作為疫苗平臺(tái)的含鞭毛蛋白的蛋白納米顆粒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及由適合的低聚化結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的并且還包含TLR5結(jié)合蛋白鞭毛蛋白作為佐劑分子的自組裝蛋白納米顆粒。此外，本發(fā)明還涉及所述納米顆粒用于疫苗接種的用途。
【專利說明】
作為疫苗平臺(tái)的含鞭毛蛋白的蛋白納米顆粒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及自組裝蛋白納米顆粒，包含TLR5結(jié)合蛋白質(zhì)鞭毛蛋白的蛋白序列作為 內(nèi)置佐劑。并且，本發(fā)明還涉及所述納米顆粒用于疫苗的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 針對(duì)入侵病原體的第一道防線是通過宿主的先天免疫，并且Toll-樣受體(TLR)作 為膜結(jié)合受體在其中起重要作用(Yoon S.I.et al.，Science 2012,335:859-64) JLR通過 其富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)的胞外域識(shí)別具有高度保守的分子結(jié)構(gòu)的抗原。LRR具有馬 蹄形狀。每種TLR具有可識(shí)別其特定分子抗原的獨(dú)特的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述特定分子抗原 可以是特殊形式的病毒或細(xì)菌核酸、細(xì)菌表面分子例如脂多糖(LPS)或其他具有特定模式 的病原體相關(guān)分子。即使識(shí)別多種不相關(guān)的分子抗原，所有已知的激動(dòng)劑激活的TLR結(jié)構(gòu) (即已識(shí)別并結(jié)合其分子抗原的TLR)在抗原結(jié)合后形成相似的二聚體結(jié)構(gòu)，這使其C-末端 區(qū)域相互靠近，繼而激活其細(xì)胞內(nèi)Toll/白介素-1受體(TIR)結(jié)構(gòu)域，以此起始細(xì)胞信號(hào)級(jí) 聯(lián)放大。
[0003] 至于本發(fā)明的范圍，有趣的是在許多不同的TLR受體中TLR5是僅有的脊椎動(dòng)物(從 魚類到哺乳動(dòng)物）中保守的蛋白結(jié)合TLLTLR5可結(jié)合β-變形菌和γ-變形菌的未組裝形式 的鞭樣鞭毛絲鞭毛蛋白，其負(fù)責(zé)鞭毛運(yùn)動(dòng)。近期的結(jié)晶學(xué)研究顯示了鞭毛蛋白和TLR5之間 的二聚復(fù)合體。鞭毛蛋白結(jié)合到TLR5后，MyD88-依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被誘導(dǎo)，繼而激活樹突 狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞中的促炎轉(zhuǎn)錄因子NF-kB，最后引起針對(duì)鞭毛菌的先天免疫應(yīng) 答。
[0004] 鞭毛蛋白的分子結(jié)構(gòu)包含DO、D1、D2和D3四個(gè)結(jié)構(gòu)域。蛋白鏈自D0結(jié)構(gòu)域中的N-末 端起始，通過其它結(jié)構(gòu)域D1、D2和D3到分子末端并在那兒轉(zhuǎn)彎形成大的環(huán)，然后通過D3、D2 和D1結(jié)構(gòu)域返回，使DO結(jié)構(gòu)域中的C-末端非?？拷銷-末端。鞭毛蛋白以2種方式激活先天 免疫系統(tǒng)。第一種方式是通過結(jié)合到TLR5受體，這主要通過其D1結(jié)構(gòu)域高度保守的部分 (Yoon et 31.，1〇〇.〇;[1:.)。第二種激活方式是通過與炎性體相互作用，這主要通過其00結(jié) 構(gòu)域的高度保守的C-末端部分(Lightfield K.L.et al.，Nat Immunol.2008,9:1171-8)。
[0005] 鞭毛蛋白已被用作常規(guī)佐劑，即可作為獨(dú)立的部分與抗原一起注入，或者其可被 改造以使其自身分子結(jié)構(gòu)中含有抗原本身。第二種方式的優(yōu)勢(shì)在于佐劑效應(yīng)與抗原效應(yīng)共 定位，因此佐劑的劑量可顯著減少且結(jié)果是副作用也顯著減小。
[0006] 鞭毛蛋白可能的局限性之一是其可能會(huì)誘導(dǎo)炎性免疫應(yīng)答。通過改造鞭毛蛋白結(jié) 構(gòu)使其缺失與炎性體互作的D0的C-末端可減低免疫刺激的炎性部分。
[0007] 許多佐劑在使用中由于其嚴(yán)重的副作用而具有明顯的局限性。例如弗氏完全佐 劑，是非常強(qiáng)的免疫刺激成分，甚至已不能用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。目前，只有少數(shù)被許可的佐劑可 用于人類，最重要的是明礬。限制全身性應(yīng)用佐劑的副作用的一種可能的途徑是將其配制 為微粒系統(tǒng)，即，將佐劑摻入微粒中或者含油乳劑中，這可限制其副作用并且將佐劑集中靠 近目標(biāo)抗原。因此，抗原和佐劑可同時(shí)到達(dá)相同的淋巴結(jié)，因而在增加佐劑效應(yīng)的同時(shí)減小 佐劑的全身性副作用。
[0008] 鞭毛蛋白是非常令人關(guān)注的可用于蛋白納米顆粒的佐劑，如W02004/071493中所 述的那些，因?yàn)槠浔旧硎堑鞍踪|(zhì)，這不同于其他許多佐劑是小分子，例如咪喹莫德或者基于 核酸的實(shí)體例如CpG。由于鞭毛蛋白是蛋白質(zhì)，可通過分子生物學(xué)手段而不需要化學(xué)交聯(lián)將 其加工到納米顆粒上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明涉及自組裝的蛋白納米顆粒，其由多個(gè)式(la)或（lb)的結(jié)構(gòu)單元的聚合體 組成，
[0010] X-ND1-L卜ND2-FLA (la)或FLA-ND1-L卜ND2-X (lb)
[0011] 由包含蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域ND1、接頭L1、蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域ND2、鞭毛蛋白衍生物 FLA以及取代基X的連續(xù)鏈組成，其中
[0012] ND1是形成m個(gè)ND1亞基的低聚體(NDl)m的蛋白質(zhì)，
[0013] ND2是形成η個(gè)ND2亞基的低聚體(ND2)n的蛋白質(zhì)，
[0014] m和η各自的值介于2和10之間，條件是m不等于n，并且不是η的倍數(shù)，而且η不是m的 倍數(shù)，
[0015] L1代表鍵或者是短的柔性接頭，
[0016] FLA是鞭毛蛋白，或者缺失部分鞭毛蛋白氨基酸序列但至少包含TLR5結(jié)合結(jié)構(gòu)域 D1的鞭毛蛋白衍生物，并且其中，可任選地，缺失結(jié)構(gòu)域被1到20個(gè)氨基酸的柔性接頭片段 取代以連接其余鞭毛蛋白序列的兩個(gè)末端，或者被完全折疊的蛋白質(zhì)抗原取代；
[0017] X可不存在或者是含有1到1000個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)序列，
[0018] 可任選地，與多個(gè)式(II)的結(jié)構(gòu)單元共組裝
[0019] Y-ND3-L2-ND4-Z (II)，
[0020]由包含蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域ND3、接頭L2、蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域ND4以及其他取代基Y和 Z的連續(xù)鏈組成，其中
[0021] ND3是形成y個(gè)ND3亞基的低聚體(ND3)y的蛋白質(zhì)，
[0022] ND4是形成z個(gè)ND4亞基的低聚體(ND4)Z的蛋白質(zhì)，
[0023] 7和2各自的值介于2和10之間，條件是y不等于z，并且不是z的倍數(shù)，而且z不是 7的 倍數(shù)，并且其中
[0024] ND3與ND1相同，或者ND4與ND2相同，或者ND3和ND4分別與ND1和ND2相同，
[0025] L2代表鍵或者是短的柔性接頭，其可與L1不同或者相同，并且
[0026] Y和Z，獨(dú)立于彼此地，可缺失或者是含有1到1000個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)序列。
【附圖說明】
[0027] 圖1:在直立位置由含有表位的鏈以及含鞭毛蛋白或含鞭毛蛋白衍生物的鏈的共 組裝體組成的不同蛋白納米顆粒的示意圖。
[0028]左上角示出了融合到低聚化結(jié)構(gòu)域ND2和ND1的含鞭毛蛋白的蛋白鏈單體;右側(cè)示 出了與ND3-L2-ND4-Z以1:59比率共組裝的納米顆粒，假定T = 1的二十面體對(duì)稱。為了清晰， 未示出最可能無序的His-標(biāo)簽(X和Y)。
[0029] "ND1"和"ND3" ：五聚體結(jié)構(gòu)域；"ND2"和"ND4" ：三聚體結(jié)構(gòu)域；"FLA" ：鞭毛蛋白或 鞭毛蛋白衍生物；"Z"：表位。
[0030] A)鞭毛蛋白D0-D1-D2-D3及相應(yīng)的表位呈遞納米顆粒的模式圖；
[0031] B)鞭毛蛋白D0-D1-D2及相應(yīng)的表位呈遞納米顆粒的模式圖；
[0032] C)鞭毛蛋白D0-D1及相應(yīng)的表位呈遞納米顆粒的模式圖；
[0033] D)鞭毛蛋白D1-D2-D3及相應(yīng)的表位呈遞納米顆粒的模式圖；
[0034] E)融合到ND3-L2-ND4核心的低聚化結(jié)構(gòu)域ND4的NANP B-細(xì)胞表位(Z)的模式圖；
[0035]圖2:鞭毛蛋白與TLR5相互作用的示意圖。
[0036]理想地，鞭毛蛋白是二聚體并且在納米顆粒上以翻轉(zhuǎn)方向顯示。所顯示的蛋白鏈 的部分起始于(例如五聚體的)低聚結(jié)構(gòu)域ND1，其通過接頭L連接到(例如二聚體的）低聚結(jié) 構(gòu)域ND2,繼而連接到含D2的鞭毛蛋白衍生物FLA，然后連接到鞭毛蛋白的D1結(jié)構(gòu)域直到頂 部(T)。在頂部，D1序列聯(lián)接并自身回折，并且進(jìn)入D2結(jié)構(gòu)域。為了清晰，未示出最可能無序 的His-標(biāo)簽。
[0037] A)左圖：?jiǎn)误w的模式圖；右圖：其中鞭毛蛋白以右側(cè)二聚體構(gòu)象用于與TLR5互作的 二聚體模式圖。
