一種肺炎鏈球菌融合蛋白及其疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種肺炎鏈球菌融合蛋白及其疫苗。該融合蛋白為肺炎鏈球菌毒力蛋白基因和蛋白連接器基因重組后的表達(dá)產(chǎn)物，肺炎鏈球菌毒力蛋白為Ply、PspA、PsaA、PcpA或PhtD。本發(fā)明肺炎鏈球菌融合蛋白疫苗鼻腔免疫動(dòng)物后不僅能夠誘導(dǎo)出高效價(jià)的血清特異性IgG抗體，也能誘導(dǎo)出高效價(jià)的局部粘膜特異性IgA，并且對不同肺炎鏈球菌菌株的鼻腔攻毒都有很好的保護(hù)性作用。
【專利說明】
一種肺炎鏈球菌融合蛋白及其疫苗
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種肺炎鏈球菌融合蛋白及其疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)是一種有莢膜的革蘭氏陽性菌，該菌通 常定植于健康人群的口腔和鼻咽部，是正常菌群中的一種；當(dāng)人體免疫力低下時(shí)，肺炎鏈球 菌局部浸潤引起鼻竇炎、中耳炎，吸入肺引起肺炎，還可以侵襲機(jī)體引起菌血癥和腦膜炎等 疾病。WHO估計(jì)全球每年約有160萬人死于肺炎鏈球菌疾病，其中五歲以下兒童約有100萬左 右，占該年齡組總死亡率的11 %。
[0003] 現(xiàn)在市場上銷售的肺炎鏈球菌疫苗是基于肺炎鏈球菌莢膜多糖抗原的疫苗，SP23 價(jià)肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗和莢膜多糖-蛋白結(jié)合疫苗。肺炎鏈球菌莢膜多糖是肺炎鏈球 菌主要的毒力因子，它的結(jié)構(gòu)存在著變異性，根據(jù)肺炎鏈球菌莢膜多糖抗原與抗體反應(yīng)的 差別，肺炎鏈球菌被分為多種不同的血清型，現(xiàn)在已經(jīng)鑒定出90多個(gè)不同的血清型。因此， 無論是莢膜多糖疫苗還是莢膜多糖-蛋白結(jié)合疫苗都很難將90多個(gè)血清型覆蓋。23價(jià)莢膜 多糖疫苗是非T細(xì)胞依賴性的，免疫后不能引起免疫細(xì)胞的免疫記憶性，對免疫系統(tǒng)發(fā)育尚 未完全的嬰幼兒免疫效果較差，而嬰幼兒卻是肺炎鏈球菌感染的易感人群，該疫苗主要應(yīng) 用于成年人;肺炎鏈球菌多糖-蛋白結(jié)合疫苗將莢膜多糖偶聯(lián)到蛋白載體上，免疫機(jī)體后可 以引起針對多糖的T細(xì)胞依賴性的免疫應(yīng)答并且可以誘導(dǎo)免疫記憶性，但是需要將每一種 莢膜多糖都要偶聯(lián)到蛋白載體上，由于偶聯(lián)技術(shù)復(fù)雜導(dǎo)致疫苗價(jià)格高昂，很難在全球廣泛 應(yīng)用。由于肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗的使用，已經(jīng)出現(xiàn)了血清型替代現(xiàn)象，也就是非疫苗組 分的血清型菌株發(fā)病數(shù)量在上升。從長遠(yuǎn)角度來看，新的血清型肺炎鏈球菌流行株將會不 斷出現(xiàn)而替代舊的流行株，因此現(xiàn)有疫苗的效用將會越來越低。因此，研發(fā)一種更具廣譜性 保護(hù)、生產(chǎn)成本低廉的肺炎鏈球菌疫苗是非常重要的。而現(xiàn)在肺炎疫苗研發(fā)的方向是基于 肺炎鏈球菌自身蛋白的疫苗，因其具有保守性并且非血清型依賴性、生產(chǎn)成本相對低廉和 免疫原性好將有可能成為新一代的肺炎鏈球菌疫苗。
[0004] 肺炎鏈球菌自身蛋白疫苗的研發(fā)已經(jīng)有幾十年的歷史了，現(xiàn)在已經(jīng)獲得了許多可 喜的結(jié)果。肺炎球菌蛋白疫苗的候選抗原主要是與感染密切相關(guān)的肺炎鏈球菌重要的毒力 因子和表面蛋白。很多肺炎鏈球菌疫苗候選蛋白都已經(jīng)進(jìn)行了研究，例如肺炎鏈球菌表面 蛋白A(Pneumococcal surface protein A，PspA)、肺炎鏈球菌溶血素蛋白（Pneumolysin， Ply)、肺炎鏈球菌表面粘附素A(Pneumococcal surface adhesion A，PsaA)、肺炎鏈球菌膽 固醇結(jié)合蛋白A(Pneumococcal choline-binding protein A，PcpA)與肺炎鏈球菌組氨酸 三耳關(guān)蛋白D(Pneumococcal histidine triad protein D，PhtD)等。
[0005] 大多數(shù)病原體是通過粘膜層侵入機(jī)體，例如通過鼻或肺等。因此如果能在局部粘 膜免疫，將更有利于預(yù)防呼吸道病原體的感染。然而，實(shí)際應(yīng)用的肺炎鏈球菌疫苗多是進(jìn)行 皮下或肌肉等系統(tǒng)免疫途徑，因此不能誘導(dǎo)局部粘膜免疫應(yīng)答。與皮下或肌肉等系統(tǒng)免疫 相比，鼻腔粘膜免疫容易給藥，但是可溶性抗原鼻腔給藥后吸收差并且免疫反應(yīng)弱。因此， 選擇合適的粘膜免疫佐劑尤為重要?；魜y毒素和大腸桿菌腸毒素等細(xì)菌毒素有很強(qiáng)的粘膜 佐劑活性，能增強(qiáng)粘膜免疫抗原的免疫反應(yīng)性。但是，細(xì)菌毒素存在安全性問題，有文獻(xiàn)報(bào) 道霍亂毒素能夠引起小鼠大腦的炎癥反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種肺炎鏈球菌融合蛋白及其疫苗。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，與 對照組(PBS)相比，肺炎鏈球菌融合蛋白疫苗鼻腔免疫動(dòng)物后不僅能夠誘導(dǎo)出高效價(jià)的血 清特異性IgG抗體，也能誘導(dǎo)出高效價(jià)的局部粘膜特異性IgA，并且對不同肺炎鏈球菌菌株 的鼻腔攻毒都有很好的保護(hù)性作用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種融合蛋白，該融合蛋白為肺炎鏈球菌毒力蛋白基因和蛋白連接 器基因重組后的表達(dá)產(chǎn)物，肺炎鏈球菌毒力蛋白為Ply、PspA、PsaA、PcpASPhtD。
[0009] PspA是一種膽固醇結(jié)合蛋白，是肺炎鏈球菌關(guān)鍵的毒力因子，至今在所有的臨床 分離到的肺炎鏈球菌菌株中都能檢測到PspA的表達(dá)。PspA在肺炎鏈球菌與宿主相互作用中 起到關(guān)鍵作用，主要是通過影響補(bǔ)體C3固定在菌體表面而發(fā)揮作用的，PspA通過抑制補(bǔ)體 沉積到菌體表面來阻斷補(bǔ)體受體調(diào)節(jié)的清除菌體的作用;PspA還可以結(jié)合乳鐵蛋白，抑制 乳鐵蛋白的殺菌活性。很多研究已經(jīng)對PspA的免疫保護(hù)作用進(jìn)行了評估，現(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)了 重組的PspA蛋白免疫后誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答可以保護(hù)各種動(dòng)物攻毒模型，例如肺炎鏈球菌定 植、肺炎鏈球菌肺炎、菌血癥和腦膜炎。PspA蛋白分子在所有肺炎鏈球菌中并不完全保守， 存在著結(jié)構(gòu)變異性，分子量由67-100KD不等。PspA分子分為5個(gè)區(qū)域:信號肽區(qū)、a螺旋區(qū)、脯 氨酸富集區(qū)、膽堿結(jié)合區(qū)和C端17個(gè)氨基酸尾。基因和蛋白圖譜研究結(jié)果顯示，關(guān)鍵的交叉 保護(hù)性抗原表位位于a螺旋區(qū)中靠近脯氨酸富集區(qū)的大約100個(gè)氨基酸左右的序列，被稱為 亞類決定區(qū)（亞類defining region，簡稱⑶R)。根據(jù)⑶R區(qū)的不同，PspA被分為3個(gè)家族(家 族1、家族2和家族3 )、6個(gè)亞類(亞類1、亞類2、亞類3、亞類4、亞類5和亞類6 )，6個(gè)亞類分別屬 于3個(gè)家族;其中亞類1和亞類2屬于家族1，亞類3、亞類4和亞類5屬于家族2,亞類6屬于家族 3。每個(gè)家族內(nèi)亞類間CDR區(qū)基因序列相似度大于80%;各家族間CDR區(qū)基因序列間相似度大 于50%。在三個(gè)家族中，家族1與家族2流行率大于95%，而家族3很少出現(xiàn)。盡管PspA的結(jié)構(gòu) 和抗原性具有多變性，但是針對PspA產(chǎn)生的抗體具有高度的交叉反應(yīng)性與交叉保護(hù)性。 [0010] PsaA蛋白是一種保守的脂蛋白，并且在所有的臨床分離株中均有表達(dá)，該蛋白參 與錳離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和宿主細(xì)胞的粘附。PsaA突變后能夠阻斷體內(nèi)Mn離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此影響肺 炎鏈球菌各種功能，包括細(xì)菌的粘附功能和毒力。通過免疫基因工程方法表達(dá)的重組PsaA 蛋白或通過肺炎鏈球菌鼻咽部定植都能誘導(dǎo)出針對PsaA的特異性抗體，一些研究已經(jīng)在各 種肺炎鏈球菌的攻毒模型中評價(jià)了 PsaA蛋白的免疫保護(hù)效能。
