Torch檢測并聯(lián)探針、基因芯片、試劑盒與檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種TORCH檢測并聯(lián)探針，包括弓形蟲TOX探針1、2、3，序列分別為SEQ ID NO.1～3；風(fēng)疹病毒RV探針1、2、3，序列分別為SEQ ID NO.4～6；巨細(xì)胞病毒CMV探針1、2、3，序列分別為SEQ ID NO.7～9；單純皰疹病毒I型HSV I探針1、2、3，序列分別為SEQ ID NO.10～12；和單純皰疹病毒II型HSV II探針1、2、3，序列分別為SEQ ID NO.13～15；還公開了含有上述探針的基因芯片以及該基因芯片的試劑盒，以及利用該試劑盒進(jìn)行TORCH檢測的方法。本發(fā)明操作簡單、結(jié)果易讀，滿足醫(yī)院、產(chǎn)前檢測等的現(xiàn)場檢測需求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【專利說明】
TORCH檢測并聯(lián)探針、基因芯片、試劑盒與檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種TORCH檢測并聯(lián)探針、基因芯片、試劑盒與 檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] TORCH是指可導(dǎo)致先天性宮內(nèi)感染及圍產(chǎn)期感染而引起圍產(chǎn)兒畸形的病原體，它 是一組病原微生物的英文名稱縮寫，其中T(Toxoplasma)是弓形蟲，0(0thers)是其他病原 微生物，如梅毒螺旋體、帶狀皰疹病毒、細(xì)小病毒B19、柯薩奇病毒等，R(Rubella.Virus)是 風(fēng)疹病毒，C(Cytomegalo.Virus)是巨細(xì)胞病毒，H(Herpes.Virus)即是單純皰疹I(lǐng)/II型。其 中弓形蟲寄生于細(xì)胞內(nèi)，隨血液流動(dòng)，到達(dá)全身各部位，破壞大腦、心臟、眼底，致使人的免 疫力下降;風(fēng)疹病毒主要通過呼吸道傳播，孕婦感染后能使胎兒致畸，病毒通過胎盤感染胎 兒形成先天性感染，稱為先天性風(fēng)疹綜合癥(CRS)，主要是先天性白內(nèi)障、先天性心臟病和 神經(jīng)性耳聾，風(fēng)疹感染發(fā)生在孕期越早，胎兒的致畸也越嚴(yán)重;巨細(xì)胞病毒感染能引起宮內(nèi) 胎兒生長遲緩、小頭形、腦炎、視網(wǎng)膜脈膜炎、黃疸、肝脾腫大、溶血性貧血等，新生兒死亡率 較高;懷孕早期感染單純皰疹病毒(HSV I、II型）能破壞胚芽面導(dǎo)致流產(chǎn)，孕中晚期雖少發(fā) 畸胎，但可引起胎兒和新生兒發(fā)病。TORCH的感染影響著人口素質(zhì)，與優(yōu)生優(yōu)育有重要關(guān)系。
[0003] 目前，臨床上最常用的TORCH檢測是EL ISA法，常規(guī)的EL ISA檢測的是抗體，常檢測 IgM和IgG抗體，即可判斷近期感染(IgM指標(biāo)），又可檢測人群抗體(免疫力)水平（IgG指標(biāo)）， 但是如果要對5種病原體進(jìn)行檢測，就需要十幾種試劑盒才能將所有的IgM和IgG檢測完畢， 每次反應(yīng)只能檢測一個(gè)指標(biāo)，速度慢，效率低，費(fèi)用昂貴，需要樣本量大，并存在一定的窗口 期，可能導(dǎo)致假陰性。
