用于治療劑的效價測定的制作方法
【專利摘要】本文提供了測定治療劑的致耐受潛力的方法，所述方法包括測定所述治療劑增加抗原呈遞細胞諸如單核細胞、巨噬細胞、B細胞和樹突狀細胞表達致耐受性標志物例如PD?L1的能力。
【專利說明】用于治療劑的效價測定 發(fā)明領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明提供測定治療劑的致耐受性和/或效價的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 目前，使用不同的測試方法，諸如針對感染或疾病的物理化學(xué)性質(zhì)、抗原性、免疫 原性、感染性測定和預(yù)防，測量治療劑的效價。本申請依賴于治療劑性質(zhì)和測試目的。例如， 就疫苗而言，效價通常通過測量靶動物物種或另一個物種(如小鼠或大鼠）中的免疫應(yīng)答來 測定。
[0004] 前述報告指出，自體免疫疾病的T細胞免疫療法，如利用減毒自體反應(yīng)性T細胞進 行疫苗，通過提高對自體反應(yīng)性T細胞的抗獨特型和/或抗工效型活性誘發(fā)調(diào)節(jié)性免疫應(yīng)答 以控制異常自體免疫應(yīng)答。據(jù)認為，自體抗原特異性T細胞的施用可引發(fā)獨特的旁分泌信 號，這促進了抗原呈遞細胞(APC)和/或效應(yīng)子T細胞的致耐受性網(wǎng)絡(luò)，從而協(xié)助控制與自體 免疫紊亂相關(guān)的炎癥。因此，測定此類基于T細胞的治療劑的效價需要測量調(diào)節(jié)性免疫應(yīng)答 的誘導(dǎo)。
[0005] 需要能夠測量治療劑(尤其是誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性免疫的治療劑)的效價的高通量、優(yōu)選體 外測定。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本文公開了評估治療劑的效價的方法，該方法包括測定治療劑的致耐受性。測定 治療劑的致耐受性的方法通常包括以下步驟:使治療劑優(yōu)選體外接觸包含測試抗原呈遞細 胞的試樣;測量接觸治療劑的測試抗原呈遞細胞的至少一個致耐受性標志物的表達；以及 將測試抗原呈遞細胞的至少一個致耐受性標志物的表達與適當(dāng)?shù)膶φ毡容^;其中與對照抗 原呈遞細胞相比，測試抗原呈遞細胞的至少一個致耐受性標志物的表達增加確定治療劑具 有致耐受性。在優(yōu)選的實施方案中，至少一個致耐受性標志物包含ro-i配體，如ro-Li。在優(yōu) 選的實施方案中，測量步驟在接觸步驟后約24-72小時內(nèi)，更優(yōu)選地在約48-72小時內(nèi)，最優(yōu) 選地在約72小時內(nèi)進行。在一個實施方案中，治療劑的效價與治療劑的致耐受性直接相關(guān)。
[0008] 在一個實施方案中，將治療劑施用于需要其的患者，使患者對特定的試劑耐受化， 如下調(diào)患者對該抗原諸如過敏原或自體抗原的免疫應(yīng)答。在一個實施方案中，治療劑選自 過敏原、其耐受化表位、包含過敏原特異性免疫細胞的疫苗、包含過敏原特異性免疫細胞的 片段疫苗以及編碼過敏原或其耐受化表位的核酸。優(yōu)選地，治療劑選自自體抗原、其耐受化 表位、包含自體抗原特異性免疫細胞的疫苗、包含自體抗原特異性免疫細胞的耐受化片段 的疫苗以及編碼自體抗原或其耐受化表位的核酸。
[0009] 在一個示例性優(yōu)選的實施方案中，治療劑包含自體抗原特異性T細胞，其中自體抗 原優(yōu)選地選自髓鞘蛋白（如，髓鞘堿性蛋白、蛋白脂質(zhì)蛋白、髓鞘少突膠質(zhì)細胞蛋白）、水通 道蛋白4以及血小板糖蛋白Ilb-IIIa和Ib-IX。最優(yōu)選地，治療劑包含髓鞘蛋白特異性減毒T 細胞。在另一個實施方案中，T細胞與測試和對照抗原呈遞細胞是異體的。在某些優(yōu)選的實 施方案中，T細胞與測試和對照抗原呈遞細胞是自體的。