[0011] Ply是一種分子量為53kDa大小的分泌蛋白，屬于膽固醇依賴型溶血素；在所有肺 炎鏈球菌臨床分離株中都會有該蛋白的表達(dá)，也是肺炎鏈球菌的自溶素。Ply在肺炎鏈球菌 致病過程發(fā)揮重要作用，在體外對人細(xì)胞和組織也有直接的細(xì)胞毒性。Ply還可以在缺乏特 異性補(bǔ)體的情況下直接激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑，繼而消耗血清中補(bǔ)體的調(diào)理活性。很多研究 都暗示Ply抗體可能對預(yù)防感染是有保護(hù)性的。由于天然的蛋白具有毒性，因此降低細(xì)胞毒 性和補(bǔ)體激活效應(yīng)是該蛋白作為候選疫苗必須具備的。通過基因突變獲得的脫毒的Ply已 經(jīng)制備，并且仍然保持很好的免疫原性，本單位成功制備了脫毒的Ply減毒體命名為Plym2。
[0012] PcpA是肺炎鏈球菌的一種表面蛋白，90%以上的臨床分離株中均有該蛋白的表 達(dá)。PcpA在肺炎鏈球菌的粘附中發(fā)揮重要作用，尤其是在與肺泡上皮細(xì)胞的粘附中。動(dòng)物模 型中，免疫PcpA蛋白后對小鼠的肺炎和菌血癥的攻毒模型都有很好的保護(hù)作用。
[0013] PhtD是肺炎鏈球菌的一種重要的毒力因子，該蛋白表達(dá)在菌體表面。雖然該蛋白 的功能現(xiàn)在仍未完全闡述，但是已經(jīng)證實(shí)該蛋白可以抑制補(bǔ)體沉積到菌體表面并且可以結(jié) 合鋅離子。免疫重組的PhtD蛋白對小鼠和靈長類的攻毒模型都有很好的保護(hù)作用。
[0014] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，蛋白連接器(PA)為乳酸乳球菌細(xì)胞壁水解酶ACMA 細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)域全序列或截短序列。
[0015] ACMA對乳酸乳球菌的肽聚糖結(jié)構(gòu)有很強(qiáng)的結(jié)合能力?，F(xiàn)在ACMA的肽聚糖結(jié)合區(qū)已 經(jīng)很明確，通過基因重組的方法將抗原與PA融合表達(dá)，然后與BLP混合這樣抗原就很容易結(jié) 合到BLP上。PA與BLP的結(jié)合是很穩(wěn)定的，結(jié)合后不易分離。
[0016]作為優(yōu)選，PA的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所 不。
[0017]作為優(yōu)選，Ply為Ply蛋白全序列或截短序列，或突變減毒序列；
[0018] 優(yōu)選地，Ply為突變減毒序列Plym2，Plym2的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，其核 苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0019] PspA為PspA亞類1、亞類2、亞類3、亞類4或亞類5中任何一個(gè)亞類的全序列或截短 序列，或者突變序列，或者PspA亞類1、亞類2、亞類3、亞類4或亞類5中兩個(gè)或兩個(gè)以上亞類 的全部或部分序列的融合蛋白；
[0020] 作為優(yōu)選，PspA2為PspA亞類2的a螺旋區(qū)，PspA亞類2的N端氨基酸序列為SEQ ID 從):9所示的序列，？8口42的核苷酸序列如3￡〇10從)：12所示。
[0021] 作為優(yōu)選，PspA4為PspA亞類4的PspA蛋白序列，PspA亞類4的N端氨基酸序列如SEQ ID N0:15所示，PspA4的核苷酸序列如SEQ ID N0:18所示。
[0022]作為優(yōu)選，PsaA為PsaA蛋白全序列或截短序列；
[0023] 優(yōu)選地，PsaA的氨基酸序列如SEQ ID N0: 21所示，PsaA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 24所示。
[0024]作為優(yōu)選，PcpA為PcpA蛋白全序列或截短序列；
[0025] 優(yōu)選地，PcpA的氨基酸序列如SEQ ID N0: 27所示，PcpA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 30所示。
[0026]作為優(yōu)選，PhtD為PhtD蛋白全序列或截短序列；
[0027] 優(yōu)選地，PhtD的氨基酸序列如SEQ ID N0: 33所示，PhtD的核苷酸序列如SEQ ID NO: 36所示。
[0028]作為優(yōu)選，肺炎鏈球菌毒力蛋白為Plym2，融合蛋白（Plym2_PA融合蛋白）的氨基酸 序列如SEQ ID N0:7所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0029]作為優(yōu)選，PspA為PspA亞類2的a螺旋區(qū)，融合蛋白（PspA2_PA融合蛋白）的氨基酸 序列如SEQ ID N0:13所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:14所示。
[0030] 作為優(yōu)選，PspA為PspA亞類4,融合蛋白（PspA4-PA融合蛋白）的氨基酸序列如SEQ ID N0:19所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:20所示。
[0031 ]作為優(yōu)選，PsaA為PsaA蛋白截短序列，融合蛋白（PsaA-PA融合蛋白）的氨基酸序列 如SEQ ID N0:25所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:26所示。
[0032]作為優(yōu)選，PcpA為PcpA蛋白截短序列，融合蛋白（PcpA-PA融合蛋白）的氨基酸序列 如SEQ ID N0:31所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:32所示。
[0033]作為優(yōu)選，PhtD為PhtD蛋白截短序列，融合蛋白（PhtD-PA融合蛋白）的氨基酸序列 如SEQ ID N0:37所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:38所示。
[0034] 本發(fā)明還提供了編碼該融合蛋白的融合基因，融合基因由肺炎鏈球菌毒力蛋白基 因和蛋白連接器基因重組獲得，肺炎鏈球菌毒力蛋白為Ply、PspA、PsaA、PcpASPhtD。
[0035] 作為優(yōu)選，融合基因是經(jīng)密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)的。
[0036] 優(yōu)選地，融合基因是按照大腸桿菌(Escherichia coli)偏愛的密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì) 的。
[0037]作為優(yōu)選，Ply為Ply蛋白全序列或截短序列，或突變減毒序列Plym2。
[0038] 作為優(yōu)選，PspA為PspA亞類1、亞類2、亞類3、亞類4或亞類5中任何一個(gè)亞類的全序 列或截短序列，或者突變序列，或者PspA亞類1、亞類2、亞類3、亞類4或亞類5中兩個(gè)或兩個(gè) 以上亞類的全部或部分序列的融合蛋白。
[0039]作為優(yōu)選，PsaA為PsaA蛋白全序列或截短序列。
[0040]作為優(yōu)選，PcpA為PcpA蛋白全序列或截短序列。
[00411作為優(yōu)選，PhtD為PhtD蛋白全序列或截短序列。
[0042]作為優(yōu)選，肺炎鏈球菌毒力蛋白為Plym2,融合基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:8 所示。
[0043]作為優(yōu)選，PspA為PspA亞類2,融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示；
[0044] 作為優(yōu)選，PspA為PspA亞類4,融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
[0045]作為優(yōu)選，PsaA為PsaA蛋白截短序列，融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 26所 不。
[0046] 作為優(yōu)選，PcpA為PcpA蛋白截短序列，融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 32所 不。
[0047]作為優(yōu)選，PhtD為PhtD蛋白截短序列，融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 38所 不。
[0048] 本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，重組表達(dá)載體為包含本發(fā)明提供的融合基因 的重組表達(dá)載體。
[0049] 作為優(yōu)選，重組表達(dá)載體采用的表達(dá)載體為質(zhì)粒。
[0050] 作為優(yōu)選，重組表達(dá)載體采用的表達(dá)載體為pET20b質(zhì)粒。
[0051 ]本發(fā)明還提供了一種該重組表達(dá)載體的細(xì)胞。
[0052]作為優(yōu)選，細(xì)胞為原核細(xì)胞。
