用于同時檢測聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)溶液中的dna標(biāo)靶擴(kuò)增子的非電動化的光學(xué)復(fù)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種復(fù)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)DNA檢測系統(tǒng)以及一種用于在所述PCR系統(tǒng)內(nèi)檢測DNA的方法。所述PCR DNA檢測系統(tǒng)包括彩色電荷耦合器件(CCD)相機(jī)、熒光團(tuán)?猝滅劑探針和成像室。所述熒光團(tuán)?猝滅劑探針被選擇響應(yīng)于由所述熒光團(tuán)?猝滅劑探針?biāo)绲膶?yīng)于三種選定的原色和所述CCD相機(jī)的峰值通道響應(yīng)的熒光團(tuán)，使得所述熒光團(tuán)的發(fā)射譜基本上匹配這三種選定的原色，并且所述熒光團(tuán)的峰值發(fā)射譜對應(yīng)于所述CCD相機(jī)的峰值RGB通道響應(yīng)。DNA樣品和所述熒光團(tuán)?猝滅劑探針位于所述成像室內(nèi)。所述彩色CCD相機(jī)聚焦于所述成像室以便從所述DNA樣品和所述熒光團(tuán)?猝滅劑探針的熒光同時檢測最多三個標(biāo)靶。
【專利說明】用于同時檢測聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)溶液中的DNA標(biāo)靶擴(kuò)増子的非 電動化的光學(xué)復(fù)用
[00011優(yōu)先權(quán)聲明
[0002]本申請要求2013年10月14日提交的新加坡專利申請?zhí)?01307650-0的優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)生物分析。具體來說，其涉及用于同時檢測PCR 溶液中的DNA標(biāo)靶擴(kuò)增子的非電動化的光學(xué)復(fù)用。
【背景技術(shù)】
[0004] 近三十年來，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)已經(jīng)成為實驗室和臨床環(huán)境兩者中廣泛使用 的生物測定。隨后，實時PCR的出現(xiàn)實現(xiàn)了擴(kuò)增步驟和檢測步驟這兩者的自動化。已經(jīng)開發(fā) 了具有高通量和復(fù)用特征的多種臺式實時PCR裝置。最近還開發(fā)了覆蓋樣品制備、DNA提取、 PCR擴(kuò)增和檢測的全自動系統(tǒng)。這些裝置能夠?qū)?xì)菌和病毒病原體的宿主進(jìn)行快速、精確和 特異性的診斷。
[0005] 然而，在缺少中心化實驗室的發(fā)展中國家對于此類床旁(point-of-care，P0C)診 斷存在迫切但尚未滿足的需求。便攜性是PCR裝置的關(guān)鍵P0C特征并且將會影響用于此類系 統(tǒng)的光學(xué)模塊的設(shè)計。便攜式系統(tǒng)需要光學(xué)模塊(i)具有不可移動的組件，（ii)占據(jù)較小的 空間，（iii)由電池供電，（iv)具有充分的檢測靈敏度，和(v)提供適度的通量和復(fù)用。
[0006] 針對中心化實驗室所設(shè)計的臺式PCR裝置通常使用可移動的光學(xué)組件，使得檢測 器(例如電荷耦合器件(CCD)、光電倍增管(PMT)、光電二極管)和激發(fā)光源可以使用x-y馬達(dá) 在96孔板或384孔板的不同區(qū)域上自動定位。臺式PCR裝置還使用電動化的激發(fā)、二向色性 和發(fā)射濾光輪以使特定光譜帶寬的多種探針的檢測實現(xiàn)自動化。
[0007] 然而，不存在X-y馬達(dá)則意味著光電檢測器具有與96孔板或384孔板一樣大的視 野。另外，激發(fā)光需要被大面積投射，并且因此每單位面積的光強(qiáng)度必須足夠高，高到可以 檢測熒光探針。這需要使用高功率鎢燈或汞燈，這與開發(fā)便攜式P〇C PCR裝置的目標(biāo)產(chǎn)生了 偏離。隨著在紫外線(UV)和可見波長范圍兩者內(nèi)的高功率(大于5瓦）、高亮度和緊湊型發(fā)光 二極管(LED)光源的出現(xiàn)，已經(jīng)提出了一種對于常規(guī)光源的有效且由電池供電（大約12伏） 的替代物。
[0008] 此外，已經(jīng)在非電動化的光學(xué)檢測系統(tǒng)的開發(fā)中實施了不同的策略。舉例來說，單 一藍(lán)色LED已被用于通過熒光共振能量傳遞(FRET)同時激發(fā)具有530nm、640nm和705nm的發(fā) 射波長的熒光共輒探針。然后通過三個對應(yīng)的光電二極管，經(jīng)由發(fā)射帶通濾光片和分束器 的級聯(lián)收集發(fā)射光譜。雖然這種光學(xué)方案比較便宜，但是由于傳輸損失，所發(fā)射信號的收集 效率被限定在約40-50 %。
[0009] -種常規(guī)的解決方案提議使用分光計來檢測和解析熒光共輒DNA探針的發(fā)射波 長。使用分光計的好處在于，其提供在復(fù)用PCR環(huán)境中很重要的極佳波長解析。然而，其缺乏 空間解析，并且這需要使用電動化的圓盤傳送帶在連接到分光計的光學(xué)纖維的直觀視圖中 依序定位DNA樣品。備選地，需要并入1維或2維掃描儀以實現(xiàn)空間解析。
[0010] 另一種常規(guī)的解決方案提出了基于CCD的熒光計以用于實時PCR。使用470nm LED 作為激發(fā)光源，但是代替將發(fā)射濾光片級聯(lián)起來，實施具有6個光學(xué)濾光片的旋轉(zhuǎn)盤以提供 在530腦、56〇]1111、61〇11111、64〇11111、67〇111]1和71〇111]1的6個焚光檢測通道。雖然解決了收集效率有 限的問題，但是由于需要使旋轉(zhuǎn)盤電動化，因此這種設(shè)計更為復(fù)雜。
[0011] 另一種常規(guī)的裝置利用緊湊型的模塊化筒體系統(tǒng)，其包括PCR反應(yīng)室、熱循環(huán)模 塊、4個LED激發(fā)光和對應(yīng)的用于檢測的光電二極管。然而，每一筒體僅處理一種患者樣品并 且成本較高。此外，集成筒體使復(fù)用范圍僅限于光學(xué)方面，而不是空間與光學(xué)復(fù)用的組合。
[0012] 另外的一種解決方案實施了實時PCR光學(xué)檢測系統(tǒng)，其并入有激光器、濾光塊、光 電檢測器和1X4纖維光學(xué)開關(guān)，使得可以從4個不同的反應(yīng)部位獲得熒光信號。此類設(shè)計似 乎非常適合于便攜式PCR系統(tǒng)，借此存在4個部位的空間復(fù)用并且整個系統(tǒng)不具有任何可移 動的部件。然而，不存在光學(xué)復(fù)用，因為激光器產(chǎn)生特定波長的激發(fā)，并且二向色鏡和發(fā)射 濾光片兩者都具有帶通性質(zhì)。
