利用核酸和信號探針的非對稱等溫擴增的核酸檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用外部引物對、正向和反向DNA?RNA?DNA雜交引物的比例不同的內(nèi)部引物對、DNA?RNA?DNA雜交信號探針，在等溫下以非對稱方式擴增靶核酸的同時，擴增探針的信號，從而準(zhǔn)確地檢測靶核酸的方法。根據(jù)本發(fā)明，相比于作為現(xiàn)有方法的采用相同比例引物的等溫引物及探針擴增方法的對稱iTPA方法等，可以有效地擴增探針的信號，可應(yīng)用于檢測及確認(rèn)正確的病原菌、檢測可帶來規(guī)定表現(xiàn)型的DNA變更、診斷遺傳疾病有關(guān)感受性、DNA表現(xiàn)的評估及各種基因項目，有利于分子生物學(xué)研究及疾病診斷。
【專利說明】
利用核酸和信號探針的非對稱等溫擴増的核酸檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及核酸和信號探針的等溫擴增方法及利用擴增的信號探針的核酸檢測方法，更具體地涉及利用外部引物對、脫氧核糖核酸-核糖核酸-脫氧核糖核酸(DNA-RNA-DNA)雜交引物對及DNA-RNA-D NA雜交信號探針，同時擴增靶核酸和信號探針，并迅速地檢測靶核酸的方法。進一步具體地涉及，采用不同比例的正向DNA-RNA-DNA雜交引物和反向DNA-RNA-DNA雜交引物，以非對稱方式擴增核酸，與此同時，利用具有在以非對稱方式擴增的DNA中因過量使用引物而以非對稱方式過量擴增的DNA互補的堿基序列的DNA-RNA-DNA雜交信號探針并擴增信號，從而在等溫下檢測核酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸擴增技術(shù)在檢測和分析少量核酸的過程中屬于非常有用的技術(shù)。針對靶核酸的核酸擴增技術(shù)的高度敏感性促進了感染性疾病及遺傳性疾病的診斷和分析所需的DNA分離技術(shù)以及法醫(yī)學(xué)層面的特定核酸檢測技術(shù)的發(fā)展，也開發(fā)了基于這種核酸檢測方法而執(zhí)行非常敏感的診斷分析的方法(Belkum，Current Opin1n in Pharmacology，3: 497，2003)。核酸的檢測基于DNA鏈的互補性和體外中單鏈核酸形成雙鏈雜交分子的能力，借助上述能力，可從樣本中檢測出特定核酸(B arry et al., Current Opin1n inB1technology，12:21，2001)。
[0003]用于核酸檢測的探針由存在于核酸樣本的靶序列和可雜交化的特定序列組成。上述探針可由化學(xué)物質(zhì)、免疫-化學(xué)物質(zhì)、熒光或放射線同位素讀取。大體上，探針包括針對靶核酸互補序列的短片段核酸和可讀取DNA雜交的熒光物質(zhì)或生物素及雙加氧酶(d1xygenase)等標(biāo)記或報道分子。
[0004]但是，根據(jù)如上所述的核酸檢測方法，無法檢出尤其是染色體DNA上的短序列，復(fù)制數(shù)低，在解決野生型基因有關(guān)變形對立DNA的有限復(fù)制數(shù)方面存在局限性。作為核酸檢測方法的其他存在問題，與限制靶序列、化學(xué)物質(zhì)或探針與其它分子或結(jié)構(gòu)的物理相互作用的體外(in vitro)或體內(nèi)(in situ)的環(huán)境條件有關(guān)。
[0005]靶核酸檢測方法可以分組為三類，作為使靶核酸擴增的方法的靶核酸序列擴增，使探針分子本身擴增的探針擴增，將各探針表現(xiàn)出的信號借助復(fù)合探針或連接探針技術(shù)增加的信號擴增。
[0006]體外(invitro)核酸擴增技術(shù)用作檢測和分析少量核酸的方法。其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain react1n)是最廣泛使用的核算的擴增方法，將互補性序列的各螺旋(strand)用作模板，借助引物來反復(fù)進行核酸合成，由此，完成互補性序列的各螺旋的復(fù)制本。為了執(zhí)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程，需要預(yù)先編程的熱循環(huán)裝備(thermal cyclinginstrument)。但是，這種方法所需費用高，特異性較低，而且為了呈現(xiàn)結(jié)果，需要將執(zhí)行步驟高度標(biāo)準(zhǔn)化。
[0007]作為其他核酸擴增方法的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ligase chain react1n，LCR)，兩個相鄰的寡核苷酸與靶核酸雜交，借助連接酶(Iigase)而連接。由此，所形成的探針(probe)與互補的核苷酸一同借助溫度周期(temperature cycling)而被擴增。
[0008]連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)具有比利用引物的核酸的引物延伸(primer exten s1n)高的識別力(discriminatory power)，因此，對于基因的點突變(genotyping point mutat1n)，相比于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，表現(xiàn)出更高的對立基因特異性(allele specificity)。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)具有截至目前開發(fā)的核酸擴增技術(shù)中最高的特異性，所有識別機制已得到最優(yōu)化，因此，可以最方便地執(zhí)行，但缺點是反應(yīng)速度最慢、并需要大量的變形探針。
[0009]根據(jù)如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)利用連接(ligat1n)的方法，借助在連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或滾環(huán)擴增(rolling circle amplicat1n，RCA)過程中伴隨的DNA接合，利用第一個圓形化的鎖式探針(padlock probe)并以滾環(huán)擴增方法進行擴增，由此，無需執(zhí)行革El擴增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，也可以分析DNA分型(genotyping)(Qi et al.,Nucleic Acids Research,29:ell6,2001)。
[0010]鏈置換擴增(strand displacement amplificat1n，SDA)是通過核酸內(nèi)切酶來置換螺旋(strand displacement)，使樣本內(nèi)的革E核酸序列及其互補性螺旋擴增的方法。該方法使用包含核酸聚合酶(nucleic aci d polymerase)、至少一個被置換的脫氧核苷三磷酸(deoxynucleoside triphosphate，dNTP)的三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNTPs)以及包含至少一個對革巴片段(target fragment)的3 ’末端互補的引物的雜交物。各引物在5，末端具有可由限制性核酸內(nèi)切酶(restrict1n endonucleas e)認(rèn)知的序列(Walker et al.,NucleicAcids Res.，20:1691，1992)。
[0011]作為與鏈置換擴增方法類似的方法，有使用RNA-DNA雜交引物或RNA引物，使引物進行引物延伸后，使用用于切斷與模板DNA構(gòu)成雜交化的RNA引物的RNaseH酶，切斷引物和模板DNA后，借助鏈置換而使新的引物進行引物延伸的方法;使用5’-RNA-DNA-3’引物的單引物恒溫擴增(single primer isothermal amplificat1n，SPIA)方法(美國專利6,251，639);使用5，-DNA-RNA-3，引物的 ICAN( i sothermal chimeric primer-1nitiatedamplificat1n of nucleic acid)方法(美國專利申請2005/0123950);使用RNA引物的Ribopr imer方法(美國專利申請2004/0180361);利用外部引物和內(nèi)部DNA-RNA-DNA雜交弓I物的方法(美國專利5，824，517)等。