[0053]優(yōu)選地，細(xì)胞為大腸桿菌。
[0054]更優(yōu)選地，細(xì)胞為大腸桿菌BL21。
[0055] 本發(fā)明還提供了該融合蛋白的制備方法，包括：
[0056] 將本發(fā)明提供的融合基因插入表達(dá)載體，將所得的重組表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，使融 合基因表達(dá)生成融合蛋白。
[0057] 作為優(yōu)選，制備方法還包括分離純化融合蛋白的步驟。
[0058] 作為優(yōu)選，分離純化采用的方法為親和層析、離子交換層析、疏水層析和/或凝膠 過濾層析。
[0059] 本發(fā)明還提供了一種肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗，包括本發(fā)明提供的融合蛋白和細(xì) 菌樣顆粒(BLP)。
[0060] 細(xì)菌樣顆粒(Bacterium-1 ike particles，縮寫為BLP)是一種新型的粘膜佐劑，它 將佐劑的顆粒性質(zhì)與免疫刺激性質(zhì)完美的融合為一體。BLP可以來源于滅活的乳酸乳球菌。 乳酸乳球菌是一種安全的細(xì)菌，它被廣泛應(yīng)用在益生菌飲料和奶產(chǎn)品的生產(chǎn)。BLP是通過熱 酸處理乳酸乳球菌得到，為無生命活性的球型的顆粒，主要成分為乳酸乳球菌肽聚糖殼，因 其大小與形態(tài)與細(xì)菌相似，故得名細(xì)菌樣顆粒即BLP3LP顆粒作為疫苗抗原成分的載體，可 以有效的結(jié)合抗原并將抗原展示到其表面。BLP本身的肽聚糖殼通過與Toll樣受體的作用 而激活固有性免疫系統(tǒng)發(fā)揮佐劑的功能。
[0061] 作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的融合蛋白為Plym2-PA、PspA2-PA、PspA4-PA、PsaA-PA、 PcpA-PA或PhtD-PA中的一種或幾種。
[0062] 作為優(yōu)選，肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗為？171112-?厶-81^、？8口厶2-?厶-81^、？8口厶4-?八-BLP、PsaA-PA-BLP、PcpA-PA-BLP 或 PhtD-PA-BLP 中的一種或幾種。
[0063] 優(yōu)選地，肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗為PspA2-PA-BLP和/或PspA4-PA-BLP。
[0064]作為優(yōu)選，BLP為通過培養(yǎng)革蘭陽性菌、熱酸處理培養(yǎng)的菌體得到；
[0065]作為優(yōu)選，革蘭陽性菌為乳酸乳球菌。
[0066]作為優(yōu)選，熱酸處理的方法為終濃度為10%的三氯乙酸72°C處理2小時(shí)。
[0067]本發(fā)明還提供了一種該肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗的制備方法，包括：
[0068]將融合蛋白與細(xì)菌樣顆?；旌?，在4~30 °C條件下結(jié)合20~60分鐘，通過離心或超 濾的方法去除未結(jié)合的融合蛋白，得到肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗。
[0069] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗的制備方法為:將融合 蛋白與BLP混合，室溫振蕩結(jié)合30分鐘，然后離心去除未結(jié)合的融合蛋白，洗滌5次，PBS重 懸，得到肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗。
[0070] 優(yōu)選地，融合蛋白為純化的融合蛋白。
[0071] 本發(fā)明還提供了一種肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗組合物，包括本發(fā)明提供的肺炎鏈 球菌重組蛋白疫苗。
[0072] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗或其組合物在制備預(yù)防肺炎鏈 球菌感染的疫苗中的應(yīng)用。
[0073] 本發(fā)明還提供了一種細(xì)菌樣顆粒的制備方法，該細(xì)菌樣顆粒為通過培養(yǎng)革蘭陽性 菌，然后通過熱酸處理培養(yǎng)的菌體得到；
[0074] 優(yōu)選地，革蘭陽性菌為乳酸乳球菌，熱酸處理為終濃度為10%的三氯乙酸72°C處 理2個(gè)小時(shí)。
[0075]本發(fā)明提供了一種肺炎鏈球菌融合蛋白及其疫苗。該融合蛋白為肺炎鏈球菌毒力 蛋白基因和蛋白連接器基因重組后的表達(dá)產(chǎn)物，肺炎鏈球菌毒力蛋白為Ply、PsPA、PsaA、 PcpA或PhtD。本發(fā)明具有如下有益效果：
[0076]本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，與對照組(PBS)相比，本發(fā)明肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗鼻腔免疫 動(dòng)物后不僅能夠誘導(dǎo)出高效價(jià)的血清特異性IgG抗體，也能誘導(dǎo)出高效價(jià)的局部粘膜特異 性IgA，并且對不同肺炎鏈球菌菌株的鼻腔攻毒都有很好的保護(hù)性作用；
[0077] 與對照組（PBS)相比，PspA2-PA-BLP與PspA4-PA-BLP聯(lián)合免疫組對肺炎鏈球菌 PspA分型家族1和家族2的攻毒菌株都有很好的保護(hù)作用。
【附圖說明】
[0078] 圖 1 示pET20b-Plym2-PA的Nde I/BamH I/Xho I酶切鑒定結(jié)果，其中，泳道 1 示lkb DNA Ladder，泳道2-3均示pET20b-Plym2-PA質(zhì)粒Nde I/BamH I/Xho 頂每切結(jié)果；
[0079] 圖2示pET20b-PspA2-PA的Nde I/BamH I酶切鑒定結(jié)果，其中，泳道l:lkb DNA Ladder，泳道2:pET20b-PspA2-PA的Nde I/BamH 頂每切結(jié)果；
[0080] 圖3示pET20b-PspA4-PA的Nde I/BamH I酶切電泳鑒定結(jié)果，其中，泳道l:lkb DNA Ladder，泳道2:pET20b-PspA4-PA的Nde I/BamH 頂每切結(jié)果；
[0081 ] 圖4示pET20b-PsaA-PA的Nde I/BamH I酶切電泳鑒定結(jié)果，其中，泳道1示lkb DNA Ladder，泳道2:pET20b-PsaA-PA的Nde I/BamH 頂每切結(jié)果；
[0082] 圖5示pET20b-PcpA-PA的Nde I/BamH I酶切電泳鑒定結(jié)果，其中，泳道1示lkb DNA Ladder，泳道2:pET20b-PcpA-PA的Nde I/BamH 頂每切結(jié)果；
[0083] 圖6示pET20b-PhtD-PA的Nde I/BamH I酶切電泳鑒定結(jié)果，其中，泳道1示lkb DNA Ladder，泳道2:pET20b-PhtD-PA的Nde I/BamH 頂每切結(jié)果；
[0084] 圖 7示SDS-PAGE電泳鑒定Plym2-PA-BLP，泳道l:Marker，泳道2:BLP，泳道3-4: Plym2-PA-BLP；
[0085] 圖 8示 SDS-PAGE 電泳鑒定 PspA2-PA-BLP，泳道 1: Marker，泳道 2-3: PspA2-PA-BLP， 泳道4:BLP;
[0086] 圖9示SDS-PAGE電泳鑒定PspA4-PA-BLP，泳道 1:Marker，泳道2 : BLP，泳道3-4 : PspA4_PA_BLP;
[0087] 圖 10示SDS-PAGE電泳鑒定PsaA-PA-BLP，泳道 1 :Marker，泳道2 :BLP，泳道3-4 : PsaA-PA-BLP;
[0088] 圖 11示SDS-PAGE電泳鑒定 PcpA-PA-BLP，泳道1: Marker，泳道 2: BLP，泳道 3: PcpA-PA-BLP；
[0089] 圖 12示 SDS-PAGE 電泳鑒定 PthD-PA-BLP，泳道 1: Marker，泳道2: BLP，泳道 3: PthD-PA-BLP；
[0090]圖13示Plym2-PA-BLP疫苗免疫原性檢測結(jié)果，其中13-1示血清特異性IgG，13-2示 局部粘I吳特異性IgA;
[0091] 圖14示PspA2-PA-BLP疫苗免疫原性檢測結(jié)果，其中14-1示血清特異性IgG，14-2示 局部粘I吳特異性IgA;
[0092] 圖15示PspA4-PA-BLP疫苗免疫原性檢測結(jié)果，其中15-1示血清特異性IgG，15-2示 局部粘I吳特異性IgA;
[0093] 圖16示PsaA-PA-BLP疫苗免疫原性檢測結(jié)果，其中16-1示血清特異性IgG，16-2示 局部粘I吳特異性IgA;
[0094]圖17示PcpA-PA-BLP疫苗免疫原性檢測結(jié)果，其中17-1示血清特異性IgG，17-2示 局部粘I吳特異性IgA;
[0095] 圖18示PhtD-PA-BLP疫苗免疫原性檢測結(jié)果，其中18-1示血清特異性IgG，18-2示 局部粘膜特異性IgA;
