一種碳酸酯類光敏試劑及其制備方法、5`-光敏保護核苷的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種碳酸酯類光敏試劑及其制備方法、5'?光敏保護核苷的制備方法。碳酸酯類光敏試劑，其結(jié)構(gòu)式為：其中X為-OX’、咪唑基、取代咪唑基；5'-光敏保護核苷的制備方法步驟包括將2’-脫氧核苷與2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯類光敏試劑和三乙胺得5'-光敏保護核苷粗產(chǎn)物、粗產(chǎn)物提純得到5'-光敏保護核苷。本發(fā)明5'-光敏保護核苷制備方法選擇性平均提高了3.4倍，減化了提純過程，提高了產(chǎn)率，大大降低了生產(chǎn)成本，同時避免了使用劇毒的雙光氣。
【專利說明】
一種碳酸酯類光敏試劑及其制備方法、5光敏保護核苷的制 備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于有機合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種碳酸酯類光敏試劑及其制備方法、 5 光敏保護核苷的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因芯片技術(shù)是利用核酸分子雜交原理與微電子技術(shù)相結(jié)合而形成的一種高新 生物技術(shù)?？蓮V泛應(yīng)用于疾病診斷、藥物篩選、生物科學(xué)研究，農(nóng)作物的優(yōu)選優(yōu)育、司法鑒 定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境檢測等許多領(lǐng)域。由于原位光刻技術(shù)可制備高密度寡核苷酸基因芯 片，目前，以原位光刻技術(shù)為基礎(chǔ)的基因芯片被廣泛采用，5 光敏保護核苷及其衍生物5 ' -光敏亞磷酰胺單體是制備該類基因芯片的關(guān)鍵原料之一。但是，現(xiàn)有制備5'-光敏保護核苷 的方法(如下所示）中，
[0004]有二個共同的難題：（1)、在引入5'-光敏基團時，由于使用的是酰氯類光敏試劑， 反應(yīng)缺乏足夠的選擇性，特別是大規(guī)模反應(yīng)，酰氯類光敏試劑的選擇反應(yīng)條件較難控制，在 生成5'_光敏保護核苷（5'-Photolabile dN)的同時，有相當(dāng)量的副產(chǎn)物3'-光敏保護核苷 (3'_Photolabile dN)和3'，5'_雙光敏保護核苷（3'，5'_diPhotolabile dN)生成，根據(jù)堿 基不同，生成的主產(chǎn)物5'-光敏保護核苷與副產(chǎn)物(3'_光敏保護核苷和3'，5'_雙光敏保護 核苷等）的比例一般為5 :1 至2:1 (參考文獻：Sigrid Buhler，Irene Lago ja等，Helvetica Chimica Acta，2004，v87(3)，620-659)。由于3'-光敏保護核苷與5'-光敏保護核苷分離性 質(zhì)很相近，使分離5'-光敏保護核苷與3'-光敏保護核苷相當(dāng)困難。即使分離，由于兩者易 相互交叉，導(dǎo)致5光敏保護核苷產(chǎn)物損失較大，產(chǎn)率偏低。因此，尋找對伯（1°)醇和仲(2°) 醇具有高度選擇性的試劑，提高反應(yīng)的選擇性非常重要(參考文獻:Abbas-Alli G. Shaikh， Chem Review ,1996, v96,951-976) ; (2)、在制備酰氯類光敏試劑時必須使用雙光氣 (diphosgene)(參考文獻：Woffgang Pfleiderer&Heiner Giegrich，1998，美國專利， US5763599)，雙光氣毒性很大，操作起來很不方便，并且嚴重污染環(huán)境，在生產(chǎn)中應(yīng)盡可能 避免使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種碳酸酯類光敏試劑及其制備方法、5'-光敏 保護核苷的制備方法，本發(fā)明合成一種新的碳酸酯類光敏試劑，其與對伯（1°)醇和仲(2°) 醇具有高度反應(yīng)選擇性，將光敏基團選擇性引入核苷的5'-位，使得5'-光敏保護核苷的產(chǎn) 率大幅提尚。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 一種碳酸酯類光敏試劑，其結(jié)構(gòu)式為：
