纈氨霉素b及制備和醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供一種具有抗膠質(zhì)瘤活性的化合物纈氨霉素B，提供從海泥中分離培養(yǎng)到活性物質(zhì)產(chǎn)生菌小鏈霉菌,并從中制備獲得活性物質(zhì)纈氨霉素B。所述的小鏈霉菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，分類命名為小鏈霉菌P11?23B，(Streptomyces parvulus P11?23B)保藏編號(hào)CCTCC NO：M 2015675，保藏日2015.11.12。纈氨霉素B具有顯著抑制多種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、明顯阻滯膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期于G0/G1期、降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞不同代謝途徑的多個(gè)關(guān)鍵酶的蛋白水平表達(dá)，具有獨(dú)特的抗腫瘤作用。因此，纈氨霉素B可在制備治療腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。纈氨霉素B化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：CCTCC NO：M 201567520151112
【專利說明】
繳氨霉素 B及制備和醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及從海洋放線菌小鏈霉菌（Streptomyces parvulus P11-23B)中制備抗腫瘤活性化合物纈氨霉素B(Valinomycin B)的方法及該化合物在制備治療 腦膠質(zhì)瘤藥物方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦膠質(zhì)瘤是腦顱內(nèi)最常見和最惡性的腦腫瘤，占所有惡性腦腫瘤的70%。世界衛(wèi) 生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明：惡性膠質(zhì)瘤是34歲以下腫瘤患者的第2位死亡原因，是35~54歲患者 的第3位死亡原因，嚴(yán)重危害人類的健康及生命。膠質(zhì)瘤由于所處的位置特殊，手術(shù)難度大 而且不容易將腫瘤全部切除，所以放療和藥物對(duì)膠質(zhì)瘤的治療尤為重要。可是，目前抗膠質(zhì) 瘤藥物嚴(yán)重缺乏，替莫唑胺是唯一可選擇的單獨(dú)用于膠質(zhì)瘤治療的藥物。而且，包括替莫唑 胺在內(nèi)的現(xiàn)有治療膠質(zhì)瘤藥物的療效有限，多有嚴(yán)重不足，突出表現(xiàn)為：（1)多為化學(xué)品，毒 副作用大；（2)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的嚴(yán)重耐藥性；（3)血腦屏障阻礙了藥物到達(dá)腦內(nèi)發(fā)揮其療 效。因此，臨床上需要克服以上缺陷，療效更好、安全性更高和作用機(jī)制獨(dú)特的新型抗膠質(zhì) 瘤藥物。
[0003] 大量研究證明：過度的糖酵解（Glycolysis )、旺盛的谷氨酰胺分解 (Glutaminolysis)和脂類合成(Lipogenesis)是膠質(zhì)瘤細(xì)胞代謝不同于正常細(xì)胞代謝的突 出特征。膠質(zhì)瘤細(xì)胞從微環(huán)境中攝取大量葡萄糖在糖酵解環(huán)節(jié)由膠質(zhì)瘤細(xì)胞特異依賴而高 表達(dá)的多個(gè)關(guān)鍵酶包括己糖激酶2(HK2)、磷酸果糖激酶/果糖2，6_二磷酸酶(PFKFB3)、丙酮 酸激酶M2(PKM2)和乳酸脫氫酶5(LDH5)等共同參與產(chǎn)生大量中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物乳酸，這些 中間產(chǎn)物是腫瘤細(xì)胞合成生物大分子的起始原料，而乳酸分泌至細(xì)胞外可抑制機(jī)體免疫細(xì) 胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除能力，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，高表達(dá)的糖酵解關(guān)鍵酶M2還可提高腫瘤 細(xì)胞對(duì)放療和替莫唑胺化療的抗性。同時(shí)，谷氨酰胺酶(GLS)主導(dǎo)的旺盛的谷氨酰胺分解， 為生物分子的合成提供大量的氮源，而高表達(dá)的脂肪酸合成酶(FASN)主導(dǎo)的活躍的脂類合 成有利于細(xì)胞膜的生成。不難理解，正是腫瘤細(xì)胞高度利用其代謝中間產(chǎn)物合成生物大分 子DNA、RNA、蛋白質(zhì)和生物膜的能力促使其快速無限制地增殖，調(diào)控腫瘤代謝不同環(huán)節(jié)的關(guān) 鍵酶可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。因此，靶向膠質(zhì)瘤代謝不同環(huán)節(jié)關(guān)鍵酶的多靶點(diǎn)作用的 藥物可能具有更好的抗腫瘤療效。