易降解等特點，因此，對于 miRNA的檢測方法需要具備良好的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性。miRNA的傳統(tǒng)檢測方法有:實時 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、微陣列技術(shù)和Northern印跡法。除此之外，還有熒光法、電化學(xué)法、比色法 和生物發(fā)光法。在這些方法中，識別模式對于miRNA的特異性檢測至關(guān)重要。近期報道的識 別模式主要是基于直接雜交反應(yīng)的識別模式和基于連接反應(yīng)的識別模式。盡管這些識別模 式在一定程度上提高了miRNA檢測的特異性，但是仍然存在某些限制。例如:在基于直接雜 交反應(yīng)的識別模式中，miRNA的特異性識別是基于簡單的Watson-Crick配對。但是比較小的 熱力學(xué)能變化使得該識別模式具有較差的特異性。在基于連接反應(yīng)的識別模式中，miRNA的 特異性識別是基于連接酶在完全匹配的末端通過連接反應(yīng)連接探針。然而，當(dāng)堿基錯配的 位置遠離連接位點時，該識別模式不能表現(xiàn)出滿意的特異性。
[0004] 粘性末端介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)是一個可控的反應(yīng)。在這個反應(yīng)中，目標(biāo)序列與兩條 雜交鏈中的一條的粘性末端雜交，引發(fā)鏈置換反應(yīng)。當(dāng)目標(biāo)物與粘性末端互補的部分與粘 性末端完全匹配時，目標(biāo)物從粘性末端的解離速率比鏈置換的速率慢。然而，當(dāng)目標(biāo)物與粘 性末端互補的部分存在錯配時，目標(biāo)物從粘性末端的解離速率比鏈置換的速率快，不能引 發(fā)鏈置換反應(yīng)。李課題組構(gòu)建了一種基于粘性末端介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)的識別模式用于特異 性檢測miRNA。與基于直接雜交反應(yīng)和連接反應(yīng)的識別模式相比，該識別模式具有一個額外 的競爭鏈，因此表現(xiàn)出較高的特異性。然而，該識別模式在特異性檢測堿基錯配位置遠離粘 性末端的同源序列時依舊存在限制。因此，亟需發(fā)展一種能夠區(qū)別堿基錯配序列位于任何 位置的miRNA特異識別模式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于分裂式識別模式 結(jié)合級聯(lián)信號放大策略檢測miRNA的方法。其中，分裂式識別模式的雙部分識別能力使得該 策略具有良好的選擇性，級聯(lián)信號放大的高放大效率使得該策略具有較高的靈敏度，檢測 限達3.2pM，對于臨床診斷和疾病治療方面具有較大的應(yīng)用潛力。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明的第一方面，提供一種用于檢測miRNA的發(fā)夾識別探針(HP)和輔助識別探 針(AP);
[0008] 所述發(fā)夾識別探針包括:聚合模板序列、切刻酶識別序列和miRNA識別序列I;
[0009] 所述輔助識別探針包括:miRNA識別序列II和引物序列；
[0010] 所述miRNA識別序列I和miRNA識別序列II與待檢測的miRNA序列互補，用于同時識 別miRNA。
[0011] 所述切刻酶識別序列為:5' -G CTG AGG-3'。
[0012] 所述引物序列為：5'-ATG GGA GTT GAG TG-3'。
[0013] 在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，提供了一種用于檢測let_7b的發(fā)夾識別探針和 輔助識別探針；
[0014] 所述發(fā)夾識別的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;具體如下：
[0015] HP:5'-GGG AGT TGA GTG CTG AGG TTT TTC ACT CAA CTC CCT ACT ACC TCA-3' (SEQ ID NO.1);(序列中，正常字體部分為聚合模板序列，加粗字體部分為切刻酶識別序 列，斜體部分為miRNA識別序列I)