[0013]另一種系統(tǒng)利用使用巢式PCR的實時PCR裝置，借此擴(kuò)增后的DNA樣品被遞送到多 孔芯片上以用于第二輪實時PCR擴(kuò)增。用特異性引物對和SYBR綠色插入染料預(yù)加載每個孔， 以便使用不可移動的基于CCD的熒光成像系統(tǒng)檢測單一 DNA標(biāo)靶。雖然這種系統(tǒng)提供高度的 空間復(fù)用，但是它僅具有單個光學(xué)通道以供檢測之用。
[0014]因此，需要一種便攜式系統(tǒng)，其光學(xué)模塊（i)具有不可移動的組件，（ii)占據(jù)較小 的空間，（iii)由電池供電，（iv)具有充分的檢測靈敏度，和(v)提供適度的通量和復(fù)用。此 外，其它期望的特征和特點將根據(jù)隨后的【具體實施方式】和隨附權(quán)利要求書，結(jié)合本公開的 附圖和背景而變得顯而易見。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 根據(jù)【具體實施方式】，提供了一種復(fù)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)DNA檢測系統(tǒng)。所述PCR DNA檢測系統(tǒng)包括彩色電荷耦合器件(CCD)相機(jī)、熒光團(tuán)-猝滅劑探針和成像室。所述熒光 團(tuán)-猝滅劑探針被選擇響應(yīng)于由所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針?biāo)绲膶?yīng)于三種選定的原色 和所述CCD相機(jī)的峰值通道響應(yīng)的熒光團(tuán)，使得所述熒光團(tuán)的發(fā)射譜基本上匹配這三種選 定的原色，并且所述熒光團(tuán)的峰值發(fā)射譜對應(yīng)于所述CCD相機(jī)的峰值RGB通道響應(yīng)。DNA樣品 和所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針位于所述成像室內(nèi)。所述彩色CCD相機(jī)聚焦于所述成像室以便從 所述DNA樣品和所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針的熒光同時檢測最多三個標(biāo)靶。
[0016] 根據(jù)另一個方面，提供了一種用于在包括CCD相機(jī)的系統(tǒng)中進(jìn)行PCR檢測的方法。 所述方法包括用熒光團(tuán)-猝滅劑探針光學(xué)復(fù)用最多三個標(biāo)靶。所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針被選 擇響應(yīng)于由所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針?biāo)绲膶?yīng)于三種選定的原色和所述CCD相機(jī)的峰 值通道響應(yīng)的熒光團(tuán)，使得所述熒光團(tuán)的發(fā)射譜基本上匹配這三種選定的原色，并且所述 熒光團(tuán)的峰值發(fā)射譜對應(yīng)于所述CCD相機(jī)的峰值RGB通道響應(yīng)。
【附圖說明】
[0017] 附圖用于說明各種實施方案并且用于解釋根據(jù)一個本發(fā)明的實施方案的各種原 則和優(yōu)勢，在附圖中類似的參考數(shù)字是指遍及單獨視圖中的相同或功能類似的元件，并且 所述附圖連同以下【具體實施方式】一起并入說明書中并且形成說明書的部分。
[0018] 圖1示出了根據(jù)一個本發(fā)明的實施方案的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)系統(tǒng)。
[0019] 圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的圖1的PCR系統(tǒng)中的發(fā)光二極管(LED)光源。
[0020] 圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的圖1的PCR系統(tǒng)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的圖 表。
[0021] 圖4示出了根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的圖1的PCR系統(tǒng)的彩色電荷耦合器件(CCD) 相機(jī)的紅色、綠色和藍(lán)色(RGB)多波段發(fā)射光譜和RGB響應(yīng)的圖表。
[0022]圖5示出了根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的圖1的PCR系統(tǒng)的多波段濾光片的激發(fā)光譜 和發(fā)射光譜以及熒光團(tuán)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的圖表。
[0023]包括圖6A和6B的圖6示出了根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的RGB熒光團(tuán)，其中圖6A示出 了采取線性探針構(gòu)型的RGB熒光團(tuán)，并且圖6B示出了采取發(fā)夾探針構(gòu)型的RGB熒光團(tuán)。
[0024]包括圖7A、7B和7C的圖7示出了根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的圖1的PCR系統(tǒng)的光絕 緣體，其中圖7A是光絕緣體的前視平面示意圖，圖7B是光絕緣體的俯視平面示意圖，并且圖 7C示出了并入有該光絕緣體的圖1的PCR系統(tǒng)的光學(xué)系統(tǒng)。
[0025]包括圖8A、8B、8C、8D和8E的圖8根據(jù)本發(fā)明的該實施方案示出了亮黑表面的襯底 材料與鋁板襯底材料之間關(guān)于來自DNA探針的熒光讀出數(shù)的信噪比（SNR)的比較，其中圖8A 描繪了被放置在亮黑表面上的多孔DNA芯片中的FAM探針，圖8B描繪了被放置在鋁板上的多 孔DNA芯片中的FAM探針，圖8C描繪了被放置在亮黑表面和鋁板上的DNA芯片中的每個孔的 熒光讀出數(shù)的SNR的圖表，圖8D描繪了被放置在亮黑表面上的PCR反應(yīng)管中的UV探針的連續(xù) 稀釋液，并且圖8E描繪了被放置在鋁板上的PCR反應(yīng)管中的UV探針。