[0010] 在優(yōu)選的實施方案中，包含抗原呈遞細胞的測試和/或?qū)φ諛悠钒▎魏思毎?突狀細胞、B細胞和/或衍生自單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞或B細胞的細胞系。在一些實 施方案中，抗原呈遞細胞包括衍生自單核細胞(如，U937、THP-1等）的細胞系。優(yōu)選地，測試 和對照抗原呈遞細胞包括B細胞。最優(yōu)選地，測試和對照抗原呈遞細胞包括單核細胞。
[0011] 在一個實施方案中，至少一個致耐受性標志物與抗原呈遞細胞的至少一個標志物 (諸如CD86)-起組合測量。更優(yōu)選地，使用檢測致耐受性標志物以及任選地抗原呈遞細胞 標志物的高通量方法。最優(yōu)選地，使用流式細胞分析實時檢測抗原呈遞細胞上至少一個致 耐受性標志物(如，PD-L1)和抗原呈遞細胞標志物(優(yōu)選地⑶86)的細胞表面表達。
[0012] 本文還提供了測定治療劑的致耐受性的試劑盒，該試劑盒包括致耐受性標志物的 抗體和抗原呈遞細胞標志物的抗體。優(yōu)選地，該試劑盒還可包括檢測一個或多個抗體的檢 測試劑和/或使用該試劑盒的說明。
【附圖說明】
[0013 ]圖1示出了流式細胞點圖，該圖示出了在(A)單獨或⑶存在TCELNA睡的情況下 孵育時，自體淋巴細胞（CD86' X-軸）或自體單核細胞(CD86，X-軸）的細胞表面PD-L1表達 (y-軸)。
[0014] 圖2示出了在單獨（)或存在自體T細胞的情況下（□)孵育時，五個獨立的 TC E LN A?產(chǎn)品(X-軸)的細胞表面表達ro-Ll的單核細胞的百分比(y-軸）。
[0015] 圖3示出了在與自體T細胞一起孵育后，五個獨立的TCELN A⑧產(chǎn)品（X-軸）的結(jié) 合熒光抗H)-L1抗體的單核細胞的平均熒光強度(MFI，y-軸)倍數(shù)變化。
[0016] 圖4示出了在單獨或與T細胞一起孵育（A) 24小時或（B) 72小時后，異體 TCELNA?產(chǎn)品的細胞表面表達H)-L1的免疫細胞的百分比(y-軸）。
【具體實施方式】
[0017] 據(jù)信，抗原呈遞細胞(APC)尤其是專職性抗原呈遞細胞，在輻照相互作用時，凋亡 細胞(諸如減毒自體反應(yīng)性T細胞)能夠經(jīng)歷顯著的表型和致耐受性變化。在輻照暴露后，自 體白細胞、樹突狀細胞顯示出致耐受特性，包括IL-10的分泌增加以及未暴露的T細胞增殖 的刺激修復(fù)（Zheng DH等（2010)Biochem Biophys Res Commun.395(4) :540-6)。此外，HIV 慢性病毒感染導(dǎo)致各種細胞類型上PD-L1的表達增加，單核細胞分泌IL-10以及T細胞擴增 抑制（Said ΕΑ等(2010)Nat ]^(1.16(4):452-9)。1'細胞擴增和功能通過例如^)-1^和^)-1之 間以及IL-10R和IL-10之間的相互作用的阻斷恢復(fù)，暗示涉及PD-L1和/或IL-10、它們在各 自途徑中各自的受體和其它分子的相互作用可作為耐受性誘導(dǎo)的有效標志物。
[0018] 如本文所用，致耐受性標志物可包括這樣的蛋白質(zhì)：其上調(diào)表達可立即通過接觸 耐受化劑的抗原表達細胞檢測。例如，包含ro-i配體(優(yōu)選地ro-Li)的致耐受性標志物的表 達可在接觸耐受化劑后24小時、48小時或72小時內(nèi)，優(yōu)選地48小時內(nèi)，最優(yōu)選地24小時內(nèi)檢 測。
[0019]在多發(fā)性硬化中，ro-Ll的APC表達減少和促炎性細胞因子的分泌增加與MS患者的 進展相關(guān)(Kami A.等（2006)J Immunol .177(6) :4196-202)。相反，用IFN-β療法治療MS顯 著增加了單核細胞和DC上的H)-L1表達，并且顯著抑制了自體⑶4T細胞活化(Schreiner B (2004)J Neuroimmunol.155:172-182·)。
[0020] TCELNA銳是多發(fā)性硬化(MS)的τ細胞免疫療法，它由從個體的外周血單核細胞 擴增的自體髓鞘反應(yīng)性Τ細胞庫構(gòu)成。如本文所公開，TCELNA?產(chǎn)品的效價可通過監(jiān)測 抗原呈遞細胞對TCELNA?暴露作出的應(yīng)答而表達的PD-L1來測試。具體地講，作為與 TCELNA?產(chǎn)品一起培養(yǎng)作出的應(yīng)答，PD-L1表達在應(yīng)答者單核細胞中誘導(dǎo)。