[0016] 所述輔助識別探針的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示;具體如下：
[0017] AP:5'-AAC CAC ACA ACC ATG GGA GTT GAG TG-3'（SEQ ID Ν0·2);(序列中，正常 字體部分為引物序列，斜體部分為miRNA識別序列II)
[0018] 上述發(fā)夾識別探針和輔助識別探針可以用于miRNA的識別和檢測。
[0019] 本發(fā)明的第二方面，提供一種檢測miRNA的試劑，包含：
[0020] 上述發(fā)夾識別探針(HP)、輔助識別探針(AP)和具有G四倍體互補序列和切刻酶識 別位點的鎖式DNA;
[0021] 所述鎖式DNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，具體如下：
[0022] Padlock DNA：p-AGT GCT GAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GAA ACC CAACCCGCCCTACCCGCTGAGGGAGTTG(SEQIDN0.3)。（序列中，加粗字體部分為切刻 酶識別序列）
[0023] 進一步的，所述試劑中還包含：KF聚合酶、Nt.BbvCI切刻酶、T4DNA連接酶和 Phi29DNA聚合酶。
[0024]本發(fā)明的第三方面，提供一種檢測miRNA的方法，步驟如下：
[0025] (1)制備不同濃度的miRNA溶液，加入發(fā)夾識別探針和輔助識別探針，恒溫孵育;再 加入KF聚合酶、Nt.BbvCI切刻酶和dNTPs，進行鏈置換放大反應(yīng)；
[0026] (2)向步驟（1)反應(yīng)后的溶液中加入鎖式DNA和T4DNA連接酶，恒溫孵育，進行連接 反應(yīng);再加入Nt. BbvCI切刻酶、Phi29DNA聚合酶和dNTPs，進行循環(huán)滾環(huán)放大反應(yīng)；
[0027] (3)向步驟(2)反應(yīng)后的溶液中加入NMM和KC1，孵育，檢測熒光強度，構(gòu)建凈熒光強 度與miRNA濃度之間的線性方程，對待測樣品，可通過測定樣品的凈熒光強度，代入線性方 程，計算樣品的miRNA濃度。
[0028]步驟(1)中，所述恒溫孵育的條件為:37°C恒溫孵育lh。
[0029]步驟（1)中，所述鏈置換放大反應(yīng)的條件為：37°C恒溫孵育0.5h，然后于85°C加熱 20min使酶失活，結(jié)束反應(yīng)。
[0030] 步驟(2)中，所述恒溫孵育的條件為:37°C恒溫孵育lh。
[0031] 步驟(2)中，所述循環(huán)滾環(huán)放大反應(yīng)的條件為：37°C下孵育1.5-4.011，然后于751€ 加熱20min使酶失活，結(jié)束反應(yīng)。
[0032]步驟(3)中，熒光強度檢測的光譜條件為:發(fā)射光譜范圍為550~680nm，激發(fā)波長 為399nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為10nm，激發(fā)電壓為700V，選擇612nm處熒光發(fā)射強度為 衡量標(biāo)準(zhǔn)。
[0033]在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，步驟(3)，構(gòu)建的凈熒光強度與miRNA(let-7b) 濃度之間的線性方程為：7 = 95.4+2.96\101%其中，7為凈熒光強度（即？+〇^為含有 miRNA的樣品的熒光強度，F(xiàn)o為不含miRNA的樣品的熒光強度）;X為miRNA濃度。
[0034] 上述線性方程的線性范圍為10pM-10nM。
[0035] 本發(fā)明的基于分裂式識別模式結(jié)合級聯(lián)信號放大策略檢測miRNA的原理為：
