一種響應(yīng)面法優(yōu)化女貞葉中熊果酸的亞臨界水提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種響應(yīng)面法優(yōu)化女貞葉中熊果酸的亞臨界水提取方法，包括如下步驟：亞臨界水法提取女貞葉中熊果酸，冷卻反應(yīng)釜，固液分離，沉淀中加入乙醇，震蕩溶解，離心分離，高效液相色譜法（HPLC）測(cè)上清液中熊果酸含量，通過(guò)單因素分析，利用響應(yīng)面優(yōu)化方法優(yōu)化提取工藝。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，工藝簡(jiǎn)單可控、提取時(shí)間短、清潔環(huán)保、提取率高、成本低等特點(diǎn)，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】
一種響應(yīng)面法優(yōu)化女貞葉中熊果酸的亞臨界水提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種天然植物有效成分提取工藝，具體涉及一種響應(yīng)面法優(yōu)化女貞葉 中熊果酸的提取及純化工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 女貞葉（Ligustrum lucidum Ait)別名冬青葉、木犀科植物，屬常綠喬木，樹(shù)皮灰 色、平滑，廣泛分布于長(zhǎng)江流域及以南地區(qū)，《本草綱目》中記載：除風(fēng)散血，消腫定痛，治頭 目昏痛，諸惡瘡腫，瘍瘡潰爛，久者以水煮，乘熱貼之，頻頻換易，米醋煮亦可。口舌生瘡，舌 腫脹出，搗汁含浸吐涎。《貴州民間方藥集》：外敷止因傷出血，消炎消腫，治湯火傷。內(nèi)服可 止咳嗽，止吐血。女貞葉作為一種藥材，來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值，且能夠 實(shí)現(xiàn)其高附加值的利用。
[0003] 女貞葉中有較高含量的熊果酸，它是一種弱酸性五環(huán)三萜類(lèi)化合物，毒性低，具有 廣泛的生物活性，尤其在抗腫瘤、抗氧化、抗炎、保肝、降血脂等方面作用顯著。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)， 熊果酸不僅對(duì)多種致腫瘤、促腫瘤物有抵抗作用，而且能抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。同 時(shí)，熊果酸及其衍生物還對(duì)病毒具有抑制活性。因此，熊果酸的藥理學(xué)活性越來(lái)越引起藥物 專家們的關(guān)注。市售的熊果酸價(jià)格昂貴，成本高，為其利用帶來(lái)很大的阻礙，尤其是在合成 藥物時(shí)無(wú)疑增大了成本價(jià)，負(fù)載高昂的科研費(fèi)用，也給患者帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
[0004] 目前提取熊果酸的方法較少，主要的提取方法如乙醇-超聲提取法超聲時(shí)間長(zhǎng)，噪 音大;分子印跡固相萃取法實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜，難以控制，對(duì)設(shè)備要求高，大大增加了實(shí)驗(yàn)成本； 纖維素酶法操作復(fù)雜，精密度要求高，大規(guī)模實(shí)驗(yàn)困難、提取時(shí)間長(zhǎng)、提取效率低等限制性 因素，一直制約著女貞葉中熊果酸的提取。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提取女貞葉中熊果酸的限制性因素，提供一種亞臨界 水法提取的方法，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化女貞葉中熊果酸的提取及純化工藝，本發(fā)明對(duì)固液比、 提取時(shí)間、提取溫度以及反應(yīng)壓力這些影響女貞葉中熊果酸提取率的因素進(jìn)行優(yōu)化，從而 提高女貞葉中熊果酸的提取率，降低熊果酸的提取成本，減少環(huán)境污染，節(jié)約能源消耗。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種亞臨界水法提取女貞葉中熊果酸的工 藝，本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下： 選取風(fēng)干女貞葉，磨粉，40~400目，裝入密封袋避光，平衡水分24h，計(jì)算干度。
[0007] 作為本發(fā)明的亞臨界水法提取女貞葉中熊果酸工藝，稱取一定量女貞葉粉末，以 一定的固液比與去離子水混合均勻，置于內(nèi)含聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中，ll〇°C~200°C下反 應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束，迅速冷卻反應(yīng)液至室溫，離心、分離，收集沉淀，加入3V的95%乙醇，震蕩均勻， 離心，收集上清液。
[0008] 本發(fā)明提供了女貞葉中熊果酸含量的測(cè)定方法，利用高效液相色譜法進(jìn)行定量分 析，流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液：甲醇(色譜純)=12:88，流速0.6ml/min，波長(zhǎng)212nm下繪制熊 果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到熊果酸的回歸方程Yua=2885.8X+21.931，R2=0.9991，其中UA-熊果酸。