[0038] B)上圖：與TLR5二聚體互作的鞭毛蛋白二聚體的模式圖。下圖中左圖：完全組裝的 "僅鞭毛蛋白"顆粒的裁剪模式圖；右圖：完全組裝的"僅鞭毛蛋白"顆粒的全視圖。
[0039] 圖3:pPEP_T 載體圖
[0040] "prom" ：?jiǎn)?dòng)子；"term" ：終止子；"ori" ：起始位點(diǎn)；"bp" ：堿基對(duì)；"amp" ：氨節(jié)西林 抗性基因。
[0041] 圖4:蛋白納米顆粒的透射電鏡圖。
[0042]重折疊并共組裝重組表達(dá)蛋白后，將樣本吸附到碳包被的網(wǎng)格上并用2%乙酸雙 氧鈾負(fù)染色。
[0043] A) T81C-WRW-8RRVRA-D0-D1: T81C-WRW-8RRVRA-T1BT*共組裝比 12 :48，如 "FLA- SAPN的設(shè)計(jì)"部分及實(shí)施例6中所述。標(biāo)尺代表500nm。
[0044] B)T81c-8-D0-Dl:T81c-8-Pf共組裝比3:57，如實(shí)施例8中所述。標(biāo)尺代表200歷。
[0045] C)PD52-2i88-PAND0RA-D2-Dl-〇ri : PD52-2i88-PAND0RA-Noro共組裝比5:55，如實(shí) 施例7中所述。標(biāo)尺代表200nm。
[0046] D)D 頂-D0-D1: DM-D2-Dl-tip3_NIC-pept 共組裝比 5:55，如實(shí)施例 9 中所述。標(biāo)尺 代表200nm。
[0047] 圖 5:實(shí)施例 1 和5 的構(gòu)建體 L0NG-D2-D1 -or i 的 SDS-PAGE。
[0048] 該構(gòu)建體的理論分子量為41. lkDa。
[0049] CL-澄清的裂解液；
[0050] FT-流通物；
[0051] 1-ρΗ8·0用 10mM 咪唑洗滌；
[0052] 2-ρΗ8·0用500mM NaH2P〇4洗滌；
[0053] 3-ρΗ6·3 洗滌；
[0054] 4_口!15.9洗滌；
[0055] 5-?!14.5洗滌；
[0056] Elu-250mM咪唑洗脫液，5μ1和10μ1樣本用于凝膠。
[0057]圖6:構(gòu)建體L0NG-D2-D1 -or i的蛋白顆粒不同清晰度的透射電鏡圖
[0058]重折疊并共組裝重組表達(dá)蛋白后，將納米顆粒吸附到碳包被的網(wǎng)格上并用2%乙 酸雙氧鈾負(fù)染色。
[0059] 右上圖、左上圖、右下圖和左下圖的標(biāo)尺分別代表1000nm、500nm、200nm和100nm。
[0060] 圖7:TLR5細(xì)胞途徑的活化
[0061] A)Long-D2-Dl_ori(實(shí)施例 5);
[0062] 8)丁81。-研^-81?^1^-00-01:丁81。-?^-81?^1^-1'181'*(12:48)(實(shí)施例6) ;
[0063] C)PD52-2i88-PAND0RA-D2-Dl-〇ri:PD52-2i88-PAND0RA-Noro(5:55)(實(shí)施例 7); [0064]上圖：劑量-反應(yīng)活性評(píng)估；
[0065] 下圖：EC50評(píng)估；
[0066] 頂G-2205:鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白（0.29ng/ml)，陽性對(duì)照。
[0067] X軸:納米顆粒的濃度(ng/ml);
[0068] Y軸：SEAP表達(dá)(ng/ml)或者 ％ A = % 活性；
[0069] 圖8 :C57Bl/6小鼠中免疫后，ELISA結(jié)合測(cè)定抗體滴度(實(shí)施例8[圖A]和實(shí)施例9 舊B]中所述）
[0070] A)
[0071] 單獨(dú)的 T81c-8_Pf，劑量為 lyg;
[0072] ?單獨(dú)的 T81c-8_Pf，劑量為 10yg;
[0073] X比率為3:57的了81(：-8-00-01和了81(3-8^^的共組裝體，劑量為叫8;
[0074] ▲比率為3:57的T81 c-8-DO-D 1和T81 c-8-Pf的共組裝體，劑量為1 Oyg;
[0075] #比率為9:51的T81 c-8-DO-D 1和T81 c-8-Pf的共組裝體，劑量為lyg;
[0076] )K比率為9:51的T81 c-8-DO-D 1和T81 c-8-Pf的共組裝體，劑量為1 Oyg;
[0077] X軸:血清的稀釋因子；
[0078] Y軸:0D =光密度；
[0079] ELISA板使用用于免疫的完全免疫原包被；
[0080] B)
[0081 ] # 比率為 5:55 的 DM-D0-D1 和 D 頂-D2-Dl-tip3_NIC-pept 的共組裝體，劑量為 10μ g;
[0082] 耦合到載體KLH的尼古丁，劑量為10yg;
[0083] X軸:血清的稀釋因子；
[0084] Y軸：0D =光密度；
[0085] ELISA板僅用耦合到不相關(guān)載體的尼古丁包被。
[0086]圖9: Ni c-DEDDL構(gòu)建體的蛋白納米顆粒的透射電鏡圖。
[0087]重折疊并共組裝重組表達(dá)蛋白后，將樣本吸附到碳包被的網(wǎng)格上并用2%乙酸雙 氧鈾負(fù)染色。
[0088] 標(biāo)尺代表 lOOOnrn。
[0089] 圖1〇:抗體生成
[0090] 三只C57B1/6小鼠的組通過皮下注射10yg Nic-DEDDL(實(shí)施例10)進(jìn)行免疫，或者 皮下注射l〇yg Nic-KLH(耦合到載體KLH的尼古丁)作為陽性對(duì)照，每周獨(dú)立注射3次。通過 ELISA測(cè)定第0天(即第一次注射前)的抗體滴度以及每次注射后一周的抗體滴度。
[0091] d =第一次免疫后的天數(shù);A =抗體滴度(log2刻度）。
【具體實(shí)施方式】
[0092] 本發(fā)明提供了不同形式的鞭毛蛋白，其包含以任一方向納入納米顆粒中的鞭毛蛋 白的不同結(jié)構(gòu)域。某些實(shí)施方案中，鞭毛蛋白連接到納米顆粒，其N-末端和C-末端靠近納米 顆粒的表面（圖1);另一些實(shí)施方案中，鞭毛蛋白的遠(yuǎn)端部分靠近納米顆粒表面，因此將鞭 毛蛋白以相反方向呈遞到納米顆粒上（圖2)。
[0093] 由于炎性免疫應(yīng)答是佐劑尤其是TLR結(jié)合佐劑的主要問題之一，因此減低其誘導(dǎo) 炎性應(yīng)答的潛能是有利的。已知鞭毛蛋白的C-末端部分作為D0結(jié)構(gòu)域的部分，包含可與炎 性體相互作用的肽序列，因此負(fù)責(zé)鞭毛蛋白的炎性反應(yīng)。因此，設(shè)計(jì)了缺失可激活炎性體的 D0結(jié)構(gòu)域的C-末端部分的鞭毛蛋白構(gòu)建體(圖2)。
[0094] 本發(fā)明涉及自組裝蛋白納米顆粒，其由多個(gè)式(la)或式(lb)結(jié)構(gòu)單元的聚集物組 成。
[0095] X-ND1-L卜ND2-FLA (la)或者FLA-ND1-L卜ND2-X (Ib)，
[0096] 由包含蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域ND1、接頭L1、蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域ND2、鞭毛蛋白衍生物 FLA以及其它取代基X的連續(xù)鏈組成，其中
[0097] ND1是形成m個(gè)ND1亞基的低聚體(NDl)m的蛋白質(zhì)，
[0098] ND2是形成η個(gè)ND2亞基的低聚體(ND2)n的蛋白質(zhì)，
[0099] m和η各自的值介于2和10之間，條件是m不等于n，并且不是η的倍數(shù)，而且η不是m的 倍數(shù)，
[0100] L1代表鍵或者是短的柔性接頭，
[0101] FLA是鞭毛蛋白，或者缺失部分鞭毛蛋白氨基酸序列但至少包含TLR5結(jié)合結(jié)構(gòu)域 D1的鞭毛蛋白衍生物，并且其中，可任選地，缺失結(jié)構(gòu)域被1到20個(gè)氨基酸的柔性接頭片段 取代以連接其余鞭毛蛋白序列的兩個(gè)末端，或者被完全折疊的蛋白質(zhì)抗原取代；
[0102] X可不存在或者是含有1到1000個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)序列，
[0103] 可任選地與多個(gè)式(II)的結(jié)構(gòu)單元共組裝，
[0104] Y-ND3-L2-ND4-Z (II)，
[0105]由包含蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域ND3、接頭L2、蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域ND4以及其他取代基Y和 Z的連續(xù)鏈組成，其中
[0106] ND3是形成y個(gè)ND3亞基的低聚體(ND3)y的蛋白質(zhì)，
[0107] ND4是形成z個(gè)ND4亞基的低聚體(ND4)Z的蛋白質(zhì)，
[0108] 7和2各自的值介于2和10之間，條件是y不等于z，并且不是z的倍數(shù)，而且z不是7的 倍數(shù)，并且其中
[0109] ND3與ND1相同，或者ND4與ND2相同，或者ND3和ND4分別與ND1和ND2相同，
[0110] L2代表鍵或者是短的柔性接頭，其可與L1不同或者相同，并且
[0111] Y和Z，相互獨(dú)立地，可不存在或者是包含1到1000個(gè)氨基酸的1到100個(gè)氨基酸的肽 序列。
[0112] 本發(fā)明的蛋白納米顆粒以非常巧妙的方式將佐劑分子與目標(biāo)免疫原共定位，因此 鞭毛蛋白的佐劑屬性可與所需免疫應(yīng)答所針對(duì)的疫苗抗原共定位。通過將形成納米顆粒的 兩種蛋白鏈，一種具有鞭毛蛋白或者式(la)或（lb)分子中的鞭毛蛋白衍生物(FLA)，另一種 是納入目標(biāo)抗原(Y或Z)的式（II)，共組裝形成單個(gè)蛋白納米顆粒，佐劑和抗原可完美地共 定位。因此，這些實(shí)施方案中，佐劑效應(yīng)與納米顆粒重復(fù)的抗原展示的優(yōu)點(diǎn)共定位。此外，佐 劑效應(yīng)的貢獻(xiàn)可通過使用不同的、式(la)或（lb)的含鞭毛蛋白蛋白鏈與式(II)的含抗原蛋 白鏈共組裝比來增加或減低?？烧{(diào)整佐劑效應(yīng)以在最佳的抗原性和最低的副作用之間優(yōu) 化。
[0113] 如上所述，F(xiàn)LA是鞭毛蛋白或者缺失部分鞭毛蛋白氨基酸序列但至少包含TLR5結(jié) 合結(jié)構(gòu)域D1的鞭毛蛋白衍生物。缺失結(jié)構(gòu)域可以被1到20個(gè)氨基酸的柔性接頭片段取代，以 連接剩余鞭毛蛋白序列的兩個(gè)末端，或者可被完全折疊的蛋白質(zhì)抗原取代。柔性接頭區(qū)域 可包含適合的附著位點(diǎn)用于共價(jià)耦合抗原。