[0036] 分裂式的識別模式包含兩種特異性的識別過程，這兩種特異性的識別過程分別是 基于粘性末端介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)和直接雜交反應(yīng)。基于此，本發(fā)明設(shè)計了兩種特異性探針， 即：具有粘性末端的發(fā)夾識別探針(HP)和輔助識別探針(AP)。
[0037] 首先，發(fā)夾探針的粘性末端和輔助探針同時識別部分miRNA，然后進行鏈置換反應(yīng) 將發(fā)夾探針打開形成穩(wěn)定的DNA Y型結(jié)構(gòu)。接下來，DNA Y型結(jié)構(gòu)中的輔助探針能夠作為引 物在KF聚合酶和dNTPs的存在下引發(fā)聚合反應(yīng)，生成具有Nt. BbvCI切刻位點的雙鏈DNA。然 后引發(fā)聚合切刻鏈置換放大反應(yīng)，釋放出許多的觸發(fā)序列。最后，這些觸發(fā)序列與設(shè)計有G 四倍體互補序列和切刻酶識別位點的鎖式DNA雜交引發(fā)循環(huán)滾環(huán)放大反應(yīng)，產(chǎn)生許多G四倍 體序列。G四倍體序列能夠綁定N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)，產(chǎn)生增強的熒光信號，實現(xiàn)級聯(lián) 信號放大。相反，當(dāng)miRNA不存在時，HP和AP不能夠相互雜交，因為HP和AP雜交雙鏈的解旋溫 度(Tm~41°C )比HP自身的解旋溫度(Tm~76 °C )低。因此不能夠形成DNA Y型結(jié)構(gòu)引發(fā)放大 反應(yīng)，產(chǎn)生較低的背景信號。其檢測的原理具體如圖1所示。
[0038] 本發(fā)明的關(guān)鍵在于對miRNA具有識別能力的探針的設(shè)計，本發(fā)明將miRNA的識別序 列設(shè)計在兩個不同的識別探針上。分裂式識別模式的雙部分識別能力使得該策略具有良好 的選擇性，在本發(fā)明的一個實施例中，能夠?qū)et-7b從同源性序列中準(zhǔn)確的區(qū)分出來。而 且，級聯(lián)信號放大的高放大效率使得該策略具有較高的靈敏度，檢測限為3.2pM。
[0039] 本發(fā)明的有益效果：
[0040] 本發(fā)明的miRNA檢測試劑和檢測方法是基于分裂式識別模式結(jié)合級聯(lián)信號放大策 略進行設(shè)計的，可以實現(xiàn)將目標(biāo)miRNA從同源性序列中準(zhǔn)確的區(qū)分出來，方法的選擇性好， 靈敏度高，方法的檢測限為3.2pM。本發(fā)明還進行了血清中的加標(biāo)回收實驗，回收率范圍為 96%-102%。結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測試劑和檢測方法對于臨床診斷和疾病治療方面miRNA 的檢測具有較大的應(yīng)用潛力。
【附圖說明】
[0041] 圖1:分裂式識別模式結(jié)合級聯(lián)信號放大策略用于高特異、靈敏檢測miRNA的原理 圖；
[0042]圖2:不同情況下miRNA檢測策略的熒光發(fā)射光譜；
[0043]圖3: A為不同濃度miRNA的熒光發(fā)射光譜;B為不同濃度miRNA與F-F〇的線性關(guān)系；
[0044] 圖4:不同miRNA的相對熒光響應(yīng)。
【具體實施方式】
[0045] 結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。
[0046] 實驗試劑和儀器：
[0047] 本發(fā)明實施例中所用到的實驗試劑和儀器如下：
[0048] HPLC純化的miRNAs、dNTPs和焦碳酸二乙酯(DEPC)購自生工生物工程有限公司（中 國，上海）。KF聚合酶、Nt. BbvCI切刻酶、T4DNA連接酶購自NEB(中國，北京）。Phi29DNA聚合酶 購自賽默飛世爾科技公司（中國，上海）。_購自百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司（中國，北京）。實 驗中所用其他化學(xué)試劑都為分析純，且使用過程中無需進一步的純化。0.1%DEPC處理的去 離子水被用于整個實驗過程中。實驗中所用核酸鏈由生工生物工程股份有限公司（上海，中 國）合成和純化。
[0049] 實驗中所需緩沖液組成如下：
[0050] KC1 溶液：2M KC1。