[0004] 生物芯片技術(shù)是九十年代發(fā)展起來的一項(xiàng)新興生物技術(shù)。按照檢測對象來分類， 可以分為基因芯片和蛋白質(zhì)芯片等兩大類。相較于蛋白質(zhì)芯片，基因芯片利用的是核苷酸 鏈之間的互補(bǔ)作用，特異性強(qiáng)，重現(xiàn)性好?；蛐酒傅氖菍⒋罅?通常每平方厘米點(diǎn)陣密 度高于400)探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子雜交，通過檢測每個(gè)探針分子的 雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。采用基因芯片進(jìn)行檢測，其檢測通量 大，在一張芯片上一次性完成幾種病原體檢測，直接針對病原體基因進(jìn)行，結(jié)果更準(zhǔn)確，具 有檢測靈敏度高、特異性好，所需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 目前，已有利用基因芯片技術(shù)檢測TORCH的報(bào)道，如1)用于TORCH檢測的探針、基因 芯片和試劑盒CN 104846074A;2)-種ToRCH檢測的熒光標(biāo)記基因芯片試劑制備方法及其應(yīng) 用CN 103805715A，但是以上的研究存在假陽性率較高的可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種特異性好、結(jié)果準(zhǔn)確、假陽性率低、檢測效率高的TORCH 檢測并聯(lián)探針、基因芯片、試劑盒與檢測方法。
[0007] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)其目的的技術(shù)方案為：
[0008] 一種TORCH檢測并聯(lián)探針，包括弓形蟲Τ0Χ探針1、2、3,風(fēng)疹病毒RV探針1、2、3,巨細(xì) 胞病毒CMV探針1、2、3,單純皰疹病毒I型HSV I探針1、2、3和單純皰疹病毒II型HSV II探針 1、2、3;所述探針序列為：
[0009] 弓形蟲Τ0Χ探針1、2、3序列分別為SEQ ID N0.1~3;
[0010] 風(fēng)疹病毒RV探針1、2、3序列分別為SEQIDN0.4~6;
[0011]巨細(xì)胞病毒CMV探針1、2、3序列分別為SEQIDN0.7~9;
[0012] 單純皰疹病毒I型HSVI探針1、2、3序列分別為SEQIDN0.10~12;
[0013] 單純皰疹病毒II型HSVII探針1、2、3序列分別為SEQIDN0.13~15。
[0014] 一種TORCH檢測基因芯片，包括固體相和上述的探針組SEQ ID NO. 1~15。
[0015] 作為優(yōu)選地，所述固相載體為氨基修飾的玻璃基片、尼龍膜或者硝酸纖維素膜。
[0016] 一種TORCH檢測試劑盒，包括前述的基因芯片。
[0017] 在上述TORCH檢測試劑盒中，還包括以下引物對：弓形蟲靶序列擴(kuò)增引物對、風(fēng)疹 病毒靶序列擴(kuò)增引物對、巨細(xì)胞病毒靶序列擴(kuò)增引物對、單純皰疹病毒I型靶序列擴(kuò)增引物 對、單純皰疹病毒II型靶序列擴(kuò)增引物對，所述引物對的序列分別為：
[0018] 弓形蟲靶序列擴(kuò)增引物對序列如SEQ ID N0.16、17所示;風(fēng)疹病毒靶序列擴(kuò)增引 物對序列如SEQIDN0.18、19所示；巨細(xì)胞病毒靶序列擴(kuò)增引物對序列如SEQIDN0.20、21 所示；單純皰疹病毒I型靶序列擴(kuò)增引物對序列如SEQ ID N0.22、23所示;單純皰疹病毒II 型靶序列擴(kuò)增引物對序列如SEQ ID N0.24、25所示。
[0019] 作為優(yōu)選地，所述引物對的下游引物的5'端含有生物素標(biāo)記。
[0020] 作為優(yōu)選地，TORCH檢測試劑盒還包括PCR反應(yīng)體系、雜交緩沖液、親和素、洗滌液、 TMB顯色液。
[0021] 作為優(yōu)選地，10yL的PCR反應(yīng)體系包括：50~150ng/yL的擴(kuò)增模板0.4yL，Premix Taq 5yL，濃度為8~12μΜ的上、下游引物各0.2yL。。
[0022] 一種TORCH檢測方法，使用前述的TORCH檢測試劑盒進(jìn)行檢測，當(dāng)檢測對象的三個(gè) 探針顯示的檢測結(jié)果一致時(shí)可以判斷樣品是否感染病原體；當(dāng)檢測對象的三個(gè)探針顯示的 檢測結(jié)果不一致時(shí)，不能判斷該待測樣品為陽性或陰性，使用該檢測試劑盒重新檢測或者 使用現(xiàn)有其它檢測方法(比如Elisa方法)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。