[0096] 圖19、圖 20示P1ym2-PA-BLP、PspA2-PA-BLP、PspA4-PA-BLP、PsaA-PA-BLP、PcpA-PA-BLP與PhtD-PA-BLP的免疫保護(hù)作用；其中圖19示使用PspA家族1的肺炎鏈球菌進(jìn)行攻毒 后的免疫保護(hù)作用，圖20示使用PspA家族2的肺炎鏈球菌進(jìn)行攻毒后的免疫保護(hù)作用。
【具體實(shí)施方式】
[0097] 本發(fā)明公開了一種肺炎鏈球菌融合蛋白及其疫苗，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文 內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人 員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí) 施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法 和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0098] 本發(fā)明提供的肺炎鏈球菌融合蛋白及其疫苗中所用生物材料、試劑等均可由市場 購得。
[0099] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0100] 實(shí)施例1:編碼目標(biāo)蛋白的核酸序列的獲得
[0101] l.Plym2-PA融合蛋白氨基酸序列的選取，編碼核苷酸序列的獲得
[0102] PA為乳酸乳球菌細(xì)胞壁水解酶ACMA(GenBank:U17696.1)的219-437位氨基酸序 列，如SEQ ID N0:1所示。選擇大腸桿菌偏愛的密碼子對編碼PA氨基酸序列的核苷酸序列進(jìn) 行優(yōu)化，在核酸合成時(shí)5'端引入了BamH I酶切位點(diǎn)與接頭序列，3'端引入了終止密碼子與 Xho I酶切位點(diǎn)，從而獲得了編碼PA蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID N0:2所示。PA的編碼核苷 酸序列委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行基因合成，合成的PA編碼核苷酸序列插入到 pGH質(zhì)粒中。對其進(jìn)行測序，驗(yàn)證無誤。
[0103] Plym2為Ply (肺炎鏈球菌溶血素）的突變體，是將Ply序列(GenBank: NC_003098 ? 1) 中的第428位半胱氨酸突變?yōu)楦拾彼?第433位色氨酸突變?yōu)楸奖彼帷Ｔ撐稽c(diǎn)是決定Ply溶 血活性的重要位點(diǎn)；突變后的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功設(shè)計(jì)和構(gòu) 建了Plym2的表達(dá)載體pRSETB-Plym2,因此本申請中將以該質(zhì)粒為模板通過PCR技術(shù)獲得 ?1丫1112蛋白的核酸序列 ：通過?〇?技術(shù)，以載體口1?￡了8-?171112為模板，以如5￡0 10^):4所示 的序列為5'端引物，以如SEQ ID N0:5所示的序列為3'端引物，獲得如SEQ ID N0:6所示的 核苷酸序列。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：
[0104] PCR反應(yīng)體系為：5 '端引物lyL; 3 '端引物lyL;模板lyL; Taq酶0 ? 5yL; 10 X PCR緩沖 液 5此；dNTP (1 Ommo 1) lyL; MgSCU (50mmo 1) 1 ? fSuL;水39uL 〇
[0105] PCR 反應(yīng)條件為：941€5111111;941€3〇8,571€3〇8,72 1€9〇8(共30個(gè)循環(huán)）；72°(：1〇111111。
[0106]將測序正確的PCR擴(kuò)增的Plym2核苷酸序列連接到T-easy載體(購于PROMEGA)中。 連接體系:T-easy lyL; PCR產(chǎn)物0 ? 5yL; T4連接酶0 ? 5yL; 10 X T4緩沖液1此;水7yL。條件為：16 °C過夜。次日轉(zhuǎn)化到E.coli Top 10(購于天根生化科技有限公司），涂板37°C培養(yǎng)過夜。選取 單克隆接種到5ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。然后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，測序。測序正 確的質(zhì)粒用于酶切操作。
[0107] Plym2-PA蛋白序列為上述Plym2與PA蛋白序列的融合，如SEQ ID N0:7所示； 卩17!112^^編碼核苷酸序列如3￡〇10從):8所示。
[0108] 2. PspA2-PA融合蛋白氨基酸序列的選取，編碼核苷酸序列的獲得
[0109] PA氨基酸序列的選取，編碼核苷酸序列的獲得同前所述。
[0110] PspA2 為肺炎鏈球菌 RX1菌株 PspA(家族1亞類 2)(GenBank:M74122.1)的32-319 位 氨基酸序列，如3￡〇10^):9所示;？叩42核酸序列是以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的表達(dá)載體口￡12013-PsaA-PspA質(zhì)粒為模板通過PCR技術(shù)獲得的。為了蛋白純化的需要，本申請通過PCR技術(shù)在 PspA2序列的N端引入了 6Hi s組氨酸標(biāo)簽;為了表達(dá)載體構(gòu)建的需要，通過PCR技術(shù)在PspA2 序列兩端引入Nde I和BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)。
[0111] 通過?〇?技術(shù)，以載體口￡了2013-?8&4-?8口4為模板，以如3￡0 10勵(lì):10所示的序列為 5'端引物，以如SEQ ID N0:11所示的序列為3'端引物，獲得如SEQ ID N0:12所示的PspA2核 苷酸序列。
[0112] PCR反應(yīng)體系為：5 '端引物lyL; 3 '端引物lyL;模板lyL; Taq酶0 ? 5yL; 10 X PCR緩沖 液 5此；dNTP (1 Ommo 1) lyL; MgSCU (50mmo 1) 1 ? fSuL;水39uL 〇
[0113] PCR 反應(yīng)條件為：94°〇5111111;941€3〇8,571€3〇8,72 1€9〇8(共30個(gè)循環(huán)）；72°(：1〇111111。
[0114] 將測序正確的PCR擴(kuò)增的PspA2核苷酸序列連接到T-easy載體(購于PROMEGA)中。 連接體系:T-easy lyL; PCR產(chǎn)物0 ? 5yL; T4連接酶0 ? 5yL; 10 X T4緩沖液1此;水7yL。條件為：16 °C過夜。次日轉(zhuǎn)化到E.coli Top 10(購于天根生化科技有限公司），涂板37°C培養(yǎng)過夜。選取 單克隆接種到5ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。然后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，測序。測序正 確的質(zhì)粒用于酶切操作。
[0115] ?8口厶2-?厶蛋白序列為上述？8口厶2與卩厶蛋白序列的融合，如3￡〇10觀：13所示 ； ?8口六2^^編碼核苷酸序列如3￡〇10從)：14所示。
[0116] 3. PspA4-PA融合蛋白氨基酸序列的選取，編碼核苷酸序列的獲得
[0117] PA氨基酸序列的選取，編碼核苷酸序列的獲得同前所述。
[0118] PspA4序列為肺炎鏈球菌EF5668菌株的PspA (家族2亞類4) (GenBank: U89711.1)的 32-450位氨基酸序列，如SEQ ID N0:15所示。PspA4核酸序列是以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的表達(dá)載體 pET20b-PspA4質(zhì)粒為模板通過PCR技術(shù)獲得的。為了蛋白純化的需要，本申請通過PCR技術(shù) 在PspA4序列的N端引入了6Hi s組氨酸標(biāo)簽；為了表達(dá)載體構(gòu)建的需要，通過PCR技術(shù)在 PspA4序列兩端引入Nde I和BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)。
[0119] 通過?〇?技術(shù)，以載體口6了2013-?8口44為模板，以如3￡0 10勵(lì):16所示的序列為5'端 引物，以如SEQ ID N0:17所示的序列為3'端引物，獲得如SEQ ID N0:18所示的核苷酸序列。
[0120] PCR反應(yīng)體系為：5 '端引物lyL; 3 '端引物lyL;模板lyL; Taq酶0 ? 5yL; 10 X PCR緩沖 液 5此；dNTP (1 Ommo 1) lyL; MgSCU (50mmo 1) 1 ? fSuL;水39uL 〇
[0121] PCR 反應(yīng)條件為：941€5111111;941€3〇8,571€3〇8,72 1€9〇8(共30個(gè)循環(huán)）；72°(：1〇111111。