纈氨霉素B(Valinomycin B)是從海洋細(xì)菌小鏈霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)中分離得到的新化合物，該化合物對(duì)多種不同膠質(zhì) 瘤細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，可明顯降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖酵解、谷氨酰胺分解和脂類 合成途徑中數(shù)個(gè)關(guān)鍵酶的蛋白表達(dá)水平，具有獨(dú)特的抗腫瘤作用機(jī)制，因此，纈氨霉素B在 制備抗膠質(zhì)瘤藥物方面具有良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種具有抗膠質(zhì)瘤活性的化合物纈氨霉素 B (Valinomycin B，化合物1)，所述的繳氨霉素B為一新化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供結(jié)|氨霉素 B(Valinomycin B)的制備方法，通過以下步 驟實(shí)現(xiàn)：
[0007] (1)小鏈霉菌Streptomyces parvulus P11-23B發(fā)酵菌液的制備
[0008] 取鏈霉菌Streptomyces parvulus P11-23B的菌落接種到含有一定量的液體菌種 培養(yǎng)基的大三角燒瓶中，將含有P11-23B菌種的培養(yǎng)液在室溫條件下振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間后 以制備菌種液。最后將菌種液轉(zhuǎn)入含有一定量的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的大三角燒瓶，在室溫條 件下振蕩發(fā)酵培養(yǎng)一定時(shí)間后，得到具有抗腫瘤活性的P11-23B的發(fā)酵菌液。
[0009] 所述的液體菌種培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基均為液體高氏培養(yǎng)基；所述的用量為 100-200mL;所述的大三角培養(yǎng)瓶為250或500mL;所述的室溫培養(yǎng)溫度為20~30°C;所述振 蕩的轉(zhuǎn)速為160-180rpm;所述的培養(yǎng)時(shí)間為5~15天。
[0010] ⑵結(jié)|氨霉素B(Valinomycin B)的提取分離純化
[0011]菌株P(guān)11-23B的發(fā)酵菌液用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物 用十八烷基硅烷鍵合硅膠(0DS)柱層析分離，分別用70%和100%的甲醇洗脫，100%的甲醇 洗脫液合并后經(jīng)減壓濃縮得到的殘留物用HPLC分離，得到純化合物纈氨霉素B (Valinomycin B)〇
[0012]所述柱層析的0DS用量與上量的樣品量比例是40~60g:1.0g;所述的高效液相分 離條件是：Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent 1260DAD檢測器，Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（250 \9.4111111，5_)，100%甲醇為流動(dòng)相，柱溫26°(：，檢測波長21011111，流速為 1?0mL/min 〇
[0013] (3)繳氨霉素 B(Valinomycin B)的結(jié)構(gòu)鑒定
[0014] 纈氨霉素B(Valinomycin B)的結(jié)構(gòu)是根據(jù)它們的一維和二維的NMR光譜、高分辨 質(zhì)譜數(shù)據(jù)、以及化學(xué)降解等方法來鑒定的。
[0015]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種小鏈霉菌P11-23B，所述的菌株保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，分類命名為小鏈霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)，保藏 編號(hào)CCTCC N0:M 2015675,保藏日2015.11.12,保藏地址：中國武漢。
[0016] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述的小鏈霉菌P11-23B的制備方法，是一種從海泥 中分離具有抗膠質(zhì)瘤活性的菌株P(guān)11-23B的方法，通過以下步驟分離培養(yǎng)而獲得：
[0017] (1)小鏈霉菌（Streptomyces parvulus P11-23B)的分離培養(yǎng)