[0009] 其中X為-0X'、咪唑基、取代咪唑基，所述取代咪唑基為2-甲基咪唑基、1，2,4_三氮 P坐基;-0X'中X'為對硝基苯基(4-nitrophenyl)，五氟苯基(pentafluorophenyl) ,2-吡啶基 (2-pyridyl)，和琥泊酰亞胺基(succinimidyl)。
[0010] -種碳酸酯類光敏試劑的制備方法，步驟包括：
[0011] A、將2-鄰硝基苯-1-丙醇溶于有機溶劑中，加入碳酸二酯類試劑或羰基二唑類試 劑，再加入三乙胺，室溫下攪拌反應(yīng)6-10h;
[0012] B、將反應(yīng)后的溶液先后用水和飽和氯化鈉水溶液萃取，保留有機溶液層，有機溶 液用無水硫酸鈉干燥后，過濾，濾液蒸干，真空干燥，得2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯類光敏試 劑。
[0013] 所述步驟A中有機溶劑選自二氯甲烷，三氯甲烷，乙酸乙酯、甲苯中的一種；
[0014] 所述步驟A中2-鄰硝基苯-1-丙醇、碳酸二酯類試劑或羰基二唑類試劑、三乙胺在 有機溶劑中的濃度分別為 〇 ? 40-0 ? 65mol/L、0 ? 50-0 ? 75mol/L、0 ? 40-0 ? 65mol/L。
[0015] 所述步驟A碳酸二酯類試劑選自雙（對硝基苯)碳酸酯、雙（五氟苯)碳酸酯、碳酸 二-2-吡啶酯、N，N' -琥珀酰亞胺基碳酸酯中的一種;羰基二唑類試劑選自N ' N-羰基二咪唑、 N'N-羰基二(2-甲基咪唑），N'N-羰基二（1，2，4-三氮唑）中的一種；
[0016] 所述步驟A室溫溫度為10-3(TC。
[0017] -種5 光敏保護核苷的制備方法，步驟包括：
[0018] a、將干燥的2 脫氧核苷溶于無水吡啶和二氯甲烷的混合溶劑中，冷卻至-3°C-3 °C，依次加入2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯類光敏試劑和三乙胺，在室溫下攪拌反應(yīng)14_22h， 減壓蒸去反應(yīng)溶劑，得5'-(2_鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯)-2'_脫氧核苷粗產(chǎn)物，即5'-光敏保 護核苷粗產(chǎn)物；
[0019] b、將5'-光敏保護核苷粗產(chǎn)物用乙酸乙酯和碳酸氫鈉水溶液的混合液萃取，保留 乙酸乙酯層，乙酸乙酯層先后用水和飽和氯化鈉水溶液洗滌，然后乙酸乙酯層用無水硫酸 鈉干燥，過濾，濾液蒸干，將蒸干后的產(chǎn)物用硅膠柱層析提純，以二氯甲烷/甲醇為洗脫溶 劑，收集產(chǎn)物組分，濃縮得5'_(2_鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯)-2'_脫氧核苷即5'-光敏保護核 苷。
[0020]所述步驟a中2 脫氧核苷選自2 脫氧胸苷、2 脫氧尿苷，N-乙酰基-2 脫氧胞 苷、N-苯甲酰基-2'-脫氧腺苷、N-異丁?；?2'-脫氧鳥苷中的一種；
[0021]所述步驟a中2'-脫氧核苷、2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯類光敏試劑和三乙胺在無 水吡啶和二氯甲烷的混合溶劑中的濃度分別為0.25-0.35mol/L、0.29-0.39mol/L、0.26-0?36mol/L。
[0022] 所述步驟a中無水吡啶與二氯甲烷的體積比為4-6:1;
[0023] 所述步驟a中室溫溫度為10_30°C;
[0024]所述步驟b中乙酸乙酯和碳酸氫鈉水溶液體積比為1-2:1;碳酸氫鈉水溶液質(zhì)量百 分濃度為3-5 %;
[0025] 所述步驟b中洗脫溶劑中二氯甲烷與甲醇體積比為20-50:1。
[0026] 5'-光敏保護核苷的制備方法的反應(yīng)原理如下：