[0051] Cut smart緩沖液：50mM KAc，20mM Tris-HAc，10mM Mg(Ac)2，lOOyg/mL BSA，pH 7.9〇
[0052] T4連接酶緩沖液：400mM Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT，5mM ΑΤΡ,ρΗ 7.8。
[0053] 熒光測量使用日立F-7000熒光光譜儀進行測定（日本，日立公司）。
[0054]實施例1:基于分裂式識別模式結(jié)合級聯(lián)信號放大策略檢測miRNA(let-7b)
[0055] 具體方法如下：
[0056] (1)探針的設(shè)計
[0057] 分別設(shè)計具有粘性末端的發(fā)夾識別探針(HP)和輔助識別探針(AP)，其核苷酸序列 如下：
[0058] HP:5'-GGG AGT TGA GTG CTG AGG TTT TTC ACT CAA CTC CCT ACT ACC TCA-3' (SEQ ID N0.1)；
[0059] AP:5'-AAC CAC ACA ACC ATG GGA GTT GAG TG-3'（SEQ ID N0.2);
[0060] 設(shè)計有G四倍體互補序列和切刻酶識別位點的鎖式DNA，其核苷酸序列如下：
[0061] p-AGT GCT GAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GGA GTT G(SEQ ID N0.3)〇
[0062] (2)DNA Y型結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的鏈置換放大反應(yīng)
[0063] HP在95°C退火5min，然后緩慢冷卻至室溫，以形成正確的結(jié)構(gòu)。向1 XCut Smart (50mM KAc，20mM Tris-HAc，10mM Mg(Ac)2，100yg/mL BSA，pH 7.9)中加入20nM的ΗΡ、0·50-25nM的AP以及不同濃度的miRNA溶液，在37 °C下孵育lh。隨后，向上述混合液中加入1U KF聚 合酶、2U Nt.BbvCI和3yL(10mM)的dNTPs，在37°C下孵育0.5h進行鏈置換放大反應(yīng)。然后將 反應(yīng)體系于85°C加熱20min使酶失活，然后緩慢冷卻至室溫。
[0064] (3)基于鎖式DNA的循環(huán)滾環(huán)放大反應(yīng)
[0065]向上述反應(yīng)體系中加入3yL 10XT4DNA ligase buffer(400mM Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT，5mM ΑΤΡ,ρΗ 7·8)，50-1200ηΜ的鎖式DNA和 120U T4DNA連接酶，在37°C下 孵育lh進行連接反應(yīng)。隨后，加入3yL(10mM)的dNTPs、2yL lOXCut Smart、4U Nt.BbvCI和 0.5-5. OU Phi29DNA聚合酶，在37°C下孵育1.5-4. Oh進行循環(huán)滾環(huán)放大反應(yīng)。然后將反應(yīng)系 統(tǒng)于75°C加熱20min使酶失活，然后緩慢冷卻至室溫。
[0066] (4)熒光光譜的測量
[0067] 向上述反應(yīng)系統(tǒng)中加入1-7μΜ的NMM和5yL(2M)的KC1，在37°C下孵育lh。然后用 Hitachi F-7000熒光光譜儀（日立有限公司，日本，東京)測量所有樣品的熒光光譜。發(fā)射光 譜范圍為550~680nm，激發(fā)波長為39911111。61211111處的熒光強度用于評估該傳感系統(tǒng)的性能。 激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為l〇nm，激發(fā)電壓為700V。構(gòu)建凈熒光強度與miRNA濃度之間的線 性方程，對待測樣品，可通過測定樣品的凈熒光強度，代入線性方程，計算待測樣品的miRNA 濃度。
[0068] 實施例2:本發(fā)明的檢測方法的可行性研究