[0012]轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)(transcript1nmediated amplificat1n，TMA)方法是在一定溫度、一定離子強度(1nic strength)及一定pH下，僅使用一個啟動-引物，擴增革巴核酸的方法(Kwoh et al.,Proc.Nat.Ac a.Sc1.USA，86:1173，1989)。轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)方法的特征在于，實質(zhì)上，使由革巴核酸構(gòu)成的雜交物和啟動-引物(promoter-primer)相結(jié)合，上述啟動-引物是與用于與靶核酸的3’末端部位或與其相鄰的部位雜交的靶序列的3’末端部位互補的寡核苷酸。上述啟動-引物包括位于配合序列(complexing sequence)的5’末端部位的RNA聚合酶有關(guān)啟動部位序列。上述啟動-引物及靶序列形成啟動-引物/靶序列雜交，使DNA引物延伸。
[0013]在上述轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)方法的DNA引物延伸(extens1n)過程中，據(jù)推測，革巴序列的3’末端從接近配合序列和靶序列之間啟動引物被雜交化的復(fù)合體(complex)的位置開始引物延伸。啟動序列用作生成第一個DNA引物延伸生成物并形成雙螺旋啟動序列的上述引物延伸過程的模板。啟動-引物的3’末端還可用作第二個DNA引物延伸過程的引物。在上述引物延伸過程中，使用靶序列作為模板而形成雙螺旋核酸復(fù)合體。關(guān)于上述復(fù)合體，在使用RNA靶序列的情況下為DN A/RNA復(fù)合體，在使用DNA靶序列的情況下為DNA/DNA復(fù)合體。接著，為了生產(chǎn)靶序列的各種RNA復(fù)制本，認(rèn)知啟動-引物的啟動的R NA聚合酶使用上述第一個DNA引物延伸生成物來合成RNA。
[0014]在核酸基礎(chǔ)序列擴增(nucleicacid sequence-based amplificat1n，NASBA)方法中，包括單螺旋RNA的合成、單螺旋DNA的合成及雙螺旋DNA的合成(Compton，Nature，350:91，1991)。上述單螺旋R NA成為對于第一個引物的模板，上述單螺旋DNA成為對于第二個引物的模板，上述雙螺旋DNA在合成上述第一個模板的復(fù)制本的過程中成為第三個模板。
[0015]在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等的使用熱循環(huán)過程的擴增方法中，為了達到各周期的“目標(biāo)”溫度，需要熱循環(huán)模塊，截止到熱模塊達到目標(biāo)溫度，需要延遲時間，因此，完成擴增反應(yīng)需要較長時間。
[0016]鏈置換擴增、核酸基礎(chǔ)序列擴增及轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)等等溫靶核酸擴增方法在一定溫度下完成核酸擴增，因此，不需要另行的熱循環(huán)裝置，具有操作容易的優(yōu)點。但是，目前為止公開的等溫靶核酸擴增方法還具有幾個缺點。根據(jù)鏈置換擴增方法的核酸擴增，需要用于規(guī)定限制酶的部位，因此，其應(yīng)用性受限，而核酸基礎(chǔ)序列擴增及轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)等轉(zhuǎn)錄-基礎(chǔ)擴增方法，需要借助引物的聚合酶啟動序列和擴增生成物相結(jié)合，這一過程會導(dǎo)致非-特異性擴增。由于這種缺點，借助這種轉(zhuǎn)錄-基礎(chǔ)擴增方法的DNA靶擴增機制難以成立。
[0017]并且，根據(jù)目前使用的擴增方法，另一個缺點是存在因先行擴增反應(yīng)的擴增生成物導(dǎo)致試驗樣本被污染的可能性，由此會帶來樣本的非-目標(biāo)特異性擴增。為了防止這種情況，開發(fā)了在擴增反應(yīng)的最后或靶核酸的擴增開始之前，采用可使試驗樣本去污染的各種手段和物理方法的試驗溶液的污染檢測方法，但這些大部分會導(dǎo)致核酸擴增操作過程復(fù)雜化。
[0018]作為用于核酸檢測的另一方法，還有信號擴增方法，而不是靶核酸或探針擴增。在這些方法中，有為了截取靶核酸，而是用四組探針的bDNA(branched DNA)擴增法(Ross etal.，J.Virol.Method.，101:159,2002)。利用信號擴增的雜交截取方法，直接檢測靶核酸，并具有可比擬靶核酸擴增方法的敏感性，為了檢測信號而使用抗體或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)(vander Pol et a1.,J.ClinicalMicrob1l.,40:3564,2002；NeIson et al.,Nucleic AcidsResearch，24:4998，1996)。
[0019]并且，作為信號探針擴增方法，有環(huán)狀探針技術(shù)(cycling probe technology,CPT)擴增方法(Duck et al.,B1Techniques，9:142，1990)。上述方法使用具有與靶核酸的互補的堿基序列的DNA-RNA-DN A雜交信號探針，在靶核酸與上述探針雜交的情況下，雜交信號探針的RNA部分借助RNaseH酶而被切斷，被切斷的雜交信號探針與靶核酸分離，并且有另一 DNA-RNA-DNA雜交信號探針與靶核酸雜交，再次生成被切斷的探針，最終循環(huán)地擴增信號探針。還有利用在DNA-R NA-DNA兩個末端標(biāo)記焚光物質(zhì)和焚光抑制物質(zhì)(quencher)并檢測被切斷的信號探針的焚光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(FRET!fluorescent resonan ce energytransfer)的探針檢測方法(美國專利申請2005/0214809)等。但是，上述環(huán)狀探針技術(shù)方法的擴增效率較低，g卩，擴增效率為102?104，因此，難以用于獨立診斷，借助聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法等現(xiàn)有的核算擴增方法，先增加靶核酸的特定部位的量后，另行擴增信號探針，因此，存在使用復(fù)雜和成本增加的缺點。
[0020]非對稱(asymmetric)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法是在雙螺旋DNAtempl ate中僅選擇性地擴增單一 DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的衍生技術(shù)，有效地用于堿基序列sequencing的單鏈DNA模板(template)合成。(In nis et al.Proc.Nalt.Acad.Sc1.USA85:9436，1988，美國專利5,066,584)并且，非對稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法使用molecular beacon probe，相對于對稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，在腺病毒檢測方面表現(xiàn)出顯著的有效性。(Poddar Mol.Cell.Probes14:25，2000)并且，非對稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法用于factor V基因的單一堿基變異(Singlenucleotide p olymorphism)所需焚光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)形態(tài)的hybridizat1n探針的tempIate合成。(Szilvasi et al.Clin.Chem.38:727，2005)使用同量正向(forward)引物和反向(reverse)引物的一般對稱(symm etric)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法中，在合成一定程度的擴增產(chǎn)物后，擴增產(chǎn)物之間的結(jié)合概率高于擴增產(chǎn)物與引物的結(jié)合概率。這是由于，引物的堿基序列長度顯著短于擴增產(chǎn)物的堿基序列長度。因此，相比于擴增產(chǎn)物和引物的結(jié)合，擴增產(chǎn)物之間的結(jié)合機會變高，最終，擴增效率下降，從而達到擴增被中斷的坪(plateau)階段。(Rice et al.Pre natal Diagn.22:1130，2002)非對稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法采用不同濃度的正向和反向引物，引導(dǎo)借助正向引物合成的擴增產(chǎn)物和借助反向引物合成的擴增產(chǎn)物的量不同，提供可解決擴增產(chǎn)物之間結(jié)合有關(guān)問題的方法。(Gy I lensten etal.