[0021] 這些上述觀察結(jié)果支持抗原呈遞細胞的致耐受性標志物如包含ro-i配體(如，pd- L1)的致耐受性標志物的表達檢測作為治療劑的致耐受性測定方法。
[0022]治療劑
[0023]因此，在一個方面，本發(fā)明提供用于測定治療劑的致耐受性的方法。如本文所用， 術(shù)語"致耐受性"是指治療劑"耐受化"或誘導(dǎo)對特定抗原的"耐受性"的能力。術(shù)語"耐受性" 是指對具體抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答如T細胞和/或抗體應(yīng)答的減少。對具體抗原的免疫應(yīng)答 的減少可伴隨著免疫調(diào)節(jié)細胞如抗獨特型和/或抗工效型免疫細胞的特殊子集的敏感化 和/或應(yīng)答增加。
[0024]技術(shù)人員將認識到，治療劑的致耐受性可與治療劑的效價相關(guān)。如本文所用，"效 價"是指治療劑在施用后產(chǎn)生所需效果的能力。
[0025]在優(yōu)選的實施方案中，治療劑的所需效果是對特定抗原(如，過敏原、自體抗原）的 免疫應(yīng)答的耐受化。在這些實施方案中，治療劑的致耐受性與其效價直接相關(guān)。在優(yōu)選的實 施方案中，使用本文公開的方法測定治療劑的效價，以試圖誘導(dǎo)對過敏原或自體抗原的耐 受性。
[0026] "過敏原"是可引起受試者的不期望的（如，1型超敏)免疫應(yīng)答（即，變應(yīng)性應(yīng)答或 反應(yīng))的任何物質(zhì)。過敏原包括但不限于:植物過敏原(如，花粉、豚草過敏原）、昆蟲過敏原、 昆蟲螫傷過敏原（如，蜜蜂螫傷過敏原）、動物過敏原（如，寵物過敏原，諸如動物皮毛或貓 Fel d 1抗原）、乳膠過敏原、霉菌過敏原、真菌過敏原、化妝品過敏原、藥物過敏原、食物過 敏原、粉塵、昆蟲毒液、病毒、細菌等。食物過敏原包括但不限于:乳過敏原、蛋過敏原、堅果 過敏原（如，花生或木本堅果過敏原等(如，胡桃木、腰果等））、魚過敏原、貝類過敏原、大豆 過敏原、豆類過敏原、種子過敏原和小麥過敏原。昆蟲螫傷過敏原包括作為蜜蜂螫傷、黃蜂 螫傷、大胡蜂螫傷、胡蜂螫傷等的過敏原或它們相關(guān)的過敏原。昆蟲過敏原還包括屋塵螨過 敏原(如，Der P1抗原)和蟑螂過敏原。藥物過敏原包括作為抗生素、NSAID、麻醉劑等的過敏 原或它們相關(guān)的過敏原。花粉過敏原包括草本過敏原、木本過敏原、雜草過敏原、花過敏原 等。"變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的過敏原"是單獨或與其它過敏原組合產(chǎn)生不期望的免疫應(yīng)答而導(dǎo)致， 或臨床醫(yī)生預(yù)期導(dǎo)致受試者的變應(yīng)性應(yīng)答或反應(yīng)或變應(yīng)性應(yīng)答或反應(yīng)的癥狀的過敏原。
[0027] "自體抗原"是通常導(dǎo)致組織損傷和/或自體免疫疾病的自體體液(B細胞)或T細胞 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答靶向的身體中正常組織成分。如本文所用，"自體"是指細胞或組織衍生自 免疫相容的相同個體或細胞或組織，如具有相同的MHC/HLA單倍型。如本文所用"異體"是指 細胞或組織是通常相異的并且是免疫不相容的，如具有不同的MHC/HLA單倍型。