[0114] 含鞭毛蛋白的納米顆粒自身（即不與含抗原的、形成納米顆粒的蛋白鏈共組裝)可 用作給定疫苗中的常規(guī)佐劑，簡(jiǎn)單地加入任意形式的抗原呈遞中。
[0115] 作為另外的選項(xiàng)，可將抗原作為取代基X加工到僅含鞭毛蛋白的、形成納米顆粒的 式（la)或（lb)的蛋白鏈上，即，不再與含抗原的、形成納米顆粒的式（II)蛋白鏈共組裝，以 最大化佐劑效應(yīng)和重復(fù)抗原展示效應(yīng)的益處，使用抗原X作為B-細(xì)胞表位，并且鞭毛蛋白衍 生物FLA作為佐劑。
[0116] 由于鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)體系中蛋白鏈在通過D0、D1、D2和D3所有結(jié)構(gòu)域并且再返回形 成環(huán)，一種或多種結(jié)構(gòu)域可從所述序列中移除，通過再連接兩個(gè)末端成連續(xù)的肽鏈，形成鞭 毛蛋白衍生物FLA。因此，缺失鞭毛蛋白D2和D3結(jié)構(gòu)域的鞭毛蛋白衍生物構(gòu)建體可很容易加 工獲得，簡(jiǎn)單地通過在D1和D2結(jié)構(gòu)域界面處連接蛋白鏈獲得。類似地，頂部結(jié)構(gòu)域(僅D3或 者D2和D3-起)可被蛋白質(zhì)抗原取代，只要該蛋白抗原的N-末端和C-末端可被連接到D1和 D2之間界面的N-末端和C-末端。頂部結(jié)構(gòu)域D2和D3還可被具有適合的殘基的肽序列取代， 以共價(jià)耦合抗原分子。這樣的肽環(huán)的一個(gè)實(shí)例是序列KYKD⑶K⑶DK(SEQ ID N0:1)，其包含4 個(gè)賴氨酸殘基用于共價(jià)耦合到其第一個(gè)氨基。納入賴氨酸殘基的這樣的親水環(huán)提供耦合位 點(diǎn)用于將配體分子共價(jià)附著到賴氨酸側(cè)鏈的第一個(gè)氨基酸。用精氨酸取代鞭毛蛋白序列中 的賴氨酸殘基可移除所述分子其他部分中不需要的耦合位點(diǎn)。這兩種修飾產(chǎn)生的鞭毛蛋白 衍生物序列如下：
[0118]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是將鞭毛蛋白作為二聚體加工到納米顆粒上。因此，與同樣 是二聚體的TLR5的相互作用是優(yōu)選的。通過使用二聚體蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域作為NDl(m等于 2)或者ND2(n等于2)可容易地實(shí)現(xiàn)，并且可將其用作鞭毛蛋白衍生物FLA的附著位點(diǎn)，分別 如式（lb)或（la)所示。這將使得鞭毛蛋白衍生物成為二聚體形式，其更容易與TLR5相互作 用（圖2)。優(yōu)選地，該實(shí)施方案中，鞭毛蛋白所附著的式（la)或（lb)結(jié)構(gòu)單元中的二聚體低 聚化結(jié)構(gòu)域(式（la)中的ND2或式（lb)中的ND1)與式（II)結(jié)構(gòu)單元中相應(yīng)的低聚化結(jié)構(gòu)域 (與式（la)的鏈共組裝時(shí)的ND4或者與式（lb)的鏈共組裝時(shí)的ND3)不同。優(yōu)選地，式（la)或 (lb)結(jié)構(gòu)單元中的二聚體低聚化結(jié)構(gòu)域比式（II)結(jié)構(gòu)單元中相應(yīng)的低聚化結(jié)構(gòu)域(ND3或 ND4)具有更強(qiáng)的相互作用，即二聚體形成潛能。這可保證在與式（la)或（lb)和式（II)的結(jié) 構(gòu)單元共組裝的納米顆粒中，鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生物FLA總能夠在相鄰的式（la)或 (lb)結(jié)構(gòu)單元上形成二聚體，并且作為單個(gè)單體分布在整個(gè)共組裝的納米顆粒中。
[0119]此外，通過將翻轉(zhuǎn)方向的鞭毛蛋白加工(優(yōu)選地作為二聚體)到納米顆粒上，可優(yōu) 化與TLR5二聚體的相互作用（圖2)。這樣的納米顆粒是優(yōu)選的。例如，可通過在D0和D1結(jié)構(gòu) 域之間的界面處將所述蛋白鏈與肽序列例如KAKKKDGKDDKDS(SEQ ID N0:29,圖2中的"T"） 連接而創(chuàng)建D1-D2鞭毛蛋白構(gòu)建體，以此缺失DO結(jié)構(gòu)域并完全移除D3結(jié)構(gòu)域而不需要重新 連接蛋白鏈。因此，所產(chǎn)生的鞭毛蛋白分子將具有D2結(jié)構(gòu)域中的N-末端和C-末端，以產(chǎn)生 D2-D1序列，如
[0121] 可使用具有1到20個(gè)氨基酸的類似的柔性接頭序列（圖2中的"T"），例如GS或 GKDGKDGS(SEQ ID N0:31)或者GKDGKDGKDGKDGS(SEQ ID N0:32)。優(yōu)選地，接頭序列主要包 含帶電的或者極性氨基酸，其間散步有甘氨酸殘基以產(chǎn)生接頭柔性。為避免該D2-D1構(gòu)建體 上不希望的耦合位點(diǎn)，使用精氨酸殘基取代賴氨酸殘基。
[0122] 然后，鞭毛蛋白衍生物FLA必須連接到鞭毛蛋白D2部分的二聚體低聚化結(jié)構(gòu)域ND1 或ND2。由這樣的結(jié)構(gòu)單元(單獨(dú)的或者與相應(yīng)的式(II)結(jié)構(gòu)單元共組裝的）制備納米顆粒， 可形成具有翻轉(zhuǎn)方向鞭毛蛋白衍生物的優(yōu)選的納米顆粒。
[0123] 單體結(jié)構(gòu)單元
[0124] 肽(或者多肽或蛋白質(zhì))是通過酰胺鍵共價(jià)連接的氨基酸鏈或氨基酸序列。肽可以 是天然的、改性天然的、部分合成的或者完全合成的。改性天然的、部分合成的或者完全合 成的可理解為意指自然條件下不會(huì)產(chǎn)生的。術(shù)語氨基酸包括選自20種必需的天然α-L-氨基 酸的天然存在的氨基酸，合成氨基酸例如α-D-氨基酸、6-氨基己酸、正亮氨酸、高半胱氨酸 等，以及天然存在的氨基酸經(jīng)過了某些方式改性以改變某些屬性例如帶電性，例如磷酸絲 氨酸或磷酸酪氨酸或者其他修飾例如正辛?；z氨酸等。在氨基酸衍生物中，形成酰胺鍵 的氨基是烷基化的，或者側(cè)鏈氨基、羥基或含硫官能團(tuán)被烷基化或?；?，或者側(cè)鏈羧基官能 團(tuán)被酰胺化或酯化。優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包含選自20種必需的天然α-L-氨基酸的氨基 酸。
[0125] 粗略估計(jì)，可基于其大小將肽與蛋白質(zhì)加以區(qū)別，即約50個(gè)氨基酸或更少的鏈稱 為肽，而更長(zhǎng)的鏈稱為蛋白質(zhì)。二肽是最短的肽，由2個(gè)氨基酸通過單個(gè)肽鍵連接而成。同 理，三肽由3個(gè)氨基酸組成，四肽由4個(gè)氨基酸組成等。多肽是長(zhǎng)的、連續(xù)、不分支的肽鏈。文 獻(xiàn)中，可區(qū)分肽與蛋白質(zhì)的尺寸邊界不十分明確。有時(shí)，長(zhǎng)的"肽"例如β淀粉樣蛋白被看作 是蛋白質(zhì)，反之有時(shí)較小的蛋白質(zhì)例如胰島素被稱作肽。
[0126] 短的柔性接頭鏈L1或L2選自任選取代的碳原子、任選取代的氮原子、氧原子、硫原 子及其組合，優(yōu)選地，鏈中含1到60個(gè)原子，尤其優(yōu)選含1到20個(gè)原子。所述短的柔性接頭鏈 是例如聚亞乙基氧基鏈、柔性糖鏈或者優(yōu)選柔性肽鏈，例如由1到20個(gè)氨基酸組成的肽鏈， 特別是由1到6個(gè)氨基酸組成含有1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸甘氨酸的肽鏈。最優(yōu)選的接頭具有高甘 氨酸含量，由1到6個(gè)氨基酸組成。
[0127] 本發(fā)明的低聚化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選是卷曲螺旋。卷曲螺旋是具有連續(xù)模式的主要為疏水 性的殘基間隔開3和4個(gè)殘基的蛋白質(zhì)序列，其組裝形成多聚螺旋束，下文將有更詳細(xì)描述。
[012 8 ]非卷曲螺旋的低聚化結(jié)構(gòu)域是例如菌體T 4蛋白f i b r i t i η的三聚結(jié)構(gòu)域(折疊 子）（Tao，Y.et al.，Structure 1997,5:789-798)。
[0129] 低聚化結(jié)構(gòu)域ND1、ND2、ND3和/或ND4以及接頭L1和/或L2優(yōu)選地可進(jìn)一步被靶向 實(shí)體或取代基取代，以增強(qiáng)納米顆粒的佐劑性質(zhì)，例如免疫刺激核酸，優(yōu)選含脫氧肌苷的低 聚脫氧核苷酸、含脫氧尿苷的低聚脫氧核苷酸、含CG基序、CpG的低聚脫氧核苷酸、咪喹莫 德、瑞喹莫德、嘎德莫特、含肌苷和胞苷的核酸分子等。其他增強(qiáng)納米顆粒佐劑性質(zhì)的取代 基是抗微生物肽，例如陽離子肽，其是一類免疫刺激劑，能夠促進(jìn)和/或提高適應(yīng)性免疫應(yīng) 答的帶正電荷分子。具有免疫增強(qiáng)性質(zhì)的肽的一個(gè)實(shí)例是帶正電荷的人工抗微生物肽 KLKLLLLLKLK(SEQ ID N0:2)，其可在加強(qiáng)免疫接種后誘導(dǎo)有效的蛋白特異性2型驅(qū)動(dòng)適應(yīng) 性免疫?？勺鳛槿〈囊粋€(gè)具體的靶向?qū)嶓w是ER-靶向信號(hào)，即，可將蛋白質(zhì)或肽引導(dǎo)至 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的信號(hào)肽。
[0130] 可任選的取代基，例如上述可任選的取代基，優(yōu)選連接到靠近低聚化結(jié)構(gòu)域ND1、 ND2、ND3和/或ND4末端并與結(jié)合L1或L2的末端相對(duì)的適合的氨基酸。蛋白納米顆粒自組裝 后，所述取代基可呈遞在納米顆粒的表面。取代基可連接到連續(xù)蛋白鏈的末端，或者可連接 到靠近ND1、ND2、ND3和/或ND4末端并與結(jié)合L1或L2的末端相對(duì)的氨基酸的側(cè)鏈官能團(tuán)。
[0131 ] -個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，取代基是肽或者蛋白質(zhì)取代基，并且稱作X、Y和/或Z， 代表簡(jiǎn)單的蛋白鏈延伸，例如在ND1的Ν-末端的X-ND1-L1-ND2-FLA，或在其兩個(gè)末端的Υ- ND3-L2-ND4-Z，以產(chǎn)生組合的單個(gè)連續(xù)蛋白質(zhì)序列，其可在重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)成單 個(gè)分子。
[0132] 其他實(shí)施方案中，肽或非肽取代基可連接到靠近ND1、ND2、ND3和/或ND4末端并與 結(jié)合L1或L2的末端相對(duì)的氨基酸的側(cè)鏈官能團(tuán)，或者如果X、Y和/或Z是肽或蛋白質(zhì)其優(yōu)選 地連接到Χ、Υ和/或Ζ延伸中氨基酸的側(cè)鏈官能團(tuán)。
