西葫蘆花葉病毒的全基因序列及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及西葫蘆花葉病毒的全基因序列及其檢測方法。所述西葫蘆花葉病毒的基因組經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。根據(jù)病毒全基因序列設(shè)計(jì)出可快速檢測西葫蘆花葉病毒的特異性引物和探針，并在此基礎(chǔ)上建立了熒光定量PCR檢測方法，可從發(fā)病植物組織及土壤中復(fù)雜的病原菌環(huán)境以及攜帶此病毒的棉蚜體內(nèi)快速、準(zhǔn)確地檢測出西葫蘆花葉病毒。根據(jù)該方法構(gòu)建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，對西葫蘆花葉病疫情的早期預(yù)警、疫區(qū)的病原監(jiān)測等方面具有重要意義。
【專利說明】
西葫蘆花葉病毒的全基因序列及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物學(xué)及分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及西萌蘆花葉病毒的 全基因序列及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 西萌蘆病毒病又稱花葉病，是萌蘆科蔬菜的一個(gè)重要病害。據(jù)近幾年調(diào)查，無論是 露地栽培還是保護(hù)地栽培均有發(fā)生，發(fā)病嚴(yán)重地塊可以造成30%~40%減產(chǎn)。西萌蘆病毒 病是由多種病毒單獨(dú)或復(fù)合侵染所致。通常癥狀表現(xiàn)為花葉、皺縮、混合等3種類型。花葉型 表現(xiàn)為葉片上出現(xiàn)黃綠不勻的斑駁，可引起全株萎蔫。皺縮型表現(xiàn)為沿新葉葉脈出現(xiàn)濃綠 色隆起皺紋或葉片變小，出現(xiàn)蕨葉、裂片，在果面出現(xiàn)花斑或產(chǎn)生凹凸不平的瘤狀物，果實(shí) 多畸形，嚴(yán)重時(shí)病株枯死。混合型表現(xiàn)為花葉、皺縮兩種混合病癥。
[0003] 棉姐(Aphis gossypii Glover)是廣泛分布于世界各國的一種常見害蟲，取食和 傳播植物病毒，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。已報(bào)到的棉蚜傳播病毒病種類包括小西萌蘆黃 花葉病毒病(Zucchini yellow mosaic virus)等多種植物病毒。萌蘆科瓜類為棉姐的主要 僑居寄主，這就使得棉蚜作為病毒傳毒媒介造成的危害十分嚴(yán)重。棉蚜是西萌蘆病毒病傳 播的主要途徑，盡早檢測棉蚜攜帶病毒，對病毒病的防治具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 對西萌蘆病毒病檢測鑒定，目前主要有生物學(xué)方法、電鏡法、血清學(xué)方法和分子生 物學(xué)方法。其中血清學(xué)方法具有特異性好、操作簡便、檢測周期短的特點(diǎn)，但在準(zhǔn)確性和靈 敏度方面還有一定的缺陷;分子生物學(xué)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，能夠彌補(bǔ)血清 學(xué)方法的缺點(diǎn)。分子生物學(xué)方法需要依據(jù)病毒的核酸序列信息。西萌蘆花葉病毒基因信息 的獲得為開發(fā)棉蚜帶毒檢測方法和西萌蘆花葉病毒分子診斷技術(shù)的開發(fā)提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種新的西萌蘆花葉病毒及其全基因序列。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供上述西萌蘆花葉病毒的檢測方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的西萌蘆花葉病毒，該病毒基因組經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到 的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。含有3個(gè)讀碼框，0RF1、0RF2和0RF3大小分別為7140bp、 1416bp 和603bp(圖1)。
[0008] 本發(fā)明還提供所述病毒的全基因序列。該病毒屬于正鏈ssRNA病毒，無 DNA階段，屬 于濃核病毒屬(Densovirus)類病毒，染病西萌蘆表現(xiàn)為混合類型癥狀。
[0009] 本發(fā)明還提供用于檢測所述西萌蘆花葉病毒的特異性PCR引物，引物序列為15~ 45個(gè)，優(yōu)選18-24個(gè)連續(xù)核苷酸，所述引物用于樣品經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。正向引物 和反向引物符合Tm值為55-65 °C，且二者Tm值相差不超過2 °C，GC含量為40 % -60 %。
[0010] 本發(fā)明還提供用于檢測所述西萌蘆花葉病毒的特異性探針，探針序列為15-45個(gè)， 優(yōu)選20-30個(gè)連續(xù)核苷酸，所述探針針對RNA或DNA樣品進(jìn)行檢測。