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:7652，1988)在正向或反向中，當(dāng)少量的引物被耗盡時，過量的引物引導(dǎo)線性擴增，并提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴增效率。但是，相對于對稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，非對稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴增效率雖高，但其差異并不大。(Gyl lensten etal.Methods Enzymol 218:3，1993)這是由于，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的提高溫度的denaturat1n過程中，擴增產(chǎn)物之間的結(jié)合或擴增產(chǎn)物與引物之間的結(jié)合會再次發(fā)生。在通過提高溫度來省略de naturat1n過程的等溫擴增的情況下，相比于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，非對稱方法更加有效。尤其，在使用與借助正向或反向引物而合成的擴增產(chǎn)物相結(jié)合的探針的方法中，非對稱擴增方法非常有效。即，在使用同量的正向和反向引物的對稱擴增中，會發(fā)生借助正向和反向引物而合成的擴增產(chǎn)物之間的結(jié)合和與探針互補的擴增產(chǎn)物與探針之間的競爭結(jié)合。通常而言，由于擴增產(chǎn)物的堿基序列長度大于探針的堿基序列長度，相比于借助擴增產(chǎn)物和探針相結(jié)合而產(chǎn)生信號的概率，因擴增產(chǎn)物之間的結(jié)合而不產(chǎn)生信號的概率顯著高。在反應(yīng)初期，探針的濃度高于擴增產(chǎn)物的濃度，擴增產(chǎn)物與探針之間的結(jié)合占優(yōu)勢，但隨著擴增反應(yīng)的進行，擴增產(chǎn)物的濃度變高，擴增產(chǎn)物之間的結(jié)合比擴增產(chǎn)物和探針之間的結(jié)合占據(jù)優(yōu)勢，借助探針結(jié)合的信號發(fā)生減少，最終中斷信號的產(chǎn)生。因此，在借助正向或反向引物而合成的擴增產(chǎn)物中，當(dāng)過量使用用于合成與探針相結(jié)合的擴增產(chǎn)物的引物時，相比于擴增產(chǎn)物之間的結(jié)合，引導(dǎo)具有與探針互補的堿基序列的擴增產(chǎn)物與探針之間的結(jié)合，最終，提高借助探針結(jié)合的信號產(chǎn)生概率，最終更加有效地完成擴增。
[0021]包含聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的核酸擴增方法的最大問題之一就是非特異性擴增。非特異性擴增導(dǎo)致偽陽性結(jié)果，導(dǎo)致診斷正確度下降，從而被劃入非常嚴(yán)重的問題。因此，大部分引物利用生物信息學(xué)的計算機模擬等尖端技術(shù)進行設(shè)計。但是，計算機模擬并不始終與實際實驗結(jié)果一致，借助生物信息學(xué)技術(shù)設(shè)計的引物也無法完全排除非特異性擴增。在擴增過程中，因過量使用的引物之間的結(jié)合所產(chǎn)生的擴增prime r-dimer現(xiàn)象，會導(dǎo)致阻礙核酸擴增正確度的結(jié)果。尤其，相比于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物，使用長度相對更長的引物的等溫擴增中，其問題非常嚴(yán)重。由于這種問題的存在，在等溫擴增方法中使用多種類型的引物的多重(multiplex)擴增相比于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法更具難度是事實。但是，在使用非對稱擴增方法的情況下，可以解決這種問題。即，相比于對稱擴增方法，使正向或反向引物中的一個引物采用顯著低的濃度，從而顯著降低引物之間的結(jié)合機會，并減少pr imer-dimer現(xiàn)象。
[0022]根據(jù)本發(fā)明人的先行專利(韓國專利10-0957057號)，一種利用同量的正向和反向DNA-RNA-DNA雜交引物，同時等溫擴增核酸和信號探針，并檢測靶核酸的對稱等溫擴增方法，其問題在于，敏感度為每反應(yīng)100細(xì)胞數(shù)，若用于診斷，則存在局限性，而且還會造成因非特異性反應(yīng)的偽陽性結(jié)果。并且，根據(jù)本先行專利減少，為了擴增，使包含靶DNA和引物對的反應(yīng)雜交物變性后，需要添加酶反應(yīng)雜交液。
[0023]對此，本發(fā)明人為了克服如上所述的缺點，試圖開發(fā)可改善靶核酸的檢測敏感度并使其正確擴增的方法及靶核酸擴增的同時檢測上述擴增產(chǎn)物的方法，確認(rèn)當(dāng)利用非對稱(asymmetric)時，即采用不同的具有與革El核酸互補的堿基序列的外部引物對和具有與革巴核酸部分互補的堿基序列的DNA-RNA-DNA雜交引物對的正向引物和反向引物的比例，則相比于對稱方法，在等溫下可有效地進行更多信號探針擴增，還可以降低因引物之間結(jié)合的非特異性擴增，從而完成了本發(fā)明。并且，本發(fā)明人著眼于另一等溫擴增方法的LAMP方法的先例(Maruya mAet a 1.Appl.Environ.Microbi ο 1.69: 5023,2003)，即，在等溫的革E 核酸擴增過程中，無需獨立的改性過程，也可以實現(xiàn)擴增，將其適用于本發(fā)明，并確認(rèn)無需經(jīng)過獨立的改性過程也可以實現(xiàn)簡便有效的擴增，從而完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0024]技術(shù)問題
[0025]最終，本發(fā)明的目的在于提供一種在等溫下可迅速準(zhǔn)確地擴增靶核酸和信號探針的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種在等溫下可同時執(zhí)行靶核酸和探針信號擴增的靶核酸的檢測方法。
[0026]解決問題的方法
[0027]為了達成上述目的，本發(fā)明提供一種靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述靶DNA的檢測方法利用靶DNA的等溫擴增方法及上述擴增的信號探針，上述靶DNA的等溫擴增方法包括如下步驟:向反應(yīng)雜交物添加能夠置換鏈的DNA聚合酶、RNA分解酶后，使上述靶DNA和上述信號探針在等溫下同時擴增的步驟，上述反應(yīng)雜交物包括:(i)靶DNA; (ii)具有與上述靶DNA互補的堿基序列的外部引物對；(i ii)上述靶DNA和3 ’末端DNA部分互補，5，末端DNA-RNA部分非互補堿基序列的DNA-RNA-DNA雜交引物對；以及(iV)具有與借助上述外部引物對和雜交引物對所生成的擴增產(chǎn)物互補的堿基序列的DNA-RNA-DNA雜交信號探針。用于上述反應(yīng)雜交物的DNA-RNA-D NA雜交引物對的正向引物和反向引物的比例包括因過量使用其中的一種而以非對稱方式擴增單鏈核酸的情況。
[0028]發(fā)明的效果
[0029]本發(fā)明具有可提供在等溫下迅速準(zhǔn)確地擴增靶核酸的方法及在等溫下同時執(zhí)行靶核酸的擴增及信號探針的擴增的核酸檢測方法的效果。根據(jù)本發(fā)明，相比于作為現(xiàn)有方法的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法等，簡便并且無污染危險性，可迅速準(zhǔn)確地擴增靶核酸，并可同時擴增信號探針，可應(yīng)用于檢測及確認(rèn)病原菌、檢測可帶來規(guī)定表現(xiàn)型的基因的改變、診斷遺傳疾病或疾病有關(guān)感受性、基因表現(xiàn)的評估及各種基因項目，有利于分子生物學(xué)研究及疾病診斷。并且，作為非對稱等溫擴增方法，相比于現(xiàn)有的對稱等溫擴增方法，可改善敏感度和特異度，從而實現(xiàn)更加準(zhǔn)確的診斷。
【附圖說明】
[0030 ]圖1為根據(jù)本發(fā)明的靶DNA的等溫擴增方法的圖示。
[0031]圖2為根據(jù)本發(fā)明的靶DNA和信號探針的等溫擴增方法的圖示。
[0032]圖3為根據(jù)本發(fā)明的對稱等溫擴增方法和非對稱等溫擴增方法的差異點的圖示。
[0033]圖4為以結(jié)核菌為靶的將根據(jù)本發(fā)明的對稱等溫擴增方法和借助非對稱等溫擴增方法所生成的熒光信號(DeltARn)以實時熒光檢測裝備進行測定的結(jié)果。
[0034]圖5為以衣原體為靶的將根據(jù)本發(fā)明的對稱等溫擴增方法和借助非對稱等溫擴增方法所生成的熒光信號(DeltARn)以實時熒光檢測裝備進行測定的結(jié)果。
[0035]圖6為以淋菌為靶的將根據(jù)本發(fā)明的對稱等溫擴增方法和借助非對稱等溫擴增方法所生成的熒光信號(DeltARn)以實時熒光檢測裝備進行測定的結(jié)果。