[0018] 取空氣干燥的海泥用海水稀釋成一定的濃度，取一定量的樣品稀釋液均勻分散到 含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在室溫條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后，將不同的菌落分別轉(zhuǎn)移到另 一含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在室溫條件下繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間。最后將生長良好的單一 菌落(PI 1-23B)接種到斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后置4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0019] 所述的海泥和海水是從浙江舟山東海海域中獲得;所述樣品稀釋液的濃度為IX 1(T6~1 X l(T4g/mL;所述的樣品稀釋液的取樣量為100~300yL;所述培養(yǎng)皿所含的固體培 養(yǎng)基為高氏瓊脂(GausV s agar)培養(yǎng)基或其它固體培養(yǎng)基;所述的斜面培養(yǎng)基為高氏瓊脂 培養(yǎng)基或其它固體斜面培養(yǎng)基;所述的室溫培養(yǎng)溫度為20~30°C ;所述的培養(yǎng)時(shí)間為7~15 天。
[0020] (2)小鏈霉菌（Streptomyces parvulus P11-23B)的菌種鑒定
[0021]上述步驟(1)分離培養(yǎng)所獲得的菌株用目前實(shí)驗(yàn)室普遍使用的16S rDNA序列分析 方法鑒定菌株P(guān)11-23B的種類，確定為小鏈霉菌，分類命名為Streptomyces parvulus P11-23B，已被中國典型培養(yǎng)物保藏中心-武漢中心保藏，保藏編號(hào)CCTCC NO:M 2015675。
[0022] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供纈氨霉素B在制備治療腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。所述 的纈氨霉素 B可顯著抑制多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，阻滯膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期于G0/G1期，降低膠 質(zhì)瘤細(xì)胞糖酵解、谷氨酰胺分解和脂類合成途徑中多個(gè)關(guān)鍵酶的蛋白水平表達(dá)，具有獨(dú)特 的腫瘤作用機(jī)制。
[0023] 所述藥物為纈氨霉素 B活性成分單獨(dú)，或纈氨霉素 B與其它藥物或與有效成分一 起，與藥學(xué)上可接受的載體組成的藥物。所述藥物的制劑形式為:液體制劑、固體制劑、膠囊 制劑、緩釋制劑、納米制劑。
[0024] 本發(fā)明從海泥中分離培養(yǎng)到活性物質(zhì)產(chǎn)生菌小鏈霉菌Streptomyces parvulus P11-23B，并從中發(fā)現(xiàn)了新的活性物質(zhì)纈氨霉素B(Valinomycin B)。纈氨霉素B顯著抑制多 種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，明顯阻滯膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期于Go/GjA，降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞不同代謝途徑 的多個(gè)關(guān)鍵酶的蛋白水平表達(dá)，具有獨(dú)特的抗腫瘤作用機(jī)制。因此，纈氨霉素B在制備治療 腦膠質(zhì)瘤藥物方面具有應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0025] 圖 1 是小鏈霉菌Streptomyces parvulus P11-23B的菌落圖。
[0026] 圖2-6是纈氨霉素 B(Valinomycin B)的氫譜。
[0027] 圖7-11是纈氨霉素 B(Valinomycin B)的碳譜。
[0028] 圖 12是纈氨霉素 B(Valinomycin B)的1HJH COSY譜。
[0029] 圖 13-16是纈氨霉素 B(Valinomycin B)的HSQC譜。
[0030]圖 17-23是纈氨霉素 B(Valinomycin B)的HMBC譜。
[0031]圖24是纈氨霉素B(Valinomycin B)的高分辨質(zhì)譜。
[0032]圖25是纈氨霉素B(Valinomycin B)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。
[0033] 圖26是纈氨霉素 B(Valinomycin B)阻滯膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞周期于G0/G1期。
[0034]圖27是纈氨霉素 B(Valinomycin B)阻滯膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞周期于G0/G1期。
[0035]圖28是纈氨霉素B(Valinomycin B)降低膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞不同代謝途徑關(guān)鍵酶 的蛋白表達(dá)水平(CON: U87-MG細(xì)胞對(duì)照組；1:纈氨霉素B處理組;DMS0:二甲基亞砜溶劑對(duì)照 組;HK2:己糖激酶:PFKFB3:磷酸果糖激酶/果糖2，6-二磷酸酶;PKM2:丙酮酸激酶M2;GLS:谷 氨酰胺酶;FASN:脂肪酸合成酶;0-ACTIN: 肌動(dòng)蛋白，內(nèi)部參照）。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。但是，本發(fā)明不限于這些實(shí) 施例。