[0023]在上述的TORCH檢測方法中，擴(kuò)增5個(gè)病原體靶序列的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序均為95°C 511^11;95。(：1〇8、551€3〇8、721€3〇8、30個(gè)循環(huán) ；72。(：1〇11^11。
[0024]本發(fā)明的有益效果是：①能同時(shí)完成TORCH五種病原體的檢測，減少反應(yīng)復(fù)雜程 度，簡化實(shí)驗(yàn)操作;②針對TORCH五種病原體每種病原體均設(shè)計(jì)三條高特異性的探針，當(dāng)3條 探針均檢測出陽性時(shí)才判斷該項(xiàng)指標(biāo)為陽性，能極大的提尚廣品的準(zhǔn)確性和精確性，減少 其它方法容易出現(xiàn)的假陽性問題;③本發(fā)明通過PCR技術(shù)對病原體DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物 與生物芯片上的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，通過生物素標(biāo)記，顯色液進(jìn)行顯色后，可以用普通 數(shù)碼相機(jī)拍照或肉眼直接判讀，直觀的表現(xiàn)檢測結(jié)果，操作簡單、結(jié)果易讀，滿足醫(yī)院、產(chǎn)前 檢測等的現(xiàn)場檢測需求，為優(yōu)生優(yōu)育及診斷TORCH感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【附圖說明】
[0025]圖1為檢測TORCH五種病原體的基因芯片示意圖。
[0026] 圖2為5種病原體基因擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物電泳條帶圖；Y-T:弓形蟲;Y-R:風(fēng)疹病毒;Y-C:巨細(xì)胞病毒;Υ-Η1:單純皰疹病毒I型;Υ-Η2:單純皰疹病毒Π 型;M: lOOOObp marker。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0028]主要試劑及生產(chǎn)者：
[0029]氨基修飾的玻璃基片（武漢陽達(dá)生物科技有限公司），病毒基因組DNA/RNA共提試 劑盒（貨號(hào)DP438,天根生化科技(北京）有限公司），親和素(辣根過氧化物酶標(biāo)記）（碧云天 生物技術(shù)研究所），TMB顯色液(上海生工生物工程有限公司），Premix Taq(TAKARA公司，日 本）：成分為PrimeSTARHS DNA Polymerase，dNTP Mixture，PrimeSTAR Buffer。
[0030] 引物合成公司為英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。
[0031] 實(shí)施例1目的片段引物與探針設(shè)計(jì)
[0032] 查找NCBI數(shù)據(jù)庫中弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒I型和Π 型的基 因序列，選擇高特異性的基因序列作為靶序列(5個(gè)檢測對象選擇的基因保守序列的ID依次 為:AF179871 · 1，ΑΥ161375· 1，F(xiàn)J491284.1，JQ352183.1，HQ123122.1)，設(shè)計(jì)引物與探針。靶 序列確定后，根據(jù)引物與探針設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)各病原體基因的擴(kuò)增引物與探針，為了使芯片 結(jié)果用顯色液顯色后可直接通過肉眼判讀，在各病原體靶基因的R引物5'端用生物素進(jìn)行 標(biāo)記，具體序列如下：