[0026]包括圖9A、9B、9C、9D和9E的圖9示出了常規(guī)實時PCR系統(tǒng)與根據(jù)本發(fā)明的該實施方 案的圖1的實時PCR系統(tǒng)的熒光讀出數(shù)之間的相關(guān)性，其中圖9A描繪了使用熒光素亞酰胺 (:1^111〇代8〇6；[11&111丨(1;^6)131111-!1111：(311；[1^8-(>)皿716探針（例如？4]\1-13現(xiàn)1探針）的3-磷酸甘油 醛脫氫酶(GAPDH)小鼠對照基因在35個循環(huán)之后的雙重實時PCR熒光讀出數(shù)，圖9B描繪了使 用FAM-BHQ1探針的GATOH小鼠對照基因在25個循環(huán)之后的重復(fù)實時PCR熒光讀出數(shù)，圖9C描 繪了與常規(guī)實時PCR系統(tǒng)的每個循環(huán)的類似讀出數(shù)相比，在使用圖1的實時PCR系統(tǒng)的情況 下，圖9A和9B的循環(huán)中的每個循環(huán)的雙重讀出數(shù)的PCR擴(kuò)增結(jié)果的圖表，圖9D描繪了使用圖 9B的探針的圖1的實時PCR系統(tǒng)與常規(guī)PCR系統(tǒng)的歸一化熒光讀出數(shù)以及在25個循環(huán)后相關(guān) 聯(lián)的條形圖，并且圖9E描繪了使用圖9A的探針的兩個PCR系統(tǒng)的歸一化熒光讀出數(shù)以及在 35個循環(huán)后相關(guān)聯(lián)的條形圖。
[0027] 包括圖10A、10B、10C和10D的圖10示出了在使用常規(guī)PCR系統(tǒng)和根據(jù)本發(fā)明的該實 施方案的圖1的PCR系統(tǒng)的情況下，PCR溶液中的Cy3與Cy5熒光的解析，其中圖10A描繪的圖 表示出了利用常規(guī)PCR系統(tǒng)使用FAM共輒DNA探針、Cy3共輒DNA探針和Cy5共輒DNA探針的 GAPDHJ-肌動蛋白和B2M小鼠對照基因的三重實時PCR擴(kuò)增，圖10B描繪了 FAM-GAPDH、Cy3- β-肌動蛋白和Cy5-B2M的終點單重擴(kuò)增結(jié)果，圖10C描繪了終點雙重擴(kuò)增結(jié)果，并且圖10D描 繪了圖10C的擴(kuò)增結(jié)果的RGB散點圖。
[0028] 圖11示出了根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的圖1的PCR系統(tǒng)中的光譜上不同的熒光團(tuán) 的單重、雙重和三重混合物。
[0029] 包括圖12A和12B的圖12示出了使用FAM、Cy5和Alexa 405探針的GAPDH、B2M和β-肌 動蛋白小鼠對照基因的終點PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中圖12A描繪了FAM、Cy5和Alexa 405的單重反 應(yīng)，并且圖 12B描繪了FAM+Alexa 405、FAM+Cy5和Alexa 405+Cy5的雙重反應(yīng)。
[0030] 圖13示出了利用根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的圖1的PCR系統(tǒng)，用于將復(fù)用PCR溶液 解析成其熒光團(tuán)分量的基于顏色的去卷積法。
[0031] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，示出圖中的元件是為了簡單和清楚的目的，并且這些 元件不是必需按比例描繪的。舉例來說，圖解、框圖或流程圖中的一些元件的尺寸相比其它 元件可以放大，以便幫助加強(qiáng)對本發(fā)明的實施方案的理解。
【具體實施方式】
[0032]以下【具體實施方式】在本質(zhì)上僅僅是示例性的，并且不旨在限制本發(fā)明或本發(fā)明的 應(yīng)用和用途。此外，也不打算受本發(fā)明的先前背景或以下【具體實施方式】中所提出的任何理 論束縛。本發(fā)明的實施方案旨在呈現(xiàn)一種用于實時PCR的完全靜態(tài)的光學(xué)檢測系統(tǒng)，其提供 在缺少中心化實驗室的發(fā)展中國家供診斷之用的便攜式床旁(POC)PCR系統(tǒng)。便攜式實時 PCR系統(tǒng)有利地具有特征如下的光學(xué)模塊：（i)具有不可移動的組件，（ii)占據(jù)較小空間， (iii)由電池供電，（iv)具有充分的檢測靈敏度，和(v)提供適度的通量和復(fù)用。此外，所述 定時PCR系統(tǒng)是復(fù)用DNA檢測系統(tǒng)，其包括彩色電荷耦合器件(CCD)相機(jī)、熒光團(tuán)-猝滅劑探 針和成像室。熒光團(tuán)-猝滅劑探針被選擇響應(yīng)于由熒光團(tuán)-猝滅劑探針?biāo)绲膶?yīng)于三種 選定的原色和CCD相機(jī)的峰值通道響應(yīng)的熒光團(tuán)，使得熒光團(tuán)的發(fā)射譜基本上匹配這三種 選定的原色，并且熒光團(tuán)的峰值發(fā)射譜對應(yīng)于CCD相機(jī)的峰值RGB通道響應(yīng)。DNA樣品和熒光 團(tuán)-猝滅劑探針位于成像室內(nèi)，并且彩色CCD相機(jī)聚焦于成像室以便從DNA樣品和熒光團(tuán)-猝 滅劑探針的熒光同時檢測最多三個標(biāo)靶。
[0033]參考圖1，根據(jù)一個本發(fā)明的實施方案的PCR系統(tǒng)100包括彩色CCD相機(jī)102、完全多 波段激發(fā)濾光片104、完全多波段發(fā)射濾光片106、具有二向色鏡109的完全多波段二向色濾 光塊108、光源110、準(zhǔn)直透鏡112和聚焦透鏡114、不透光的成像室116和計算機(jī)118。計算機(jī) 118通過纜線120例如火線纜線與彩色CCD相機(jī)102耦合，并且包括專用圖像處理軟件。光源 110是寬帶UV-可見(例如在380-700nm波長范圍內(nèi)可見)光源，其可以使用汞燈或發(fā)光二極 管(LED)以光纖纜線實施。
[0034] 彩色(XD相機(jī)102覆蓋相當(dāng)大的視野(例如大約15cmX 15cm)，而多波段濾光片104、 106、108能夠?qū)碜猿上袷?16中的熒光團(tuán)標(biāo)記DNA探針的三原色進(jìn)行復(fù)用檢測。用相機(jī)102 捕獲熒光圖像。然后通過計算機(jī)118中的軟件對PCR反應(yīng)中的像素實施基于顏色的去卷積， 以將來自兩個或更多個DNA標(biāo)靶的混合物的熒光解析成其熒光團(tuán)分量。
[0035]對熒光團(tuán)進(jìn)行選擇，使得其發(fā)射譜幾乎匹配三原色紅、綠和藍(lán)(RGB)。根據(jù)本發(fā)明 的該實施方案，DNA熒光探針可以選自Alexa 405、級聯(lián)藍(lán)（Cascade Blue)或太平洋藍(lán) (Pacific Blue)以用于藍(lán)光發(fā)射譜，選自Alexa 488、熒光素亞酰胺(FAM)或異硫氰酸熒光 素(FITC)以用于綠光發(fā)射譜，以及選自德克薩斯紅(Texas Red)、Cy5或Alexa 647。優(yōu)選地， 根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的DNA熒光探針是Alexa 405、Alexa 488和德克薩斯紅。非電動化 的光學(xué)復(fù)用是如下實施的：使用這些DNA熒光探針，利用UV-可見光源110相應(yīng)地激發(fā)這些熒 光團(tuán)，并經(jīng)由火線纜線120,通過計算機(jī)118上的定制圖像分析軟件，利用完全三波段濾光裝 置(激發(fā)濾光片104、發(fā)射濾光片106和二向色濾光塊108)以及實時控制的RGB相機(jī)102來進(jìn) 行檢測。