[0133] 還可將取代基附著到接頭L1或L2。此情況下，自組裝的蛋白納米顆粒重折疊后，取 代基將定位于自組裝蛋白納米顆粒的內(nèi)腔中。
[0134] 形成低聚體的傾向意指所述蛋白質(zhì)可依據(jù)條件形成低聚體，例如，在變性條件下 它們是是單體，但在生理?xiàng)l件下，它們可形成例如二聚體、三聚體、四聚體或者五聚體。預(yù)定 條件下，其采用單一低聚狀態(tài)，這是納米顆粒形成所需要的。但是，條件改變后其低聚狀態(tài) 可改變，例如鹽濃度提高后可由二聚體變?yōu)槿垠w(Burkhard P.et al.，Protein Science 2000，9:2294-2301)或者pH降低后可由五聚體變?yōu)閱误w。
[0135] 式（la)、（Ib)或（II)的結(jié)構(gòu)單元構(gòu)造與病毒衣殼蛋白明顯不同。病毒衣殼由單一 蛋白組成，其形成60的低聚體或其倍數(shù)，例如乙型肝炎病毒顆粒(EP 1 262 555、EP 0 201 416)，或者由超過一種蛋白組成，其自組裝形成病毒衣殼結(jié)構(gòu)，依據(jù)病毒的類型其也可采取 不同于二十面體的幾何形狀(Fender P.et al.，Nature Biotechnology 1997,15:52-56)。 本發(fā)明的自組裝蛋白納米顆粒(SAPN)也可顯著不同于病毒類顆粒，由于(a)其結(jié)構(gòu)不同于 病毒衣殼蛋白，且(b)納米顆粒中間的腔體太小而無法容納完整病毒基因組的DNA/RNA。
[0136] 蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域是公知的（Burkhard P· et al ·，Trends Cell Biol 2001，11: 82-88) dRCSB-PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫( http://www.rcsb.org/)包含蛋白質(zhì)的原子結(jié)構(gòu)。該網(wǎng) 站提供可從原子結(jié)構(gòu)中鑒定蛋白質(zhì)低聚體的工具。使用高級(jí)搜索模式（http:// www·rsb · org/pdb/search/advSearch · do)，在 "Protein Stoichiometry" 中限定 "A5"檢索 五聚體蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域。使用高級(jí)搜索模式在"S⑶P classification Browser"中限定 "Coiled coi 1 proteins"檢索卷曲螺旋蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域。結(jié)合這兩種搜索，可在該數(shù)據(jù) 庫中檢索所有的五聚體卷曲螺旋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。同樣的，可分別使用"A2"、"A3"或者"A4"作為 限定詞，檢索二聚體、三聚體或者四聚體卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中，低聚化結(jié)構(gòu)域ND1、ND2、 ND3和ND4是優(yōu)選的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。卷曲螺旋是具有連續(xù)模式的主要為疏水性的殘基間隔 開3和4個(gè)殘基的蛋白質(zhì)序列，通常為7個(gè)氨基酸的序列（7價(jià)重復(fù)）或11個(gè)氨基酸的序列 (undecad重復(fù)），其組裝(折疊)形成多聚螺旋束。具有包含不規(guī)則分布的3和4個(gè)殘基間隔的 序列的卷曲螺旋也是可能的。疏水殘基具體地是疏水性氨基酸Val、Ile、Leu、Met、Tyr、Phe 和Trp。主要為疏水性意指至少50 %的殘基必須選自所述疏水性氨基酸。
[0137] 例如，在式（Ia)、（Ib)或（II)的優(yōu)選的單體結(jié)構(gòu)單元中，ND1、ND2、ND3和ND4是具有 任意下式的蛋白質(zhì)
[0145] 其中，aa代表氨基酸或其衍生物，aa(a)、aa(b)、aa(c)、aa(d)、aa(e)、aa(f)以及aa (g)是相同或者不同的氨基酸或其衍生物，優(yōu)選地aa(a)和aa(d)是相同或者不同的疏水性 氨基酸或其衍生物，并且X是2和20之間優(yōu)選3和10之間的數(shù)值。
[0146] 七價(jià)體是式 aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)_aa(g) (II la)的七肽或式 (Iiib)到（Iiig)的任意變換。
[0147] 優(yōu)選地是式（la)、（Ib)或（II)的單體結(jié)構(gòu)單元，其中所有蛋白質(zhì)低聚化結(jié)構(gòu)域 燦1、燦2、燦3和燦4是
[0148] (1)式（Ilia)到（Iiig)任意的蛋白質(zhì)，其中X等于3,并且aa(a)和aa(d)選自20種天 然α-L-氨基酸，例如表1中該6種氨基酸的賦值總和至少是14,且所述蛋白質(zhì)包含最多17種 其他的七價(jià)體;或者
[0149] (2)式（Ilia)到（Iiig)任意的蛋白質(zhì)，其中X等于3,并且aa(a)和aa(d)選自20種天 然α-L-氨基酸，例如表1中該6種氨基酸的賦值總和至少是12,條件是氨基酸aa(a)為帶電荷 氨基酸，能夠與相鄰七價(jià)體的氨基酸aa(d)或aa(g)形成螺旋間鹽橋，氨基酸aa(d)為帶電荷 氨基酸，能夠與相鄰七價(jià)體的氨基酸aa (a)或aa (e)形成螺旋間鹽橋，并且所述蛋白質(zhì)包含 最多2種其他的七價(jià)體。能夠與相鄰的七價(jià)體形成螺旋間鹽橋的帶電荷氨基酸是例如Asp或 Glu，如果其他氨基酸是Lys、Arg或His，反之亦然。
[0150] 表1:用于確定優(yōu)選方案的氨基酸賦值
[0153] 另外優(yōu)選的是式（la)、（Ib)或（II)的單體結(jié)構(gòu)單元，其中一種或多種蛋白質(zhì)低聚 化結(jié)構(gòu)域ND1、ND2、ND3或ND4選自以下優(yōu)選的蛋白質(zhì)：
[0154] (11)式(Ilia)到（Illg)任意的蛋白質(zhì)，其中
[0155] aa(a)選自Val、Ile、Leu和Met，及其衍生物，且
[0156] aa(d)選自 Leu、Met、Val 和 lie,及其衍生物。
[0157] (12)式（Ilia)到（Illg)任意的蛋白質(zhì)，其中一個(gè)aa(a)是Asn且其他aa(a)選自 Asn、lie和Leu,并且aa(d)是Leu。這樣的蛋白質(zhì)通常是二聚化結(jié)構(gòu)域。
[0158] (13)式（Ilia)到（Illg)任意的蛋白質(zhì)，其中aa(a)和aa(d)都是Leu或者都是lie。 這樣的蛋白質(zhì)通常是三聚化結(jié)構(gòu)域。
[0?59] (14)式(Ilia)到（Illg)任意的蛋白質(zhì)，其中aa(a)和aa(d)都是Trp。這樣的蛋白質(zhì) 通常是五聚化結(jié)構(gòu)域。
[0160] (15)式（Ilia)到（Illg)任意的蛋白質(zhì)，其中aa(a)和aa(d)都是Phe。這樣的蛋白質(zhì) 通常是四聚化結(jié)構(gòu)域。
[0161] (16)式（Ilia)到（Illg)任意的蛋白質(zhì)，其中aa(a)和aa(d)都是Trp或者Phe。這樣 的蛋白質(zhì)通常是五聚化結(jié)構(gòu)域。
[0162] (17)式（Ilia)到（Illg)任意的蛋白質(zhì)，其中aa(a)為L(zhǎng)eu或lie,且其中一個(gè)aa(d) 是Gln，并且其他aa(d)選自Gln、Leu和Met。這樣的蛋白質(zhì)可能是五聚化結(jié)構(gòu)域。
[0163] 其他優(yōu)選的蛋白質(zhì)是上述蛋白質(zhì)（1)、（2)、（11)、（12)、（13)、（14)、（15)、（16)和 (17)，并且其中進(jìn)一步地
[0164] (21)至少一個(gè)aa(g)選自Asp和Glu，并且后續(xù)七價(jià)體中的aa(e)是Lys、Arg或者 His;和/或
[0165] (22)至少一個(gè)33(8)選自1^8、4找和!1丨8，并且后續(xù)七價(jià)體中的33(6)是48?；?111， 和/或
[0166] (23)至少一個(gè)aa(a到g)選自Lys、Arg和His,并且在序列中相隔3或4個(gè)氨基酸的aa (a到g)是Asp或GltaaU到g)的氨基酸對(duì)是例如aa(b)和aa(e)或aa(f)。
[0167] 卷曲螺旋預(yù)測(cè)程序例如PC0ILS( http ://toolkit. tueb ingen .mpg · de/pcoils ; Gruber M.et al·，J.Struct.Biol·2006,155(2):140-5)或MULTICOIL(http:// groups · csail .mit · edu/cb/multicoil/cgi-bin/multicoil · cgi)能夠預(yù)測(cè)可形成卷曲螺 旋的蛋白質(zhì)序列。因此，式（Ia)、（Ib)或（II)的單體結(jié)構(gòu)單元中，ND1、ND2、ND3和ND4是含有 兩個(gè)七價(jià)體重復(fù)長(zhǎng)度的至少一個(gè)序列的蛋白質(zhì)，經(jīng)卷曲螺旋預(yù)測(cè)程序PC0ILS預(yù)測(cè)其以對(duì)于 所有的氨基酸而言超過0.9的概率形成卷曲螺旋，具有14、21或28的至少一個(gè)窗口大小。
[0168] 式（Ia)、（Ib)或（II) 一個(gè)更優(yōu)選的的單體結(jié)構(gòu)單元中，ND1、ND2、ND3和ND4是含有 三個(gè)七價(jià)體重復(fù)長(zhǎng)度的至少一個(gè)序列的蛋白質(zhì)，經(jīng)卷曲螺旋預(yù)測(cè)程序PC0ILS預(yù)測(cè)其以對(duì)于 所有的氨基酸而言超過0.9的概率形成卷曲螺旋，具有14、21或28的至少一個(gè)窗口大小。
[0169] 式（Ia)、（Ib)或（II)另一個(gè)更優(yōu)選的的單體結(jié)構(gòu)單元中，ND1、ND2、ND3和ND4是含 有兩個(gè)七價(jià)體重復(fù)長(zhǎng)度的至少兩個(gè)分離的序列的蛋白質(zhì)，經(jīng)卷曲螺旋預(yù)測(cè)程序PC0ILS預(yù)測(cè) 其以對(duì)于所有的氨基酸而言超過0.9的概率形成卷曲螺旋，具有14、21或28的至少一個(gè)窗口 大小。