[0037] 實(shí)施例 1 ?小鏈霉菌Pll_23B(Streptomyces parvulus P11-23B)的分離培養(yǎng)
[0038] 取空氣干燥的海泥1克用海水稀釋成濃度為1 X l(T6g/mL的樣品稀釋液，取200yL的 樣品稀釋液均勻分散到含有高氏瓊脂(Gause's agar)固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在28°C條件 下培養(yǎng)7天后，將不同的菌落分別轉(zhuǎn)移到另一含有高氏瓊脂固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在28°C 條件下繼續(xù)培養(yǎng)7天。最后將生長良好的單一菌落(P11-23B)接種到高氏瓊脂斜面培養(yǎng)基培 養(yǎng)后置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0039]實(shí)施例2 ?小鏈霉菌Pll_23B(Streptomyces parvulus P11-23B)的菌種鑒定 [0040]使用16S rDNA序列分析方法鑒定所獲得菌株P(guān)11-23B的種類。
[0041] 2.1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器
[0042] PCR試劑：EX Taq酶（TaKaRa)，dNTP(TaKaRa)，引物（Invitrogen合成），引物序列 是：TACGGYTACCTTGTTACGACTT和AGAGTTTGATCMTGGCTCAG;
[0043] Marker：DL500
[0044] 實(shí)驗(yàn)儀器:離心機(jī)，電泳儀，PCR儀，ABI 3730XL測序儀。
[0045] 2.2實(shí)驗(yàn)步驟
[0046] 細(xì)菌基因組DNA抽提；
[0047]電泳檢測
[0048] PCR 擴(kuò)增
[0049] a.PCR反應(yīng)體系 K)xEx Taq buffe 2.0jj,l 2.5mM dNTP Mix 1,6(.il 5p Primer 1 0.8pl 5p Primer 2 0,8jil
[0050] Tcmplalc 0.5,ul 5u Ex Taq 0.2j.il ddH.Q_M.lul Total volume 20,0卜il
[0051 ] b. PCR反應(yīng)條件 95'C 5min 95 CJ 30s ^
[0052] 55"C 30s L 24cycles 72 C lmin J 72 C lOmin
[0053] l〇°C^，
[0054] c ?電泳檢測，
[0055] d.測序:切膠純化測序，
[0056] e.分析結(jié)果:拼接序列。
[0057] 2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0058]拼接后的序列為：
[0060] 以上獲得的16S rDNA序列與美國NIH的NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫比較，其結(jié)果表明：菌 株P(guān)11-23B的 16S rDNA序列與GenBank庫中的Streptomyces parvulus strain PFS10的 16S rDNA序列有99%的相似性(登錄號(hào):KJ789323.1)。因此，本發(fā)明所獲得的海洋菌株P(guān)11-23B 定為小鏈霉菌PI 1_23B(Streptomyces parvulus P11-23B)(附圖 1)。小鏈霉菌PI 1-23B (Streptomyces parvulus P11-23B)菌株已被中國典型培養(yǎng)物保藏中心-武漢中心保藏，保 藏編號(hào)CCTCC N0:M 2015675。
[0061 ]實(shí)施例3?小鏈霉菌Pll_23B(Streptomyces parvulus P11-23B)發(fā)酵菌液的制備
[0062] 取鏈霉菌Streptomyces parvulus P11-23B的菌落接種到含有200mL液體高氏培 養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中，將含有P11-23B菌種的培養(yǎng)液在28°C條件下旋轉(zhuǎn)（180rpm)振搖培 養(yǎng)7天后得到菌種液。將5mL菌種液轉(zhuǎn)入含有200mL液體高氏培養(yǎng)基的500mL三角燒瓶中，在 28°C條件下旋轉(zhuǎn)(180rpm)振搖培養(yǎng)7天，得到具有抗腫瘤活性的P11-23B的發(fā)酵菌液。
[0063] 實(shí)施例4.纈氨霉素 B(Valinomycin B)的提取分離純化
[0064]取實(shí)施例3獲得的發(fā)酵菌液(50.0升）用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物(7.56 克），乙酸乙酯萃取物用十八烷基硅烷鍵合硅膠(0DS，500克)柱層析分離，分別用2000mL的 70%和100%的甲醇洗脫，100%的甲醇洗脫液合并后經(jīng)減壓濃縮得到的殘留物（1.38克）用 HPLC分離（儀器:Agilent 1260;層析柱:Agilent Zorbax SB_Ci8,250X9.4mm，5iim;流動(dòng)相： 100 %甲醇；柱溫：26 °C ;檢測波長：21 Onm;流速：1. OmL/min)，得到纈氨霉素B (156mg，tR 18?34min)〇