[0036]圖7為以李斯特菌為靶的將根據(jù)本發(fā)明的對稱等溫擴增方法和借助非對稱等溫擴增方法所生成的熒光信號(DeltARn)以實時熒光檢測裝備進行測定的結(jié)果。
[0037]圖8為以沙門氏菌為靶的將根據(jù)本發(fā)明的對稱等溫擴增方法和借助非對稱等溫擴增方法所生成的熒光信號(DeltARn)以實時熒光檢測裝備進行測定的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0038]根據(jù)本發(fā)明的一實施方式，本發(fā)明提供一種靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述靶DNA的檢測方法利用靶DNA的等溫擴增方法及上述擴增的信號探針，上述靶DNA的等溫擴增方法包括如下步驟:向反應(yīng)雜交物添加能夠置換鏈的DNA聚合酶、RNA分解酶后，使上述靶DNA和上述信號探針在等溫下同時擴增的步驟，上述反應(yīng)雜交物包括:(i)靶DNA; (ii)具有與上述靶DNA互補的堿基序列的外部引物對；(iii)上述靶DNA和3 ’末端DNA部分互補，5 ’末端DNA-RNA部分非互補堿基序列的DNA-RNA-DNA雜交引物對；以及(iv)具有與借助上述外部引物對和雜交引物對所生成的擴增產(chǎn)物互補性堿基序列的DNA-RNA-DNA雜交信號探針。用于上述反應(yīng)雜交物的DN A-RNA-DNA雜交引物對的正向引物和反向引物的比例包括因過量使用其中的一種而以非對稱方式擴增單鏈核酸的情況。
[0039]如圖1所示，根據(jù)本發(fā)明的靶DNA的等溫擴增能夠以下述過程執(zhí)行。
[0040]首先，在作為擬擴增的模板的靶DNA、外部引物對、DNA-RNA-DNA雜交引物對及DNA-RNA-DNA雜交探針的雜交物中，雜交包含有DNA聚合酶和RNA分解酶的酶反應(yīng)溶液后進行擴增。此時，在反應(yīng)液內(nèi)，上述外部弓I物對和上述DNA-RNA-DNA雜交弓I物對退火到靶D NA。優(yōu)選地，相比于雜交引物對，上述外部引物對包含與接近靶DN A的兩側(cè)末端的序列互補的序列，相比于外部引物，雜交引物對包含接近靶DNA的中心的序列，在此情況下，相比于外部引物，雜交引物退火到DNA鏈延伸方向的前方。退火的外部引物和雜交引物，借助具有鏈置換能力的DNA聚合酶來延伸，隨著外部引物沿著靶DNA延伸，從位于延伸方向的前方的雜交引物中延伸的DNA鏈從靶DNA中脫落，并發(fā)生鏈置換，最終，可獲得從雜交引物中延伸的單螺旋DNA擴增產(chǎn)物和從外部引物中延伸的雙螺旋DNA擴增產(chǎn)物。
[0041 ]以作為上述擴增產(chǎn)物的單螺旋DNA作為模板，對外部引物和雜交引物進行退火。退火的外部引物和雜交引物借助具有鏈置換能力的DN A聚合酶來延伸，隨著外部引物沿著單螺旋DNA延伸，從位于延伸方向的前方的雜交引物中延伸的DNA鏈從單螺旋DNA中脫落并發(fā)生鏈置換，最終，獲得從雜交引物中延伸的新的單螺旋的DNA擴增產(chǎn)物和從外部引物中延伸的雙螺旋的DNA擴增產(chǎn)物。上述擴增的單螺旋DN A作為模板，DNA-RNA-DNA雜交引物被退火和延伸，從而獲得包括RNA的雙螺旋DNA擴增產(chǎn)物。雙螺旋DNA的RNA部分被RNase H分解，借助延伸、鏈置換而生成單螺旋DNA。上述的單螺旋DNA作為模板，反復(fù)進行引物的退火、延伸、鏈置換、RNA切割的過程，從而擴增靶DNA(圖1)。
[0042]如圖2所示，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的信號探針的擴增與上述的核酸等溫擴增同時進行。通過上述靶DNA的等溫擴增而被擴增的DN A與DNA-RNA-DNA雜交信號探針被退火并形成RNA/DNA雜交雙螺旋，借助RNase H的活性，DNA-RNA-DNA雜交信號探針的RNA部分被切斷，被切斷的信號探針從靶DNA中分離并脫落，結(jié)合新的DN A-RNA-DNA雜交信號探針，不斷反復(fù)借助RNase H的切斷、分離周期，從而擴增信號探針(圖2)。
[0043]如圖3所示，在根據(jù)本發(fā)明的一實施例的雜交引物對中，采用不同的正向雜交引物和反向雜交引物的比例，過量的引物生成一側(cè)方向的擴增產(chǎn)物，提高與具有與過量擴增的一側(cè)方向的DNA互補的堿基序列的信號探針相結(jié)合的機會，最終，相比于對稱等溫擴增方法，非對稱等溫擴增方法提高信號探針的擴增機會。尤其，借助引物而擴增的擴增產(chǎn)物的長度長于探針的長度，在對稱擴增方法的情況下，擴增產(chǎn)物之間的結(jié)合概率高于擴增產(chǎn)物與探針之間的結(jié)合概率，導(dǎo)致探針擴增的效率下降，但在非對稱方法中，可以有效地引導(dǎo)過量擴增的擴增產(chǎn)物與探針之間的結(jié)合，提高探針的擴增效率，并最終大幅改善靶DN A的檢測靈敏度。
[0044]如圖4?圖6的結(jié)果所示，相比于現(xiàn)有的對稱等溫擴增方法，非對稱等溫擴增方法的敏感度得到改善。
[0045]如圖7和圖8的結(jié)果所示，相比于現(xiàn)有的對稱等溫擴增方法，非對稱等溫擴增方法的特異度得到改善。
[0046]優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用的外部引物對可使用選自由寡聚DNA、寡聚RNA及雜交寡聚RNA/DNA組成的組中的一種，與革E核酸序列互補(complementary)，并具有15?30堿基。并且，優(yōu)選地，與上述外部引物互補的靶DNA序列為與雜交引物互補的靶DNA序列相鄰的序列(I?60bp差異)，優(yōu)選地，與外部引物互補的靶DNA序列為，相比于與雜交引物互補的DNA序列，接近靶DNA序列的3，末端側(cè)的序列。
[0047]本發(fā)明的特征在于，在本發(fā)明中使用的DNA-RNA-DNA雜交引物對中，5，末端DNA-RNA部分具有與靶DNA序列非互補的堿基序列，3’末端DNA部分具有與靶DNA互補的堿基序列。優(yōu)選地，上述DN A-RNA-DNA雜交引物由32?66堿基組成，此時，優(yōu)選地，DNA部分的長度分別由15?30堿基組成，RNA部分的長度由I?6堿基組成。
[0048]優(yōu)選地，在本發(fā)明中與DNA-RNA-DNA雜交引物互補的靶DNA的序列包含:相比于與外部引物互補的靶DNA的序列，位于3 ’末端側(cè)的序列，優(yōu)選地，與雜交引物互補的靶DNA序列為與外部引物互補的靶DNA序列相鄰的序列(I?60bp差異)。
[0049]在本發(fā)明中使用的DNA聚合酶作為可沿著DNA模板擴張核酸引物的酶，應(yīng)能夠從結(jié)合有所置換的鏈的多核苷酸中置換核酸鏈。優(yōu)選地，在本發(fā)明中可使用的DNA聚合酶為耐熱性DNA聚合酶，作為耐熱性DNA聚合酶，可以舉出Bst DNA聚合酶、exo(-)vent DNA聚合酶、exo(-)Deep vent DNA聚合酶、exo(-)Pfu DNA聚合酶、B cADNA聚合酶、phi29DNA聚合酶等。
[0050]優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用的RNA分解酶在切斷RNA/DNA雜交體的RNA鏈上具有特異性，優(yōu)選地，單鏈RNA不應(yīng)分解，優(yōu)選地，使用RNase H。
[0051 ] 優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用的DNA-RNA-DNA雜交信號探針為具有與在上述DNA-RNA-DNA雜交弓I物對中的正向或反向引物中過量使用的引物而被擴增的核酸擴增產(chǎn)物互補的堿基序列的寡核苷酸，優(yōu)選地，DNA-RNA-DNA雜交信號探針的5，末端和3，末端由寡聚DNA組成，中間部分由寡聚RNA組成。
[0052]優(yōu)選地，上述DNA-RNA-DNA雜交信號探針由18?38堿基組成，5’末端及3末端的DNA部分分別由8?16堿基組成，位于中間的RN A部分由I?6堿基組成。
[0053]并且，上述DNA-RNA-DNA雜交信號探針的特征可以是末端以標(biāo)記物質(zhì)進行標(biāo)記，上述標(biāo)記物質(zhì)可使用焚光物質(zhì)(fluorescein)和焚光信號抑制物質(zhì)(quencher)等。
[0054]在本發(fā)明中使用的雜交引物對中，正向引物和反向引物的濃度比例可以是1:5至1:20，或者也可以是5:1至20:1，更優(yōu)選地，可以是1:10或10:1。過量使用的雜交引物具有與雜交探針互補的堿基序列。
[0055]在本發(fā)明中，優(yōu)選地，上述等溫擴增可以使本發(fā)明的引物和模板DNA退火，在實際上不抑制所使用的酶的活性的溫度下實施。在本發(fā)明中，執(zhí)行擴增反應(yīng)的溫度，優(yōu)選為30?75°C，更優(yōu)選為37?70°C，最優(yōu)選為50?65°C。