[0036] 光學(xué)系統(tǒng)100可以被廣泛地分成4個模塊：（i)UV_可見寬帶汞光源或LED光源110， (ii)激發(fā)濾光片104、發(fā)射濾光片106和二向色濾光片108(例如由Rochester，New York, U.S.A.的Semrock公司銷售的濾光片），其各自具有兼容的三波長帶，（iii)基于CCD的RGB相 機(jī) 102和透鏡 112(例如由Richmond,British Columbia,Canada的Point Grey Research公 司銷售的具有25mm聚焦透鏡的Grasshopper2牌基于CCD的RGB相機(jī)），和（iv)在計算機(jī)118上 執(zhí)行的用于分析來自相機(jī)102的圖像的定制圖像分析軟件（例如使用由Natick， Massachusetts,U.S.A.的The Mathworks公司銷售/許可的Matlab Image Acquisition Toolbox所開發(fā)的軟件）。
[0037] 光源110可以使用萊光源(例如由Wetzlar,Germany的Leica Microsystems銷售的 EL6000汞燈）實施。圖2示出了一種替代性的光源配置200。在光源配置200中，使用UV LED 202與暖白光可見LED 204的組合作為光源110。額定功率大于5瓦的LED 202、204可以有利 地提供具有380-700nm的寬帶UV光譜的光學(xué)系統(tǒng)100。根據(jù)本發(fā)明的該實施方案，光源配置 200是便攜式的，因為其可以由12伏電池供電并且有利地配備有散熱器和微型風(fēng)扇（例如5 伏的微型風(fēng)扇）以用于有效散熱。
[0038]濾光塊108中的二向色鏡109反射來自UV LED 202的光，并且透射來自可見白色 LED 204的光，使得UV可見光束206入射到成像室116中的DNA樣品上，光束206是波長范圍為 390nm到700nm的UV-可見寬帶光束。凸透鏡208、210減小來自這兩個LED 202、204的光的發(fā) 散角，使得光可以有效地耦合入濾光塊108中。
[0039]多波段濾光片已經(jīng)被用于熒光顯微術(shù)以及熒光原位雜交(FISH)應(yīng)用中，但是在本 發(fā)明的該實施方案之前尚未在實時PCR環(huán)境中實施。多波段濾光片的使用產(chǎn)生了特定問題， 例如（i)難以從被雜交到PCR溶液中的對應(yīng)DNA標(biāo)靶上的兩個或更多個基于熒光的DNA探針 的均質(zhì)混合物解析每一熒光團(tuán)分量的相對熒光單位(RFU)，（ ii)CCD偏好500nm到550nm的光 譜帶寬，對于450nm以下和600nm以上的波長的靈敏度逐漸降低，（iii)由于單一激發(fā)帶寬而 導(dǎo)致可能激發(fā)兩個或更多個熒光團(tuán)，這是因為所有熒光團(tuán)都被同時激發(fā)并且對應(yīng)的發(fā)射光 譜被同時收集，以及（iv)在兩個(或更多個)熒光團(tuán)之間存在顯著的光譜重疊，使得這些熒 光團(tuán)的混合物可能難以解析。
[0040]本發(fā)明的該實施方案解決并且有利地克服了這些問題。參考圖3,描繪了根據(jù)本發(fā) 明的該實施方案的PCR系統(tǒng)100的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的圖表300。沿X軸302對光波長繪圖， 并且沿y軸304對透射率百分比繪圖。寬帶UV-可見光在通過激發(fā)濾光片104之后產(chǎn)生透射光 譜306。這個光譜306也被稱為激發(fā)光譜306并且由二向色鏡109反射，因為其不與鏡子的透 射光譜308重疊。激發(fā)光譜306入射到成像室116中的DNA樣品上，并且目的熒光團(tuán)將發(fā)射出 發(fā)射光譜310。發(fā)射光譜310將通過二向色鏡109透射到(XD相機(jī)102中，這是因為該CCD相機(jī) 被完全容納在鏡子109的透射光譜308中。因此，由用于激發(fā)、發(fā)射和二向色目的的兼容的三 波段濾光片104、106、108組成的多波段濾光裝置檢測1號波段312、2號波段314和3號波段 316中的每一個，這些波段312、314、316與目的特定熒光團(tuán)匹配。根據(jù)本發(fā)明的該實施方案， 有利地選擇三波段濾光片104、106、108以將復(fù)用限定在用于最佳熒光團(tuán)發(fā)射區(qū)分的三種顏 色，因為在更高階多波段濾光片中普遍存在的光譜重疊阻礙實時PCR系統(tǒng)中的熒光團(tuán)分量 的精確解析。
[0041 ]此外，三波段濾光片的發(fā)射光譜310與RGB C⑶相機(jī)102中的紅色、綠色和藍(lán)色通道 的峰值光譜響應(yīng)重疊，如圖4所示。圖表400示出了紅色、綠色和藍(lán)色(RGB)多波段發(fā)射光譜 310和CCD相機(jī)102的RGB響應(yīng)。沿X軸402對光波長繪圖，并且沿y軸404對透射率百分比繪圖。 多波段發(fā)射光譜310的藍(lán)色312、綠色314和紅色316分量與彩色CCD相機(jī)102的藍(lán)色通道響應(yīng) 406、綠色通道響應(yīng)408和紅色通道響應(yīng)410-起繪圖。可以從圖表400觀察到，藍(lán)色406、綠色 408和紅色410通道的峰值響應(yīng)接近于多波段發(fā)射光譜310的藍(lán)色312、綠色314和紅色316分 量。藍(lán)色分量312主要與相機(jī)102的藍(lán)色通道響應(yīng)406重疊，而綠色分量314主要與綠色通道 響應(yīng)408重疊，并且紅色分量316主要與紅色通道響應(yīng)410重疊。
[0042]因此，根據(jù)本發(fā)明的該實施方案，每一多波段分量312、314、316在光譜上是不同 的，并且選擇這三個熒光團(tuán)共輒DNA探針以使得(a)熒光團(tuán)的峰值發(fā)射譜對應(yīng)于CCD相機(jī)的 峰值RGB通道響應(yīng)和三波段發(fā)射濾光片的帶寬這兩者，和(b)熒光團(tuán)的峰值激發(fā)譜對應(yīng)于三 波段激發(fā)濾光片的帶寬。參考圖5,圖表500示出了多波段濾光片104、106、108的激發(fā)光譜 306和發(fā)射光譜310以及為了在PCR系統(tǒng)100中最佳運(yùn)轉(zhuǎn)而選擇的熒光團(tuán)的激發(fā)光譜506、 508、510和發(fā)射光譜516、518、520。沿1軸502對光波長繪圖，并且沿7軸504對透射率百分比 繪圖。