[0028] 在式中，BR為胸腺嘧啶（Thymine，簡稱T)、N4_乙酰胞嘧啶(N 4_Acetyl Cytosine,簡 稱Ac-C)，N6-苯甲?；汆堰?N6-Benzoyl-Adenine，簡稱Bz-A)，和N2-異丁?；B嘌呤(N 2-ibu-Guanine,簡稱ibu-G)等。由于5'-(2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯）中與鄰硝基苯相連的碳 原子具有手性，所得5'-光敏保護核苷產(chǎn)物應(yīng)為比例約為1:1的二個非對映異構(gòu)體的混合 物，在對產(chǎn)物1H HMR和HPLC分析中，可清晰地觀察到二個非對映異構(gòu)體的存在。
[0029]本發(fā)明使用對伯（1°)醇和仲(2°)醇具有高度反應(yīng)選擇性的碳酸酯類光敏試劑，選 擇性地與脫氧核苷或堿基保護的脫氧核苷中的伯（1°)醇5'-OH反應(yīng)，選擇性生成5'-光敏 保護核苷，將生成所需產(chǎn)物(5'_光敏保護核苷)與副產(chǎn)物(3'_光敏保護核苷和3'，5'_雙光 敏保護核苷)的比例從5:1至2:1(平均為3.5:1)提高到14:1至10:1(平均為12:1)，選擇性平 均提高了3.4倍，減化了提純過程，提高了產(chǎn)率，大大降低了生產(chǎn)成本，同時避免了使用劇毒 的雙光氣，為制備廣泛用于基因芯片技術(shù)的5'-光敏保護核苷及其衍生物提供了一種高效 實用的新工藝方法，具有很高的應(yīng)用價值。
【具體實施方式】
[0030] 實施例1:
[0031] 5'-NPP0C_dT(互)的制備
[0032] la.光敏試劑的制備反應(yīng)步驟：
[0034]室溫25°C，在反應(yīng)容器中，將2-鄰硝基苯-1-丙醇丄[2-(2-11；[1：1'(^1161171)口1'(^311-1-01，54.4g，0.30mol ]溶于二氯甲燒（544ml)中，加入雙（對硝基苯）碳酸酯蘭[1318(4-nitrophenyl) carbonate，0 ? 33mol ]，再加入三乙胺(0 ? 303mol);室溫攪拌反應(yīng)體系，6小時 后，HPLC表明反應(yīng)完全，停止反應(yīng)，反應(yīng)溶液先后用水(2x 300ml，表示用300ml水萃取后，再 用300ml水萃取一次，共萃取2次)和飽和氯化鈉水溶液(300ml)萃取，保留有機(二氯甲燒） 層，二氯甲烷層用無水硫酸鈉干燥后，過濾，濾液蒸干，真空干燥，得對硝基苯碳酸(2-鄰硝 基苯)_1_丙酯g，87.3g，HPLC純度為96%，產(chǎn)率為84%。
[0035] lb.選擇偶聯(lián)反應(yīng)步驟：
[0037] 將干燥的2'-脫氧胸苷！(Thymidine，0? 20mol)溶于無水吡啶（485ml)和二氯甲燒 (97ml)中，冷卻，在0°C先后依次加入硝基苯碳酸（2-鄰硝基苯)-1_丙酯}(0.224m〇l)和三 乙胺（0.204mol)，加畢，在室溫25°C攪拌反應(yīng)體系，14小時后，HPLC表明反應(yīng)完全，停止反 應(yīng)，減壓蒸去反應(yīng)溶劑，得5'-[對硝基苯碳酸(2-鄰硝基苯)-1_丙基碳酸酯]-2'-脫氧胸苷互 (5 ' -NPPOC-dT)反應(yīng)粗產(chǎn)物。此時，HPLC表明產(chǎn)物(5 ' -光敏保護核苷）與副產(chǎn)物(3 ' -光敏保 護核苷和3 '，5 雙光敏保護核苷)的比例為14:1。
[0038] lc、提純步驟：
[0039] 將上述5 ' -NPPOC-dT反應(yīng)粗產(chǎn)物用乙酸乙酯（500ml)和3 %碳酸氫鈉水溶液 (300ml)萃取，保留乙酸乙酯層，乙酸乙酯層先后用水(300ml)和飽和氯化鈉水溶液(300ml) 洗滌，然后乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液蒸干，得5 ' -NPPOC-dT粗產(chǎn)物。5 ' -NPP0C-dT粗產(chǎn)物用硅膠柱層析提純，以二氯甲烷/甲醇為洗脫溶劑，收集產(chǎn)物組分，濃縮得 5'-(2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯）-2'_脫氧胸苷5'-NPPOC-dT)，73.7g，HPLC純度為 98.3%，產(chǎn)率為82%。5 ' -(2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯）-2 ' -脫氧胸苷g5 ' -NPPOC-dT)的化 學(xué)結(jié)構(gòu)通過1H NMR和LC-MS(M+)證實。