[0? 70]已知卷曲螺旋序列可從數(shù)據(jù)庫例如RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http: //www. rcsb. org)中 檢索。
[0171] 最優(yōu)選卷曲螺旋序列，并且單體結(jié)構(gòu)單元在實(shí)施例中描述。
[0172] 另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，一個(gè)低聚化結(jié)構(gòu)域ND1、ND2、ND3或ND4是噬菌體T4蛋白 fibritin的三聚結(jié)構(gòu)域（折疊子）（Tao，Y.et al.，Structure 1997,5:789-798)或其衍生 物。所述三聚結(jié)構(gòu)域序列為GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 3)。對(duì)該結(jié)構(gòu)域進(jìn) 行小的修飾是可行的。
[0173]自組裝蛋白納米顆粒:LCM單元
[0174]自組裝蛋白納米顆粒(SAPN)由式（la)、（lb)的單體結(jié)構(gòu)單元或者式（la)或（lb)的 單體結(jié)構(gòu)單元與式（II)的單體結(jié)構(gòu)單元的混合物形成。如果這些結(jié)構(gòu)單元組裝，它們將形 成所謂的"LCM單元"。將組裝成這樣的LCM單元的單體結(jié)構(gòu)單元的數(shù)量可通過最小公倍數(shù) (LCM)定義。因此，如果例如單體結(jié)構(gòu)單元的低聚化結(jié)構(gòu)域形成五聚體(NDl)5(m=5)和二聚 體(ND2)2(n = 2)，那么將由10個(gè)單體形成LCM單元。如果接頭片段L具有適合的長(zhǎng)度，那么該 LCM單元可組裝成球形蛋白納米顆粒。
[0175] 自組裝蛋白納米顆粒（SAPN)可由僅一種或者超過一種LCM單元形成（表2)。這種 SAPN代表拓?fù)浞忾]結(jié)構(gòu)。
[0176] 正多面體
[0177] 有5種正多面體，四面體、立方體、八面體、十二面體和二十面體。他們具有不同的 內(nèi)部旋轉(zhuǎn)對(duì)稱元素。四面體具有一個(gè)2-折疊軸線和2個(gè)3-折疊軸線，立方體和八面體具有2- 折疊、3-折疊和4-折疊旋轉(zhuǎn)對(duì)稱軸，十二面體和二十面體具有2-折疊、3-折疊和5-折疊旋轉(zhuǎn) 對(duì)稱軸。立方體中，這些軸的空間定向與八面體完全一致，十二面體和二十面體中這些軸的 空間定向也是相互之間完全一致。因此，為了本發(fā)明的SAPN的目的，十二面體和二十面體可 以認(rèn)為是一致的。十二面體/二十面體由60個(gè)一致的三維結(jié)構(gòu)單元組成(表2)。這些結(jié)構(gòu)單 元是多面體的不對(duì)稱單元(AU)。他們是椎體，并且椎體邊緣對(duì)應(yīng)于旋轉(zhuǎn)對(duì)稱軸，因此這些AU 的邊緣具有2-折疊、3-折疊和5-折疊對(duì)稱元素。如果這些對(duì)稱元素是由蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域 產(chǎn)生的，則所述AU由上述單體結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成。將兩個(gè)低聚化結(jié)構(gòu)域ND1和ND2或者ND3和ND4 沿AU的兩條對(duì)稱軸排列是足夠的。如果這兩個(gè)低聚化結(jié)構(gòu)域形成穩(wěn)定的低聚體，則沿第三 條對(duì)稱軸的對(duì)稱界面將自動(dòng)產(chǎn)生，并且可通過優(yōu)化沿該界面的相互作用例如疏水相互作 用、親水相互作用或離子相互作用或者共價(jià)鍵例如二硫鍵來使其穩(wěn)定。
[0178] 表2:正多面體形成中低聚化狀態(tài)可能的組合
[0181] 組裝成為具有正多面體對(duì)稱性的自組裝蛋白納米顆粒(SAPN)
[0182] 為形成具有規(guī)則幾何形狀(十二面體、二十面體、八面體、立方體)的自組裝蛋白納 米顆粒(SAPN)，需要多于一個(gè)LCM單元。例如，為由含三聚體和五聚體低聚化結(jié)構(gòu)域的單體 形成二十面體，需要4個(gè)LCM單元，每種由15個(gè)單體結(jié)構(gòu)單元組成，也就是具有規(guī)則幾何形狀 的蛋白納米顆粒將由60個(gè)單體結(jié)構(gòu)單元組成。所需的兩種低聚化結(jié)構(gòu)域的低聚化狀態(tài)的組 合以及形成兩種可能的多面體的LCM單元的數(shù)量見表2所列。
[0183] LCM單元是否將進(jìn)一步組裝形成由多于一個(gè)LCM單元組成的正多面體依賴于兩種 低聚化結(jié)構(gòu)域ND1和ND2或者ND3和ND4相對(duì)于彼此的幾何排列，尤其是依賴于兩種低聚化結(jié) 構(gòu)域的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱軸之間的角度。其控制主要通過i)納米顆粒中相鄰結(jié)構(gòu)域之間的相互作 用，ii)接頭片段L的長(zhǎng)度，iii)個(gè)體低聚化結(jié)構(gòu)域的形狀。與正多面體中的排列相比，LCM單 元中的該角度較大。并且，與正多面體相反，單體結(jié)構(gòu)單元中的角度并不一致。如果將正多 面體的角度限定為較小值(通過兩種低聚化結(jié)構(gòu)域之間的有吸引力的疏水、親水或離子相 互作用或者共價(jià)二硫橋)并且接頭L足夠短，則每個(gè)包含確定數(shù)量的單體結(jié)構(gòu)單元的給定數(shù) 量的LCM單元將進(jìn)一步退火形成正多面體(表2)，或者包裝更多的單體結(jié)構(gòu)單元以形成多面 體的缺少精確內(nèi)部對(duì)稱性的納米顆粒。
[0184] 如果兩種低聚化結(jié)構(gòu)域之間的角度足夠小(甚至小于具有二十面體對(duì)稱的正多面 體中的角度），則大量(數(shù)百條)蛋白鏈可組裝成蛋白納米顆粒。該設(shè)計(jì)中，SAPN的分子量可 相當(dāng)于60條蛋白鏈的數(shù)倍，接近于準(zhǔn)等價(jià)理論或病毒衣殼貼磚理論所描述的"全部五聚體" 病毒結(jié)構(gòu)。
[0185] 優(yōu)選地，可包含在含鞭毛蛋白納米顆粒中的抗原可以是B-細(xì)胞表位和/或T-細(xì)胞 表位，并且選自：（a)適于誘導(dǎo)針對(duì)癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)或肽；（b)適于誘導(dǎo)針對(duì)感染 性疾病的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)、肽或碳水化合物；（c)適于誘導(dǎo)針對(duì)變應(yīng)原的免疫應(yīng)答的蛋白 質(zhì)或肽；（d)適于誘導(dǎo)可用于治療人疾病的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)或者肽激素；和（e)適于誘導(dǎo) 可治療成癮或其他病癥的免疫應(yīng)答的半抗原分子。包含所述蛋白質(zhì)、其肽段、肽、碳水化合 物或者半抗原的蛋白納米顆?？蛇m于誘導(dǎo)人或者農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物及寵物體內(nèi)的免疫應(yīng)答。
[0186] 另一方面，本發(fā)明涉及上述所定義的式(la)或（lb)的單體結(jié)構(gòu)單元。
[0187] 另一方面，本發(fā)明涉及包含本文所述的蛋白納米顆粒的組合物。所述組合物非常 適合作為疫苗。優(yōu)選的疫苗組合物包括水性緩沖溶液中的蛋白納米顆粒，并且還可包括例 如糖衍生的賦形劑(例如甘油、海藻糖、蔗糖等)或者氨基酸衍生的賦形劑(例如精氨酸、脯 氨酸、谷氨酸等)或者陰離子、陽離子、非離子或兩性離子去垢劑(例如膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、 吐溫等)或任意類型的鹽(例如NaCl、MgCl2等）用于調(diào)節(jié)溶液的離子強(qiáng)度。
[0188] 另一方面，本發(fā)明涉及預(yù)防接種人或者非人動(dòng)物的方法，包括給予需要所述疫苗 接種的受試者以有效量的本文所述蛋白納米顆粒。
[0189 ] FLA-SAPN(含鞭毛蛋白的自組裝蛋白納米顆粒)的設(shè)計(jì)
[0190] 本發(fā)明的FLA-SAPN的具體實(shí)例包括下述構(gòu)建體"FLA-SAPN-la"和"FLA-SAPN-2"
[0195]所述構(gòu)建體由以下局部結(jié)構(gòu)組成：
[0197] 為方便純化，F(xiàn)LA-SAPN-la起始于式(la)或（lb)中所定義的序列X:
[0198] MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGS (SEQ ID NO:6)
[0199] 其包含His-tag用于鎳親和純化并且在DNA水平包含限制性位點(diǎn)用于進(jìn)一步亞克 隆（NcoI、NheI、BamHI)。
[0200] 對(duì)于ND1，選擇五聚結(jié)構(gòu)域(m = 5)。具體的五聚化卷曲螺旋是色氨酸拉鏈五聚化結(jié) 構(gòu)域的新修飾(Liu J.et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101(46):16156-61，pdb- entry 1T8Z)。
[0201 ]初始色氨酸拉鏈五聚化結(jié)構(gòu)域序列如下：
[0202] SSNAKWDQWSSDWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQA概DDWARWNQRWDNWAT(SEQ ID N0:12)。
[0203] 用于FLA-SAPN-1 a的五聚化結(jié)構(gòu)域的修飾的卷曲螺旋序列始于位點(diǎn)13、終于位點(diǎn) 49,并且在其C-末端包含少量的序列變異(RALWM取代NQRWD)但保留色氨酸殘基的七價(jià)重復(fù) 模式，如起始序列（SEQ ID NO: 12)中的。
[0204] 13-ffQTffNARWDQffSNDffNAffRSDffQAffRDDffARffRALffM-49(SEQ ID N0:7)〇
[0205] 該序列然后通過2個(gè)甘氨酸殘基的短接頭Ll(GG)延伸，然后連接到下述序列的三 聚化結(jié)構(gòu)域ND2,其為非常穩(wěn)定的卷曲螺旋三聚體：