[0065]纈氨霉素B為無色粉末;分子式C53H88N6〇18; [a]D25+36 ? 8 ? 7(c 0 ? 36，MeOH); IR(KBr) 2967，2936,2873,1743,1655,1193,1094,1027mm;高分辨質(zhì)譜（HRESIMS)為m/z[M-H] - 1095.6051 (計(jì)算值C53H87N6〇181095.6077)。經(jīng)手性氨基酸柱和氣相色譜分析，并與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì) 照，纈氨霉素B的酸水解產(chǎn)物鑒定為D-纈氨酸(D-Val)、L-纈氨酸(L-Val)、L-乳酸(L-Lac)、 D-a-羥基異戊酸(D-Hiv)、D-a-羥基丁酸(D-Hbu)。
[0066] 根據(jù)纈氨霉素B的1H譜（附圖2-6)、13C譜（附圖7-11)、咕-咕COSY譜（附圖12)、HSQC 譜（附圖13_16)、HMBC譜（附圖17-23)、高分辨質(zhì)譜圖（附圖24)和化學(xué)降解，纈氨霉素B的結(jié) 構(gòu)鑒定為新化合物，其13C和1H NMR信號(hào)歸屬見表一。
[0068] 表一、繳氨霉素B的碳和氫信號(hào)歸屬（in⑶Ch)
[0070]
[0071] 實(shí)施例5.纈氨霉素 B的活性研究
[0072] 5.1.纈氨霉素 B抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用
[0073] 大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞和人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞用DMEM和10%FBS培養(yǎng)基在37°C和 5%二氧化碳的孵化箱中培養(yǎng)，而人腦膠質(zhì)瘤U87-MG和SHG-44細(xì)胞分別用MEM培養(yǎng)基和 RPMI-1640培養(yǎng)基在37°C和5%二氧化碳的孵化箱中培養(yǎng)，經(jīng)過三代培養(yǎng)的細(xì)胞用于本發(fā)明 的實(shí)驗(yàn)研究。
[0074]用磺酰羅丹明B(SRB)法測定腫瘤細(xì)胞存活率，阿霉素(Doxorubicin)用于陽性藥 對(duì)照。細(xì)胞接種于96孔板中，貼壁24h后加入不同濃度的纈氨霉素B。藥物處理72h后用SRB染 色，用酶標(biāo)儀測定515nm處的吸收光度值，檢測腫瘤細(xì)胞的存活率，計(jì)算纈氨霉素B抑制膠質(zhì) 瘤細(xì)胞增殖的IC 5Q值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：纈氨霉素B顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，其IC5Q值分別 為0.25-0.41yM(表二，附圖25)。
[0075]表二、纈氨霉素 B抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用（IC5Q:iiM)
[0077] 5.2.纈氨霉素B阻滯膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期于Go/^期
[0078]用碘化丙啶(PI)DNA染色后，流式細(xì)胞儀分析纈氨霉素B對(duì)膠質(zhì)瘤U87-MG和U251細(xì) 胞生長周期的影響。將膠質(zhì)瘤U87-MG和U251細(xì)胞分別用纈氨霉素 B(0.8yM)處理12h、24h、 48h、或和72h后，收集細(xì)胞并與冰凍的70%乙醇混合后在4°C條件下過夜。過夜后的混合液 經(jīng)離心（1900rpm，7分鐘）分離得到的細(xì)胞用PBS洗滌兩次。細(xì)胞重新分散在含有RNase A的 PBS中，在37°C孵化30分鐘，最后用碘化丙啶(PI)在4°C黑暗處染色30分鐘。用FACScan流式 細(xì)胞儀分析纈氨霉素 B對(duì)U87-MG和U251細(xì)胞周期的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：（1)與對(duì)照組比較， 纈氨霉素 B(0.8yM)處理膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞12h、24h和48h后，細(xì)胞周期的Go/Gi期細(xì)胞比例分 別增加了40.92% ,32.54%和31.30% (表三，附圖26)。
[0079]表三、纈氨霉素B對(duì)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞周期的影響
[0081 ] (2)與對(duì)照組比較，纈氨霉素B(0.8yM)處理膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞12h、24h、48h和72h 后，細(xì)胞周期的G〇/G^細(xì)胞比例分別增加了40.92% ,32.54%和31.30% (表四，附圖27)。 [0082]表四、纈氨霉素B對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞周期的影響