[0043]可以從圖表500看出，所選熒光團(tuán)的激發(fā)光譜506、508、510不應(yīng)彼此重疊，并且熒 光團(tuán)的發(fā)射光譜516、518、520僅應(yīng)彼此最小程度地重疊。此外，多波段濾光裝置104、106、 108的激發(fā)光譜306應(yīng)對應(yīng)于熒光團(tuán)的峰值激發(fā)響應(yīng)506、508、510，并且多波段濾光裝置 506、508、510的發(fā)射光譜310應(yīng)覆蓋熒光團(tuán)的峰值發(fā)射光譜值516、518、520。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的該實施方案，所選熒光團(tuán)優(yōu)選是具有激發(fā)光譜506和發(fā)射光譜516的 Alexa 405-ProbelSeq.-Dabcyl探針、具有激發(fā)光譜508和發(fā)射光譜518的Alexa 488- Probe2Seq.-BHQl探針、和具有激發(fā)光譜510和發(fā)射光譜520的德克薩斯紅-Probe3Seq·- BHQ2探針。也符合本發(fā)明的該實施方案的標(biāo)準(zhǔn)并且可能潛在地使用的其它熒光團(tuán)包括級聯(lián) 藍(lán)和太平洋藍(lán)(代替Alexa 405)、FAM和FITC(代替Alexa 488)以及Cy5和Alexa 647(代替德 克薩斯紅）。
[0045] 熒光團(tuán)德克薩斯紅或Cy5、Alexa 488或FAM以及Alexa 405統(tǒng)稱為RGB熒光團(tuán)，因為 它們響應(yīng)于UV-可見寬帶光激發(fā)而分別發(fā)射紅色、綠色和藍(lán)色熒光。參考圖6,描繪了熒光團(tuán) 德克薩斯紅或Cy5 602、612、Alexa 488或FAM 604、614以及Alexa 405 606、616。圖6A示出 了采取線性探針構(gòu)型的RGB熒光團(tuán)602、604、606，并且圖68示出了采取發(fā)夾探針構(gòu)型的1?? 焚光團(tuán)612、614、616。
[0046]焚光團(tuán)的發(fā)射強(qiáng)度由比爾-朗伯定律(Beer-Lambert Law)如下定義：
[0047] Iem=k(i>Iex(l-e-ebc) (1)
[0048] 其中Iem是發(fā)射光的強(qiáng)度，k是幾何儀器因子，Φ是熒光量子產(chǎn)率，Iex是激發(fā)光的強(qiáng) 度，ε是摩爾消光系數(shù)，b是光程長度(光通過材料行進(jìn)的距離），c是熒光團(tuán)濃度。如果 0.05(其中b = lcm)，則等式1可以近似為等式2:
[0049] Iem=k<})Iexebc (2)
[0050] 假定Alexa 405、Alexa 488和德克薩斯紅的消光系數(shù)分別是34,0001^011-^71, 000M-Vm-1和85，000M-Vm-1，那么所有三個熒光團(tuán)都滿足等式2實現(xiàn)近似的ebc彡0.05要求， 因為PCR反應(yīng)中的未猝滅的熒光團(tuán)的最大濃度被固定在200nM。等式2可以用矩陣表示法如 下表示。
[0052] 等式3可以如下簡化：
[0057]如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，算法被分成訓(xùn)練階段和測試階段，借此在訓(xùn)練階 段期間通過實施非負(fù)矩陣分解(NMF)算法確定矩陣Q，并且其中所有三個矩陣的元都是非負(fù) 的。這是通過捕獲已知濃度Ctrain的單一熒光團(tuán)溶液的熒光圖像來實現(xiàn)的，其中Itrain將代表 來自目的區(qū)域的η個RGB像素的矩陣。
[0058]在測試階段，如下確定矩陣C:
[0059] Ctest=ItestQ_1 (8)
[0060] 其中Itest代表新的一組η個RGB像素。
[0061] 包括圖7A、7B和7C的圖7示出了根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的PCR系統(tǒng)100的光絕緣 體702。參考圖7A和7B，前視平面示意圖700和俯視平面示意圖710示出了圓錐形的光絕緣體 702。光絕緣體702的目的是用于防止雜散光漏入光學(xué)檢測系統(tǒng)中，如圖7C所示。圖7C示出了 PCR系統(tǒng)100的光學(xué)系統(tǒng)720,其并入有光絕緣體702。除了防止雜散光漏入光學(xué)檢測系統(tǒng)720 之外，圓錐形的絕緣體702還能夠使并入有相機(jī)102、多波段濾光塊108和光源110的光學(xué)系 統(tǒng)720直接安裝在它上面，例如經(jīng)由C型安裝接口。
[0062]關(guān)于絕緣體702,襯底材料的選擇對于PCR系統(tǒng)100的運(yùn)轉(zhuǎn)是至關(guān)重要的。關(guān)鍵的 是，絕緣體702的內(nèi)表面增強(qiáng)而不是抑制來自PCR反應(yīng)的熒光讀出數(shù)的信噪比（SNR)。包括圖 8A、8B、8C、8D和8E的圖8根據(jù)本發(fā)明的該實施方案示出了被放置在亮黑表面的襯底材料上 的加載有FAM探針的多孔DNA芯片與被放置在反射性鋁板襯底材料上的多孔DNA芯片的熒光 讀出數(shù)的SNR的比較。參考圖8A和8B，視圖800描繪了被放置在亮黑表面上的多孔DNA芯片中 的FAM探針，并且視圖810描繪了被放置在鋁板上的多孔DNA芯片中的類似FAM探針。圖8C描 繪了來自DNA芯片中的每個孔的熒光讀出數(shù)的SNR的圖表820，其中沿X軸822對孔數(shù)繪圖，并 且沿y軸對SNR繪圖。如從圖表820可以看出，對于每個孔來說，來自被放置在亮黑表面上的 DNA芯片中的多個孔的熒光讀出數(shù)的SNR 826高于來自被放置在鋁板上的DNA芯片中的多個 孔的熒光讀出數(shù)的SNR 828。
[0063]雖然鋁板襯底產(chǎn)生來自DNA芯片中的多個孔的熒光讀出數(shù)的較低SNR，但是鋁板的 反射率可能存在問題。舉例來說，鋁板在UV激發(fā)下反射藍(lán)光，從而抑制從UV探針DAPI樣品的 實際藍(lán)光發(fā)射，如圖8D和8E所示。圖8D描繪了被放置在亮黑表面上的PCR反應(yīng)管832中的UV 探針的連續(xù)稀釋液的視圖830,并且圖8E描繪了被放置在鋁板上的PCR反應(yīng)管842中的UV探 針的視圖840。因此，根據(jù)本發(fā)明的該實施方案，光絕緣體702是由黑色陽極化鋁制造的，以 便對鋁賦予亮黑修飾層，從而實現(xiàn)鋁材料的SNR降低同時沒有反射鋁的缺點。
[0064]包括圖9A、9B、9C、9D和9E的圖9示出了常規(guī)實時PCR系統(tǒng)與根據(jù)本發(fā)明的該實施方 案的實時PCR系統(tǒng)100的熒光讀出數(shù)之間的相關(guān)性。參考圖9A，視圖900描繪了在小鼠3-磷酸 甘油醛脫氫酶(GAPDH)特異性標(biāo)靶擴(kuò)增35個循環(huán)之后在兩個相同反應(yīng)中測量的FAM熒光團(tuán) 的終點熒光讀出數(shù)902、904。同樣地，在圖9B中，視圖910描繪了同樣在小鼠 GAPDH特異性標(biāo) 靶擴(kuò)增25個循環(huán)之后在兩個相同反應(yīng)中測量的FAM熒光團(tuán)的終點熒光讀出數(shù)912、914。