[0206] RLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARG(SEQ ID NO:8)
[0207] 已發(fā)現(xiàn)，即使在SDS-PAGE的完全變性條件下也可形成三聚體（圖5)。其還包含泛DR 結(jié)合HTL表位串RFVAAWTLRVRA，其是具有優(yōu)化的三聚體卷曲螺旋偏好的PADRE序列的衍生 物。
[0208] FLA-SAPN-la中，式la的"FLA"部分由鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白的D0和D1結(jié)構(gòu)域(如 專利US8，420，102所述)組成，具有如下序列：
[0210]然后，該設(shè)計(jì)得到如下序列，可用于蛋白表達(dá)、純化和生物物理分析。
[0212] FLA-SAPN-la單體的模型見圖1C。
[0213] 相應(yīng)的構(gòu)建體"FLA-SAPN-2"如下：
[0214] 為方便純化，F(xiàn)LA-SAPN-2起始于式(II)中所定義的序列Y:
[0215] MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGS(SEQ ID NO:10)
[0216] 其包含His-tag可用于鎳親和純化、來自瘧原蟲CS-蛋白的T-細(xì)胞表位序列T1BT* (Calvo-Calle J.Μ., Infection and immunity 2006:6929-6939)
[0217] EYLNKIQNSLSTEWSPSSVT(SEQ ID NO:13)
[0218] 其中一個(gè)半胱氨酸被絲氨酸取代，并且在DNA水平包含限制性位點(diǎn)用于進(jìn)一步亞 克隆(NcoI、NheI、BamHI)，因此與FLA-SAPN-la的 "X"有一些區(qū)別。
[0219] FLA-SAPN-2中的ND3與FLA-SAPN-la中的ND1完全一致，以確保正確的共組裝。
[0220] 13-ffQTffNAKWDQffSNDffNAffRSDffQAffKDDffARffRALffM-49(SEQ ID N0:7)〇
[0221] 該序列然后通過2個(gè)甘氨酸殘基的短接頭L2(GG)延伸，這也與FLA-SAPN-la-致。
[0222] 然后，F(xiàn)LA-SAPN-2中的接頭與以下序列的三聚化結(jié)構(gòu)域ND4連接：
[0223] RLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARG
[0224] (SEQ ID N0:8)
[0225] 其與FLA-SAPN-la中的序列完全一致，因此，納米顆粒FLA-SAPN-la和FLA-SAPN-2 的核心ND1-L1-ND2和ND3-L2-ND4完全一致，并確保兩種蛋白鏈重折疊后正確的共組裝。
[0226] FLA-SAPN-2中，式（II)的"Z"部分由瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白（CSP)的重復(fù)區(qū)組成，其 包含3個(gè)重復(fù)的（NANP)以及在天然CS -蛋白序列中發(fā)生的它的某些修飾 (DPNANPNVDPNANPNV，SEQ ID勵(lì):14)，并且是可產(chǎn)生免疫應(yīng)答的8-細(xì)胞表位。其通過序列36 連接到顆粒：
[0227] SGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP(SEQ ID NO:11)
[0228] 然后，該設(shè)計(jì)得到如下序列，可用于蛋白表達(dá)、純化和生物物理分析。
[0230] FLA-SAPN-2單體的模型見圖1C。
[0231] 由FLA-SAPN-la和FLA-SAPN-2以1:59比率共組裝的納米顆粒的模型見圖1C，假設(shè)T =1二十面體對(duì)稱。
[0232] FLA-SAPN-la和FLA-SAPN-2蛋白以48:12比率共組裝的EM圖見圖4。
[0233] 實(shí)施例
[0234] 實(shí)施例1-克隆
[0235] 編碼納米顆粒構(gòu)建體的DNA是通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)操作制備的。含有編碼L0NG- D2-Dl-〇ri蛋白序列的DNA的質(zhì)粒是通過將圖3的基本SAPN表達(dá)構(gòu)建體克隆進(jìn)入NcoI/EcoRI 限制性位點(diǎn)構(gòu)建的。所述L0NG-D2-D1 -or i蛋白序列如下：
[0237] 此構(gòu)建不包括兩種不同構(gòu)建體的混合/共組裝步驟。所述疫苗免疫原可通過將疫 苗表位例如尼古丁共價(jià)附著到已經(jīng)納入鞭毛蛋白衍生物的載體產(chǎn)生，優(yōu)選地附著到賴氨酸 殘基。
[0238] 該構(gòu)建體由五聚化卷曲螺旋色氨酸拉鏈(ND1)通過2個(gè)甘氨酸殘基(GG)連接到三 聚化從頭設(shè)計(jì)的卷曲螺旋(ND2)構(gòu)成，其包含泛DR結(jié)合⑶4表位串ERFVAAWTLRVRAL( SEQ ID 勵(lì):16)。其1末端包含把8-丨&8及凝血酶切割位點(diǎn)〇)。該乂-勵(lì)1-1^1-冊(cè)2核心結(jié)構(gòu)見上述。在 C_末端，鞭毛蛋白構(gòu)建體(FLA)由沙門菌鞭毛蛋白的D1和D2結(jié)構(gòu)域組成，其來自有pdb-code 3V47(RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫）附著的結(jié)構(gòu)。D1和D2結(jié)構(gòu)域跨越部分的348到447殘基通過單個(gè)甘 氨酸殘基以相反方向連接到D1和D2結(jié)構(gòu)域再跨越部分的24到214殘基。該設(shè)計(jì)將鞭毛蛋白 D1和D2分子附著到納米顆粒以將D1結(jié)構(gòu)域展示在納米顆粒的外表面，并且將TLR5結(jié)合位點(diǎn) 暴露至納米顆粒的表面(圖2a)。與圖2不同，從頭設(shè)計(jì)的卷曲螺旋ND2是三聚化卷曲螺旋。
[0239] 實(shí)施例2-表達(dá)
[0240]將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，所述細(xì)胞在含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng)。使用異丙基β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)后4小時(shí)，從37°C取出細(xì)胞，并通過4， 000 X g離心15min收獲細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀物儲(chǔ)存在-20°C。使細(xì)胞沉淀物在冰上解凍，并懸浮 于由9M尿素、100mM NaH2P〇4、10mM Tris pH 8、20mM咪唑和0.2mM三（2-羧乙基）膦（TCEP)組 成的裂解緩沖液中。
[0241] 可選擇地，其他細(xì)胞系也可用于表達(dá)，例如KRX細(xì)胞。KRX細(xì)胞中，通過KRX細(xì)胞的早 期自誘導(dǎo)方法，使用含氨芐西林(l〇〇yg/mL)和葡萄糖(0.4%)的0/N預(yù)培養(yǎng)基在37°C培養(yǎng)可 進(jìn)行表達(dá)。將0/N預(yù)培養(yǎng)物以1:100稀釋入含氨芐西林（100yg/mL)、葡萄糖(0.05 % )和鼠李 糖(0.1%)的表達(dá)培養(yǎng)基中在25°C培養(yǎng)24小時(shí)。通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，見圖5。所述構(gòu)建體即使在SDS-PAGE變性條件下也可形成單 體、三聚體和四聚體。
[0242] 實(shí)施例3-純化
[0243] 通過超聲裂解細(xì)胞，并通過30，500 X g離心45min使裂解液澄清。將澄清的裂解液 與Ni-NTA瓊脂糖珠他&8611，1611(^，04，1^)共孵育至少1小時(shí)。使用裂解緩沖液洗柱，然 后使用含9M尿素、500mM NaH2P〇4、10mM Tris pH 8、20mM咪唑和0.2mM TCEP的緩沖液洗柱。 使用pH梯度:9M尿素、100mM NaH2P〇4、20mM檸檬酸鹽、20mM咪唑和0.2mM TCEP洗脫蛋白質(zhì)。然 后在pH 6.3、5.9和4.5條件下進(jìn)行隨后的洗滌。pH梯度后，使用增加咪唑強(qiáng)度的裂解緩沖液 的梯度進(jìn)一步洗脫蛋白質(zhì)。通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)蛋白 表達(dá)水平，見圖5。
[0244] 實(shí)施例4 一重折疊
[0245] 為重折疊，將蛋白質(zhì)再緩沖到如下條件:9M尿素、20mM Tris pH 8.5、50mM NaCl、 5 %丙三醇、2mM EDTA。為第一次篩選的快速重折疊，將濃度為1.8mg/ml的4μ1溶液加入到緩 沖溶液中，如表3所示，至終濃度0.05mg/ml。然后，通過負(fù)染透射電子顯微鏡在不同解析度 分析所得溶液。
[0246] 表3:用于重折疊 L0NG-D2-D1 (第一次篩選)的緩沖液
[0247]
[0248] MES = 2_嗎啉乙磺酸
[0249] HEPES = 2- [ 4- (2-輕乙基）哌嗪-卜基]乙磺酸
[0250] TRIS = 2-氨基-2-輕甲基-丙烷-1,3-二醇
[0251] 如果需要進(jìn)一步篩選進(jìn)行優(yōu)化，重折疊條件可在較小的pH和離子強(qiáng)度取樣范圍實(shí) 施。此外，可加入賦形劑例如海藻糖、蔗糖、精氨酸、脯氨酸等，或者如果需要可加入去垢劑 例如膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、吐溫-80等。L0NG-D2-Dl-〇ri不需要另外的優(yōu)化重折疊，重折疊條 件是pH 8.5、50mM NaCl、20mM Tris、5%甘油。重折疊后不同解析度下L0NG-D2-Dl-〇ri的EM 圖示出了精密的納米顆粒結(jié)構(gòu)（圖6)。
[0252] 實(shí)施例5-TLR5途徑活化測(cè)定I