[0056]根據(jù)本發(fā)明的核酸的等溫擴增方法，使用補充外部引物，因此，相比于使用單一RNA-DNA雜交引物的現(xiàn)有方法(美國專利6，251，639)，不僅其特異性高，借助外部引物而被置換的內(nèi)部引物作為新的模板，以幾何級數(shù)方式擴增，由此，可以徹底改善擴增效率。并且，根據(jù)現(xiàn)有的方法，使用單一RNA-DNA雜交引物來擴增靶堿基序列時，為了擴增一定部位，適用用于阻斷擴增的獨立的阻斷劑(blocker)或模板開關(guān)寡核苷酸(TSO)，而本發(fā)明使用正向引物和反向引物對，不使用獨立的阻斷劑或模板開關(guān)寡核苷酸，可以干凈地擴增所需部位。
[0057]并且，將擴增的DNA作為模板，反復(fù)由DNA-RNA-DNA雜交信號探針相結(jié)合和相分離的周期，并使信號探針擴增，因此，可在一個步驟(single-tube)中實現(xiàn)核酸擴增和信號探針擴增，因此，相比于作為現(xiàn)有技術(shù)的利用DNA-RNA-DNA雜交引物來僅擴增核酸的技術(shù)(美國專利5，824，517)或僅擴增DNA-RNA-DNA雜交信號探針的技術(shù)(美國專利申請2005/0214809)，具有可同時擴增核酸和信號探針的優(yōu)點。
[0058]根據(jù)本發(fā)明的核酸的等溫擴增方法，相比于現(xiàn)有的使用同量正向引物和反向引物的對稱方式的等溫核酸及信號探針擴增方法，提供不同比例的正向引物與反向引物的以非對稱方式過量擴增的DNA，提高具有與此互補的堿基序列的信號探針被退火的機會，有效地擴增信號探針，并最終改善核酸檢測的靈敏度和特異度。
[0059]本發(fā)明的優(yōu)點還有，在所使用的DNA-RNA-DNA雜交引物中，5’末端DNA-RNA部分具有與模板非互補的堿基序列，無需考慮在使用單一RNA-DNA雜交引物的現(xiàn)有方法中存在的RNA分解酶的反應(yīng)活性高于DNA聚合酶的引物擴張活性時所產(chǎn)生的問題。
[0060]并且，根據(jù)本發(fā)明的DNA的等溫擴增方法，經(jīng)過最初的引物擴張和鏈置換反應(yīng)后，當(dāng)最新合成的擴增產(chǎn)物使用新模板時，與模板非互補的RNA部位作用于與引物互補的模板，提高與引物的結(jié)合(anneali ng)溫度，不僅增加擴增效率，而且防止引物-二聚體(primer-d imer)的形成，從而提高擴增產(chǎn)物的純度。[0061 ]根據(jù)本發(fā)明的核酸的等溫擴增方法，從樣本的DNA提取到完全擴增，耗時約I小時，當(dāng)完成樣本DNA的提取時，耗時約40分鐘，具有可非常迅速地完成擴增反應(yīng)的優(yōu)點。
[0062]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述靶DNA的檢測方法利用靶DNA的等溫擴增方法及上述擴增的信號探針，上述靶DNA的等溫擴增方法包括如下步驟:向反應(yīng)雜交物添加能夠置換鏈的DNA聚合酶、RNA分解酶后，使上述靶DNA和上述信號探針在等溫下同時擴增的步驟，上述反應(yīng)雜交物包括:(i)靶DNA; (ii)具有與上述靶DNA互補的堿基序列的外部引物對；(i ii)上述靶DNA和3 ’末端DNA部分互補，5，末端DNA-RNA部分非互補堿基序列的DNA-RNA-DNA雜交引物對；以及(iV)具有與借助上述外部引物對和雜交引物對所生成的擴增產(chǎn)物互補的堿基序列的DNA-RNA-DNA雜交信號探針。用于上述反應(yīng)雜交物的DNA-RNA-D NA雜交引物對的正向引物和反向引物的比例包括因過量使用其中的一種而以非對稱方式擴增單鏈核酸的情況。
[0063]借助本發(fā)明的方法而被擴增的信號探針利用熒光檢測器可直接從反應(yīng)管中檢測熒光信號，而無需獨立的后處理過程。此時，DNA-RNA-DNA雜交探針的末端分別標(biāo)記有熒光物質(zhì)(fluorescence)和焚光信號抑制物質(zhì)(quencher)，在探針被切斷之前，焚光能量轉(zhuǎn)移到熒光信號抑制物質(zhì)，抑制熒光信號釋放，在探針被切斷以后，不發(fā)生熒光信號轉(zhuǎn)移的FRET(fluorescence resonance energy transfer)形態(tài)的信號探針。
[0064]根據(jù)本發(fā)明的核酸的等溫擴增方法及核酸檢測方法，作為在一定溫度下進行反應(yīng)的一站式(one-step)核酸及信號探針等溫擴增，不需要特殊的熱轉(zhuǎn)換裝置，因此，可以迅速簡單地完成擴增，在擴增過程中使用兩對引物對和探針，因此，相比于現(xiàn)有的方法，不僅可以準(zhǔn)確地擴增靶核酸，還可以擴增信號探針，它是在擴增過程中采用不同比例的正向雜交引物和反向雜交引物的非對稱核酸及信號探針方法，相比于現(xiàn)有的方法，提高所擴增的DNA模板和信號探針的退火機會，最終可改善靈敏度和特異度。并且，根據(jù)本發(fā)明的核酸的等溫擴增方法及核酸的檢測方法，在等溫的一個管(one-tube)內(nèi)完成，因此，具有可實現(xiàn)用于核酸實時檢測的大量處理。這種優(yōu)點可以使限制擴增技術(shù)的廣泛使用的污染所造成的附加反應(yīng)產(chǎn)生的風(fēng)險最小化。
[0065]下面，將通過實施例對本發(fā)明進行更加詳細(xì)的說明。這些實施例僅僅是為了示例本發(fā)明，不應(yīng)解釋為本發(fā)明的范圍受這些實施例的限制，這對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
[0066]實施例1:結(jié)核DNA的等溫擴增
[0067]作為革E1DNA，定量稀釋市售的結(jié)核菌(Mycobacteriumtuberculos is)DNA組DNA，用作等溫擴增反應(yīng)的模板。(Vircell ,Spain)
[0068]外部引物(序列號I及序列號2)設(shè)計成包含與Mycobacterium t uberculosisIS6110堿基序列互補的序列，序列號1(正向，sense)及序列號2(反向，anti_sense)如下。
[0069]序列號1:5，-CGATCGAGCAAGCCA-3’
[0070]序列號2: 5 ’ -CGAGCCGCTCGCTGA-3 ’
[0071 ] 在DNA-RNA-DNA雜交引物(序列號3及序列號4)中設(shè)計成，5，末端寡聚DNA-RNA部分具有與Mycobacterium tuberculosis IS6110堿基序列非互補的序列，3’末端寡聚DNA部分具有與Mycobacteri um tuberculosis IS6110堿基序列互補的序列，序列號3(正向，sense)及序列號4(反向，anti_sense)如下(寡聚RNA部分用下劃線表示)。
[0072]序列號3:5，-CGATGACTGACTATACAAGAGGAAAGGCGTACTCGACCTGA-3’
[0073]序列號4:5，-CATTCCAGTTAAGCTAGCAGGTACTGAGATCCCCT 3’
[0074]用于執(zhí)行信號探針擴增的DNA-RNA-DNA雜交信號探針(序列號5)具有與借助上述的引物對而擴增的DNA互補的堿基序列，5，末端標(biāo)記為FAM dye,3'末端標(biāo)記為DABCYLquencher，序列號5(anti_sense)如下(寡聚RNA部分用下劃線表示)。
[0075]序列號5:5，-FAM-ATCCGTAUGGTGGATAACGTCTTTCA-DABCYL-3，
[0076]為了利用上述外部引物對和雜交引物對來擴增靶核酸，首先準(zhǔn)備含有上述外部引物對、雜交引物對的反應(yīng)雜交物和酶雜交物。上述反應(yīng)雜交物通過在1mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) (pH 8.5)緩沖液中添加1mM硫酸銨((NH4)2SO4)、1mM MgS04、50mM氯化鉀(KCl)、1.6mM脫氧核苷三磷酸(Fermentas)、1.6mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.Iyg牛血清白蛋白(BSA)、0.6mM精胺(s permine)、10mM海藻糖(trehalose)、0.IΙμΜ外部引物對(IDT)、I.IμΜ的雜交引物對(IDT)(在非對稱等溫擴增的情況下，2.2μΜ正向雜交引物(sense)及0.22μΜ反向雜交引物(ant1-sense))而制備。上述酶雜交物通過添加lunit Bst polymerase(NEB)、6units RNas e H(Epicentre)、6units RNase inhibitor(NEB)、50nM雜交信號探針(IDT)而制備。
[0077]在常溫下，向0.2ml聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管添加上述反應(yīng)雜交物5μ1、酶雜交物5μ1、不同濃度的模板DNAlOyl，在6rC條件下等溫擴增1.5小時。另一方面，作為陰性對照組，使用蒸餾水10ml。在擴增反應(yīng)中，使用等溫擴增熒光檢測裝備(Shinko，韓國)，將反應(yīng)溫度設(shè)置為ere，設(shè)置為每分鐘取得熒光信號。