[0069] 為了驗證本發(fā)明的檢測方法的可行性，本發(fā)明考察了不同情況下反應(yīng)體系的熒光 發(fā)射光譜。結(jié)果如圖2所示，在陰性體系，即當(dāng)miRNA不存在時，系統(tǒng)表現(xiàn)出很弱的熒光信號 (曲線a)，此結(jié)果表明當(dāng)miRNA不存在時，HP和AP不能夠相互雜交，因此不能夠形成DNA Y型 結(jié)構(gòu)引發(fā)放大反應(yīng)。與之相反，陽性體系，即當(dāng)加入miRNA后，可以觀察到明顯的熒光強度增 強（曲線d)，這表明HP的粘性末端和AP能夠同時識別部分miRNA形成穩(wěn)定的DNA Y型結(jié)構(gòu)并 引發(fā)級聯(lián)信號擴增反應(yīng)。與陽性反應(yīng)體系相比，當(dāng)體系中缺乏進行循環(huán)滾環(huán)放大反應(yīng)的 Nt.BbvCI切刻酶時，系統(tǒng)表現(xiàn)為降低的熒光信號（曲線b)。該結(jié)果表明，與線性滾環(huán)放大反 應(yīng)相比，Nt.BbvCI輔助的循環(huán)滾環(huán)放大反應(yīng)具有較高的放大效率。
[0070] 本發(fā)明還設(shè)計了不含"AT"的輔助識別探針(AP)，其核苷酸序列為:AAC CAC ACA ACC GGG AGT TGA GTG〇
[0071] 當(dāng)AP不含有"AT"突出堿基時，系統(tǒng)表現(xiàn)為降低的熒光信號（曲線c)。該結(jié)果與以有 報道相符，即未配對的突出核苷酸能夠穩(wěn)定三項節(jié)結(jié)構(gòu)。以上實驗結(jié)果表明，該本發(fā)明的檢 測方法是可行的。
[0072] 實施例3:本發(fā)明的檢測方法的靈敏度考察
[0073]為了評估本發(fā)明檢測方法的分析性能，我們在最優(yōu)條件下測量了不同濃度miRNA 的熒光發(fā)射光譜，結(jié)果如圖3A所示。隨著miRNA濃度從0增加到10nM，熒光強度也逐漸增加。 構(gòu)建凈熒光強度與miRNA濃度之間的線性方程，結(jié)果如圖3B所示，凈信號F-F〇與10pM-10nM 濃度范圍的miRNA呈線性關(guān)系，檢測限為3.2pM。該方法較高的靈敏度主要歸因于鏈置換放 大反應(yīng)和循環(huán)滾環(huán)放大反應(yīng)結(jié)合的級聯(lián)信號放大策略的高放大效率。
[0074] 實施例4:本發(fā)明的檢測方法的選擇性考察
[0075] 選擇性是評價檢測方法的重要指標(biāo)，為了考察本發(fā)明檢測方法的選擇性，我們在 相同的實驗條件下檢測了 let-7家族中l(wèi)et-7b的幾種同源序列（如表1所示），結(jié)果如圖4所 示。當(dāng)let_7b存在時，可以產(chǎn)生顯著增強的相對熒光強度。其余同源序列卻表現(xiàn)出較低的相 對熒光強度。該結(jié)果表明無論同源序列的堿基錯配位于哪一位置，該方法都能夠精確的將 let_7b區(qū)別出來。該策略較高的特異性主要歸功于分裂式識別模式雙部分的識別能力。
[0076] 表1:
[0078] 實施例5:本發(fā)明的檢測方法的精密度和重現(xiàn)性考察
[0079] 精密度和重現(xiàn)性是衡量分析方法實際應(yīng)用的重要參數(shù)，我們通過計算日內(nèi)和日間 實驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來評估本發(fā)明檢測方法的精密度和重現(xiàn)性(n = 3)。選擇的高、 中、低三個濃度分別為8. OnM，4. OnM和1 OOpM。日內(nèi)RSD分別為1.1 %，2.9 %和1.4%。相同濃 度下，日間RSD分別為2.8%，5.3%和4.1%。這些結(jié)果表明：本發(fā)明的檢測方法具有可接受 的精密度和重現(xiàn)性。
[0080] 實施例6:復(fù)雜生物樣品的分析
[0081] 為了評估本發(fā)明檢測方法在復(fù)雜生物樣品中的實際應(yīng)用，我們在10%的人血清樣 品中進行了加標(biāo)回收實驗。選擇的高、中、低三個濃度分別為8. OnM，4. OnM和1 OOpM?；厥章?分別為98%、102%和96%，且RSD分別為2.3%、4.8%和3.4%。這些結(jié)果表明，復(fù)雜生物樣 品中的干擾效應(yīng)可以忽略，該方法對于復(fù)雜生物樣品中miRNA的檢測具有很大的應(yīng)用潛力。