自體抗原的 非限制性實例包括髓鞘蛋白（如，髓鞘堿性蛋白、蛋白脂質(zhì)蛋白、髓鞘少突膠質(zhì)細胞蛋白）、 水通道蛋白4、血小板糖蛋白Ilb-IIIa和Ib-IX、胰島素、胰島素原、谷氨酸脫羧酶(GAD)、 GAD65、GAD67、熱激蛋白65(hsp65)、胰島細胞抗原69(ICA69)、胰島細胞抗原相關(guān)蛋白酪氨 酸磷酸酶(PTP)、GM2-1神經(jīng)節(jié)苷脂、Tep69、胰島細胞蛋白酪氨酸磷酸酶及其衍生的37-kDa 自體抗原(包括IA-2)、phogrin、人軟骨細胞糖蛋白-39、膠原、II型膠原、軟骨鏈蛋白、埃茲 蛋白、根蛋白、膜突蛋白、分枝桿菌熱激蛋白6、橋粒芯糖蛋白、i3-2-GPI、Ku(p70/p80)自體抗 原或其80-kd亞基蛋白、核自體抗原La(SS-B)和Ro(SS-A)、蛋白酶體β-型亞基C9、中心體自 體抗原PCM-1、多肌炎-硬皮病自體抗原(PM-Scl)、自體抗原CENP-A、U5、核仁U3-和Th(7-2) 核糖核蛋白、核糖體蛋白L7、hPopl、核基質(zhì)抗原的36-kd蛋白、甲狀腺過氧化物酶和促甲狀 腺激素受體、人TSH受體、乙酰膽堿受體、肌肉受體激酶或任何其它合適的自體抗原的成分。
[0028] 技術(shù)人員將易于認識到，試圖誘導(dǎo)對過敏原或自體抗原的耐受性的治療劑包括但 不限于:全長過敏原或全長自體抗原;過敏原的耐受化表位或自體抗原的耐受化表位;包含 可為減毒的、過敏原或自體抗原特異性的或?qū)ζ洚a(chǎn)生應(yīng)答的免疫細胞的疫苗;包含過敏原 或自體抗原特異性的或?qū)ζ洚a(chǎn)生應(yīng)答的免疫細胞的耐受化片段（如，T細胞受體、B細胞受 體、其衍生物等）的疫苗，以及包含編碼過敏原、自體抗原、其耐受化表位的核酸（如，DNA或 RNA)和過敏原或自體抗原特異性的和/或?qū)ζ洚a(chǎn)生應(yīng)答的免疫細胞的耐受化片段的疫苗。 如本文所用，過敏原或自體抗原的耐受化表位可包括但不限于:分別地過敏原或自體抗原 的片段、融合蛋白、肽模擬型和修飾肽。
[0029] "表位"也稱為抗原決定簇，是免疫系統(tǒng)尤其是例如抗體、B細胞或T細胞識別的抗 原(如，過敏原、自體抗原）的一部分。表位通常由可見于有核細胞的MHC或HLA分子呈遞至免 疫細胞。在一些實施方案中，表位本身是抗原。
[0030] 在一個實施方案中，治療劑試圖誘導(dǎo)對自體抗原的耐受性。在優(yōu)選的實施方案中， 自體抗原選自髓鞘蛋白、水通道蛋白-4和血小板糖蛋白Ilb-IIla和Ib-IX。在更優(yōu)選的實施 方案中，自體抗原是選自髓鞘堿性蛋白、蛋白脂質(zhì)蛋白和髓鞘少突膠質(zhì)細胞蛋白的髓鞘蛋 白。優(yōu)選地，試圖誘導(dǎo)對自體抗原的耐受性的治療劑包含減毒T細胞，其中該T細胞是自體抗 原特異性的。
[0031] 在一個實施方案中，治療劑的所需效果是活化對特定抗原的免疫應(yīng)答。此類治療 劑包括病原性抗原、腫瘤抗原、病原性抗原的片段、腫瘤抗原的片段、編碼病原性抗原的核 酸以及編碼腫瘤抗原的核酸是本領(lǐng)域熟知的。熟知的腫瘤抗原的非限制性實例包括作為癌 抗原的細胞角蛋白，尤其是細胞角蛋白8、18和19;上皮細胞膜抗原(EMA);人胚抗原(HEA- 125);人乳脂肪球、MBrl、MBr8、Ber-EP4、17-lA、C26和T16;作為肌源性肉瘤的抗原的肌間線 蛋白和肌肉特異性肌動蛋白；作為滋養(yǎng)層和生殖細胞腫瘤的抗原的胎盤堿性磷酸酶、人 絨毛膜促性腺激素和胎兒球蛋白；作為前列腺癌的抗原的前列腺特異性抗原；結(jié)腸腺癌 的癌胚抗原;作為黑素瘤的抗原的ΗΜΒ-45;以及作為神經(jīng)內(nèi)分泌和神經(jīng)外胚層腫瘤的抗原 的嗜鉻粒蛋白-Α和突觸小泡蛋白。在這些實施方案中，治療劑的致耐受性不與治療劑的效 價直接相關(guān)，相反，治療劑的致耐受性可與其效價負相關(guān)。
[0032] 抗原呈遞細胞、致耐受性標志物及其測量
[0033] 如本文所公開，本文公開的治療劑的致耐受性的測定方法通常包括使治療劑接觸 抗原呈遞細胞以及測量抗原呈遞細胞的至少一個致耐受性標志物的表達。
[0034] 如上文所討論，表位通常由可見于有核細胞的MHC或HLA分子呈遞至免疫細胞。換 句話講，所有有核細胞均能夠使用I類分子呈遞抗原。然而，一些表位由可見于專職性抗原 呈遞免疫細胞，諸如可見于巨噬細胞、單核細胞、Β細胞、樹突狀細胞以及由其衍生的細胞系 的MHC或HLA分子呈遞至免疫細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，本文公開的方法包括測量專 職性抗原呈遞細胞的致耐受性標志物的表達。在優(yōu)選的實施方案中，測量包括單核細胞、巨 噬細胞、B細胞或由其衍生的細胞系的抗原呈遞細胞的致耐受性標志物的表達。更優(yōu)選地， 測量包括巨噬細胞、單核細胞和/或由其衍生的細胞系（如，U937或THP-1細胞系）的抗原呈 遞細胞，最優(yōu)選地單核細胞的致耐受性標志物的表達。