[0065] 圖9C描繪了在使用常規(guī)實時PCR系統(tǒng)和實時PCR系統(tǒng)100的情況下的對應(yīng)PCR擴(kuò)增 結(jié)果的圖表920,其中沿X軸922對循環(huán)數(shù)繪圖并且沿y軸924對相對熒光單位(RFU)繪圖。在 兩種情況下（25個循環(huán)930、932和35個循環(huán)926、928)，結(jié)果針對使用常規(guī)非便攜式實時PCR 系統(tǒng)的相同反應(yīng)的終點RFU值進(jìn)行比較。圖9D描繪了在25個循環(huán)后相關(guān)聯(lián)的PCR系統(tǒng)100的 歸一化熒光讀出數(shù)944、945和常規(guī)PCR系統(tǒng)的歸一化熒光讀出數(shù)946、947(沿y軸942繪圖）的 條形圖940,并且圖9E描繪了在35個循環(huán)后相關(guān)聯(lián)的PCR系統(tǒng)100的歸一化熒光讀出數(shù)954、 955和常規(guī)PCR系統(tǒng)的歸一化熒光讀出數(shù)956、957(沿y軸952繪圖）的條形圖950。因此，從圖9 可以看出，便攜式實時PCR系統(tǒng)100提供與非便攜式的常規(guī)PCR系統(tǒng)類似的檢測靈敏度。
[0066] 包括圖10A、10B、10C和10D的圖10示出了在使用常規(guī)PCR系統(tǒng)和根據(jù)本發(fā)明的該實 施方案的PCR系統(tǒng)100的情況下，PCR溶液中的Cy 3與Cy 5熒光的解析。參考圖10A，其中沿X軸 100 2對循環(huán)數(shù)繪圖并且沿y軸1004對RFU繪圖的圖表1000示出了利用常規(guī)PCR系統(tǒng)，使用Cy 3 共輒DNA探針1006、Cy 5共輒DNA探針1008和FAM共輒DNA探針1010的GAPDH、β-肌動蛋白和β-2 微球蛋白（Β2Μ)小鼠對照基因的三重實時PCR擴(kuò)增結(jié)果。Cy3-i3-肌動蛋白1006的擴(kuò)增似乎較 低，因為常規(guī)PCR系統(tǒng)沒有針對檢測Cy3而進(jìn)行優(yōu)化。
[0067] 參考圖10B和10C，視圖1020(圖10B)描繪了常規(guī)PCR系統(tǒng)中的FAM-GAPDH、Cy 3-β-肌 動蛋白和Cy5-B2M的終點單重擴(kuò)增結(jié)果，并且視圖1030(圖10C)描繪了常規(guī)PCR系統(tǒng)中的雙 重溶液的終點雙重擴(kuò)增結(jié)果，其中ProbeixProbe2y代表X份Probei和y份Probe2。從提出的光 學(xué)系統(tǒng)測量的Cy3-i3-肌動蛋白的單重擴(kuò)增的終點熒光讀出數(shù)與FAM-GAH)H和Cy5-B2M是相 當(dāng)?shù)?，如視圖1020所示。視圖1030中的雙重PCR反應(yīng)突出了在解析FAMtyS1和FAMkyS2具有 類似顏色特征的Cy3和Cy5方面的難度，并且這在圖10D中被觀察到，其中三維RGB散點圖 1040 顯示 Cy3 1042 與 Cy5 1044 以及 FAMtyShiMe 與 FAMtyS1 1048 的顯著光譜重疊。
[0068]圖11描繪了視圖1100，其示出了根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的PCR系統(tǒng)100中的在光 譜上不同的熒光團(tuán)的單重、雙重和三重混合物，其中CxFyDz*別表示X份Cy3、y份FAM和z份 DAPI。視圖1100顯示PCR溶液中的單重、雙重和三重混合物的更寬光譜，其中'洋紅'、'青色' 和'黃色'分別指示Cy3與DAPI的混合物(CV)、FAM與DAPI的混合物(FV)以及Cy3與FAM的 混合物(CV)。等量的所有三個焚光團(tuán)(CbV)產(chǎn)生'白色熒光'。
[0069] 考慮到Cy3與Cy5之間的光譜重疊，選擇焚光素亞酰胺Bull-Hutchings-Quayle One (FAM-BHQ1)、Cy5-BHQ2和A1 exa 405-Dabcy 1作為與PCR系統(tǒng)100-起使用的探針組，其中 Cy5優(yōu)于Cy3，因為與Cy3相比，Cy5與FAM和Alexa 405的光譜分離是更好的。包括圖12A和12B 的圖12示出了使用所選FAM、Cy5和A1 exa 405探針的GATOH、B2M和β-肌動蛋白小鼠對照基因 的終點PCR擴(kuò)增結(jié)果。參考圖12Α，視圖1200描繪了FAM、Cy5和Alexa 405的單重反應(yīng)，并且參 考圖 12B，視圖 1220描繪了FAM+Alexa 405、FAM+Cy5和Alexa 405+Cy5的雙重反應(yīng)。Alexa 405的背景焚光似乎高于FAM和Cy5的背景焚光。然而，Alexa 405的背景焚光可以通過實施 采用發(fā)夾探針構(gòu)型616(圖6B)的Alexa 405來減少，使得Dabcyl可以更有效地猝滅非混雜態(tài) 下的熒光，因為其接近熒光團(tuán)。
[0070] 接下來參考圖13,圖解1300描繪了利用根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的PCR系統(tǒng)100將 復(fù)用PCR溶液解析成其熒光團(tuán)分量的基于顏色的去卷積。使用以上等式1到8的基于顏色的 去卷積算法，將如視圖1310所示的FAM+Alexa 405、FAM+Cy5和Alexa 405+Cy5的雙重反應(yīng)物 解析成Cy5、FAM和Alexa 405熒光團(tuán)分量 1320、1330、1340。
[0071] 因此，可以看出，便攜式實時PCR系統(tǒng)100克服了現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)的缺點并且提供特 征如下的系統(tǒng)：（i)具有不可移動的組件，（ii)占據(jù)較小空間，（iii)由電池供電，（iv)具有 充分的檢測靈敏度，和(v)提供適度的通量和復(fù)用。根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的便攜式實時 PCR系統(tǒng)100包括光學(xué)系統(tǒng)，該光學(xué)系統(tǒng)并入有RGB彩色CCD相機(jī)102、完全多波段濾光系統(tǒng) (包括濾光片104、106和具有二向色鏡109的濾光塊108)、RGB熒光探針、UV-可見光源110、不 透光的成像室116和能夠由計算機(jī)118執(zhí)行的基于顏色的去卷積算法(等式1到8)。