[0078]其結(jié)果，如圖4所示，相比于對稱等溫擴增方法，非對稱等溫擴增方法具有優(yōu)秀的檢測能力。
[0079]實施例2:衣原體DNA的等溫擴增
[0080]作為革EDNA，使用衣原體(Chlamydi A trachomatis )DNA組DN A。為了提取衣原體的DNA組DNA，在衣原體菌株(ATCC Cat.N0.VR-887)中，使用G_spinTM DNA組DNA提取試劑盒(iNtRON B1 technology，Cat.N0.17121),提取DNA組DNA后，實施擴增反應(yīng)。提取DNA組DNA時，將菌懸濁液500μ1以13 ,OOOrprn進行離心分離I分鐘并去除上層液，雜交少量500μ1磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.2)進行離心分離并去除上層液后，添加含有RNase A,Proteinase K的G-buffer溶液300μ1，并使細(xì)胞聚合體(cell pellet)懸濁，在65°C溫度條件下靜置15分鐘。接著，添加結(jié)合緩沖液(Binding buffer)250μ1并均勾雜交后，吸附柱(spin column)與DNA相結(jié)合。添加洗滌緩沖液(washing buffer)A 500ml后，在13000rpm中進行離心分離I分鐘并去除，添加洗滌緩沖液(washing buffer)B 500ml并進行離心分離。1.5ml微量離心管(microcentrifuge tube)移至柱，并添加50μ1的洗脫緩沖液(eleut1n buffer)后，離心分離I分鐘，獲得15.8ng/ml的DN A組DNA。將其稀釋一定量并用作等溫擴增反應(yīng)的模板。
[0081 ] 外部引物(序列號6及序列號7)設(shè)計成包含與ChlamydiAtracho mat is crypticplasmid DNA堿基序列互補的序列，序列號6(正向，s ense)及序列號7(反向，ant1-sense)如下。
[0082]序列號6:5，-TAAACATGAAAACTCGTTCCG-3’
[0083]序列號7:5，-CAGTTATAGGTAATCCATTGTC-3’
[0084]在DNA-RNA-DNA雜交引物(序列號8及序列號9)中設(shè)計成，5，末端寡聚DNA-RNA部分具有與ChlamydiAtrachomatis cryptic plas mid DNA非互補的序列，3’末端寡聚DNA部分具有與ChlamydiAtra chomatis cryptic plasmid DNA喊基序列互補的序列，序列號8(正向，sense)及序列號9(反向ant1-sense)如下(寡聚RNA部分用下劃線表示。)。
[0085]序列號8:5，-ACCGCATCGAATCGATGTAAAATAGAAAATCGCATGCAAGATA-3’
[0086]序列號9:5，-CGATTCCGCTCCAGACTTAAAAAGCTGCCTCAGAATATACTCAG-3 ’
[0087]用于信號探針擴增的DNA-RNA-DNA雜交信號探針(序列號5)具有與借助上述的引物對而擴增的DNA互補的堿基序列，5，末端標(biāo)記為FAM dye，3，末端標(biāo)記為BHQlquencher，序列號10(sense)如下(寡聚RNA部分用下劃線表示)。
[0088]序列號?ο: 5，-FAM-GGTAAAGCTCUGAUAUTTGAAGACTCT-BHQ1-3，
[0089]為了利用上述外部引物對和雜交引物對來擴增靶核酸，首先準(zhǔn)備含有上述外部引物對、雜交引物對的反應(yīng)雜交物和酶雜交物。上述反應(yīng)雜交物通過在5mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) (pH 8.5)緩沖液中添加1mM硫酸銨((NH4)2SO4)、20mM MgS04、10mM氯化鉀(KCl)、ImM脫氧核苷三磷酸(Fermentas)、ImM二硫蘇糖醇(DTT)、0.1yg牛血清白蛋白(BSA)、0.15mM精胺(spermi ne)、2OmM海藻糖(trehalose)、0.2μΜ外部引物對(IDT)、ΙμΜ的雜交引物對(IDT)(在非對稱等溫擴增的情況下，0.4μΜ正向雜交引物(sense)及2μΜ反向雜交引物(ant1-sense))而制備。上述酶雜交物通過添加3units Bst polymerase(NEB)、8units RNase H(Ep icentre)、6units RNase inhibitor(NEB)、50nM雜交信號探針(I DT)而制備。
[0090]在常溫下，向0.2ml聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管添加上述反應(yīng)雜交物5μ1、酶雜交物5μ1、不同濃度的模板DNAlOyl，在6rC條件下等溫擴增1.5小時。另一方面，作為陰性對照組，使用蒸餾水10ml。在擴增反應(yīng)中，使用等溫擴增熒光檢測裝備(Shinko，韓國)，將反應(yīng)溫度設(shè)置為ere，設(shè)置為每分鐘取得熒光信號。
[0091 ]其結(jié)果，如圖5所示，相比于對稱等溫擴增方法，非對稱等溫擴增方法具有優(yōu)秀的檢測能力。
[0092]實施例3:淋菌DNA的等溫擴增
[0093]作為革E1DNA，使用淋菌(NeisseriAgonorrhoease)DNA組DNA。為了提取淋菌的DNA組DNA，在淋菌菌株(ATCC Cat.N0.49226)中，使用G-spinTMDNA組DNA提取試劑盒(iNtRONB1technology,Cat.N0.17121),提取DNA組DNA后，實施擴增反應(yīng)。提取DNA組DNA時，將菌懸濁液500μ1以13 ,OOOrprn進行離心分離I分鐘并去除上層液，雜交少量500μ1磷酸鹽緩沖液(PBS) (pH 7.2)進行離心分離并去除上層液后，添加含有RNase A,Proteinase K的G-buffer溶液300μ1，并使細(xì)胞聚合體(cell pellet)懸濁，在65°C溫度條件下靜置15分鐘。接著，添加結(jié)合緩沖液(Binding buffer)250μ1并均勾雜交后，吸附柱(spin column)與DNA相結(jié)合。添加洗滌緩沖液(w ashing buffer)A 500ml后，在13000rpm中進行離心分離I分鐘并去除，添加洗滌緩沖液(washing buff er)B 500ml并進行離心分離。1.5ml微量離心管(microcentrifuge tube)移至柱，并添加50μ1的洗脫緩沖液(eleut1n buffer)后，離心分離I分鐘，獲得4.7ng/ml的DNA組DNA。將其稀釋一定量并用作等溫擴增反應(yīng)的模板。
[0094]外部引物(序列號11及序列號12)設(shè)計成包含與NeisseriAgonor rhoease opA基因DNA堿基序列互補的序列，序列號11(正向，sense)及序列號12(反向，anti_sense)如下。
[0095]序列號11:5，-TCATCCGCCATATTGTG-3’
[0096]序列號12:5，-TTTCGGCTCCTTATTCGGTTT-3 ’
[0097]DNA-RNA-DNA雜交引物(序列號13及序列號14)設(shè)計成，5，末端寡聚DNA-RNA部分包含有與NeisseriAgonorrhoease opA基因D NA喊基序列非互補的序列，3’末端寡聚DNA部分包含有與Neisseri Agonorrhoease opA基因DNA堿基序列互補的序列，序列號13(正向，sense)及序列號14(反向ant1-sense)如下(寡聚RNA部分用下劃線表示)。
[0098]序列號13:5，-GCATAGCTCAAGTATATGGCACATTGAAACACCGCCCGGAA-3’
[0099]序列號14:5，-CTATCACGTGAAGCTAACGACCGGTTAAAAAA AGATTTTCACTG-3 ’
[0100]用于擴增信號探針的DNA-RNA-DNA雜交信號探針(序列號15)具有與借助上述的引物對而擴增的DNA互補的堿基序列，5，末端標(biāo)記為FAM dye，3 ’末端標(biāo)記為DABCYLquencher，序列號15(ant1-sense)如下(寡聚RNA部分用下劃線表示)。
[0101 ]序列號15:5，-FAM-ATGTTGAAGGACGGATTATATCGGDABC YL-3 ’