[0122] 將測序正確的PCR擴(kuò)增的PspA4核苷酸序列連接到T-easy載體(購于PROMEGA)中。 連接體系:T-easy lyL; PCR產(chǎn)物0 ? 5yL; T4連接酶0 ? 5yL; 10 X T4緩沖液1此;水7yL。條件為：16 °C過夜。次日轉(zhuǎn)化到E.coli Top 10(購于天根生化科技有限公司），涂板37°C培養(yǎng)過夜。選取 單克隆接種到5ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。然后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，測序。測序正 確的質(zhì)粒用于酶切操作。
[0123] ?叩厶4-?厶蛋白序列為上述？8口厶4與卩厶蛋白序列的融合，如3￡〇10觀：19所示； ?8口六4^^編碼核苷酸序列如3￡〇10從):20所示。
[0124] 4. PsaA-PA融合蛋白氨基酸序列的選取，編碼核苷酸序列的獲得
[0125] PA氨基酸序列的選取，編碼核苷酸序列的獲得同前所述。
[0126] PsaA序列為肺炎鏈球菌D39菌株的PsaA(GenBank: P0A4G2.1)的20-309位氨基酸序 列，如SEQ ID ^):21所示。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功設(shè)計(jì)和構(gòu)建了表達(dá)載體?￡12013-?8&4-?8口八， PsaA核酸序列是以該質(zhì)粒為模板通過PCR技術(shù)獲得的。為了蛋白純化的需要，我們通過PCR 技術(shù)在PsaA序列的N端引入了6Hi s組氨酸標(biāo)簽;為了表達(dá)載體構(gòu)建的需要，通過PCR技術(shù)在 PspA4序列兩端引入Nde I和BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)。通過PCR技術(shù)，以載體pET20b-PsaA-PspA 為模板，以如SEQ ID N0:22所示的序列為5'端引物，以如SEQ ID N0:23所示的序列為3'端 引物，獲得如SEQ ID N0:24所示的PsaA核苷酸序列。
[0127] PCR反應(yīng)體系為：5 '端引物lyL; 3 '端引物lyL;模板lyL; Taq酶0 ? 5yL; 10 X PCR緩沖 液 5此；dNTP (1 Ommo 1) lyL; MgSCU (50mmo 1) 1 ? fSuL;水39uL 〇
[0128] PCR 反應(yīng)條件為：941€5111111;941€3〇8,571€3〇8,72 1€9〇8(共30個(gè)循環(huán)）；72°(：1〇111111。
[0129] 將測序正確的PCR擴(kuò)增的PsaA核苷酸序列連接到T-easy載體(購于PROMEGA)中。連 接體系:T-easy lyL; PCR產(chǎn)物0 ? 5yL; T4連接酶0 ? 5yL; 10 X T4緩沖液1此;水7yL。條件為：16 °C 過夜。次日轉(zhuǎn)化到E. co 1 i Top 10 (購于天根生化科技有限公司），涂板37 °C培養(yǎng)過夜。選取單 克隆接種到5ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。然后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，測序。測序正確 的質(zhì)粒用于酶切操作。
[0130] PsaA-PA蛋白序列為上述PsaA與PA蛋白序列的融合，如SEQ ID N0: 25所示;PsaA-PA編碼核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。
[0131 ] 5. PcpA-PA融合蛋白氨基酸序列的選取，編碼核苷酸序列的獲得
[0132] PA氨基酸序列的選取，編碼核苷酸序列的獲得同前所述。
[0133] PcpA 序列為肺炎鏈球菌 TIGR4 菌株的 PcpA(GenBank:NC_003028.3)的 21-463 位氨 基酸序列，如SEQ ID ^):27所示。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功設(shè)計(jì)和構(gòu)建了表達(dá)載體?￡12013-?〇口八， PcpA核酸序列是以該質(zhì)粒為模板通過PCR技術(shù)獲得的。為了蛋白純化的需要，我們通過PCR 技術(shù)在PcpA序列的N端引入了6Hi s組氨酸標(biāo)簽;為了表達(dá)載體構(gòu)建的需要，通過PCR技術(shù)在 PcpA序列兩端引入Nde I和BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)。
[0134] 通過PCR技術(shù)，以載體pET20b-PcpA為模板，以如SEQ ID N0:28所示的序列為5'端 引物，以如SEQ ID N0:29所示的序列為3'端引物，獲得如SEQ ID N0:30所示的核苷酸序列。
[0135] PCR反應(yīng)體系為：5 '端引物lyL; 3 '端引物lyL;模板lyL; Taq酶0 ? 5yL; 10 X PCR緩沖 液 5此；dNTP (1 Ommo 1) lyL; MgSCU (50mmo 1) 1 ? fSuL;水39uL 〇
[0136] PCR 反應(yīng)條件為：941€5111111;941€3〇8,571€3〇8,72 1€9〇8(共30個(gè)循環(huán)）；72°(：1〇111111。
[0137] 將測序正確的PCR擴(kuò)增的PcpA核苷酸序列連接到T-easy載體(購于PROMEGA)中。連 接體系:T-easy lyL; PCR產(chǎn)物0 ? 5yL; T4連接酶0 ? 5yL; 10 X T4緩沖液1此;水7yL。條件為：16 °C 過夜。次日轉(zhuǎn)化到E. co 1 i Top 10 (購于天根生化科技有限公司），涂板37 °C培養(yǎng)過夜。選取單 克隆接種到5ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。然后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，測序。測序正確 的質(zhì)粒用于酶切操作。
[0138] PcpA-PA蛋白序列為上述PcpA與PA蛋白序列的融合，如SEQ ID N0:31所示;PsaA- PA編碼核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示。
[0139] 6. PhtD-PA融合蛋白氨基酸序列的選取，編碼核苷酸序列的獲得
[0140] PA氨基酸序列的選取，編碼核苷酸序列的獲得同前所述。
[0141] 選取肺炎鏈球菌蛋白PhtD(GenBank:AF318955.1)的447-656位氨基酸序列，如SEQ ID N0:33所示。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功設(shè)計(jì)和構(gòu)建了表達(dá)載體pET20b-PhtD，PhtD核酸序列是以 該質(zhì)粒為模板通過PCR技術(shù)獲得的。為了蛋白純化的需要，我們通過PCR技術(shù)在PhtD序列的N 端引入了6His組氨酸標(biāo)簽；為了表達(dá)載體構(gòu)建的需要，通過PCR技術(shù)在PhtD序列兩端引入 Nde I和BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)。
[0142] 通過PCR技術(shù)，以載體pET20b-PhtD為模板，以如SEQ ID N0:34所示的序列為5'端 引物，以如SEQ ID N0:35所示的序列為3'端引物，獲得如SEQ ID N0:36所示的核苷酸序列。
[0143] PCR反應(yīng)體系為：5 '端引物lyL; 3 '端引物lyL;模板lyL; Taq酶0 ? 5yL; 10 X PCR緩沖 液 5此；dNTP (1 Ommo 1) lyL; MgSCU (50mmo 1) 1 ? fSuL;水39uL 〇
[0144] PCR 反應(yīng)條件為：941€5111111;941€3〇8,571€3〇8,72 1€9〇8(共30個(gè)循環(huán)）；72°(：1〇111111。
[0145] 將測序正確的PCR擴(kuò)增的PhtD核苷酸序列連接到T-easy載體(購于PROMEGA)中。連 接體系:T-easy lyL; PCR產(chǎn)物0 ? 5yL; T4連接酶0 ? 5yL; 10 X T4緩沖液1此;水7yL。條件為：16 °C 過夜。次日轉(zhuǎn)化到E. co 1 i Top 10 (購于天根生化科技有限公司），涂板37 °C培養(yǎng)過夜。選取單 克隆接種到5ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。然后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，測序。測序正確 的質(zhì)粒用于酶切操作。
[0146] PhtD-PA蛋白序列為上述PhtD與PA蛋白序列的融合，如SEQ ID N0:37所示;PhtD-PA編碼核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