[0035]患有繼發(fā)進展型多發(fā)性硬化(SP-MS)的個體的抗原呈遞細胞(APC)的表型與患有 復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化(RR-MS)的個體或健康對照的比較研究暗示，患有自體免疫疾病的 個體的APC偏向于特征為PD-L1表達減少和炎癥介質(zhì)的分泌增加的炎性應(yīng)答(Karni A等 (2006) J. Immunol. 177(6) :4196-202.)。然而，用IFN-β療法治療顯著增加了單核細胞和DC 上的PD-L1表達，并且賦予DC更多致耐受性/調(diào)節(jié)性，這由在繼代培養(yǎng)時它們不能誘導(dǎo)自體 CD4T細胞活化支持(Schreiner B等(2004) J.Neuroimmunol .155:172-182·)。這些數(shù)據(jù)共同 暗示，SP-MS患者中PD-L1表達的誘導(dǎo)有助于恢復(fù)SP-MS患者中不正常的致耐受性/調(diào)節(jié)性網(wǎng) 絡(luò)，顯示了新的治療目的。如本文所公開，暴露至TCELNA?顯著誘導(dǎo)了單核細胞中的H)- L1表達，暗示抗原呈遞細胞的致耐受性標志物誘導(dǎo)可作為產(chǎn)品效價以及作用機制二者的指 不。
[0036]因此，在一個實施方案中，測量致耐受性標志物Η)-1配體(如，PD-L1、PD-L2等）的 表達。在一個實施方案中，測量抗原呈遞細胞的ro-Li表達。在另一個實施方案中，PD-1配體 的表達在抗原呈遞細胞接觸治療劑后72小時內(nèi)測量。優(yōu)選地，抗原呈遞細胞的ro-i配體表 達在抗原呈遞細胞接觸治療劑后約24小時測量。存在多種本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的檢 測抗原呈遞細胞的致耐受性標志物表達的測定形式。參見例如Harlow和Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988年。作為非限制性實例，致 耐受性標志物蛋白的檢測可使用結(jié)合蛋白質(zhì)并且優(yōu)選地被可檢測標記(如，放射性標記、發(fā) 光標記、熒光標記、酶等）的抗體進行?？乖蔬f細胞的致耐受性標志物蛋白表達可根據(jù)熟 知的方法或測定，如免疫沉淀、ELI SA、蛋白質(zhì)印跡分析、免疫組織化學(xué)、免疫熒光、"夾心"免 疫測定、免疫放射測定、凝聚擴散沉淀反應(yīng)、免疫擴散測定、原位免疫測定、沉淀反應(yīng)、凝集 測定、補體結(jié)合測定、蛋白A測定、免疫電泳測定、焚光活化細胞分選(FACS)分析、放射性免 疫測定、試紙檢驗、即時檢驗等等檢測特異性抗體結(jié)合的致耐受性標志物來測量。在一些實 施方案中，利用自動化檢測測定。用于免疫測定自動化的方法包括美國專利No. 5，885，530、 4,981，785、6,159,750和5,358,691中描述的那些，每個專利以引用的方式并入本文。在一 些實施方案中，分析和結(jié)果展示也是自動化的。
[0037] 抗原呈遞細胞的致耐受性標志物(包括細胞表面蛋白，如，PD-L1)的表達可通過熒 光活化細胞分選測量?；蛘撸毎蜃拥闹履褪苄詷酥疚锏谋磉_可使用熟知的免疫分 析法，優(yōu)選地ELISA測量。