[0040] 5 ' -(2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯）-2 ' -脫氧胸苷g(5 ' -NPPOC-dT): 4 NMR(CDC13， 4001抱）5化口111)8.65(8，順，非對映異構(gòu)體），8.63(8，順，非對映異構(gòu)體），7.76(111，1-厶廣11，11-NPP0C)，7 ? 57(t，1-Ar-H，H-NPP0C)，7 ? 40(m，2Ar-H，H-NPP0C)，7 ? 31 (s，H-6，非對映異構(gòu)體）， 7.28(8，11-6，非對映異構(gòu)體），6.33(^-1'，非對映異構(gòu)體），6.29(^-1'，非對映異構(gòu)體）， 4.31-3.87(m，6H，H-3'，H-4'，2H-5'，NPP0C的-CH2)，3.76(m，lH，NPP0(^9-CH)，2.61-2.58 (dd，lH，3'-OH),2.39-2.18(m，2H，H-2'），1.85,1.74(2s，3H，5-CH3)，l.38,1.35(2d，3H， NPP0C的-CH3); LC-MS: m/z f or (M+H) +，計算值C2QH24N3O9，450 ? 41 ?;實測值450 ? 4。
[0041 ] 實施例2:
[0042] 5'-NPP0C-N-Ac-dC(竺)的制備 [0043] 2a.光敏試劑的制備反應(yīng)步驟：
[0045]室溫20<€下，在反應(yīng)容器中，將2-鄰硝基苯-1-丙醇1[2-(2-11；[1：1'(^116117141'(^&11-1-01，0.30mol]溶于三氯甲燒（544ml)中，加入雙（五氟苯）碳酸酯蘭[Bis (pentaf luorophenyl )carbonateO ? 33mol ]，再加入三乙胺（0 ? 303mol)。室溫攪拌反應(yīng)體系， 9小時后，HPLC表明反應(yīng)完全，停止反應(yīng)，反應(yīng)溶液先后用水(2x 300ml)和飽和氯化鈉水溶 液(300ml)萃取，保留有機(三氯甲烷)層;三氯甲烷層用無水硫酸鈉干燥后，過濾，蒸干，真 空干燥，得五氟苯碳酸(2-鄰硝基苯)-1_丙酯^，95.1 8，即^：純度為97%，產(chǎn)率為81%。
[0046] 2b ?選擇偶聯(lián)反應(yīng)步驟：
[0048] 將干燥的N-乙酰基-2'-脫氧胞苷g(N-Ac-dC，0.20mol)溶于無水吡啶（540ml)和二 氯甲烷（108ml)中，冷卻，在0°C先后依次加入五氟苯碳酸（2-鄰硝基苯）-1_丙酯Z (0.224mol)和三乙胺(0.204mol)，加畢，在室溫20°C攪拌反應(yīng)體系，18小時后，HPLC表明反 應(yīng)完全，停止反應(yīng)，減壓蒸去反應(yīng)溶劑，得5 ' - (2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯)-N-乙?；?2 ' -脫氧胞苷&(5 ' -NPPOC-N-Ac-dC)反應(yīng)粗產(chǎn)物。此時，HPLC表明產(chǎn)物(5 ' -光敏保護核苷）與副 產(chǎn)物(3 光敏保護核苷和3 '，5 雙光敏保護核苷)的比例為12:1。
[0049] 2c.提純步驟：