[0147] 實(shí)施例2:融合蛋白的表達(dá)與疫苗的制備
[0148] 1、表達(dá)載體的構(gòu)建
[0149] 將帶有測序正確的Plym2編碼核酸（SEQ ID N0:6)的質(zhì)粒以Nde I和BamH I雙酶 切，回收Plym2核酸片段;將將帶有測序正確的PA編碼核酸（SEQ ID N0:2)的質(zhì)粒以BamH I 和Xho I雙酶切，回收PA核酸片段;將表達(dá)載體PET20b(購于Novagen公司）以Nde I和Xho I 雙酶切，回收載體片段。將經(jīng)過Nde I/BamH頂每切得到的Plym2片段，經(jīng)過BamH I/Xho I酶 切的PA片段以及經(jīng)過Nde I/Xho頂每切后具有黏性末端的pET20b空載體共連接，然后轉(zhuǎn)化 E.coli Topl0(購于天根生化科技有限公司），加入含有50iig/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基平 板中培養(yǎng)過夜，次日挑克隆到加入含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，第二天 提取質(zhì)粒。用Nde I、BamH I和Xho I酶切后，將酶切鑒定結(jié)果正確的克隆測序，挑選與目的 序列一致的克隆，從而獲得表達(dá)質(zhì)粒pET20b-Plym2-PA。用Nde I/BamH I/Xho頂每切質(zhì)粒進(jìn) 行驗(yàn)證，片段大小正確。酶切結(jié)果分別如圖1所示，對酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序，選取序 列正確的表達(dá)質(zhì)粒。
[0150] 將上述測序正確的pET20b-Plym2-PA質(zhì)粒以Nde I和BamH I雙酶切，回收pET20b-PA核酸片段;將帶有測序正確的PspA2編碼核酸(SEQ ID NO: 12)的質(zhì)粒以Nde I和BamH I雙 酶切，回收PspA2核酸片段;將帶有測序正確的PspA4編碼核酸(SEQ ID NO: 18)的質(zhì)粒以Nde I和BamH I雙酶切，回收PspA4核酸片段;將帶有測序正確的PsaA編碼核酸（SEQ ID N0:24) 的質(zhì)粒以Nde I和BamH I雙酶切，回收PsaA核酸片段;將帶有測序正確的PcpA編碼核酸(SEQ ID N0:30)的質(zhì)粒以Nde I和BamH I雙酶切，回收PcpA核酸片段;將帶有測序正確的PhtD編 碼核酸（3￡〇10如:36)的質(zhì)粒以制61和8&111111雙酶切，回收?1^0核酸片段。分別將經(jīng)過 Nde I/BamH I酶切得到的PspA2片段、PspA4片段、PsaA片段、PcpA片段和PhtD片段，與經(jīng)過 Nde I/BamH I酶切的pET20b-PA核酸片段連接，然后轉(zhuǎn)化E.coli ToplO(購于天根生化科技 有限公司），加入含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)過夜，次日挑克隆到加入 含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，第二天提取質(zhì)粒。用Nde I和BamH頂每切 后，將酶切鑒定結(jié)果正確的克隆測序，挑選與目的序列一致的克隆，從而獲得表達(dá)質(zhì)粒 PA。用Nde I/BamH I酶切質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，片段大小正確。酶切結(jié)果分別如圖2-6所示，對酶切 鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序，選取序列正確的表達(dá)質(zhì)粒。
[0151] 2?在宿主菌中表達(dá)目的蛋白PIym2-PA、PspA2-PA、PspA4-PA、PsaA-PA、PcpA-PA和 PhtD-PA融合蛋白：
[0152] 分別將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)?？凇?2013-?171112-?44￡12013-?8口42-?44￡12013-PspA4-PA、pET20b-PsaA-PA、pET20b-PcpA-PA 與 pET20b-PhtD-PA 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)感 受態(tài)細(xì)胞(購于TransGen Biotech)。用含50iig/ml氨節(jié)青霉素的LB瓊脂平板篩選。挑取單菌 落接種于含50μg/ml氨芐青霉素的5ml LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。次日取50yl過夜培 養(yǎng)物接種于5ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中。37°C振蕩培養(yǎng)約3小時(shí)，至OD600~0.4-0.6時(shí)，添加終濃度ImM的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)，（對照組為不添加 IPTG)，37°C誘導(dǎo)表 達(dá)5-6小時(shí)，4°C下12000rpm離心5分鐘收集細(xì)菌。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及 蛋白質(zhì)免疫印跡(western blotting)鑒定目的蛋白的表達(dá)。
[0153] 3.培養(yǎng)和擴(kuò)增表達(dá)宿主:將蛋白表達(dá)量高的克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)物按1:50 的比例接種于新鮮的含50μg/ml氨芐青霉素的500ml LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)約3小時(shí)， 至OD600~0.4-0.6時(shí)，添加終濃度ImM的IPTG，（對照組為不添加 IPTG)，37°C誘導(dǎo)表達(dá)5-6小 時(shí)，取大量表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液，4°C6000rpm離心30分鐘，收集細(xì)胞沉淀，棄上清。
[0154] 4.BLP的制備:將乳酸乳球菌凍存菌種融化后加入到100mL含葡萄糖的M17液體培 養(yǎng)基中，30 °C靜止培養(yǎng)過夜。次日，按照1:50 (v: v)的比例轉(zhuǎn)接到1L Ml7液體培養(yǎng)基中，30 °C 靜止培養(yǎng)過夜。次日，離心收集菌體。將上述乳酸乳球菌菌體用注射用水洗滌三次，然后重 懸，加入終濃度為10%的三氯乙酸(TCA);加熱至72°C，孵育2h降解菌體表面蛋白和細(xì)胞內(nèi) 核酸與蛋白，然后離心去上清，將沉淀用PBS重懸洗滌;反復(fù)洗滌三次去除TCA和降解的核酸 與蛋白，再次重懸到PBS中，即得到了BLP。
[0155] 5 ? BLP 技術(shù)疫苗P1 ym2-PA-BLP、PspA2-PA-BLP、PspA4-PA-BLP、PsaA-PA-BLP、PcpA-PA-BLP 與 PhtD-PA-BLP 的制備：
[0156] 按照上述確定的表達(dá)條件大量表達(dá)Plym2-PA、PspA2-PA、PspA4-PA、PsaA-PA、 PcpA-PA與PhtD-PA融合蛋白，離心收集表達(dá)的菌體，SDS-PAGE確定各目的蛋白的表達(dá)情況。 將表達(dá)菌體超聲破碎:整個(gè)超聲破碎過程中在冰浴中進(jìn)行，超聲功率設(shè)定為37 %，超聲時(shí)間 為20min。經(jīng)過超聲破碎之后，將破碎的菌體分裝到離心筒中進(jìn)行離心，條件為12000rpm/ min，離心30min。結(jié)束后，用吸管取出上清液避免渾濁，然后將上清液用0.22mi濾膜進(jìn)行過 濾去除顆粒雜質(zhì)。將超聲后的表達(dá) PhtD-PA融合蛋白的上清分別加入到制備的BLP溶液中，在室溫條件下振蕩結(jié)合30min。 13000rpm離心10min，將沉淀用PBS重懸洗滌，重復(fù)洗滌5次。將經(jīng)過洗滌的Plym2-PA-BLP、 PspA2-PA-BLP、PspA4-PA-BLP、PsaA-PA-BLP、PcpA-PA-BLP 與 PhtD-PA-BLP 重懸于 PBS 溶液 中。
[0157] 用BLP定量法進(jìn)行定量，SDS-PAGE確定結(jié)合情況。Plym2-PA-BLP疫苗的SDS-PAGE電 泳結(jié)果如圖7,與BLP對照相比，Plym2-PA-BLP在80kD處有一條明顯條帶，其大小與Plym2-PA 蛋白相符，表明Plym2-PA融合蛋白結(jié)合到了 BLP上；
[0158] PspA2-PA-BLP疫苗的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖8,與BLP對照相比，PspA2-PA-BLP在 70kD處有一條明顯條帶，其大小與PspA2-PA蛋白相符，表明PspA2-PA融合蛋白結(jié)合到了 BLP 上；