[0011]所述探針可以與上述引物配合使用。探針的Tm值為65-70°C，通常比引物Tm值高5- 10 °C (至少高5 °C)，GC含量為40 % -70 %，探針的5 '端應(yīng)避免使用鳥嘌呤。
[0012] 本發(fā)明還提供用于熒光定量PCR檢測所述西萌蘆花葉病毒的特異性引物和探針， 包括：
[0013] Primer-F:5 '-TTAGGAACGATTCCATTCTT-3 '
[0014] Primer-R:5 '-TTCGATCTCACTTATGTAGC-3 '
[0015] Probe:5，-CTCGTCAAGCACACTAAGGCA-3 '
[0016] 其中，探針5'端帶有熒光基團(tuán)，3'端帶有熒光淬滅基團(tuán)。
[0017] 本發(fā)明還提供基于熒光定量PCR技術(shù)檢測所述西萌蘆花葉病毒的方法，即利用上 述引物F、R和探針進(jìn)行熒光定量PCR檢測。
[0018] 具體地，所述方法包括以下步驟：
[0019] 1)提取樣品中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;
[0020] 2)以步驟1)的cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0021] 3)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0022]其中，熒光定量PCR反應(yīng)體系為： 模板 cDNA 2μ1 lOmMdNTPs 2μ! ΙΟμΜ 引物F 1μ! ΙΟμΜ 引物R ΙμL
[0023] ΙΟμΜ 探針 0.5μ1 5υ/μΙ Γ叫 DMA聚合酶 0.2μΙ 10 x PCR反應(yīng)緩沖液（含Mg2 ) 2,5μ1 ddH20 補(bǔ)足至25μ1
[0024] 熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 °C3min;然后98 °C 10s，68 °C 60s，40個(gè)循環(huán)，并且在第2 步時(shí)收集熒光。
[0025]本發(fā)明進(jìn)一步提供含有所述引物和/或探針的檢測試劑盒。
[0026] 本發(fā)明公開了西萌蘆花葉病毒的全基因序列，并根據(jù)全基因序列設(shè)計(jì)出可快速檢 測該病毒的特異性引物和探針，并在此基礎(chǔ)上建立了熒光定量PCR檢測方法，可從發(fā)病植物 組織及土壤中復(fù)雜的病原菌環(huán)境以及攜帶此病毒的棉蚜體內(nèi)快速、準(zhǔn)確地檢測出西萌蘆花 葉病毒。根據(jù)該方法構(gòu)建的檢測試劑盒操作簡便，特異性好，靈敏度高，對西萌蘆花葉病疫 情的早期預(yù)警、疫區(qū)的病原監(jiān)測等方面具有重要意義。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明西萌蘆花葉病毒基因組序列中含有的3個(gè)讀碼框。
[0028]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中構(gòu)建的西萌蘆花葉病毒的系統(tǒng)進(jìn)化樹。
[0029]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中熒光定量PCR擴(kuò)增情況，其中濃度1-8分別代表1、10、100、 200、400、800、1600 和 3200倍稀釋的 cDNA樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0031] 實(shí)施例1西萌蘆花葉病毒全基因序列的獲得
[0032] 棉姐于2011年6月12日采自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東試驗(yàn)農(nóng)場棉田（36° 5 ' 34.8'%114°31'47.191)。采集后挑選無翅成蚜，置于液氮中速凍，隨即進(jìn)行總1?^提取。利 用II lumina的Solexa高通量測序平臺(tái)構(gòu)建Paired-End片段庫進(jìn)行表達(dá)譜測序。對測得原始 數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，步驟為采用滑動(dòng)窗口法去除低質(zhì)量片段，切除原始序列中含N部分序 列。然后使用軟件abyssl · 3 ·0進(jìn)行Denovo拼接，得到Unigenes。使用Blastn將Unigenes與 661113&111<：中核酸數(shù)據(jù)庫1^1(111^口：//\￥?^.11(313；[.111111.11；[11.80￥/)進(jìn)行比對化-￥&1116<10-5)，同 時(shí)使用BlastX工具將Unigenes與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫NR進(jìn)行比對，挑選與病毒有同源關(guān) 系的序列進(jìn)行分析。
[0033] 結(jié)果獲得一條大小為9235bp的病毒基因組序列，不含3'端polyA尾巴。該基因組序 列含有3個(gè)讀碼框，0RF1、0RF2和0RF3大小分別為7140bp、1416bp和603bp(圖1)。通過摩擦接 種試驗(yàn)證明該病毒是一種西萌蘆花葉病毒。