[0253] 使用 TLR5/SEA Porter HEK 293 細(xì)胞（MGENEX,目錄號(hào)：ML-105)測(cè)定 L0NG-D2- Dl-ori對(duì)Toll-樣受體5(TLR5)的激動(dòng)劑活性，并評(píng)價(jià)了活性L0NG-D2-Dl-〇ri的EC5Q。將頂L- 105細(xì)胞系以5X104個(gè)細(xì)胞/孔鋪板至96-孔板中16小時(shí)。使用多種濃度(0.01和1000ng/ml 之間）的每種測(cè)試樣本、陽性對(duì)照（MGENEX鞭毛蛋白，目錄號(hào)：MG-2205)或者介質(zhì)對(duì)照(每 種相應(yīng)的緩沖液)一式兩份地處理細(xì)胞24小時(shí)。然后將每孔中的細(xì)胞培養(yǎng)基按1:2稀釋并轉(zhuǎn) 移到96-孔微孔滴定板(一式兩份），其中系列稀釋的分泌型堿性磷酸酶(SEAP)標(biāo)準(zhǔn)品也一 式兩份地加入。將板在65°C孵育30min以失活任意內(nèi)源性堿性磷酸酶。然后向每孔中加入磷 酸酶底物，并在室溫孵育30min。將所述平板在405nm下讀數(shù)測(cè)定，得到劑量-反應(yīng)活性評(píng)估 和EC5Q評(píng)估（圖7A)。
[0254] TLR5的激動(dòng)劑活性有一定的提高，計(jì)算EC5q值為12.59ng/ml，而來自鼠傷寒沙門菌 的鞭毛蛋白陽性對(duì)照的計(jì)算EC5Q值為0.29ng/ml。
[0255] 實(shí)施例6-TLR5途徑活化測(cè)定II
[0256] 式（1&)的化合物了81。-?^-81?^1^-00-01(?1^貝_5厶1^￥):
[0258] 式（11)的化合物了81(3-研^-81?^1^-1'181'*卬1^-5厶?12):
[0259]
[0260] 這兩條共組裝的鏈詳述見上文。ND1-L1-ND2的核心結(jié)構(gòu)與式（la)和（II)中的一 致，即與ND3-L2-ND4-致，也與實(shí)施例1中的一致。鏈1(式la)中，F(xiàn)LA部分由鞭毛蛋白的D0和 D1結(jié)構(gòu)域組成，但是來自與實(shí)施例1中不同的鏈。鏈2中的取代基Y和Z是T1BT*T-細(xì)胞表位和 來自瘧原蟲CS蛋白NANP重復(fù)區(qū)的28個(gè)殘基長(zhǎng)度的序列，作為B細(xì)胞表位。
[0261 ]所述兩條鏈的克隆、表達(dá)、純化和重折疊基本上按照實(shí)施例1、2、3和4中所述的方 法。這些共組裝納米顆粒的重折疊條件是pH 7.5、50mM NaCl、20mM HEPES、5%甘油。共組裝 納米顆粒的EM圖見圖4A所示。
[0262] TLR5激動(dòng)劑的劑量-反應(yīng)活性評(píng)估以及EC5Q評(píng)估依據(jù)實(shí)施例5中所述方法實(shí)施。 TLR5激動(dòng)劑活性非常高，其計(jì)算EC5Q值僅為0.0901ng/ml，而來自鼠傷寒沙門菌的鞭毛蛋白 陽性對(duì)照的計(jì)算EC5Q值為0.29ng/ml(圖7B)。因此，這些納米顆?？烧T導(dǎo)非常強(qiáng)的TLR5激活， 大約為天然鞭毛蛋白的3倍，雖然含鞭毛蛋白的鏈存在的摩爾比僅為12:48。劑量-反應(yīng)曲線 呈現(xiàn)為鐘型曲線，因此鞭毛蛋白濃度較高時(shí)免疫應(yīng)答下降。優(yōu)選的濃度是大約50ng/ml。
[0263] 實(shí)施例7-TLR5途徑活化測(cè)定III
[0264] 式（la)的化合物PD52-2i88-PAND0RA-D2-Dl-〇ri :
[0265]
[0266] 式（II)的化合物 PD52-2i88-PAND0RA-Noro:
[0267]
[0268] 這兩條共組裝鏈 PD52-2i88-PAND0RA-D2-Dl-〇ri 和 PD52-2i88-PAND0RA-Noro 的核 心結(jié)構(gòu)與式（la)和（II)中的一致，即ND1-L1-ND2與ND3-L2-ND4的核心結(jié)構(gòu)一致。PD52- 2i88-PAND0RA-D2-Dl-〇ri (式la)中，F(xiàn)LA部分由鞭毛蛋白的D2和D1結(jié)構(gòu)域組成。將低聚化結(jié) 構(gòu)域ND2(或ND4,分別地)設(shè)計(jì)形成二聚化卷曲螺旋。這是重要的，因?yàn)锽-細(xì)胞表位(Z)以及 鞭毛蛋白（FLA)形式都是二聚體蛋白質(zhì)。共組裝比率為5:55。
[0269] PD52-2i88-PAND0RA-Noro(式II)中的取代基Y和Z分別是His-tag和通過GSGS接頭 連接到ND4的來自諾如病毒P-蛋白的298個(gè)殘基長(zhǎng)度的序列。該序列符合諾如病毒Hu/1968/ US的P2-亞結(jié)構(gòu)域(Jiang X.et al.，Virology 1993; 195(1) :51-61)，具有一致的pdb-入口 碼1IHM用于X-射線晶體結(jié)構(gòu)。其包含223到520個(gè)殘基，這是P結(jié)構(gòu)域(缺失C-末端的10個(gè)殘 基521-530,因?yàn)檫@10個(gè)殘基在X-射線晶體結(jié)構(gòu)中是不規(guī)則的并且其帶有很強(qiáng)的正電荷)加 S結(jié)構(gòu)域C-末端的3個(gè)氨基酸，依據(jù)Prasad B.V.V.et al.，Science 1999;286:287-290中所 述命名法。223蘇氨酸殘基是通過計(jì)算機(jī)可視化程序仔細(xì)選擇用作與noro-SAPN的附著位 點(diǎn)，由于其是病毒衣殼的晶體結(jié)構(gòu)中穿過2-折疊軸的鏈之間的最緊密接觸點(diǎn)。
[0270] 所述兩條鏈的克隆、表達(dá)、純化和重折疊基本上按照實(shí)施例1、2、3和4中所述的方 法。這些共組裝納米顆粒的重折疊條件是pH 6.8、80mM NaCl、20mM MES、5%甘油。共組裝 (比率為5:55)納米顆粒的EM圖見圖4C所示。
[0271] TLR5激動(dòng)劑的劑量-反應(yīng)活性評(píng)估以及EC5Q評(píng)估依據(jù)實(shí)施例5中所述方法實(shí)施。 TLR5激動(dòng)劑活性有一定的提高，其計(jì)算的EC5q值為17.66ng/ml，而來自鼠傷寒沙門菌的鞭毛 蛋白陽性對(duì)照的計(jì)算EC5Q值為0.29ng/ml (圖7C)。
[0272] 實(shí)施例8-免疫原性I
[0273] 式（1&)的化合物了81(：-8-〇〇-〇1化111'〇861^6(3〇):
[0274]
[0275] 式（II)的化合物 T81c-8-Pf:
[0276]
[0277] 這兩條共組裝鏈與實(shí)施例6中所述的鏈相似。Y中無 T1BT*T-細(xì)胞表位并且Z中的來 自瘧原蟲CS蛋白重復(fù)區(qū)的B細(xì)胞表位僅為16個(gè)殘基長(zhǎng)度。三聚化卷曲螺旋(ND2和ND4)包含 泛DR結(jié)合表位PADRE。鏈1 (式la)中，F(xiàn)LA部分由鞭毛蛋白的D0(6到171殘基)和D1 (229到312 殘基)結(jié)構(gòu)域組成，但是其來自腸道沙門氏菌亞種腸鼠傷寒沙門氏菌的相位I的鞭毛蛋白中 間結(jié)構(gòu)域變體C150,這是與實(shí)施例1和6中不同的鏈。D0和D1通過兩個(gè)甘氨酸殘基相連。
[0278] 所述兩條鏈的克隆、表達(dá)、純化和重折疊基本上按照實(shí)施例1、2、3和4中所述的方 法。該類型共組裝納米顆粒的重折疊條件是pH 8.5、50mM NaCl、20mM Tris、5%甘油。比率 為3:57的共組裝納米顆粒的EM圖見圖4B所示。
[0279] 7只C57B1/6小鼠的組通過腹腔注射10yg或者lyg進(jìn)行免疫，共3次注射每次間隔2 周。免疫原是單獨(dú)的T81c-8-Pf (式II)或者 T81C-8-D0-D1 (式la)和 T81c-8-Pf (式II)以3:57 和9:51兩種不同的共組裝比率的共組裝體。換言之，假設(shè)為T1-二十面體對(duì)稱的納米顆粒， 則有3種不同的免疫原，每種納米顆粒中包含0或3或9個(gè)D0-D1分子。第3次注射后的抗體滴 度通過ELISA測(cè)定，見圖8A所示。使用共組裝比率為3:57的lyg(大致相當(dāng)于總計(jì)20ng鞭毛蛋 白），似乎會(huì)出現(xiàn)免疫應(yīng)答的飽和，與不含D0-D1結(jié)構(gòu)域的納米顆粒相比可增加抗體滴度的 因數(shù)約等于9。與不含D0-D1結(jié)構(gòu)域的納米顆粒相比，共組裝比率為9:51的10yg(大致相當(dāng)于 總計(jì)2yg鞭毛蛋白）的較高劑量實(shí)際上稍微減低了免疫應(yīng)答。
[0280] 實(shí)施例9 一免疫原性II
[0281] 式（la)的化合物DIM-D〇-Dl(Eurogentec 1):
[0282]

[0283]式（II)的化合物 DBl-D2-Dl-tip3_NIC-pept:
[0285]實(shí)施例5和實(shí)施例6中，D0-D1形式的鞭毛蛋白衍生物似乎比其D2-D1形式具有更高 的免疫原性。因此，D0-D1形式可用作TLR5激動(dòng)劑以增加攜帶D2-D1形式鞭毛蛋白的免疫原 的免疫原性。因此，本實(shí)施例中序列D0-D1
[0287] 相當(dāng)于式（la)中的"FLA"，但序列D2-Dl_tip3
[0289] 相當(dāng)于式（II)中的"Z'D2-Dl_tip3中的該序列"Z"是鞭毛蛋白的變體，其中鞭毛 蛋白的D2結(jié)構(gòu)域與D1結(jié)構(gòu)域組合，如上所述。此外，D2-Dl-tip3的蛋白骨架可作為載體用于 展示尼古丁抗原。為將活化的尼古丁共價(jià)耦合到所述蛋白骨架，將非表面暴露的賴氨酸側(cè) 鏈突變?yōu)榫彼幔鴮⒈砻姹┞兜木彼嵬蛔優(yōu)橘嚢彼??；罨哪峁哦」矁r(jià)附著到所述蛋 白序列的第一位氨基后，尼古丁就展示在納米顆粒的表面。此外，為將尼古丁分子展示在納 米顆粒的最外表面，D2-D1蛋白在包含高密度賴氨酸的分子的最暴露部分?jǐn)y帶所謂的 "tip3"序列KAKKKDGKDDKD(SEQ ID N0:25)(圖2A)。因此將尼古丁共價(jià)耦合到賴氨酸側(cè)鏈可 在納米顆粒分子表面提供尼古丁分子的高密度展示。
[0290] DIM-D0-D1 和 D 頂-D2-Dl-tip3_NIC-pept 的核心（即 ND1-L1-ND2 和 ND3-L2-ND4)是 一致的，尤其是低聚化結(jié)構(gòu)域ND2和ND4分別設(shè)計(jì)形成二聚化卷曲螺旋。這可將鞭毛蛋白分 子(任意形式）以二聚體形式展示，易于與二聚化TL5-受體相互作用（圖2B)。
[0291 ]所述兩條鏈的克隆、表達(dá)、純化和重折疊基本上按照實(shí)施例1、2、3和4中所述的方 法。該類型共組裝納米顆粒的重折疊條件是:pH 7.0、50mM NaCl、20mM HEPES、5%甘油。以 5:55比率共組裝的納米顆粒的EM圖見圖4D所示。