[0009] 本發(fā)明通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取女貞葉中熊果酸，作為優(yōu)選，女貞葉粉末按照固 液比1:10，壓力0.5MPa，溫度130°C下，設(shè)定提取時(shí)間為5、10、15、20、25、30min，通過(guò)高效液 相色譜法檢測(cè)不同條件下女貞葉熊果酸的提取率，得到最佳提取時(shí)間為15min。
[0010] 作為優(yōu)選，女貞葉粉末按照固液比1:10，壓力〇. 5MPa，提取時(shí)間15min下，設(shè)定提取 溫度分別為120、130、140、150、160、170、180°C，通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)不同條件下女貞 葉熊果酸的提取率，得到最佳提取溫度為150°C。
[0011 ] 優(yōu)選地，女貞葉粉末按照壓力0 ? 5MPa，提取時(shí)間15min，提取溫度為150 °C下，設(shè)定 固液比分別為l:4、l:6、l:8、l:10、l:12(g/ml)，通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)不同條件下女貞 葉熊果酸的提取率，得到最佳固液比為1:8。
[0012] 優(yōu)選地，女貞葉粉末按照固液比1:8,提取時(shí)間15min，提取溫度150°C下，設(shè)定壓力 分別為1. 〇、1.5、2.0、2.5、3. OMPa，通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)不同條件下女貞葉熊果酸的 提取率，得到最佳壓力為2.0 MPa。
[0013] 作為優(yōu)選，采用響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用Design-Expert軟件根據(jù)Box-Benhnken設(shè) 計(jì)模型，以女貞葉中熊果酸提取率為響應(yīng)值，三個(gè)主要的影響提取率的因素提取時(shí)間、提取 溫度、固液比，三個(gè)水平，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)女貞葉中熊果酸的提取率的影響因素進(jìn)行優(yōu)化 得到最佳優(yōu)化條件。
[0014]優(yōu)選地，所述數(shù)學(xué)模型為： Yua=1.0216+0.02161*A+0.02578*B+0.0061*C-0.2706*A*B+0.2051*A*C-0.2320*B*C-0 ? 2721*A2-0 ? 2639B2-0 ? 1244C2，其中 UA 為熊果酸。
[0015]本發(fā)明對(duì)女貞葉中熊果酸進(jìn)行分離純化，不同濃度的乙醇提取液，加入到樹(shù)脂柱 中，用甲醇作為洗脫劑，洗脫液進(jìn)行濃縮，得到提取液。
[0016] 本發(fā)明提供一種提取女貞葉中熊果酸的優(yōu)化方法，對(duì)反應(yīng)壓力、提取時(shí)間、提取溫 度以及固液比對(duì)熊果酸提取率的影響因素進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳優(yōu)化條件為反應(yīng)壓力2 MPa，提取時(shí)間15min，提取溫度150 °C，固液比1:8。
[0017] 本發(fā)明是應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化女貞葉中熊果酸提取工藝的一種方法，通過(guò)15組 實(shí)驗(yàn)對(duì)女貞葉中熊果酸的提取條件提取時(shí)間、提取溫度以及固液比進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的 提取優(yōu)化條件，獲得最佳廣率，提尚提取效率，縮短提取時(shí)間，降低能耗，無(wú)環(huán)境污染，乙醇 可以回收，具有工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際意義。
[0018] 本發(fā)明只通過(guò)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)方法，少量的實(shí)驗(yàn)，簡(jiǎn)單便宜的操作，就可有效的優(yōu)化女 貞葉中熊果酸的提取工藝。
[0019] 本發(fā)明可適用于工業(yè)化生產(chǎn)女貞葉中熊果酸，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0020] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)： 以水作為溶劑，提取女貞葉中熊果酸的方法步驟簡(jiǎn)單，提取效率高。
[0021] 應(yīng)用響應(yīng)面分析優(yōu)化女貞葉中熊果酸的提取工藝，只有15組實(shí)驗(yàn)就可以對(duì)女貞葉 中熊果酸的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。
[0022] 當(dāng)反應(yīng)壓力為2 MPa，提取時(shí)間為15min，提取溫度為150°C，固液比為1:8時(shí)，女貞 葉中熊果酸達(dá)到1.063%。本發(fā)明降低了提取溫度，節(jié)約能源;縮短了提取時(shí)間，提高生產(chǎn)效 率，降低了料液比，減少水的消耗，整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中無(wú)污染物的產(chǎn)生和排放。乙醇溶解熊果 酸，無(wú)毒性，溶劑可回收，硫酸鈉脫水后可再循環(huán)利用。提純選擇樹(shù)脂柱，操作簡(jiǎn)單，分離效 果好，得到的熊果酸純度高，而且樹(shù)脂柱可再生使用。