[0050] 將上述5'-即?0(：-^4(3-(1(：反應(yīng)粗產(chǎn)物用乙酸乙酯（50〇1111)和和3%碳酸氫鈉水溶 液（300ml)萃取，保留乙酸乙酯層，乙酸乙酯層先后用水（300ml)和飽和氯化鈉水溶液 (300ml)洗滌，然后乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液蒸干，得5 ' -NPPOC-N-Ac-dC粗 產(chǎn)物。5 ' -NPPOC-N-Ac-dC粗產(chǎn)物用硅膠柱層析提純，以二氯甲烷/甲醇為洗脫溶液，收集產(chǎn) 物組分，濃縮得5 ' -(2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯）-N-乙?；?2 ' -脫氧胞苷^(5'-即?0(：，-Ac-dC)，75.3g，HPLC純度為98.1 %，產(chǎn)率為79 %。5 ' -(2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯)-N-乙酰 基-2' _脫氧胞苷&(5' -NPPOC-N-Ac-dC)的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過1H NMR和LC-MS(M+)證實。
[0051 ] 5 ' - (2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯）-N-乙?；?2 脫氧胞苷&(5 ' -NPPOC-N-Ac-dC) :咕 NMR(CDCl3,400MHz)S(ppm)8.92(br，乙?；?NH,非對映異構(gòu)體），8.89(br,乙?；?NH, 非對映異構(gòu)體），7.92((1，11-6，非對映異構(gòu)體），7.89((1，11-6，非對映異構(gòu)體），7.74(111，1-八廣 H，H-NPPOC)，7 ? 55(t，1 -Ar-H，H-NPPOC)，7 ? 38(m，2Ar-H，H-NPPOC)，7 ? 29(d，H-5，非對映異構(gòu) 體），7.26((1，11-5非對映異構(gòu)體），6.24(^-1'，非對映異構(gòu)體），6.19(^-1'，非對映異構(gòu) 體），4.32-3.89(m，6H，H-3'，H-4'，2H-5'，NPP0C的-CH2)，3.75(m，lH，NPP0(^9-CH)，2.62-2.59(dd，lH，3，-OH)，2.38-2.17(m，2H，H-2，），2.14,2.11(2s，3H，CH3C = 0)，l .40,1.37(2(1， 3H，NPPOC的-CH3); LC-MS:m/z for(M+H) +，計算值C21H25N4O9，477 ? 44 ?;實測值477 ? 5。
[0052] 實施例3:
[0053] 5'-NPP0C-N-Bz-dA(p)的制備 [0054] 3a.光敏試劑的制備反應(yīng)步驟：
[0056] 室溫25°C下，在反應(yīng)容器中，將2-鄰硝基苯-1-丙醇1[2-(2-11；[1：1'(^116117141'(^已11- 1-01，0 ? 30mol ]溶于乙酸乙酯（ 540ml )中，加入N 'N-羰基二咪唑1_^(1，1/-Carbonyldiimidazole，0 ? 33mol)，再加入三乙胺(0 ? 303mol)。室溫攪拌反應(yīng)體系，7小時后， HPLC表明反應(yīng)完全，停止反應(yīng)，反應(yīng)溶液先后用水(2x 300ml)和飽和氯化鈉水溶液(300ml) 萃取，保留有機（乙酸乙酯）層；乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥后，過濾，蒸干，真空干燥，得 N-咪唑碳酸(2-鄰硝基苯)-1 -丙酯U，69.4g，HPLC純度為96 %，產(chǎn)率為84 %。
[0057] 3b.選擇偶聯(lián)反應(yīng)步驟：
[0059] 將干燥的N-苯甲?；?2 ' -脫氧腺苷B(N-BZ-dA，71. lg，0.20mol)溶于無水吡啶 (710ml)和二氯甲烷（142ml)中，冷卻，在0°C先后依次加入N-咪唑碳酸（2-鄰硝基苯)-1_丙 酯U (0.224mol)和三乙胺(0.204mol)，加畢，在室溫25°C攪拌反應(yīng)體系，16小時后，HPLC表 明反應(yīng)完全，停止反應(yīng)，減壓蒸去反應(yīng)溶劑，得5 '-(2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯)-N-苯甲酰 基-2 ' -脫氧腺苷5 ' -NPPOC-N-Bz-dA)反應(yīng)粗產(chǎn)物。此時，HPLC表明產(chǎn)物(5 ' -光敏保護核 苷)與副產(chǎn)物(3 光敏保護核苷和3 '，5 雙光敏保護核苷)的比例為11:1。