[0033] 1、弓形蟲（Τ0Χ)
[0034]弓形蟲(Τ0Χ)靶序列擴(kuò)增引物：
[0035] F引物（T0X-F):5'-CGTATTGTCGAGTAGATCAG-3'（SEQ ID N0.16)，
[0036] I^|*(T0X-R):5'-biotin-TCGCTGCGGAGACAGCGAAG(SEQIDN0.17)-3'。
[0037] Τ0Χ并聯(lián)探針：
[0044] 2、風(fēng)疹病毒(RV)
[0045] 風(fēng)疹病毒(RV)靶序列擴(kuò)增引物：
[0046] F引物（RV-F):5'-TCCGGGTCAAGTTCCATACA-3'（SEQ ID N0.18)，
[0047] R引物（RV-R):5'-biotin-GCCAACGCCATTCCCCTGAC-3'（SEQ ID N0.19)。
[0048] RV并聯(lián)探針：
[0055] 3、巨細(xì)胞病毒(CMV)
[0056] 巨細(xì)胞病毒(CMV)靶序列擴(kuò)增引物：
[0057] F引物（CMV-F):5'-AGGTGACACCAGAGAATCAG-3'（SEQ ID N0.20)，
[0058] I^|*(CMV-R):5'-biotin-CTTCATTACACTGATAACCT-3'（SEQIDN0.21)。
[0059] CMV并聯(lián)探針：
[0060] CMV 探針 1:
[0066] 4、單純皰疹病毒(HSV) I型
[0067] HSV I靶序列擴(kuò)增引物：
[0068] F引物（HSV I-F):5'-ACCCGCACCATCTACGACGG-3'（SEQ ID N0.22)，
[0069] R引物（HSV I-R):5，-biotin-ACCCCACTTC CGGGTTTCAC-3，（SEQ ID N0.23)。
[0070] HSV I并聯(lián)探針：
[0077] 5、單純皰疹病毒(HSV) II型
[0078] HSV II靶序列擴(kuò)增引物：
[0079] F引物（HSV II-F):5'-CGGGAACGGG GACGAGGATA-3'（SEQ ID N0.24)
[0080] R引物（HSV II-R):5'-biotin-GCCGTCGCGCACCTGGAGGC-3'（SEQ ID N0.25)
[00811并聯(lián)探針：
[0088] 實(shí)施例2芯片的制備
[0089] 將實(shí)施例1中1'(?、1^、01^、!^￥1、!^￥11的并聯(lián)探針按照表1的順序點(diǎn)樣到氨基修 飾的玻璃基片上，得到含有探針的基因芯片（如圖1所示）。探針濃度為30μΜ，每個(gè)點(diǎn)0.2yL， 然后80 °C孵育1.5小時(shí)。
[0090] 表1T0RCH檢測芯片探針排列順序
[0092]實(shí)施例3檢測方法 [0093] 1、待測樣品基因組提取
[0094]使用病毒基因組DNA/RNA共提試劑盒，按照操作說明書的步驟提取待測樣品的基 因組作為擴(kuò)增模板。
[0095] 2、PCR擴(kuò)增目的片段
[0096] 經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)摸索，確定對5個(gè)檢測對象1'(^、1^、01^、批￥1、批￥11通用的？0財(cái)廣 增體系和PCR反應(yīng)程序，使得檢測方法更加容易，一臺(tái)機(jī)器即可同時(shí)對多個(gè)對象進(jìn)行擴(kuò)增， 增加了工作效率。
[0097] 5個(gè)檢測對象的PCR擴(kuò)增體系一樣，具體如下:不同的檢測對象使用相應(yīng)的F引物、R 引物即可。
[0100] 5 個(gè)檢測對象的 PCR 反應(yīng)程序均為：951€5111丨11;95°(：1〇8、55 1€3〇8、721€3〇8、30個(gè)循 環(huán)；72°C10min。
[0101] 3、PCR產(chǎn)物與芯片雜交 [0102]按照如下步驟操作：