[0023] 綜上所述，本發(fā)明采用的Design-Expert軟件根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)模型是響應(yīng) 面分析法，三個(gè)主要的影響提取率的因素，三個(gè)水平，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，較少的實(shí)驗(yàn)組數(shù)就可 以精確的優(yōu)化出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)采取響應(yīng)面法分析女貞葉中熊果酸提取的最優(yōu)條件，通過(guò) 對(duì)提取時(shí)間、提取溫度以及固液比對(duì)女貞葉中熊果酸提取率的影響因素進(jìn)行優(yōu)化得到最佳 優(yōu)化條件。
【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為提取純化工藝的方案流程圖； 圖2為熊果酸的高效液相色譜HPLC檢測(cè)圖； 圖3溫度、固液比對(duì)提取率的影響的響應(yīng)面三維圖； 圖4提取時(shí)間、溫度對(duì)提取率的影響的響應(yīng)面三維圖； 圖5提取時(shí)間、固液比對(duì)提取率的影響的響應(yīng)面三維圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1、一種響應(yīng)面優(yōu)化女貞葉中熊果酸的提取及純化方法： 1、女貞葉粉末水分含量測(cè)定 選取烘干女貞葉，粉碎，80~200目，裝入密封袋避光，平衡水分24h，稱取2 ± 0.1 g女貞 葉粉末于恒重的容量瓶中，105 ± 1°C的烘箱中恒重4h，取出放入干燥器里，30min后稱重，計(jì) 算干度。
[0026] 2、亞臨界法提取女貞葉中熊果酸 稱取女貞葉粉末絕干1 g，以一定的固液比與去離子水混合均勻，置于內(nèi)含聚四氟乙烯 的反應(yīng)釜中，120 °C~180 °C下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束，迅速冷卻反應(yīng)液至室溫，離心分離，收集沉 淀，加入3V的95%乙醇，震蕩均勻，離心，收集上清液。
[0027] 3、單因素實(shí)驗(yàn) 依次改變亞臨界水提取熊果酸的反應(yīng)壓力、提取時(shí)間、提取溫度、固液比進(jìn)行單因素實(shí) 驗(yàn)，用高效液相色譜法測(cè)定所得的乙醇提取液中的總熊果酸的含量。
[0028] 4.響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取女貞葉中熊果酸提取顯著的固液比、提取時(shí)間、提取溫度這 三個(gè)因素，利用Design-Expert軟件根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)定結(jié)果 見(jiàn)表1。
[0029]表1實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)定
以提取溫度A、提取時(shí)間B、固液比C為自變量，以提取率為響應(yīng)值Y，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn) 表2。
[0030] 表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
根據(jù)表2數(shù)據(jù)得到多元回歸方程如下： Yua=1.0216+0.02161*A+0.02578*B+0.0061*C-0.2706*A*B+0.2051*A*C-0.2320*B*C-0.2721*A 2-0.2639B2-0.1244C2 利用Des ign-Expert軟件二次回歸方程繪圖分析，得到回歸方程的響應(yīng)面圖3、圖4、圖 5,根據(jù)模型分析得知，女貞葉中熊果酸的提取優(yōu)化工藝參數(shù)為:提取時(shí)間15.5min、提取溫 度 153.7°C、固液比 1:8.6。
[0031] 實(shí)驗(yàn)1、一種響應(yīng)面法優(yōu)化女貞葉中熊果酸的提取及純化工藝，包括如下步驟： 將女貞葉粉碎，80~200目，裝入密封袋避光，平衡水分24h，稱取2 ±0. lg女貞葉粉末于 恒重的容量瓶中，105 ± 1°C的烘箱中恒重4h，取出放入干燥器里，30min后稱重，計(jì)算干度。
[0032] 稱取上述女貞葉粉末絕干1 g，以一定的固液比與去離子水混合均勻，置于內(nèi)含聚 四氟乙烯的反應(yīng)釜中，120 °C~180°C下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束，迅速冷卻反應(yīng)液至室溫，離心分離， 收集沉淀，加入3V的95%乙醇，震蕩均勻，離心，收集上清液。