[0084] 以上結(jié)果說明，纈氨霉素邱且滯于膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期于Go/Gi期。
[0085] 5.3.纈氨霉素B對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞不同代謝途徑關(guān)鍵酶的影響
[0086] 蛋白樣品的制備：人膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞用MEM和10%FBS培養(yǎng)基在37°C和5%二氧 化碳的孵化箱中培養(yǎng)，經(jīng)過三代培養(yǎng)的細(xì)胞用于本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞（1.5X107)接種 于10厘米的培養(yǎng)皿中，貼壁24h后加入纈氨霉素B(5.0yM或lO.OyM)共培養(yǎng)48小時(shí)后，先用冰 冷的ros緩沖液洗兩次，后冰冷的裂解緩沖液(200yL)裂解15分鐘。裂解液經(jīng)4°C低溫高速 (11200rpm)離心，上清液為蛋白樣品。
[0087]蛋白含量的測定:使用BCA試劑盒測定各個(gè)蛋白樣品的蛋白含量。將試劑盒中試劑 A和B以50:1比例配成工作試劑液，用牛血清白蛋白（BSA)將標(biāo)準(zhǔn)品BCA稀釋配成不同濃度的 BCA標(biāo)準(zhǔn)溶液。取10yL標(biāo)準(zhǔn)溶液或蛋白樣品液和200yL工作試劑液混勻后在37 °C孵化30分 鐘.孵化液用酶標(biāo)儀在562nm波長測定吸收度。以BCA量為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線，計(jì)算回歸方程。從回歸方程計(jì)算各蛋白樣品液的蛋白含量。
[0088] Western Blotting:含等量蛋白（15yg)的各樣品用10%十二烷基磺酸鈉聚丙稀酰 胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分離，將凝膠電泳蛋白圖譜轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上，PVDF膜用 還有5%去脂牛奶的0.1%了83!'在室溫下封閉2小時(shí)。封閉后的？￥0?膜先與服2、？？狀83、 PKM2、FASN和GLS酶的一抗在4°C孵育過夜，用TBST洗膜;后與HRP標(biāo)記的二抗在室溫孵育2小 時(shí)。TBST洗膜三次后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑檢測免疫反應(yīng)性，然后顯影，水洗，定影，水洗，晾 干，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以肌動(dòng)蛋白⑴-ACTIN)作為內(nèi)參對(duì)照。
[0089]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與陰性對(duì)照組（沒有藥物處理的U87-MG細(xì)胞）比較，纈氨霉素B (10.0 yM)顯著降低腫瘤細(xì)胞不同代謝途徑的關(guān)鍵酶HK2，PFKFB3，F(xiàn)ASN和GLS的蛋白水平表 達(dá)(附圖28)。這個(gè)結(jié)果提示，纈氨霉素B可能通過影響膠質(zhì)瘤糖酵解、谷氨酰胺分解和脂類 合成的關(guān)鍵酶而產(chǎn)生其抗腫瘤活性，具有獨(dú)特的多靶點(diǎn)抗腫瘤作用機(jī)制。
[0090]綜上所述，本發(fā)明證明纈氨霉素 B顯著抑制多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，阻滯腫瘤細(xì)胞 周期于Go/GjA，顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞不同代謝過程中多個(gè)關(guān)鍵酶的蛋白水平表達(dá)，具有獨(dú) 特的抗腫瘤作用機(jī)制，所以，由纈氨霉素B制備的相關(guān)藥物在治療腦膠質(zhì)瘤方面具有應(yīng)用前 景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗膠質(zhì)瘤活性物質(zhì)鄉(xiāng)氨霉素 B(Valinomycin B)，其特征在于，具有w下化學(xué)結(jié) 構(gòu)式：2. -種小鏈霉菌P11-23B，其特征在于，所述的小鏈霉菌菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保 藏中屯、，分類命名為小鏈霉菌Pll-23B(Str邱tomyces parvulus P11-23B)，保藏編號(hào)CCTCC NO: Μ 2015675，保藏日2015.11.12，保藏地址：中國武漢。3. 