[0060] 3c ?提純步驟：
[0061 ] 將上述5'-即?0(：-182-(^反應(yīng)粗產(chǎn)物用乙酸乙酯（60〇1111)和和3%碳酸氫鈉水溶 液（400ml)萃取，保留乙酸乙酯層，乙酸乙酯層先后用水（400ml)和飽和氯化鈉水溶液 (400ml)洗滌，然后乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液蒸干，得5 ' -NPPOC-N-Bz-dA粗 產(chǎn)物。5 ' -NPPOC-N-Bz-dA粗產(chǎn)物用硅膠柱層析提純，以二氯甲烷/甲醇為洗脫溶劑，收集產(chǎn) 物組分，濃縮得5 ' -(2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯)-N-苯甲酰基-2 ' -脫氧腺苷以(5'-即?0(：-N-Bz-dA)，90. lg，HPLC純度為98.2%，產(chǎn)率為80%。5 ' -(2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯)-N-苯 甲酰基-2' -脫氧腺苷巧(5' -NPPOC-N-Bz-dA)的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過1H NMR和LC-MS(M+)證實。 [0062] 5 ' -(2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯)-N-苯甲酰基-2 ' -脫氧腺苷以(5'-陬?0(：，-82- dA):咕 NMR(CDCl3,400MHz)S(ppm)9.29(br，苯甲?；?NH,非對映異構(gòu)體），9.25(br,苯甲 ?；?NH，非對映異構(gòu)體），8.61 (s，H-2，非對映異構(gòu)體），8.58(s，H-2，非對映異構(gòu)體），8.19 (s，H-8，非對映異構(gòu)體），8.16(s，H-8，非對映異構(gòu)體），7.86(m，2H，苯甲?；腁r-H)，7.75 (m，1-Ar-H，H-NPP0C)，7 ? 56(t，1-Ar-H，H-NPP0C)，7 ? 45-7 ? 44(m，3H，苯甲?；腁r-H)，7 ? 37 (m，2Ar-H，H-NPP0C)，6.35(t，H-r，非對映異構(gòu)體），6.31 (t，H-r，非對映異構(gòu)體），4.31_ 3?88(m，6H，H-3 '，H-4 '，2H-5 '，NPPOC的-CH2)，3?74(m，1H，NPPOC的-CH)，2?83-2?80(dd，1H， 3'-OH),2.39-2.17(m，2H，H-2'），1.41，1.38(2d，3H，NPP0C的-CH3);LC-MS:m/z for(M+H)+， 計算值 C27H27N6〇8，563 ? 53 ?;實測值563 ? 5。
[0063] 實施例4:
[0064] 5'-NPP0C_dT(互)的制備 [0065] 4a.光敏試劑的制備反應(yīng)步驟：
[0067] 室溫26°C下，在反應(yīng)容器中，將2-鄰硝基苯-1-丙醇丄[2-(2-11；[1：1'(^1161171)口1'(^已11-1-01，54 ? 4g，0 ? 30mol ]溶于二氯甲燒（540ml)中，加入碳酸二_2_吡啶酯 14(Di_2-pyridyl carbonate，0.33mol )，再加入三乙胺(0.303mol)。室溫攪拌反應(yīng)體系，10小時后，HPLC表明 反應(yīng)完全，停止反應(yīng)，反應(yīng)溶液先后用水(2x 300ml)和飽和氯化鈉水溶液(300ml)萃取，保 留有機(二氯甲烷)層;二氯甲烷層用無水硫酸鈉干燥后，過濾，蒸干，真空干燥，得(2-吡啶） 碳酸-2-鄰硝基苯-1-丙酯叢，74 ? 4g，HPLC純度為97 %，產(chǎn)率為82 %。
[0068] 4b.選擇偶聯(lián)反應(yīng)步驟：