[0102]為了利用上述外部引物對和雜交引物對來擴增靶核酸，首先準(zhǔn)備含有上述外部引物對、雜交引物對的反應(yīng)雜交物和酶雜交物。上述反應(yīng)雜交物通過在1mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) (pH 8.5)緩沖液中添加1mM硫酸銨((NH4)2SO4)、1mM MgSO4、1mM氯化鉀(KCl)、1.6mM脫氧核苷三磷酸(Fermentas)、5mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.Iyg牛血清白蛋白(BSA)、0.4mM精胺(spermin e)、20mM海藻糖(trehalose)、0.ΙμΜ外部引物對(IDT)、ΙμΜ的雜交引物對(IDT)(在非對稱等溫擴增的情況下，4.4μΜ正向雜交引物(sense)及0.44μΜ反向雜交引物(ant1-sense))而制備。上述酶雜交物通過添加5units Bst polymerase(NEB)、5units RNase H(E picentre)、6units RNase inhibitor(NEB)、30nM雜交信號探針(I DT)而制備。
[0103]在常溫下，向0.2ml聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管添加上述反應(yīng)雜交物5μ1、酶雜交物5μ1、不同濃度的模板DNAlOyl，在6rC條件下等溫擴增1.5小時。另一方面，作為陰性對照組，使用蒸餾水10ml。在擴增反應(yīng)中，使用等溫擴增熒光檢測裝備(Shinko，韓國)，將反應(yīng)溫度設(shè)置為ere，設(shè)置為每分鐘取得熒光信號。
[0104]其結(jié)果，如圖6所示，相比于對稱等溫擴增方法，非對稱等溫擴增方法具有優(yōu)秀的檢測能力。
[0105]實施例4:李斯特DNA的等溫擴增
[0106]作為革EDNA，使用李斯特(Listeria monocytogene)DNA組DN A。為了提取李斯特菌的DNA組DNA，在李斯特菌株(ATCC Cat.N ο.35152)中，使用G-spinTMDNA組DNA提取試劑盒(iNtRON B1t echnology，Cat.N0.17121),提取DNA組DNA后，實施擴增反應(yīng)。提取DNA組DNA時，將菌懸濁液500μ1以13 ,OOOrpm進行離心分離I分鐘并去除上層液，雜交少量500μ1磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.2)進行離心分離并去除上層液后，添加含有RNase A,Proteinase K的G-buffer溶液300μ1，并使細(xì)胞聚合體(cell pellet)懸濁，在65°C溫度條件下靜置15分鐘。接著，添加結(jié)合緩沖液(Binding buffer)250μ1并均勾雜交后，吸附柱(spin column)與DNA相結(jié)合。添加洗滌緩沖液(washing buffer)A 500ml后，在13000rpm中進行離心分離I分鐘并去除，添加洗滌緩沖液(washing buffer)B 500ml并進行離心分離。1.5ml微量離心管(microcentrifuge tube)移至柱，并添加50μ1的洗脫緩沖液(eleut1n buffer)后，離心分離I分鐘，獲得8.4ng/ml的DNA組DNA。將其稀釋一定量并用作等溫擴增反應(yīng)的模板。
[0107]外部引物(序列號16及序列號17)設(shè)計成包含與Listeria monoc ytogenene actA基因DNA堿基序列互補的序列，序列號16(正向，se nse)及序列號17(反向，anti_sense)如下。
[0108]序列號16:5，-TGCGTGCGATGATGGTAGTTTT-3 ’
[0109]序列號17:5，-CTTGGCTGCTCTTCTGTTTT-3 ’
[0110]DNA-RNA-DNA雜交引物(序列號18及序列號19)設(shè)計成，5 ’末端寡聚DNA-RNA部分包含有與Listeria monocytogenene actA基因DNA堿基序列非互補的序列，3’末端寡聚DNA部分包含有與Listeri a monocytogenene actA基因DNA堿基序列互補的序列，序列號18(正向，sense)及序列號19(反向ant1-sense)如下(寡聚RNA部分用下劃線表示)。
[0111]序列號18:5，-CATCACCAACAAGAAGTAGAUUATGCATTACG ATTAACCCCGAC-3’
[0112]序列號19:5’ -CTGTCATTCATAGTCTCGTCUACUTCTTCCCAT TCATCTGTGTTCA-3’
[0113]用于擴增信號探針的DNA-RNA-DNA雜交信號探針(序列號20)具有與借助上述的引物對而擴增的DNA互補的堿基序列，5，末端標(biāo)記為FAM dye，3，末端標(biāo)記為black holequencher I(BHQl)，序列號20(anti_sense)如下(寡聚RNA部分用下劃線表示)。
[0114]序列號20: 5 ’ -FAM-ATTTGCAGCGACAGATAGCGAAGABHQ1-3，
[0115]為了利用上述外部引物對和雜交引物對來擴增靶核酸，首先準(zhǔn)備含有上述外部引物對、雜交引物對的反應(yīng)雜交物和酶雜交物。上述反應(yīng)雜交物通過在1mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) (pH 8.5)緩沖液中添加1mM硫酸銨((NH4)2SO4)、12mM MgS04、10m M氯化鉀(KCl)、1.8mM脫氧核苷三磷酸(Fermentas)、6mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.1yg牛血清白蛋白(BSA)、0.8mM精胺(spe rmine)、0.ΙμΜ外部引物對(IDT)、ΙμΜ的雜交引物對(IDT)(在非對稱等溫擴增的情況下，0.01μΜ正向外部引物(sense)、0.ΙμΜ正向雜交引物(sense)及0.ΙμΜ反向外部引物(ant1-sense )、ΙμΜ反向雜交引物(ant1-sense))而制備。上述酶雜交物通過添加3units Bst polymerase(NEB)、6units RNase H(Epicentre)、6units RNase inhibitor(NEB)、15nM雜交信號探針(IDT)而制備。
[0116]在常溫下，向0.2ml聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管添加上述反應(yīng)雜交物5μ1、酶雜交物5μ1、不同濃度的模板DNAlOyl，在61°C條件下等溫擴增1.5小時。另一方面，為了測定特異度的菌株使用以與李斯特菌DNA提取方法相同的方法所提取的金黃色葡萄球菌(Staphy I coccusaureus: Kor ean col lect1n type culture (KCTC) 1927)、沙門氏菌(Salmonel la enterica；KCTC 1925)、腸炎弧菌(Vibr1 parahaemolyticus ；ATCC 17802)、芽抱桿菌(Bacillus cereus ；ATCC 49953)、志賀氏桿菌(S higellAf lexneri ；KCTC 2517)、腸出血性大腸菌(EscherichiAcoli 0157:H7；ATCC 35150)DNA10ml。在擴增反應(yīng)中，使用等溫擴增熒光檢測裝備(Shinko，韓國)，將反應(yīng)溫度設(shè)置為61V，設(shè)置為每分鐘取得熒光信號。
[0117]其結(jié)果，如圖7所示，相比于對稱等溫擴增方法，非對稱等溫擴增方法具有優(yōu)秀的特異性。
[0118]實施例5:沙門氏菌DNA的等溫擴增
[0119]作為靶DNA，使用沙門氏菌(Salmone I IAenterica) DNA組DNA。為了提取沙門氏菌的DNA組DNA，在沙門氏菌菌株(KCTC 1925)中，使用G-spinTMDNA組DNA提取試劑盒(iNtRONB1technology,Cat.N0.17121),提取DNA組DNA后，實施擴增反應(yīng)。提取DNA組DNA時，將菌懸濁液500μ1以13 ,OOOrprn進行離心分離I分鐘并去除上層液，雜交少量500μ1磷酸鹽緩沖液(PBS) (pH 7.2)進行離心分離并去除上層液后，添加含有RNase A,Proteinase K的G-buffer溶液300μ1，并使細(xì)胞聚合體(cell pellet)懸濁，在65°C溫度條件下靜置15分鐘。接著，添加結(jié)合緩沖液(Binding buffer)250μ1并均勾雜交后，吸附柱(spin column)與DNA相結(jié)合。添加洗滌緩沖液(w ashing buffer)A500ml后，在13000rpm中進行離心分離I分鐘并去除，添加洗滌緩沖液(washing buff er)B 500ml并進行離心分離。1.5ml微量離心管(microcentrifuge tube)移至柱，并添加50μ1的洗脫緩沖液(eleut1n buffer)后，離心分離I分鐘，獲得6.7ng/ml的DNA組DNA。將其稀釋一定量并用作等溫擴增反應(yīng)的模板。