[0103] a.在實(shí)施例2中制備好的基因芯片上將5個(gè)不同的檢測對象的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對應(yīng)地 點(diǎn)樣到該檢測對象的檢測孔中，具體步驟為:PCR產(chǎn)物95°C解鏈5分鐘，迅速置于冰上，PCR產(chǎn) 物與雜交緩沖液(50 %甲酰胺，10 X SSC，0.2 % SDS)等體積混合，每孔點(diǎn)10微升混合液，在濕 盒中，于60°C雜交孵育2小時(shí)。
[0104] b.取出孵育后的基因芯片，用洗滌液(0.3 X SSC緩沖液)清洗3次，晾干芯片。
[0105] C.將親和素(辣根過氧化物酶標(biāo)記)加到晾干的芯片上，室溫孵育lOmin。
[0106] d.用洗滌液(0.3 X SSC緩沖液)清洗3次后晾干。
[0107] e.在晾干的基因芯片上點(diǎn)樣TMB顯色液，反應(yīng)15分鐘，拍照，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，檢測對象為 陽性的樣品TMB顯色反應(yīng)后溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。
[0108] 實(shí)施例4檢測待測樣品
[0109] 從第三軍醫(yī)大學(xué)獲取分別感染弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒和單純皰疹病毒I型 和II型的樣本（陰道分泌物)各20份，按照實(shí)施例1和3中的引物和方法分別提取待測樣品的 基因組，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，使用實(shí)施例2中的基因芯片進(jìn)行檢測。PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳條帶 表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的靶序列擴(kuò)增引物特異性高，能特異、靈敏地?cái)U(kuò)增出目標(biāo)基因（如圖2所 示)。
[0110] 對于感染了檢測對象的樣品，TMB顯色反應(yīng)后溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，表明樣品 為陽性，感染了該病原體，檢測中設(shè)置陽性和陰性對照。判斷檢測結(jié)果時(shí)，當(dāng)三個(gè)探針均顯 示陽性時(shí)才判斷該樣品感染了病原體，如果其中某一個(gè)或者兩個(gè)探針顯示陰性，則應(yīng)對該 檢測樣品重新檢測，三個(gè)探針結(jié)果須一致才能采信該檢測結(jié)果。三個(gè)探針檢測結(jié)果不一致 時(shí)，也可使用現(xiàn)有其它技術(shù)(比如Elisa方法)進(jìn)一步檢測驗(yàn)證。
[0111] 在試驗(yàn)的100份樣品中，97份樣品利用本發(fā)明的基因芯片的檢測結(jié)果與已知結(jié)果 相符，每個(gè)樣品的檢測對象的3個(gè)探針結(jié)果一致，均顯示陽性。其中只有1份弓形蟲樣品、1份 風(fēng)疹病毒和1份單純皰疹病毒I型的樣品，每個(gè)樣品其兩個(gè)探針顯示陽性，1個(gè)探針顯示陰 性，于是利用本發(fā)明的基因芯片重新檢測這3份可疑樣品，第二次檢測結(jié)果顯示該可疑的弓 形蟲樣品、單純皰疹病毒I型樣品的3個(gè)探針均為陽性，而可疑的風(fēng)疹病毒樣品重新檢測結(jié) 果仍是2個(gè)探針顯示陽性、1個(gè)探針顯示陰性，對該可疑樣品采取Elisa方法檢測，Elisa檢測 為陽性。