[0070] 將干燥的N-異丁?；?2 ' -脫氧鳥苷遲(N-ibu-dG，0.20mol)溶于無水吡啶(670ml) 和二氯甲烷（134ml)中，冷卻，在0°C先后依次加入（2-吡啶）碳酸-2-鄰硝基苯-1-丙酯也 (0.224mol)和三乙胺(0.204mol)，加畢，在室溫26°C攪拌反應(yīng)體系，22小時后，HPLC表明反 應(yīng)完全，停止反應(yīng)，減壓蒸去反應(yīng)溶劑，得5'-(2_鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯)-N-異丁?；? 2 ' -脫氧鳥苷5 ' -NPPOC-N-ibu-dG)反應(yīng)粗產(chǎn)物。此時，HPLC表明產(chǎn)物(5 ' -光敏保護核苷） 與副產(chǎn)物(3 光敏保護核苷和3 '，5 雙光敏保護核苷)的比例為10:1。
[0071] 4c ?提純步驟：
[0072] 將上述5 ' -NPPOC-N-ibu-dG反應(yīng)粗產(chǎn)物用乙酸乙酯(600ml)和和3 %碳酸氫鈉水溶 液（400ml)萃取，保留乙酸乙酯層，乙酸乙酯層先后用水（400ml)和飽和氯化鈉水溶液 (400ml)洗滌，然后乙酸乙酯層用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液蒸干，得5 ' -NPPOC-N-ibu-dG 粗產(chǎn)物。5 ' -NPPOC-N-ibu-dG粗產(chǎn)物用硅膠柱層析提純，以二氯甲烷/甲醇為洗脫溶劑，收集 產(chǎn)物組分，濃縮得5'-(2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯）-.異丁?；?2'-脫氧鳥苷1^(5'_ NPPOC-N-ibu-dG)，82.8g，HPLC純度為98.0%，產(chǎn)率為76%。5 ' -(2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸 酯)4-異丁?；?2'-脫氧鳥苷立(5'-即?0(：4-讓11-(16)的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過 111匪1?和^：-]^(]\〇 證實。
[0073] 5 ' -(2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸酯)-N-異丁?；?2 ' -脫氧鳥苷立(5 ' -NPP0C-N-ibu- dG): NMR(CDCl3,400MHz)S(ppm)10.25(s，鳥嘌呤-NH,非對映異構(gòu)體），10.21(s,鳥嘌呤- NH,非對映異構(gòu)體），9.28(br,異丁酰基-NH,非對映異構(gòu)體），9.24(br,異丁酰基-NH,非對 映異構(gòu)體），7.97(8，11-8，非對映異構(gòu)體），7.94(8，11-8，非對映異構(gòu)體），7.74(111，14^11-NPP0C)，7.57(t，l-Ar-H，H-NPP0C)，7.38(m，2Ar-H，H-NPP0C)，6.19(t，H-l'，非對映異構(gòu) 體），6.16(t，H-l'，非對映異構(gòu)體），4.33-3.90(m，6H，H-3'，H-4'，2H-5'，NPP0C的-CH2)， 3.73(111，111，陬？0(：的-〇1)，2.77-2.74(111，111，異丁酰基的-〇〇,2.61-2.58((1(1，111，3'-〇1〇， 2.39-2.17(m，2H，H-2'），1.42，1.39(2d，3H，NPP0C的-CH3)，1.21，1.18(dd，6H,異丁?；?CH3); LC-MS :m/z for(M+H) +,計算值C24H29N6O9，545 ? 51,實測值545 ? 5。
【主權(quán)項】