[0038] 為提高靈敏度，可在給定的樣品中測定多個標志物。具體地講，一個或多個其它致 耐受性標志物可與抗原呈遞細胞的標志物組合測定?？乖蔬f細胞的細胞表面標志物的實 例包括但不限于：MHC I類、MHC II類、CDl、CD2、CD3、CD4、CD8、CDllb、CD14、CD15、CD16、CD 19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、 CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARC0、DEC-205、甘露糖受體、朗格漢斯蛋 白、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受體和IL-2受體、ICAM-1、Fc γ受體或抗原呈遞細胞相對 特異性表達的其它受體。樹突狀細胞的細胞表面標志物的實例包括但不限于:MHC I類、MHC 11類、。01、0)2、0)3、0)4、0)8、0)1113、0)14、〇015、0)16、0)19、0)20、0)29、0)31、〇040、0)43、 CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、 CD40、BDCA-2、MARC0、DEC-205、甘露糖受體、朗格漢斯蛋白、DECTIN-l、B7-l、B7-2、IFNγ受 體和IL-2受體、ICAM-l、Fc γ受體或樹突狀細胞相對特異性表達的其它受體。單核細胞/巨 噬細胞的細胞表面標志物的實例包括但不限于:CD14、⑶32、⑶68、⑶115、⑶83、p55、⑶40和 CD863細胞的細胞表面標志物的實例包括但不限于:B220/CD45R、CD19、CD21、CD24、CD37、 CD38、CD40、CD80和CD86。
[0039] 組合測定可同時或按順序進行。可根據(jù)常規(guī)實驗選擇標志物，以確定產(chǎn)生最佳靈 敏度的組合。在優(yōu)選的實施方案中，抗原呈遞細胞的細胞表面致耐受性標志物和細胞表面 標志物使用熒光活化細胞分選和/或流式細胞分析同時測量。更優(yōu)選地，PD-L1和CD86的細 胞表面表達通過流式細胞分析同時測量。
[0040] 在優(yōu)選的實施方案中，在試樣（即，接觸治療劑的抗原呈遞細胞）的至少一個致耐 受性標志物的表達測量中，測試抗原呈遞細胞的檢測表達水平通常可與對應(yīng)和適當(dāng)?shù)膶φ?樣品（即，抗原呈遞細胞，優(yōu)選地測試抗原呈遞細胞自體的，不接觸治療劑）的檢測表達水平 進行比較。在優(yōu)選的實施方案中，與對照抗原呈遞細胞相比，測試抗原呈遞細胞的致耐受性 標志物表達水平和/或表達致耐受性標志物的測試抗原呈遞細胞的數(shù)量的相對增加與治療 劑的致耐受性和/或效價直接相關(guān)。
[0041] 試樣抗原呈遞細胞的致耐受性標志物表達水平和/或表達致耐受性標志物的測試 抗原呈遞細胞的百分比可以相對于對照樣品的倍數(shù)增加（如，可檢測表達水平增加3倍）的 方式測量，和/或表達致耐受性標志物的細胞的百分比可視為致耐受性水平為3(可檢測表 達水平增加5倍），和/或表達致耐受性標志物的細胞的百分比可視為致耐受性水平為5(相 對于對照增加10倍），可視為致耐受性水平為1〇(相對于對照增加100倍），可視為致耐受性 水平為100等。在一個實施方案中，如果治療劑的致耐受性水平為至少約3，如至少約5，如至 少約10，如至少約20，如至少約100，則確定治療劑具有致耐受性。
[0042] 本文還描述了用于測定治療劑的致耐受性的試劑盒。此類試劑盒通常包括進行效 價測定必須的兩種或更多種組件。組件可以是化合物、試劑、容器、說明和/或設(shè)備。例如，試 劑盒內(nèi)的一個容器可包含致耐受性標志物特異性抗體和抗原呈遞細胞標志物特異性抗體。 此類試劑盒還可包含上述檢測試劑，該試劑包含適于抗體結(jié)合的直接或間接檢測的報告基 團。
[0043] 因此，本文描述了用于測量抗原呈遞細胞的致耐受性標志物表達水平的試劑盒， 該試劑盒可用于提供適于測定治療劑的致耐受性和/或效價的結(jié)果。試劑盒可包括致耐受 性標志物的抗體，該抗體可任選地被可檢測標記，如放射性標記、發(fā)光標記、熒光標記、酶 等。用于可檢測標記蛋白的方法是本領(lǐng)域熟知的。此類試劑盒還可包括抗原呈遞細胞的標 志物特異性的檢測試劑。使用試劑盒進行評估的說明，包括用于定量和/或評估具體治療劑 的語境中此類致耐受性標志物的水平的適當(dāng)比較標準，也可有利地以印刷形式提供和/或 記錄在合適的介質(zhì)上。
[0044] 實施例
[0045] 實施例1:作為抗原呈遞細胞來源的PBMCS [0046] 實施例1.1 :材料和方法