[0034] 利用本發(fā)明病毒基因組0RF1編碼的氨基酸序列（SEQ ID N0: 2)，并在GenBank數(shù)據(jù) 庫(WWW.ncbi .nlm.nih.gov/genbank/)搜索與其同源性較高的病毒氨基酸序列，獲得8種與 其相似度較高的病毒氨基酸序列，使用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，由病毒基 因組序列推導(dǎo)的氨基酸序列與Loreto病毒、Negev病毒等聚在一起，而與已報(bào)道的植物病毒 有一定的距離（圖2)。
[0035] 實(shí)施例2熒光定量PCR檢測
[0036] 1、特異性引物和探針的設(shè)計(jì)與合成：
[0037]根據(jù)西萌蘆花葉病毒基因組經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的核苷酸序列（SEQ ID N0:1)，使用 Beacon Designer7.7軟件設(shè)計(jì)用于焚光定量PCR(Taqman)檢測該病毒的特異性引物和探 針，包括：
[0038] Primer-F:5 '-TTAGGAACGATTCCATTCTT-3 '
[0039] Primer-R:5 '-TTCGATCTCACTTATGTAGC-3 '
[0040] Probe: 5 ' -CTCGTCAAGCACACTAAGGCA-3 '，5 ' 標(biāo)記FAM熒光，3 ' 標(biāo)記TAMRA。
[0041] 引物及探針的合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。
[0042] 2、病毒RNA的提取
[0043] 2014年6月18日，將采集自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所試驗(yàn)農(nóng)場發(fā)病西萌蘆葉片 和寄生于其上的棉蚜，帶回實(shí)驗(yàn)室加入液氮進(jìn)行組織研磨，然后以體積比1:50加入無菌水。 于4°C，6000rpm離心30min，取上清。將上清過0.45μΜ濾膜，然后提取上清中的總RNAANA的 提取按照Promega公司的RNA gents Total RNA Isolation System Kit說明進(jìn)行。
[0044] 3、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0045] 使用Promega公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào):A3500)，取5yg總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA的第 一鏈，反應(yīng)體系如下：總RNA 10yL(5yg)、01 igo(dT) (20ymol/L) 1 · 5yL、10 X buffer 2 · 5yL、 dNTP 111丨叉（2.51111]1〇1/1^)241^、滅菌水84匕）
[0046]將上述反應(yīng)體系含各成分的混合物在42°C水浴lmin后，向其中加入lyL(200U) Superscript? II RT，輕輕混合，42°C保溫50min;70°C水浴15min，終止該反應(yīng)；獲得cDNA第 一鏈。
[0047] 4、熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0048] 將制備的cDNA樣品分為8組，分別按如下倍數(shù)稀釋：1、10、100、200、400、800、1600 和3200。然后配制如下反應(yīng)體系。
[0049] 熒光定量PCR反應(yīng)體系為： 模板 cDNA 2li! lOmMdNTPs 2μΙ ΙΟμΜ 引物F ΙμL ΙΟμΜ引物R ΙμL
[0050] ΙΟμΜ 探針 0 5μΙ 5υ/μ1 DNA聚合酶 0.2μ:1 10 χ PCR反應(yīng)緩沖液（含Mg2+) 2.5μ1 ddH20 補(bǔ)足至25μ1
[0051 ] 用Ependorf公司的Mastercycler ep realplex 4儀器，按照下列反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí) 時(shí)熒光定量PCR: 94°C 3min;然后98 °C 10s，68 °C60s，40個(gè)循環(huán)，第2步時(shí)收集熒光。反應(yīng)結(jié)束 后收集每組樣品的CT值。
[0052]結(jié)果顯示（圖3)，該試劑盒能檢測出稀釋1600倍的樣品。以CT值為Y軸，樣品濃度為 X構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)公式Ε= α〇_1/#$5-1) X 100%計(jì)算擴(kuò)增效率，得到擴(kuò)增效率為99.5%， 靈敏度高，能較好地滿足生產(chǎn)需要。
[0053]利用上述熒光定量PCR反應(yīng)體系，可對不同西萌蘆花葉病毒染病樣品進(jìn)行定量分 子檢測，應(yīng)用該方法可準(zhǔn)確預(yù)測大田西萌蘆花葉病毒消長動(dòng)態(tài)和疫情發(fā)展趨勢，便于及時(shí) 確定病害最佳防控時(shí)期，達(dá)到高效治理西萌蘆花葉病害的目的。