[0112] 本發(fā)明的探針、基因芯片、試劑盒，特異性高、結(jié)果非常準(zhǔn)確，檢測快速、工作效率 高，操作簡單、結(jié)果易讀，滿足醫(yī)院、產(chǎn)前檢測等的現(xiàn)場檢測需求，為優(yōu)生優(yōu)育及診斷TORCH 感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種TORCH檢測并聯(lián)探針，其特征在于:包括弓形蟲TOX探針I(yè)、2、3，風(fēng)疹病毒RV探針 1、2、3,巨細(xì)胞病毒CMV探針1、2、3,單純皰疹病毒I型HSV I探針1、2、3和單純皰疹病毒II型 HSV II探針1、2、3;所述探針序列為： 弓形蟲TOX探針1、2、3序列分別為SEQ ID NO. 1~3; 風(fēng)疹病毒RV探針1、2、3序列分別為SEQ ID NO.4~6; 巨細(xì)胞病毒CMV探針1、2、3序列分別為SEQ ID NO.7~9; 單純皰疹病毒I型HSV I探針1、2、3序列分別為SEQ ID NO. 10~12; 單純皰疹病毒II型HSV II探針1、2、3序列分別為SEQ ID NO. 13~15。2. -種TORCH檢測基因芯片，其特征在于:包括固體相和權(quán)利要求1所述的探針組。3. 如權(quán)利要求2所述的TORCH檢測基因芯片，其特征在于:所述固相載體為氨基修飾的 玻璃基片、尼龍膜或者硝酸纖維素膜。4. 一種TORCH檢測試劑盒，其特征在于:包括權(quán)利要求2或3所述的基因芯片。5. 如權(quán)利要求4所述的TORCH檢測試劑盒，其特征在于:還包括以下引物對：弓形蟲靶序 列擴(kuò)增引物對、風(fēng)疹病毒靶序列擴(kuò)增引物對、巨細(xì)胞病毒靶序列擴(kuò)增引物對、單純皰疹病毒 I型靶序列擴(kuò)增引物對、單純皰疹病毒II型靶序列擴(kuò)增引物對，所述引物對的序列分別為： 弓形蟲靶序列擴(kuò)增引物對序列如SEQ ID NO.16、17所示;風(fēng)疹病毒靶序列擴(kuò)增引物對 序列如SEQ ID NO. 18、19所示；巨細(xì)胞病毒靶序列擴(kuò)增引物對序列如SEQ ID NO. 20、21所 示;單純皰疹病毒I型靶序列擴(kuò)增引物對序列如SEQ ID NO.22、23所示;單純皰疹病毒II型 靶序列擴(kuò)增引物對序列如SEQ ID NO.24、25所示。6. 如權(quán)利要求5所述的TORCH檢測試劑盒，其特征在于:所述引物對的下游引物的5 '端 含有生物素標(biāo)記。7. 如權(quán)利要求6所述的TORCH檢測試劑盒，其特征在于：還包括PCR反應(yīng)體系、雜交緩沖 液、親和素、洗滌液、TMB顯色液。8. 如權(quán)利要求7所述的TORCH檢測試劑盒，其特征在于：IOyL的PCR反應(yīng)體系包括:50~ 150ng/yL的擴(kuò)增模板0 · 4yL，Premix Taq 5yL，濃度為8~12μΜ的上、下游引物各0 · 2yL。9. 一種TORCH檢測方法，其特征在于:使用權(quán)利要求4至8任一項(xiàng)所述的TORCH檢測試劑 盒進(jìn)行檢測，當(dāng)檢測對象的三個(gè)探針顯示的檢測結(jié)果一致時(shí)可以判斷樣品是否感染病原 體;當(dāng)檢測對象的三個(gè)探針顯示的檢測結(jié)果不一致時(shí)，不能判斷該待測樣品為陽性或陰性， 使用該檢測試劑盒重新檢測或者使用現(xiàn)有其它檢測方法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。10. 如權(quán)利要求9所述的TORCH檢測方法，其特征在于:擴(kuò)增5個(gè)病原體靶序列的PCR擴(kuò)增 反應(yīng)程序均為 951€5111丨11;95°(：1〇8、551€3〇8、72 1€3〇8、30個(gè)循環(huán)；72°(：1〇11^11。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK105950787SQ201610392961
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月6日
【發(fā)明人】周勇, 徐建
【申請人】重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司