權(quán)利要求1所述的抗膠質(zhì)瘤活性物質(zhì)鄉(xiāng)氨霉素 Β的制備方法，其特征在于，通過W下 步驟實(shí)現(xiàn)： (1) 小鏈霉菌Pll-23B(St;r邱tomyces parvulus Ρ11-23Β)發(fā)酵菌液的制備： 取小鏈霉菌P11-23B的菌落接種到含有一定量的液體菌種培養(yǎng)基的大Ξ角燒瓶中，將 含有P11-23B菌種的培養(yǎng)液在室溫條件下振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間后W制備菌種液，最后將菌種 液轉(zhuǎn)入含有一定量的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的大Ξ角燒瓶，在室溫條件下振蕩發(fā)酵培養(yǎng)一定時(shí)間 后，得到具有抗腫瘤活性的P11-23B的發(fā)酵菌液； 所述的液體菌種培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基均為液體高氏培養(yǎng)基;所述的用量為100- 20〇1^;所述的大Ξ角培養(yǎng)瓶為250或50〇1^;所述的室溫培養(yǎng)溫度為20~30°C;所述的振蕩 的轉(zhuǎn)速為160-18化pm;所述的培養(yǎng)時(shí)間為5~15天； (2) 鄉(xiāng)氨霉素 B的提取分離純化 菌株P(guān)11-23B的發(fā)酵菌液用乙酸乙醋萃取得到乙酸乙醋萃取物，乙酸乙醋萃取物用十 八烷基硅烷鍵合硅膠(0DS)柱層析分離，分別用70%和100%的甲醇洗脫，100%的甲醇洗脫 液合并后經(jīng)減壓濃縮得到的殘留物用HPLC分離，得到純化合物鄉(xiāng)氨霉素 B; 所述柱層析的十八烷基硅烷鍵合硅膠用量與上量的樣品量比例是40~60g:1.0g;所述 的高效液相分離條件是:Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent 1260DAD檢測器，Agilent Zorbax SB-Cis色譜柱250 X 9.4mm，5μπι，100 %甲醇為流動(dòng)相，柱溫26 °C，檢測波長2lOnm，流 速為 l.OmL/min; (3) 鄉(xiāng)氨霉素 B的結(jié)構(gòu)鑒定： 根據(jù)一維和二維的醒R光譜、高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)、W及化學(xué)降解方法鑒定鄉(xiāng)氨霉素 B的結(jié) 構(gòu)。4. 權(quán)利要求2所述的小鏈霉菌的制備方法，其特征在于，通過W下步驟分離培養(yǎng)而獲 得： (1) 小鏈霉菌PI 1-23B的分離培養(yǎng)： 取空氣干燥的海泥用海水稀釋成一定的濃度，取一定量的樣品稀釋液均勻分散到含有 固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在室溫條件下培養(yǎng)一定時(shí)間后，將不同的菌落分別轉(zhuǎn)移到另一含 有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在室溫條件下繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間，最后將單一菌落(P11-23B)接 種到斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后置4Γ冰箱保存?zhèn)溆茫? 所述的海泥和海水是從浙江舟山東海海域中獲得;所述樣品稀釋液的濃度為IX 10-6~ 1 X 1 (T4g/mM所述的樣品稀釋液的取樣量為100~所述培養(yǎng)皿所含的固體培養(yǎng)基為 高氏瓊脂(Gause^s agar)培養(yǎng)基或其它固體培養(yǎng)基;所述的斜面培養(yǎng)基為高氏瓊脂培養(yǎng)基 或其它固體斜面培養(yǎng)基;所述的室溫培養(yǎng)溫度為20~3(TC;所述的培養(yǎng)時(shí)間為7~15天； (2) 小鏈霉菌P11-23B的菌種鑒定： 上述步驟（1)分離培養(yǎng)所獲得的菌株用目前實(shí)驗(yàn)室普遍使用的16S rDNA序列分析方法 鑒定菌株P(guān)11-23B的種類，確定為小鏈霉菌，分類命名為Str邱tomyces parvulus P11-23B， 已被中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、-武漢中屯、保藏，保藏編號(hào)CCTCC NO:M2015675。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性物質(zhì)鄉(xiāng)氨霉素 B在制備治療腦膠質(zhì)瘤藥物中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物為鄉(xiāng)氨霉素 B活性成分單獨(dú)，或與 其它藥物或與有效成分一起，與藥學(xué)上可接受的載體組成的藥物。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物的制劑形式為液體制劑、固體 制劑、膠囊制劑、緩釋制劑、納米制劑。
【文檔編號(hào)】C07D273/00GK105968067SQ201510908937
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2015年12月10日
【發(fā)明人】張治針, 葉雪威, 連曉媛
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)