[0159] PspA4-PA-BLP疫苗的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖9,與BLP對照相比，PspA4-PA-BLP在 95kD處有一條明顯條帶，其大小與PspA4-PA蛋白相符，表明PspA4-PA融合蛋白結(jié)合到了 BLP 上；
[0160] PsaA-PA-BLP疫苗的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖10,與BLP對照相比，PsaA-PA-BLP在 65kD處有一條明顯條帶，其大小與PsaA-PA蛋白相符，表明PsaA-PA融合蛋白結(jié)合到了 BLP 上；
[0161] PcpA-PA-BLP疫苗的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖11，與BLP對照相比，PcpA-PA-BLP在 90kD處有一條明顯條帶，其大小與PcpA-PA蛋白相符，表明PcpA-PA融合蛋白結(jié)合到了 BLP 上；
[0162] PhtD-PA-BLP疫苗的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖12,與BLP對照相比，PhtD-PA-BLP在 55kD處有一條明顯條帶，其大小與PhtD-PA蛋白相符，表明PhtD-PA融合蛋白結(jié)合到了 BLP 上。
[0163] 結(jié)論:通過該實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)，可以獲得大量BLP技術(shù)疫苗?171112^^-81^、？8口42^^-BLP、PspA4-PA-BLP、PsaA-PA-BLP、PcpA-PA-BLP與PhtD-PA-BLP。
[0164] 實(shí)施例3:疫苗的免疫原性檢測
[0165] 將BALB/c小鼠（16-18g)隨機(jī)分組，每組6只。分別將溶于PBS中的Plym2-PA-BLP、 PspA2-PA-BLP、PspA4-PA-BLP、PsaA-PA-BLP、PcpA-PA-BLP 與 PhtD-PA-BLP 進(jìn)行小鼠鼻腔免 疫，按照BLP的量計(jì)算0.3mg/只小鼠，進(jìn)行3次鼻腔免疫；陰性對照為PBS加 BLP，按照BLP的量 計(jì)算0.3mg/只小鼠，也進(jìn)行鼻腔粘膜免疫3次;每次免疫間隔14天。皮下免疫對照組為本實(shí) 驗(yàn)室純化的？1}〇112、？8口厶2、？8口厶4、？83厶、？〇口厶或？1^0蛋白，20邱蛋白每只小鼠與100邱八1 (〇H) 3佐劑混勻，用以上混合劑分別后背皮下三點(diǎn)免疫小鼠，共免疫3次，每次間隔14天。在 最后一次免疫14天后，對小鼠取血和支氣管-肺泡灌洗液(BALF)，分別檢測血清中特異性 IgG及BALF中特異性IgA的效價(jià)。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA檢測血清中IgG與BALF中IgA的 抗體水平。
[0166] 血清IgG抗體水平檢測方法簡述如下：首先分別用本實(shí)驗(yàn)室純化的Plym2、PspA2、 PspA4、PsaA、PcpA或PhtD ELISA檢測用抗原包被ELISA反應(yīng)板，4°C孵育過夜；次日用3 %牛 血清白蛋白（BSA)封閉ELISA反應(yīng)板孵育2小時(shí);然后加入10倍系列稀釋的免疫血清，37°C孵 育45分鐘；用PBS-T(PH7 ? 4，0 ? 5%Tween20)洗滌ELISA板后，加入lOOyLl: 10000稀釋的辣根 過氧化物酶(HRP)-標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），37°C孵 育45分鐘；洗板后，加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB，購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）顯 色15分鐘；顯色結(jié)束后加入2mol H2S〇4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)檢測儀(BI0-RAD公司）在450nm波長 下檢測吸光度。抗體效價(jià)為血清抗體滴度的負(fù)對數(shù)。
[0167] BALF中IgA的抗體水平檢測方法簡述如下：首先分別用本實(shí)驗(yàn)室純化的Plym2、 ?8口六2、？8?44、？8&4、？〇?4或?1^0蛋白抗原包被￡1^4反應(yīng)板，4°(：孵育過夜；次日用3%牛血 清白蛋白（BSA)封閉ELISA反應(yīng)板孵育2小時(shí);然后加入系列稀釋的BALF洗液，37°C孵育45分 鐘；用PBS-T(PH7.4，0.5 % Tween20)洗滌ELISA板后，加入lOOyLl: 1000稀釋的辣根過氧化物 酶(HRP)-標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgA抗體二抗(天津三箭），37°C孵育45分鐘；洗板后，加入四甲 基聯(lián)苯胺（TMB，購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）顯色15分鐘；顯色結(jié)束后加入 2mol H2S〇4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)檢測儀(BI0-RAD公司）在450nm波長下檢測吸光度。抗體效價(jià)為 血清抗體滴度的負(fù)對數(shù)。
[0168] BLP技術(shù)疫苗P1 ym2-PA-BLP、PspA2-PA-BLP、PspA4-PA-BLP、PsaA-PA-BLP、PcpA-PA-BLP與PhtD-PA-BLP血清IgG水平與BALF粘膜IgA水平檢測結(jié)果如圖13~圖18所示。
[0169] 結(jié)論：如圖13~圖18所示，與對照組(BLP)相比，將蛋白結(jié)合到BLP表面制備成BLP 技術(shù)疫苗時(shí)，即 BLP 技術(shù)疫苗 Plym2-PA-BLP、PspA2-PA-BLP、PspA4-PA-BLP、PsaA-PA-BLP、 PcpA-PA-BLP與PhtD-PA-BLP疫苗，鼻腔粘膜免疫后不僅可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的血清特 異性IgG，同時(shí)也能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的局部粘膜特異性IgA。蛋白皮下免疫后可以誘導(dǎo) 機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的血清特異性IgG，但是不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生局部粘膜特異性IgA。
[0170] 實(shí)施例4:疫苗的免疫保護(hù)作用
[0171 ] 1.使用PspA家族1的肺炎鏈球菌進(jìn)行攻毒
[0172] 分別將制備的 PI ym2-PA-BLP 單獨(dú)、PsaA-PA-BLP 單獨(dú)、PcpA-PA-BLP 單獨(dú)、PhtD-PA-BLP 單獨(dú)、 PspA2-PA-BLP 單獨(dú)、 PspA4-PA-BLP 單獨(dú)或 PspA2-PA-BLP 與 PspA4-PA-BLP 聯(lián)合進(jìn)行 小鼠鼻腔免疫。作為陰性對照，將等體積的PBS與BLP混合均勻進(jìn)行鼻腔免疫。BLP技術(shù)疫苗 無論是單獨(dú)免疫還是聯(lián)合免疫，使用劑量按BLP量計(jì)算均為0.3mg每只小鼠。取6~8周齡 BALB/c雌性小鼠，將其隨機(jī)分組，每組10只。用以上疫苗分別進(jìn)行小鼠鼻腔免疫，共免疫3 次，每次間隔14天。作為陽性對照，選用市售23價(jià)多糖肺炎疫苗，免疫方式為后背皮下，按疫 苗說明只免疫一次與蛋白組第一次免疫(簡稱"一免"）同時(shí)進(jìn)行，免疫劑量為人免疫劑量的 1/5，100此每只小鼠。末次免疫后第14天，用肺炎鏈球菌ATCC10813菌株(PspA分型家族1亞 類2)進(jìn)行攻毒(菌株均購于美國菌種保藏中心）。攻毒方式為鼻腔攻毒，攻毒劑量為致死劑 量(10 5CFU/只小鼠）。攻毒后14天為生存觀察期。如圖19所示，結(jié)果如下：
[0173] (1)與對照組(BLP)相比，使用BLP技術(shù)疫苗Plym2-PA_BLP單獨(dú)、PsaA-PA-BLP單獨(dú)、 PcpA-PA-BLP 單獨(dú)、PhtD-PA-BLP 單獨(dú)、PspA2-PA-BLP 單獨(dú)、PspA4-PA-BLP 單獨(dú)或 PspA2-PA-BLP與PspA4-PA-BLP聯(lián)合以及23價(jià)多糖肺炎疫苗進(jìn)行免疫的小鼠的存活率都有所提高。
[0174] (2奸叩42-?4-81^與？叩44-?4-81^無論是單獨(dú)免疫還是聯(lián)合免疫對攻毒小鼠的保 護(hù)作用都可以達(dá)到100%的保護(hù)率，優(yōu)于其他幾種BLP技術(shù)疫苗和23價(jià)肺炎多糖疫苗（23-valent PPV);雖然PspA4蛋白屬于家族2的蛋白，但是PspA4-PA-BLP疫苗免疫后對PspA家族 1菌株的攻毒小鼠也可以達(dá)到很高的保護(hù)率，說明PspA蛋白免疫后具有交叉保護(hù)性。