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測miRNA的發(fā)夾識別探針和輔助識別探針； 所述發(fā)夾識別探針包括:聚合模板序列、切刻酶識別序列和miRNA識別序列I; 所述輔助識別探針包括:miRNA識別序列II和引物序列； 所述miRNA識別序列I和miRNA識別序列II與待檢測的miRNA序列互補，用于同時識別 miRNAo2. 如權(quán)利要求1所述的發(fā)夾識別探針和輔助識別探針，其特征在于，所述切刻酶識別序 列為：5'-G CTG AGG-3' ； 所述引物序列為:5'-ATG GGA GTT GAG TG-3'。3. -種用于檢測let-7b的發(fā)夾識別探針和輔助識別探針，其特征在于， 所述發(fā)夾識別探針的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 所述輔助識別探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4. 一種檢測miRNA的試劑，其特征在于，包含： 權(quán)利要求1-3任一項所述的發(fā)夾識別探針、輔助識別探針，以及具有G四倍體互補序列 和切刻酶識別位點的鎖式DNA; 所述鎖式DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。5. 如權(quán)利要求1所述的檢測miRNA的試劑，其特征在于，所述試劑中還包含:KF聚合酶、 Nt.BbvCI切刻酶、T4 DNA連接酶和Phi29 DNA聚合酶。6. -種利用權(quán)利要求4或5所述的試劑檢測miRNA的方法，其特征在于，步驟如下： (1) 制備不同濃度的miRNA溶液，加入發(fā)夾識別探針和輔助識別探針，恒溫孵育;再加入 KF聚合酶、Nt. BbvCI切刻酶和dNTPs，進行鏈置換放大反應(yīng)； (2) 向步驟（1)反應(yīng)后的溶液中加入鎖式DNA和T4 DNA連接酶，恒溫孵育，進行連接反 應(yīng);再加入Nt. BbvCI切刻酶、Phi29 DNA聚合酶和dNTPs，進行循環(huán)滾環(huán)放大反應(yīng)； (3) 向步驟(2)反應(yīng)后的溶液中加入NMM和KCl，孵育，檢測熒光強度，構(gòu)建凈熒光強度與 miRNA濃度之間的線性方程，對待測樣品，可通過測定樣品的凈熒光強度，代入線性方程，計 算樣品的miRNA濃度。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（1)中，所述鏈置換放大反應(yīng)的條件為： 37°C恒溫孵育0.5h，然后于85°C加熱20min使酶失活，結(jié)束反應(yīng)。8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（2)中，所述循環(huán)滾環(huán)放大反應(yīng)的條件 為:37°C下孵育1.5-4.011，然后于75°(：加熱2〇1^11使酶失活，結(jié)束反應(yīng)。9. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（1)和步驟(2)中，所述恒溫孵育的條件 均為:37°C恒溫孵育lh。10. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，熒光強度檢測的光譜條件為:發(fā) 射光譜范圍為550~680nm，激發(fā)波長為399nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為10nm，激發(fā)電壓 為700V，選擇612nm處熒光發(fā)射強度為衡量標(biāo)準(zhǔn)。
【文檔編號】C12N15/11GK105950755SQ201610436672
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】姜瑋, 王磊, 王瑞
【申請人】山東大學(xué)