[0120]外部引物(序列號16及序列號17)設(shè)計成包含與SalmonellAent ericAinvA基因DNA堿基序列互補的序列，序列號21(正向，sense)及序列號22(反向，anti_sense)如下。[0121 ]序列號 21:5’-CTGATTCTGGTACTAATGGTGATGATC-3’
[0122]序列號22: 5 ’ -CTGAGGATTCTGTCAATGTAGAACGA-3 ’
[0123]DNA-RNA-DNA雜交引物(序列號23及序列號24)設(shè)計成，5’末端寡聚DNA-RNA部分包含有與Salmonel IAentericAinvA基因DNA堿基序列非互補的序列，3’末端寡聚DNA部分包含有與SalmonellAe ntericAinvA基因DNA堿基序列互補的序列，序列號23(正向，sense)及序列號24(反向ant1-sense)如下(寡聚RNA部分用下劃線表示)。
[0124]序列號23:5’-ACCTCAGACATCCAGGAGAGTTCGTCATTCCATTACC-3’
[0125]序列號24:5，-ATCGCAGATTAGGCTCAGAGAACACCAATATCGCCAGTA-3’
[0126]用于擴增信號探針的DNA-RNA-DNA雜交信號探針(序列號20)具有與借助上述的引物對而擴增的DNA互補的堿基序列，5，末端標(biāo)記為FAM dye，3，末端標(biāo)記為black holequencher I(BHQl)，序列號25(anti_sense)如下(寡聚RNA部分用下劃線表示)。
[0127]序列號25:5’-FAM-TCAGTGCGATCAGGAAATCAACCAGATABHQ1-3’
[0128]為了利用上述外部引物對和雜交引物對來擴增靶核酸，首先準(zhǔn)備含有上述外部引物對、雜交引物對的反應(yīng)雜交物和酶雜交物。上述反應(yīng)雜交物通過在1mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) (pH 8.5)緩沖液中添加1mM硫酸銨((NH4)2SO4)、12mM MgSOhlOmM氯化鉀(KCl)、1.8mM脫氧核苷三磷酸(Fermentas)、6mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.1yg牛血清白蛋白(BSA)、0.75mM精胺(spe rmine)、0.075μΜ外部引物對(IDT)、1.125μΜ的雜交引物對(IDT)(在非對稱等溫擴增的情況下，0.075μΜ正向外部引物(sense)、2.25yM正向雜交引物(sense)及0.075μΜ 反向外部引物(ant1-sense)、0.225μΜ 反向雜交引物(ant1-sense))而制備。上述酶雜交物通過添加3units Bst polymerase(NEB)、6units RNase H(Epicentre)、6units RNase inhibitor(NEB)、25nM雜交信號探針(IDT)而制備。
[0129]另一方面，為了測定特異度的菌株使用以與李斯特菌DNA提取方法相同的方法所提取的金黃色葡萄球菌(Staphylcoccus aureus:Kor ean collect1n type culture(KCTC) 1927)、李斯特菌(Listeria mon ocytogenene: ATCC 5152)、腸炎弧菌(Vibr1parahaemolyticus ；AT CC 17802)、芽抱桿菌(Bacillus cereus ；ATCC 49953)、志賀氏桿菌(ShigellAf lexneri ；KCTC 2517)、腸出血性大腸菌(EscherichiAc oli 0157:H7；ATCC35150)DNA10ml。在擴增反應(yīng)中，使用等溫擴增熒光檢測裝備(Shinko，韓國)，將反應(yīng)溫度設(shè)置為ere，設(shè)置為每分鐘取得熒光信號。
[0130]其結(jié)果，如圖8所示，相比于對稱等溫擴增方法，非對稱等溫擴增方法具有優(yōu)秀的特異性。
[0131]以上，對本
【發(fā)明內(nèi)容】
的特定部分進行了詳細(xì)說明，對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，這種具體的說明僅僅是優(yōu)選實施方式，應(yīng)明確的是，本發(fā)明的范圍不受此限制。因此，本發(fā)明的實質(zhì)性范圍應(yīng)由所附的本發(fā)明要求保護范圍及其等同技術(shù)方案定義。
【主權(quán)項】
1.一種靶DNA的檢測方法，其特征在于， 上述靶DNA的檢測方法利用靶DNA的等溫擴增方法及擴增的信號探針， 上述靶DNA的等溫擴增方法包括如下步驟: 向反應(yīng)雜交物添加能夠置換鏈的DNA聚合酶、RNA分解酶后，使上述靶DNA和上述信號探針在等溫下同時擴增的步驟， 上述反應(yīng)雜交物包括: ⑴靶DNA; (i i)外部引物對，具有與上述靶DNA互補的堿基序列； (iii )DNA-RNA-DNA雜交引物對，具有上述靶DNA和3 ’末端DNA部分互補且上述靶DNA和5，末端DNA-RNA部分非互補的堿基序列； (iV)引物對，在上述DNA-RNA-DNA雜交弓丨物對的正向引物和反向引物的比例中，過量使用其中的一種而以非對稱方式擴增核酸；以及 (v)DNA-RNA-DNA雜交信號探針，具有與借助上述外部引物對和雜交引物對所生成的擴增產(chǎn)物互補的堿基序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述外部引物對為選自由寡聚DNA、寡聚RNA以及雜交寡聚RNA/DNA組成的組中的一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，在上述DNA-RNA-DNA雜交引物對中，5 ’末端DNA-RNA部分具有與靶DNA序列非互補的堿基序列，3 ’末端DNA部分具有與靶DNA互補的堿基序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述DNA-RNA-DNA雜交探針具有與因上述DNA-RNA-DNA弓丨物對中過量使用的引物而被擴增的產(chǎn)物互補的堿基序列。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述正向引物和反向引物具有1:5至1:20的比例或者具有與上述比例相反的比例。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述DNA-RNA-DNA雜交探針具有與因上述DNA-RNA-DNA弓丨物對中過量使用的引物而被擴增的產(chǎn)物互補的堿基序列。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述DNA聚合酶為耐熱性DNA聚合酶。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述耐熱性DNA聚合酶為選自由Bst DNA聚合酶、exo(_)vent DNA聚合酶、exo(-)Deep vent DNA聚合酶、exo(-)Pfu DNA聚合酶、BcADNA聚合酶以及phi 29DNA聚合酶組成的組中的一種。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述RNA分解酶為RNaseH。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述DNA-RNA-DNA雜交引物由32?66堿基組成。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，在上述DNA-RNA-DNA雜交引物中，DNA部分的長度分別由15?30堿基組成，RNA部分的長度由I?6堿基組成。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述DNA-RNA-DNA雜交信號探針由18?38喊基組成。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，在上述DNA-RNA-DNA雜交信號探針中，DNA部分的長度分別由8?16堿基組成，RNA部分的長度由I?6堿基組成。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述DNA-RNA-DNA雜交信號探針的末端以標(biāo)記物質(zhì)進行標(biāo)記。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述標(biāo)記物質(zhì)選自由熒光物質(zhì)和熒光信號抑制物質(zhì)組成的組。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶DNA的檢測方法，其特征在于，上述等溫擴增在30?75°C下執(zhí)行。
【文檔編號】C12Q1/68GK105960467SQ201580004417
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2015年2月2日
【發(fā)明人】金珉煥
【申請人】迪克斯真株式會社