[0175] (3)雖然23價(jià)肺炎多糖疫苗組免疫后對攻毒小鼠有一定的保護(hù)性，但是這種保護(hù) 作用遠(yuǎn)不如PspA2-PA-BLP與PspA4-PA-BLP疫苗組對攻毒小鼠的保護(hù)率。
[0176] 2.使用PspA家族2的肺炎鏈球菌進(jìn)行攻毒
[0177] 分別將制備的 PI ym2-PA-BLP 單獨(dú)、PsaA-PA-BLP 單獨(dú)、PcpA-PA-BLP 單獨(dú)、PhtD-PA- BLP 單獨(dú)、PspA2-PA-BLP 單獨(dú)、PspA4-PA-BLP 單獨(dú)或 PspA2-PA-BLP 與 PspA4-PA-BLP 聯(lián)合進(jìn)行 小鼠鼻腔免疫。作為陰性對照，將等體積的PBS與BLP混合均勻進(jìn)行鼻腔免疫。BLP技術(shù)疫苗 無論是單獨(dú)免疫還是聯(lián)合免疫，使用劑量按BLP量計(jì)算均為0.3mg每只小鼠。取6~8周齡 BALB/c雌性小鼠，將其隨機(jī)分組，每組10只。用以上疫苗分別進(jìn)行小鼠鼻腔免疫，共免疫3 次，每次間隔14天。作為陽性對照，選用市售23價(jià)多糖肺炎疫苗，免疫方式為后背皮下，按疫 苗說明只免疫一次與蛋白組第一次免疫(簡稱"一免"）同時(shí)進(jìn)行，免疫劑量為人免疫劑量的 1/5，100此每只小鼠。末次免疫后第14天，用肺炎鏈球菌ATCC6303菌株(PspA分型家族2亞類 5)進(jìn)行攻毒(菌株均購于美國菌種保藏中心）。攻毒方式為鼻腔攻毒，攻毒劑量均為致死劑 量(2.2X106CFU/只小鼠）。攻毒后14天為生存觀察期。如圖20所示，結(jié)果如下：
[0178] (1)與對照組(BLP)相比，使用BLP技術(shù)疫苗Plym2-PA_BLP單獨(dú)、PsaA-PA-BLP單獨(dú)、 PcpA-PA-BLP 單獨(dú)、PhtD-PA-BLP 單獨(dú)、PspA2-PA-BLP 單獨(dú)、PspA4-PA-BLP 單獨(dú)或 PspA2-PA-BLP與PspA4-PA-BLP聯(lián)合以及23價(jià)多糖肺炎疫苗進(jìn)行免疫的小鼠的存活率都有所提高。
[0179] (2 )PspA2-PA-BLP與PspA4-PA-BLP無論是單獨(dú)免疫還是聯(lián)合免疫對攻毒小鼠都有 很好的保護(hù)作用；雖然PspA2蛋白屬于家族1的蛋白，但是PspA2-PA-BLP疫苗免疫后對PspA 家族2菌株的攻毒小鼠也可以達(dá)到很高的保護(hù)率，說明PspA蛋白免疫后具有交叉保護(hù)性。 [0180] (3)雖然23價(jià)肺炎多糖疫苗組免疫后對攻毒小鼠有一定的保護(hù)性，但是這種保護(hù) 作用遠(yuǎn)不如PspA2-PA-BLP與PspA4-PA-BLP聯(lián)合疫苗組對攻毒小鼠的保護(hù)率。
[0181] 結(jié)論：
[0182] 本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)說明，與對照組相比，Plym2-PA_BLP單獨(dú)、PsaA-PA-BLP單獨(dú)、 PcpA-PA-BLP 單獨(dú)、PhtD-PA-BLP 單獨(dú)、PspA2-PA-BLP 單獨(dú)、PspA4-PA-BLP 單獨(dú)或 PspA2-PA-BLP與PspA4-PA-BLP聯(lián)合免疫對兩株肺炎鏈球菌的攻毒小鼠都用一定的保護(hù)作用。PspA2-PA-BLP與PspA4-PA-BLP無論是單獨(dú)免疫還是聯(lián)合免疫都有很好的保護(hù)作用，聯(lián)合免疫后對 不同PspA分型的肺炎鏈球菌菌株的攻毒小鼠都可以達(dá)到100%保護(hù)。因此，本發(fā)明的BLP技 術(shù)疫苗可以用作鼻腔免疫的免疫原，用作疫苗。
[0183] PspA2-PA-BLP與PspA4-PA-BLP聯(lián)合免疫對PspA分型家族1與家族2的攻毒菌株均 具有很好的保護(hù)作用。本發(fā)明的幾種BLP疫苗可以相互組合作為聯(lián)合疫苗或與其他肺炎鏈 球菌蛋白聯(lián)合使用，通過相互組合或與其他蛋白的聯(lián)合達(dá)到更優(yōu)的保護(hù)效果。
[0184] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為肺炎鏈球菌毒力蛋白基因和蛋白連接 器基因重組后的表達(dá)產(chǎn)物，所述肺炎鏈球菌毒力蛋白為Ply、PspA、PsaA、P CpASPhtD。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白連接器為乳酸乳球菌細(xì)胞壁 水解酶ACMA細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)域全序列或截短序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Ply為Ply蛋白全序列或截短序 列，或突變減毒序列； 所述PspA為PspA亞類1、亞類2、亞類3、亞類4或亞類5中任何一個(gè)亞類的全序列或截短 序列，或者突變序列，或者PspA亞類1、亞類2、亞類3、亞類4或亞類5中兩個(gè)或兩個(gè)以上亞類 的全部或部分序列的融合蛋白； 所述PsaA為PsaA蛋白全序列或截短序列； 所述PcpA為PcpA蛋白全序列或截短序列； 所述PhtD為PhtD蛋白全序列或截短序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述PspA為PspA亞類2的α螺旋區(qū)，所 述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:13所示;所述PspA為PspA亞類4,所述融合蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID NO: 19所示。5. -種編碼權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述融合蛋白的融合基因。6. -種包含權(quán)利要求5所述融合基因的重組表達(dá)載體。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體為包含權(quán)利要 求5所述融合基因的質(zhì)粒;更優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體為包含權(quán)利要求5所述融合基因的 pET20b 質(zhì)粒。8. -種包含權(quán)利要求6或7所述的重組表達(dá)載體的細(xì)胞，所述細(xì)胞為原核細(xì)胞;優(yōu)選地， 所述細(xì)胞為大腸桿菌;最優(yōu)選地，所述細(xì)胞為大腸桿菌BL21。9. 一種權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括： 將權(quán)利要求5所述的融合基因插入表達(dá)載體，將所得的重組表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，使所述 融合基因表達(dá)生成所述融合蛋白。10. -種肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗，其特征在于，包括權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的融 合蛋白和細(xì)菌樣顆粒。11. 一種權(quán)利要求10所述肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗的制備方法，其特征在于，包括： 將融合蛋白與細(xì)菌樣顆?；旌?，在4~30 °C條件下結(jié)合20~60分鐘，通過離心或超濾的 方法去除未結(jié)合的融合蛋白，得到肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗。12. -種肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗組合物，其特征在于，包括權(quán)利要求10所述肺炎鏈球 菌重組蛋白疫苗。13. 權(quán)利要求10所述肺炎鏈球菌重組蛋白疫苗或權(quán)利要求12所述的組合物在制備預(yù)防 肺炎鏈球菌感染的疫苗中的應(yīng)用。14. 一種細(xì)菌樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述細(xì)菌樣顆粒為通過培養(yǎng)革蘭陽性 菌，然后通過熱酸處理培養(yǎng)的菌體得到;優(yōu)選地，所述革蘭陽性菌為乳酸乳球菌，熱酸處理 為終濃度為10%的三氯乙酸72°C處理2個(gè)小時(shí)。
【文檔編號】A61K39/09GK105968213SQ201610416667
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月14日
【發(fā)明人】孔維, 吳永革, 盧井才, 王丹丹, 董運(yùn)亮, 侯宏嘉, 谷鐵軍, 姜春來
【申請人】長春百克生物科技股份公司, 吉林大學(xué)