[0072] PCR系統(tǒng)100的關(guān)鍵有利特征包括：（i)其是非電動化的，并且因此可以被并入需要 熒光讀出的床旁診斷設(shè)備中，（ii)其能夠經(jīng)由去卷積程序在復(fù)用反應(yīng)中對熒光團(tuán)進(jìn)行實時 和終點定量，和（iii)其允許光學(xué)復(fù)用最多3個標(biāo)靶以及空間復(fù)用，因為裝置中的CCD相機(jī)和 聚焦透鏡保留空間信息。為了實現(xiàn)最佳性能，多波段濾光片104、106、108需要具有與所用的 熒光探針的光譜特性和RGB相機(jī)102的峰值光譜響應(yīng)這兩者匹配的光譜特性。舉例來說，對 應(yīng)于Alexa 405和德克薩斯紅探針的多波段濾光片104、106、108的激發(fā)帶寬和發(fā)射帶寬可 以被定制成更寬，因為與Alexa 488相比，對于這些探針來說，RGB相機(jī)102的CCD靈敏度通常 更差。在實驗室裝置中，UV-可見光源110理想地使用汞燈/氙燈來實施，但是對于便攜式戶 外裝置，如光源配置200中所示的組合了 UV與可見白光LED的緊湊型光源110將是優(yōu)選的。 [0073]除了實時和終點PCR檢測之外，PCR系統(tǒng)100的使用可以延伸到其它應(yīng)用領(lǐng)域，例如 DNA微陣列、基于熒光的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和活的/死的染色系統(tǒng)。光學(xué)系統(tǒng)720可 以作為實施這些測定法中的一個或多個的集成裝置的部分而實現(xiàn)，或備選地，除了該光學(xué) 系統(tǒng)提供高度特異性的復(fù)用熒光讀出數(shù)以外，其可以是類似于凝膠成像裝置的獨立熒光讀 取器。
[0074]雖然系統(tǒng)100被設(shè)計成檢測Alexa 405、Alexa 488和德克薩斯紅熒光團(tuán)，但是滿足 多波段濾光片和相機(jī)的必需光譜特性的其它熒光團(tuán)也可以潛在地使用，例如級聯(lián)藍(lán)和太平 洋藍(lán)(代替Alexa 405)、FAM和FITC(代替Alexa 488)以及Alexa 647和Cy5(代替德克薩斯 紅）。探針可以采取線性或發(fā)夾構(gòu)型(分別參見圖6A和6B)。此外，光學(xué)系統(tǒng)720也可以用于從 例如SYBR Green、DAPI和碘化丙啶等其它常用染料讀取熒光。
[0075]顏色去卷積已經(jīng)在組織學(xué)上被傳統(tǒng)地用于從使用光學(xué)顯微鏡獲取的圖像解析基 于吸光度的染料，例如蘇木精、曙紅和DAB。在PCR系統(tǒng)100中，顏色去卷積針對熒光圖像被有 利地改寫，其中重點放在熒光發(fā)射與熒光團(tuán)濃度之間的關(guān)系上，而不是常規(guī)PCR系統(tǒng)中的透 射光與染料濃度之間的關(guān)系上。包括等式1到8的去卷積算法是基于NMF方法，其明顯比許多 常規(guī)PCR系統(tǒng)所使用的標(biāo)準(zhǔn)線性去卷積方法更直觀，因為NMF在每一熒光團(tuán)非負(fù)面地構(gòu)成總 體熒光強(qiáng)度的約束下運(yùn)轉(zhuǎn)。另外，與常規(guī)方法相比，NMF在檢測低熒光信號方面更有效。 [0076] NMF先前已被用于組織學(xué)圖像中的高達(dá)最大兩次染色的盲法顏色去卷積，但是根 據(jù)本發(fā)明的該實施方案，熒光圖像需要被去卷積成三個熒光團(tuán)分量。因此，NMF去卷積算法 已經(jīng)有利地經(jīng)過修改，從而引入訓(xùn)練階段和測試階段，借此在訓(xùn)練階段中使用NMF以確定去 卷積矩陣(等式5到7)，此后在測試階段中使用矩陣對熒光團(tuán)分量進(jìn)行定量。與線性顏色去 卷積相比，NMF在算法上更為復(fù)雜并且是迭代的。然而，根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的PCR系統(tǒng) 100中使用的NMF版本已經(jīng)有利地經(jīng)過修改，從而實現(xiàn)收斂并且最小化迭代次數(shù)。雖然在本 發(fā)明的前述【具體實施方式】中已經(jīng)呈現(xiàn)了示例性實施方案，但是應(yīng)了解存在大量的變化形 式。
[0077]應(yīng)進(jìn)一步了解，示例性實施方案僅是示例，并不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范 圍、適用性、操作或配置。事實上，前述【具體實施方式】將向所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員提供關(guān)于實 施本發(fā)明的示例性實施方案的便利的路線圖，應(yīng)理解在示例性實施方案中描述的元件的功 能和配置以及操作方法可以進(jìn)行各種改變而不會脫離如隨附權(quán)利要求書中所述的本發(fā)明 的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種復(fù)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)DNA檢測系統(tǒng)，其包括： 彩色電荷耦合器件(CCD)相機(jī)； 熒光團(tuán)-猝滅劑探針，所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針被選擇響應(yīng)于由所述熒光團(tuán)-猝滅劑探 針?biāo)绲?、對?yīng)于三種選定的原色和所述CCD相機(jī)的峰值通道響應(yīng)的熒光團(tuán)，使得所述熒 光團(tuán)的發(fā)射譜基本上匹配所述三種選定的原色，并且所述熒光團(tuán)的峰值發(fā)射譜對應(yīng)于所述 C⑶相機(jī)的峰值RGB通道響應(yīng)；以及 用于定位DNA樣品和所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針的成像室， 其中所述彩色CCD相機(jī)聚焦于所述成像室以便從所述DNA樣品和所述熒光團(tuán)-猝滅劑探 針的熒光同時檢測最多三個標(biāo)靶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)用PCR DNA檢測系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括光學(xué)濾光裝置，所述光 學(xué)濾光裝置包括完全多波段激發(fā)、發(fā)射和二向色濾光片，所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針進(jìn)一步被 選擇響應(yīng)于對應(yīng)于所述完全多波段濾光片的帶寬的所述熒光團(tuán)的激發(fā)譜。