[0047]用于效價測定的應(yīng)答者細胞從聚蔗糖分離的PBMC的冷凍儲液獲得。將PBMC解凍、 洗滌并重懸于培養(yǎng)基中，然后暴露于TCELNA?產(chǎn)品。
[0048] 從液氮存儲器取出TCELNA?產(chǎn)品，在37°C水浴中解凍。樣品在配制用于效價測 定后立即輻照和使用。應(yīng)答者PBMC(1X106)單獨或與TCELNA:?(1X106)組合在聚丙烯管 中培養(yǎng)3天。在培養(yǎng)1或3天后，酌情通過流式細胞術(shù)監(jiān)測⑶14+CD19-⑶3-單核細胞的ro-Ll、 〇095、卩01、〇)86、1^6-3、11^-6、比-4、11^-10、11^-23、11^-113、11^-27、11^-21和/或11^-22表達。使 用同種型匹配mAb檢驗H)-L1染色的特異性(數(shù)據(jù)未示出）。
[0049] 實施例1.2:結(jié)果
[0050] 基于單核細胞的效價測定證明TCELNA?賦予具有誘導(dǎo)PD-L1表達標志的應(yīng)答 者單核細胞致耐受性/調(diào)節(jié)性表型。由于暴露至TCELNA?產(chǎn)品，單核細胞表型的生產(chǎn)性 調(diào)節(jié)使ro-Ll表達在>90%的單核細胞上。在所示數(shù)據(jù)中，基于⑶14表達鑒定單核細胞。在不 存在TCELNA_?的情況下，如在PD-L1陽性級分中不超過15 %的細所證明，（PBMC單獨培 養(yǎng))單核細胞不能表達PD-L1(圖1A和2)。相比之下，PBMC與TCELNA?產(chǎn)品一起培養(yǎng)使至 少60 %的單核細胞表達PD-L1 (圖1B和2)，暗示有效誘導(dǎo)了致耐受性/調(diào)節(jié)性表型。圖2顯示 在暴露于5種獨立患者產(chǎn)品后誘導(dǎo)PD-L1在單核細胞上表達。圖3顯示在與五種不同 TCELNA⑩產(chǎn)品一起孵育后由單核細胞導(dǎo)致的平均熒光強度的倍數(shù)增加。綜上所述，所述 數(shù)據(jù)表明暴露至TCELNA?產(chǎn)品的單核細胞在體外經(jīng)歷了其調(diào)節(jié)性標志物H)-L1表達的 根本變化，該標志物也可表征產(chǎn)品的體內(nèi)作用機制。
[0051] 在測試異體抗原呈遞細胞中，配制和輻照的TCELNA?產(chǎn)品與異體應(yīng)答者PBMC 群體以1:1的比率合并。在24和72小時后，收集培養(yǎng)物并使用流式細胞術(shù)評估應(yīng)答者細胞群 體上的ro-Ll表達。圖4顯示了僅應(yīng)答者和應(yīng)答者+TCELNA?(+Tc)條件的ro-Ll表達百分 比。配對獨立樣品的Wilcox秩和檢驗證明在24和72小時(分別p〈0.004和p〈0.00002)單核細 胞上的PD-L1表達顯著上調(diào)，分別參見圖4A和圖4B。對B細胞和T細胞上PD-L1表達的類似分 析還顯示，在B細胞群體培養(yǎng)72小時后H)-L1表達顯著減少(p〈0.003)，但在任何一個時間點 T細胞未減少ro-Li。
[0052] 在輻照的TCELNA?產(chǎn)品孵育后約24小時分析由單核細胞進行的PD-L1XD95、 ?01丄086、1^6-3的細胞表面表達和11^-6、幾-4、11^-10、11^-23、11^-113、11^-27、11^-21和11^-22 的細胞因子表達。在所測試的標志物中，僅PD-L1表達由單核細胞顯著增加。在不存在 TCELNA?產(chǎn)品的情況下孵育24小時后，小于1%的單核細胞表達H)-L1。相比之下，在與 TCELNA?產(chǎn)品一起孵育24小時后，平均97.8%的單核細胞表達H)-L1 (n = 4)。
[0053] 實施例2:作為抗原呈遞細胞來源的細胞系
[0054] 將配制和輻照的TCF丄NA⑧產(chǎn)品的細胞與U937或THP-1細胞以1:1的比率合并。 在24和72小時后，收集培養(yǎng)物并使用流式細胞術(shù)評估U937或THP-1細胞上的H)-L1表達。預(yù) 期在與TCE〖LN A?產(chǎn)品一起孵育后，U937或THP-1細胞對PD-L1的表達增加。