[0033] 采用高效液相色譜法測(cè)定熊果酸的含量，首先繪制熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，流動(dòng)相為 0.2%磷酸水溶液：甲醇（色譜純)=12: 88，流速0.6ml/min，波長(zhǎng)212nm下做熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲 線，取熊果酸〇.〇125g溶于乙醇，在25ml容量瓶中搖勻20min定容，從中取1、1.5、2、2.5、3、 3.5ml于10ml容量瓶中搖勾定容，0.22wii的有機(jī)過(guò)濾器過(guò)濾，進(jìn)樣，在30min左右出峰，根據(jù) 峰面積Y(mAU ? S)和濃度X(mg/ml)的關(guān)系，得到熊果酸的回歸方程Yua=2885.8X+21.931，R2= 0.9991，其中UA-熊果酸。
[0034] 實(shí)驗(yàn)2、提取時(shí)間對(duì)女貞葉熊果酸提取率的影響 取絕干料1 g，固液比1:1 〇，壓力〇. 5MPa，溫度130 °C下，提取時(shí)間分別為5、10、15、20、 25、30min，得到的熊果酸的提取率分別為 1 ? 02%、1 ? 03%、1 ? 06%、1 ? 04%、1 ? 02%、1 ? 02%。
[0035] 實(shí)驗(yàn)3、提取溫度對(duì)女貞葉熊果酸提取率的影響 取絕干料1 g，固液比1:10，壓力〇. 5MPa，提取時(shí)間15min下，提取溫度分別為120、130、 140、150、160、170、180°C，得到熊果酸的提取率分別為 1 ? 02%、1 ? 03%、1 ? 06%、1 ? 04%、1 ? 02%、 1.02%〇
[0036] 實(shí)驗(yàn)4、固液比對(duì)女貞葉熊果酸提取率的影響 取絕干料1 g，壓力〇. 5MPa，提取時(shí)間15min，溫度150 °C下，固液比分別為1:4、1:6、1:8、 1:10、1:12(g/ml)，得到熊果酸的提取率為0 ? 98%、1 ? 00%、1 ? 00%、1 ? 00%、0 ? 99%。
[0037]實(shí)驗(yàn)5、壓力對(duì)女貞葉熊果酸提取率的影響 取絕干料1 g，提取時(shí)間15min，溫度150 °C，固液比1: 8下，壓力分別為1.0、1.5、2.0、 2 ? 5、3 ? OMPa，得到熊果酸的提取率分別為 0 ? 82%、0 ? 87%、0 ? 93%、0 ? 90%、0 ? 89%。
[0038]單因素優(yōu)化得出的最佳工藝條件為:提取時(shí)間15min，溫度150 °C，固液比1:8，壓力 2MPa〇
[0039]實(shí)驗(yàn)6、熊果酸的分離純化 不同濃度乙醇提取液，加入到樹(shù)脂柱中，對(duì)不同條件下的乙醇提取液進(jìn)行熊果酸的分 離純化，用甲醇作為洗脫劑，以0.6ml/min的流速進(jìn)行洗脫，洗脫液進(jìn)行濃縮，得到提取液， 純度為95.32%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種響應(yīng)面法優(yōu)化女貞葉中熊果酸的亞臨界水提取方法，其特征在于，具體步驟包 括： (1) 將女貞葉烘干、粉碎得到一定粒徑的女貞葉粉末女貞葉粉末； (2) 采用亞臨界水法提取女貞葉中熊果酸，稱取步驟（1)中所述女貞葉粉末，按一定固 液比加入去離子水，置于內(nèi)含聚四氟乙烯的反應(yīng)釜中，110 °C~200 °C下反應(yīng)一段時(shí)間，反 應(yīng)結(jié)束后，迅速冷卻反應(yīng)液至室溫，離心分離，收集沉淀； (3) 向所述步驟(2)中所得沉淀中加入一定體積的95%乙醇，震蕩混合一段時(shí)間，離心， 收集上清液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種響應(yīng)面法優(yōu)化提取女貞葉中熊果酸的方法，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 與優(yōu)化方案如下： (1) 進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，依次改變亞臨界水提取熊果酸的反應(yīng)壓力、提取時(shí)間、提取溫度、 固液比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)； (2) 進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇固液比、提取時(shí)間、提取溫度等 三個(gè)因素，利用Design-Expert軟件根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以提取溫度 A、提取時(shí)間B、固液比C為自變量，以提取率為響應(yīng)值Y，建立多元二次方程： Y=1.0216+0.02161*A+0.02578*B+0.0061*C-0.2706*A*B+0.2051*A*C-〇.2320*B*C-0·2721*A 2-0·2639B2-0·1244C2; (3) 回歸方程的響應(yīng)面分析，利用Design-Expert軟件二次回歸方程繪圖分析，得到回 歸方程的響應(yīng)面，直觀分析各因素對(duì)女貞葉熊果酸提取率的影響。3. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的一種響應(yīng)面法優(yōu)化提取女貞葉熊果酸，其特征在于，在單 因素實(shí)驗(yàn)中，提取時(shí)間為5~120 min;提取溫度110~200°C，固液比1:4~1:30,壓力為1~ 3.0 MPa〇
【文檔編號(hào)】G06F19/00GK105968165SQ201610389231
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日
【發(fā)明人】雷建都, 劉彥雪, 王璐瑩, 劉靜, 何靜, 晉祿祿
【申請(qǐng)人】北京林業(yè)大學(xué)