1. 一種5 光敏保護核巧的制備方法，步驟包括： a、 將干燥的2'-脫氧核巧溶于無水化晚和二氯甲燒的混合溶劑中，冷卻至-3°C-3°C，依 次加入2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸醋類光敏試劑和Ξ乙胺，在室溫下攬拌反應(yīng)14-2化，減壓蒸 去反應(yīng)溶劑，得5 '-(2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸醋)-2 ' -脫氧核巧粗產(chǎn)物，即5 ' -光敏保護核巧 粗產(chǎn)物； b、 將5'-光敏保護核巧粗產(chǎn)物用乙酸乙醋和碳酸氨鋼水溶液萃取，保留乙酸乙醋層，乙 酸乙醋層先后用水和飽和氯化鋼水溶液洗涂，然后乙酸乙醋層用無水硫酸鋼干燥，過濾，濾 液蒸干，將蒸干后的產(chǎn)物用硅膠柱層析提純，W二氯甲燒/甲醇為洗脫溶劑，收集產(chǎn)物組分， 濃縮得5 ' -(2-鄰硝基苯-1 -丙基碳酸醋)-2 ' -脫氧核巧即5 ' -光敏保護核巧。2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述步驟a中2'-脫氧核巧選自2'-脫氧 胸巧、2'-脫氧尿巧，N-乙酷基-2'-脫氧胞巧、N-苯甲酯基-2'-脫氧腺巧、N-異下酷基-2'-脫 氧鳥巧中的一種。3. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述步驟a中2'-脫氧核巧、2-鄰硝基苯- 1-丙基碳酸醋類光敏試劑和Ξ乙胺在無水化晚和二氯甲燒的混合溶劑中的濃度分別為 0.25-0.35mol/L、0.29-0.39mol/L、0.26-0.36mol/L。4. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述步驟a中無水化晚與二氯甲燒的體 積比為4-6:1。5. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述步驟b中乙酸乙醋和碳酸氨鋼水溶 液體積比為1-2:1;碳酸氨鋼水溶液質(zhì)量百分濃度為3-5%;洗脫溶劑中二氯甲燒與甲醇體 積比為20-50:1。6. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸醋類光敏 試劑的結(jié)構(gòu)式為：其中X為-OX'、咪挫基、取代咪挫基;-OX'中X'為對硝基苯基、五氣苯基、2-化晚基、和班 巧酷亞胺基。7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于： 所述2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸醋類光敏試劑的制備步驟包括： A、 將2-鄰硝基苯-1-丙醇溶于有機溶劑中，加入碳酸二醋類試劑或幾基二挫類試劑，再 加入Ξ乙胺，室溫下攬拌反應(yīng)6-lOh; B、 將反應(yīng)后的溶液先后用水和飽和氯化鋼水溶液萃取，保留有機溶液層，有機溶液用 無水硫酸鋼干燥后，過濾，濾液蒸干，真空干燥，得2-鄰硝基苯-1-丙基碳酸醋類光敏試劑。8. 如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于:所述步驟A中有機溶劑選自二氯甲燒，Ξ 氯甲燒，乙酸乙醋或甲苯中的一種。9. 如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于:所述步驟A中2-鄰硝基苯-1-丙醇、碳酸 二醋類試劑或幾基二挫類試劑、Ξ乙胺在有機溶劑中的濃度分別為0.40-0.65111〇1/1、0.50- 0.75mol/L、0.4〇-〇.65mol/L。10.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于:所述步驟A碳酸二醋類試劑選自雙(對 硝基苯)碳酸醋、雙(五氣苯)碳酸醋、碳酸二-2-化晚醋、N，N'-班巧酷亞胺基碳酸醋中的一 種;幾基二挫類試劑選自N'N-幾基二咪挫、N' N-幾基二(2-甲基咪挫），N' N-幾基二（1，2，4- Ξ氮挫）中的一種。
【文檔編號】C07C205/43GK105968016SQ201610325613
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2015年2月12日
【發(fā)明人】石平, 林金來
【申請人】石平, 林金來