[0055] 本文提及的所有專利和專利公布據(jù)此以引用的方式并入。
[0056] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀前述后將進行某些修改和改進。應(yīng)當(dāng)理解，為簡明和清 晰，所有此類修改和改進已從本文刪除，但適當(dāng)?shù)卦谝韵聶?quán)利要求的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種測定治療劑的致耐受性的方法，所述方法包括： a. 使所述治療劑體外接觸包含測試抗原呈遞細胞的試樣； b. 測量接觸所述治療劑的所述測試抗原呈遞細胞對包括PD-I配體的至少一個致耐受 性標志物的表達，其中所述測量步驟在所述接觸步驟后72小時內(nèi)進行；以及 c. 將所述測試抗原呈遞細胞對所述至少一個致耐受性標志物的表達與適當(dāng)?shù)膶φ毡?較； 其中與對照抗原呈遞細胞相比，所述測試抗原呈遞細胞對所述至少一個致耐受性標志 物的表達增加確定所述治療劑具有致耐受性。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測量步驟在所述接觸步驟后約24小時進行。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述治療劑包含T細胞，并且所述測試和對照抗原 呈遞細胞是所述T細胞自體的。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述治療劑包含T細胞，并且所述測試和對照抗原 呈遞細胞是所述T細胞異體的。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述T細胞對選自由過敏原和自體抗原組成的組的 抗原具有反應(yīng)性。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述T細胞對自體抗原具有反應(yīng)性。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述自體抗原選自由髓鞘蛋白、水通道蛋白或血小 板糖蛋白組成的組。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述髓鞘蛋白選自由髓鞘堿性蛋白、蛋白脂質(zhì)蛋白 和髓鞘少突膠質(zhì)細胞蛋白組成的組。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述PD-I配體是PD-Ll。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括單核細胞。11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括B細胞。12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括樹突狀細胞。13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測量步驟包括將所述測試和對照抗原呈遞細 胞與所述致耐受性標志物特異性抗體一起孵育，并且測量結(jié)合至所述測試和對照抗原呈遞 細胞的抗體的量。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述抗體用可檢測標記進行標記。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述抗體通過流式細胞術(shù)檢測。16. -種試劑盒，其用于測定包括抗體的治療標志物對致耐受性標志物和抗體對抗原 呈遞細胞標志物的致耐受性。
【文檔編號】C12Q1/68GK105960468SQ201580005416
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2015年1月23日
【發(fā)明人】D·西雷, L·W·克里森
【申請人】歐普薩治療股份有限公司