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)用PCR DNA檢測系統(tǒng)，其中所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針被選擇 進(jìn)一步響應(yīng)于對應(yīng)于所述完全多波段濾光片的帶寬的所述熒光團(tuán)的發(fā)射譜。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的復(fù)用PCR DNA檢測系統(tǒng)，其中所述完全多波段濾 光片包括三波段激發(fā)濾光片。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的復(fù)用PCR DNA檢測系統(tǒng)，其中所述成像室是不透 光的成像室，所述系統(tǒng)進(jìn)一步包括用于將激發(fā)光提供給所述成像室中的所述樣品和所述熒 光團(tuán)-猝滅劑探針的光源。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)用PCR DNA檢測系統(tǒng)，其中所述光源包括由電池供電的光 源。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6所述的復(fù)用PCR DNA檢測系統(tǒng)，其中所述光源包括發(fā)射 在紫外到可見電磁光譜中的光的寬帶UV-可見光源。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的復(fù)用PCR DNA檢測系統(tǒng)，其中所述寬帶UV-可見光源選自包括 汞光源、氙光源和LED光源的組。9. 根據(jù)權(quán)利要求5至8中任一項所述的復(fù)用PCR DNA檢測系統(tǒng)，其中所述光源包括光纖 光傳輸裝置，所述光纖光傳輸裝置用于對所述成像室中的所述樣品和所述熒光團(tuán)-猝滅劑 探針提供所述激發(fā)光。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的復(fù)用PCR DNA檢測系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括耦合至所 述CCD相機(jī)的計算裝置，所述計算裝置用于響應(yīng)于將來自所述DNA樣品的熒光解析成其熒光 團(tuán)分量而檢測所述成像室中的所述最多三個標(biāo)靶，所述檢測是通過所述計算裝置對來自所 述成像室的未猝滅的熒光團(tuán)激發(fā)發(fā)射的被所述CCD相機(jī)捕獲的圖像像素執(zhí)行基于顏色的去 卷積方法來進(jìn)行的。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的復(fù)用PCR DNA檢測系統(tǒng)，其中所述基于顏色的去卷積方法包 括基于非負(fù)矩陣分解(NMF)的顏色去卷積方法。12. 根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的復(fù)用PCR DNA檢測系統(tǒng)，其中所述基于顏色的 去卷積方法是響應(yīng)于將所述系統(tǒng)用于使用預(yù)定標(biāo)靶的復(fù)用PCR反應(yīng)的多個訓(xùn)練階段和測試 階段而導(dǎo)出的。13. -種用于在包括電荷耦合器件(CCD)相機(jī)的系統(tǒng)中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測的 方法，所述方法包括： 用熒光團(tuán)-猝滅劑探針光學(xué)復(fù)用最多三個標(biāo)靶，所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針被選擇響應(yīng)于 由所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針?biāo)绲?、對?yīng)于三種選定的原色和所述CCD相機(jī)的峰值通道響 應(yīng)的熒光團(tuán)，使得所述熒光團(tuán)的發(fā)射譜基本上匹配所述三種選定的原色，并且所述熒光團(tuán) 的峰值發(fā)射譜對應(yīng)于所述CCD相機(jī)的峰值RGB通道響應(yīng)。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述系統(tǒng)進(jìn)一步包括三波段激發(fā)濾光片，并且其 中光學(xué)復(fù)用所述最多三個標(biāo)靶的步驟進(jìn)一步包括通過所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針光學(xué)復(fù)用所 述最多三個標(biāo)靶，所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針進(jìn)一步被選擇響應(yīng)于對應(yīng)于所述三波段激發(fā)濾 光片的帶寬的所述熒光團(tuán)的激發(fā)譜。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中光學(xué)復(fù)用所述最多三個標(biāo)靶的步驟進(jìn)一步包括 通過所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針光學(xué)復(fù)用所述最多三個標(biāo)靶，所述熒光團(tuán)-猝滅劑探針進(jìn)一步 被選擇響應(yīng)于也對應(yīng)于所述三波段激發(fā)濾光片的帶寬的所述熒光團(tuán)的發(fā)射譜。16. 根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項所述的方法，其中所述熒光團(tuán)的所述峰值發(fā)射譜對 應(yīng)于選自包括Alexa405、FAM和Cy5、Alexa 488和德克薩斯紅的組的發(fā)射譜。17. 根據(jù)權(quán)利要求13至16中任一項所述的方法，其進(jìn)一步包括使用基于非負(fù)矩陣分解 (NMF)的顏色去卷積方法確定所述最多三個標(biāo)靶的最多三個組成熒光團(tuán)的步驟。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述基于NMF的顏色去卷積方法是響應(yīng)于包括使 用預(yù)定標(biāo)靶的復(fù)用PCR反應(yīng)的多個訓(xùn)練階段和測試階段而導(dǎo)出的。
【文檔編號】C12Q1/68GK105960466SQ201480068082
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2014年10月14日
【發(fā)明人】應(yīng)儀如, S·K·庫馬拉薩米
【申請人】新加坡科技研究局