[0054]實(shí)施例3田間棉蚜攜帶西萌蘆花葉病毒檢測
[0055]為了檢測田間棉蚜攜帶西萌蘆花葉病毒的情況，分別在2014年8月和9月分別采集 黃河流域河南安陽縣西萌蘆田、棉田、黃瓜田棉蚜，每地每時(shí)期各采集50頭，單頭提取總 RNA，按Promega公司的RNA gents Total RNA Isolation System Kit說明進(jìn)行。按實(shí)施例3 的方法進(jìn)行熒光定量PCR檢測。
[0056]結(jié)果顯示，8月份在西萌蘆田采集棉蚜中有18頭攜帶西萌蘆花葉病毒，在棉田采集 棉蚜中有5頭攜帶西萌蘆花葉病毒，在黃瓜田采集棉蚜中有9頭攜帶西萌蘆花葉病毒。8月份 在西萌蘆田采集棉蚜中有16頭攜帶西萌蘆花葉病毒，在棉田采集棉蚜中有3頭攜帶西萌蘆 花葉病毒，在黃瓜田采集棉蚜中有11頭攜帶西萌蘆花葉病毒?？梢娢髅忍J花葉病毒是一類 棉蚜攜帶率較高的病毒。
[0057]實(shí)施例4西萌蘆花葉病毒接種試驗(yàn)
[0058]為進(jìn)一步了解確定西萌蘆花葉病毒與西萌蘆病毒病的關(guān)系，通過摩擦接種試驗(yàn)， 對健康西萌蘆苗進(jìn)行接種，每處理12株，3個(gè)重復(fù)，同時(shí)做清水摩擦對照。觀察接種后發(fā)病情 況，并檢測病毒的存在情況。按實(shí)施例3的方法進(jìn)行熒光定量PCR檢測。
[0059]結(jié)果顯示（表1)，在接種后發(fā)病西萌蘆植株中，全部檢測到西萌蘆花葉病毒的存 在。
[0060] 表1摩擦接種試驗(yàn)結(jié)果
[0061]
[0062] 進(jìn)一步研究表明，未在蘿卜蚜、麥二叉蚜、麥長管蚜、甘藍(lán)蚜等非棉蚜的其他種類蚜 蟲中檢測到西萌蘆花葉病毒的存在，說明西萌蘆花葉病毒是專一侵染棉蚜的病毒種類。
[0063] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 西萌蘆花葉病毒，該病毒基因組經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. 權(quán)利要求1所述病毒的全基因序列。3. 用于檢測權(quán)利要求1所述病毒的特異性PCR引物，其特征在于，引物序列為15~45個(gè)， 優(yōu)選18-24個(gè)連續(xù)核苷酸，所述引物用于樣品經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物，其特征在于，正向引物和反向引物符合Tm值為55-65Γ， 且二者1'111值相差不超過2°(：，6(：含量為40%-60%。5. 用于檢測權(quán)利要求1所述病毒的特異性探針，其特征在于，探針序列為15-45個(gè)，優(yōu)選 20-30個(gè)連續(xù)核苷酸，所述探針針對RNA或DNA樣品進(jìn)行檢測。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的探針，其特征在于，所述探針與權(quán)利要求2或3所述引物配合使 用，其Tm值為65-70 °C，GC含量為40 % -70 %。7. 用于熒光定量PCR檢測權(quán)利要求1所述病毒的特異性引物和探針，包括： Primer-F:5 '-TTAGGAACGATTCCATTCTT-3 ' Primer-R:5 '-TTCGATCTCACTTATGTAGC-3 ' Probe:5 '-CTCGTCAAGCACACTAAGGCA-3 ' 其中，探針5 '端帶有熒光基團(tuán)，3 '端帶有熒光淬滅基團(tuán)。8. 基于熒光定量PCR技術(shù)檢測權(quán)利要求1所述病毒的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求7 所述引物和探針進(jìn)行熒光定量PCR檢測。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取樣品中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA; 2) 以步驟1)的cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 3) 分析擴(kuò)增產(chǎn)物； 其中，熒光定量PCR反應(yīng)體系為： 模板 cDNA 2μ1 lOmMdNTPs 2μ1 1μ1 ΙΟμΜ 引物R ΙμL ΙΟμΜ 探針 0.5μ1 5υ/μ1 Γ叫 DNA聚合酶 0.2μΙ 含Mg2的+10 χ PCR反應(yīng)緩沖液 2.5μ1 ddH?0 補(bǔ)足至25μ1 熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C3min;然后98°(：1〇8,681€6〇8,40個(gè)循環(huán)，并且在第2步時(shí) 收集熒光。10. 含有權(quán)利要求3-7所述引物和/或探針的檢測試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK105950781SQ201610319729
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】張帥, 崔金杰
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所