[0292] 7只C57B1/6小鼠的組通過腹腔注射10yg進(jìn)行免疫，共3次注射每次間隔2周。免疫 原是以5:55比率共組裝的0頂-00-01(式13)和0頂-02-01-丨丨口3_見(：16口丨（式11)的共組裝 體，或者是附著了相同的活化的尼古丁分子的標(biāo)準(zhǔn)載體KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白hKLH是大的、多 亞基、載氧金屬蛋白，其發(fā)現(xiàn)于巨型鑰孔帽貝的血淋巴中并且常作為抗原的載體用于免疫 實(shí)驗(yàn)。第3次注射后的抗體滴度通過ELISA測(cè)定，見圖8B所示。該類型含TLR5-激動(dòng)劑納米顆 粒免疫原的抗體滴度與表面展示相同抗原(尼古丁)的標(biāo)準(zhǔn)載體KLH的滴度相比顯著提高。
[0293] 實(shí)施例10-免疫原性III
[0294] 式（la)的化合物 DEDDL:
[0295]
[0296] 所述納米顆粒蛋白鏈包含來自腸道沙門氏菌亞種腸鼠傷寒沙門氏菌的相位I的鞭 毛蛋白中間結(jié)構(gòu)域變體C150的修飾的D0-D1結(jié)構(gòu)域作為"FLA"，如實(shí)施例8。該序列中所有的 賴氨酸殘基都被精氨酸取代。D0和D1結(jié)構(gòu)域通過氨基酸序列KYKD⑶K⑶DK(SEQ ID NO: 1)相 連，其包含4個(gè)賴氨酸作為耦合位點(diǎn)用于分子的共價(jià)附著。
[0297] 三聚化卷曲螺旋（ND2)包含泛 DR 結(jié)合序列 ELRRLLQLLRNRLERLAQFVRALSMQNA( SEQ ID NO:27)。取代基"X"包含6個(gè)氨基酸的his-tag以及3個(gè)賴氨酸殘基，其大致均勻地分布在 整個(gè)序列中用于分子的共價(jià)附著。并且，其N-末端適于共價(jià)附著，例如通過N-羥基琥珀酰亞 胺酯(NHS)化學(xué)。
[0298] 蛋白鏈的克隆、表達(dá)和純化基本上按照實(shí)施例1、2和3中所述的方法。
[0299] 耦合反應(yīng)的緩沖液交換之前，來自親和純化的匯集的洗脫流份與5mM EDTA共孵育 至少1小時(shí)以螯合任意可能滲漏的鎳離子。然后使用HiPrep 26/10脫鹽柱進(jìn)行緩沖液交換。 使用5倍體積的下述耦合緩沖液平衡所述柱:6M鹽酸胍、150mM NaCl、20mM HEPES pH 7.2， 然后將樣品結(jié)合到柱。使用2倍柱體積的耦合緩沖液進(jìn)行洗脫步驟。
[0300] NHS-尼古?。熕酦-羥基琥珀酰亞胺酯）的耦合以摩爾比1:50(DEDDL:NHS-尼古 丁)進(jìn)行，11 · lmg蛋白質(zhì)（2.5mL體積)相當(dāng)于0·24μηιο1蛋白質(zhì)。將NHS-尼古?。?mg)溶入150μ L 100%DMS0相當(dāng)于12.8μπιο1。對(duì)于50-倍摩爾過量的NHS-尼古丁，141yL所述NHS-尼古丁溶 液相當(dāng)于將12μπι〇1加入蛋白質(zhì)中。在暗處（用鋁箱覆蓋)并且電磁攪拌器攪拌下孵育3小時(shí) 進(jìn)行耦合反應(yīng)。
[0301] 下一步的緩沖液交換步驟中，為除去未耦合的NHS-尼古丁并且將緩沖液交換至重 折疊前的緩沖液，將PD minitrap G-25預(yù)填充柱用于重新緩沖至以下條件：8Μ尿素、20mM Tris pH8.5、150mM NaCl和 10%海藻糖。
[0302] 重折疊蛋白鏈基本上依據(jù)實(shí)施例4所述的方案。特別地，將8mg耦合的Nic-DEDDL蛋 白（DEDDL蛋白耦合到尼古丁，3.35mg/mL的蛋白溶液2.4mL)滴加到158.4mL重折疊緩沖液 (20mM HEPES pH 7.0、150mM NaCl、10%海藻糖）中，同時(shí)攪拌。最終的蛋白質(zhì)濃度達(dá)到 0.05mg/mL。重折疊反應(yīng)總計(jì)10分鐘。重折疊的Nic-DEDDL納米顆粒見圖9所示。
[0303] 3只C57B1/6小鼠的組通過皮下注射用10yg Nic-DEDDL免疫或者用10yg Nic-KLH (尼古丁耦合到鑰孔血藍(lán)蛋白）作為陽性對(duì)照，進(jìn)行3次注射，每次間隔一周。通過ELISA測(cè)定 第0天（即第一次注射前）的抗體滴度以及每次注射后一周（第7、14和21天）的抗體滴度，圖 10所示。實(shí)驗(yàn)顯示Nic-DEDDL具有高免疫原性，與Nic-KLH相比抗體誘導(dǎo)>30-倍。僅3次免疫 后的滴度峰值接近163840。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種自組裝蛋白納米顆粒，其由多個(gè)式（Ia)或（Ib)結(jié)構(gòu)單元的聚合體組成X-NDl-Ll-ND2-FLA(Ia)或FLA-NDl-L卜ND2-X(Ib)， 由包含蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域NDl、接頭LI、蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域ND2、鞭毛蛋白衍生物FLA以 及另外的取代基X的連續(xù)鏈組成，其中 NDl是形成m個(gè)NDl亞基的低聚體(ND1 )m的蛋白質(zhì)， ND2是形成η個(gè)ND2亞基的低聚體(ND2)n的蛋白質(zhì)， m和η各自的值介于2和10之間，條件是m不等于n，并且不是η的倍數(shù)，而且η不是m的倍 數(shù)， Ll代表鍵或者是短的柔性接頭， FLA是鞭毛蛋白或者鞭毛蛋白的衍生物，其缺失部分鞭毛蛋白氨基酸序列和/或有1到 20個(gè)氨基酸被其他氨基酸取代和/或還包含直接結(jié)合或者通過包含1到20個(gè)氨基酸的接頭 結(jié)合的抗原， X缺失或者是包含1到1000個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)序列， 可任選地與多個(gè)式(II)的結(jié)構(gòu)單元共組裝 Y-ND3-L2-ND4-Z (II), 由包含蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域ND3、接頭L2、蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域ND4以及其他取代基Y和Z的 連續(xù)鏈組成，其中 ND3是形成y個(gè)ND3亞基的低聚體(ND3)y的蛋白質(zhì)， ND4是形成z個(gè)ND4亞基的低聚體(ND4)Z的蛋白質(zhì)， y和z各自的值介于2和10之間，條件是y不等于z，并且不是z的倍數(shù)，而且z不是y的倍 數(shù)，并且其中 ND3與NDl相同，或者ND4與ND2相同，或者ND3和ND4分別與NDl和ND2相同， L2代表鍵或者是短的柔性接頭，可與Ll不同或者與其相同，并且 Y和Z，相互獨(dú)立地，可缺失或者是含有1到1000個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)序列。2. 權(quán)利要求1所述的蛋白納米顆粒，其由多個(gè)式(Ia)或(Ib)結(jié)構(gòu)單元的聚合體組成 X-NDl-Ll-ND2-FLA(Ia)或FLA-ND1-Ll-ND2-X(lb), 與多個(gè)式(I I)的結(jié)構(gòu)單元共組裝， Y-ND3-L2-ND4-Z(II)〇3. 權(quán)利要求1所述的蛋白納米顆粒，其中ND 1和ND2中的至少一個(gè)以及ND3和ND4中的至 少一個(gè)是卷曲螺旋。4. 權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述的蛋白納米顆粒，其中X、Y和Z的至少一種是目標(biāo)抗原。5. 權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的蛋白納米顆粒，其中FLA是缺失鞭毛蛋白D2和D3結(jié)構(gòu)域 的鞭毛蛋白衍生物。6. 權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)所述的蛋白納米顆粒，其中FLA是包含目標(biāo)抗原的鞭毛蛋白衍 生物。7. 權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)所述的蛋白納米顆粒，其中式（Ia)結(jié)構(gòu)單元中的η或者式（Ib) 結(jié)構(gòu)單元中的m等于2。8. 權(quán)利要求7所述的蛋白納米顆粒，其中FLA在鞭毛蛋白的D2部分連接到式（Ia)中的低 聚化結(jié)構(gòu)域ND2，其中η等于2，或者連接到式(Ib)中的低聚化結(jié)構(gòu)域NDl，其中m等于2。9. 權(quán)利要求1到8任一項(xiàng)所述的蛋白納米顆粒，其中NDl、ND2、ND3和ND4的至少一種是卷 曲螺旋。10. 權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)所述的蛋白納米顆粒，其中ND1、ND2、ND3和ND4的至少一種是 B策菌體T4蛋白fibr it in的三聚化結(jié)構(gòu)域。11. 包含權(quán)利要求1到10任一項(xiàng)所述的蛋白納米顆粒的組合物。12. 式(Ia)或(Ib)的單體結(jié)構(gòu)單元 X-NDl-Ll-ND2-FLA(Ia)或FLA-ND1-Ll-ND2-X(lb), 其由包含蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域NDl、接頭LI、蛋白低聚化結(jié)構(gòu)域ND2、鞭毛蛋白衍生物FLA 以及另外的取代基X的連續(xù)鏈組成，其中 NDl是形成m個(gè)NDl亞基的低聚體(ND1 )m的蛋白質(zhì)， ND2是形成η個(gè)ND2亞基的低聚體(ND2)n的蛋白質(zhì)， m和η各自的值介于2和10之間，條件是m不等于n，并且不是η的倍數(shù)，而且η不是m的倍 數(shù)， Ll代表鍵或者是短的柔性接頭， FLA是鞭毛蛋白或者鞭毛蛋白的衍生物，其缺失部分鞭毛蛋白氨基酸序列和/或有1到 20個(gè)氨基酸被其他氨基酸取代和/或還包含直接結(jié)合或者通過包含1到20個(gè)氨基酸的接頭 結(jié)合的抗原； X缺失或者是包含1到1000個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)序列。13. 人或非人動(dòng)物疫苗接種的方法，其包括給需要所述疫苗接種的受試者施用有效量 的權(quán)利要求1到10任一項(xiàng)所述的蛋白納米顆粒。
【文檔編號(hào)】C07K14/00GK105960412SQ201580004255
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2015年1月9日
【發(fā)明人】彼得·布克哈德, 森蒂爾·庫馬爾·拉曼, 薩拉·瑪麗亞·保利洛, 馬泰奧·皮耶薩, 卡洛琳·庫蘭加拉, 克里斯汀·米特爾霍爾澤
【申請(qǐng)人】阿爾法歐多肽股份公司