具有提高免疫活性的黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物及其制備方法，黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物由摩爾比為0.33:17.03:1.00:0.41的甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖組成；黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物分子量為715.17kDa。本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)選提取分離工藝，采用水提醇沉法得到粗多糖，再脫蛋白，然后采用DEAE?52纖維素樹脂進(jìn)行純化，制得純度高的黃蜀葵莖葉多糖，再采用酸法水解得到黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物。本發(fā)明充分利用廢棄的黃蜀葵莖葉資源，變廢為寶，得到可提高免疫活性的黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物，可實(shí)現(xiàn)中藥資源的可持續(xù)化應(yīng)用，具有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說明】
具有提高免疫活性的黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物及其制 備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種植物多糖，具體涉及一種具有提高免疫活性的黃蜀葵莖葉多糖的 酸法降解產(chǎn)物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥資源是保障國民健康、發(fā)展民族醫(yī)藥的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。近年來中藥及天然藥用生 物資源的生產(chǎn)面積已超過2.40 X 106hm2，藥材產(chǎn)量可達(dá)5.40 X 106t，而廢棄的植物根系以及 地上莖葉的生物量高達(dá)1.1 X 107~1.6 X 107t，是藥材產(chǎn)量2~3倍，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi) 和環(huán)境污染。因此，在中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程中提高藥用生物資源的利用價(jià)值、尤其是提升其 藥用價(jià)值，對于中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展以及發(fā)展資源節(jié)約型、環(huán)境友好型的經(jīng)濟(jì)具有重大 意義。
[0003] 黃蜀葵(Abelmoschus manihot L.Medic)為錦葵科秋葵屬植物，始載于《嘉祐本 草》，《本草綱目》中記載："其花氣味甘、寒、滑、無毒，主治小便淋及催生，治諸惡瘡膿水久不 瘥者，作末敷之即愈，為瘡家要藥"等。其根、莖、葉均具有一定的藥用價(jià)值。黃蜀葵花為主要 用藥部位，在采收過程中其莖葉部分多被丟棄或是焚燒，造成了黃蜀葵莖葉資源的極大浪 費(fèi)以及環(huán)境的污染。
[0004] 多糖作為一類重要的生物大分子，具有廣泛的生物活性，在食品、醫(yī)藥和化妝品等 領(lǐng)域應(yīng)用廣闊。然而，天然多糖的分子質(zhì)量大、水溶性差，不利于吸收以及生物活性的發(fā)揮， 極大地限制了多糖的發(fā)展和應(yīng)用；大量研究表明，小分子多糖在某些方面具有比大分子多 糖更好的生物活性。因此，降解植物多糖已成為開發(fā)、提高多糖生物活性的重要方向之一。 酸水解法是利用植物多糖在酸性溶液中不穩(wěn)定、易發(fā)生糖苷鍵的斷裂，形成的多糖片段具 有一定的分子量分布。酸法降解操作較簡便，降解速度可控，在實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用較普遍。
[0005] 目前，國內(nèi)外對黃蜀葵莖葉多糖的研究主要集中在理化性質(zhì)以及單糖的分析，對 其活性的研究較少。因此，應(yīng)用酸法水解改變黃蜀葵莖葉多糖的結(jié)構(gòu)、改善其理化性質(zhì)，獲 得真正具有活性的多糖，對黃蜀葵莖葉資源的高效利用以及生態(tài)環(huán)境的保護(hù)意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，以黃蜀葵莖葉廢棄物為原 料，通過優(yōu)選方法制備得到黃蜀葵莖葉粗多糖，然后采用酸法水解，得到具有提高免疫活性 的黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解 產(chǎn)物的制備方法和其應(yīng)用。本發(fā)明充分利用廢棄的黃蜀葵莖葉資源，變廢為寶，得到可提高 免疫活性的黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物，可實(shí)現(xiàn)中藥資源的可持續(xù)化應(yīng)用，具有很好 的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)環(huán)境的保護(hù)意義。
[0007] 技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0008] -種黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物，黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物由摩爾比 為0.33:17.03:1.00:0.41的甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖組成;黃蜀葵莖葉多糖的 酸法降解產(chǎn)物分子量為715.17kDa。
[0009] 本發(fā)明所述的黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物的制備方法，包括以下步驟：
[0010] (1)取黃蜀葵莖葉乙醇提取后的藥渣，加入藥渣重量10~30倍體積的水，回流提取 2~3次，每次1~2小時(shí)，過濾，合并濾液，減壓濃縮;Sevag法除蛋白，離心，取上清液，加入無 水乙醇，醇沉過夜，抽濾，取沉淀，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，烘干，得黃蜀葵莖葉粗 多糖；
[0011] (2)黃蜀葵莖葉粗多糖的分級
[0012] 稱取步驟（1)制備得到的黃蜀葵莖葉粗多糖，加蒸餾水溶解，加樣于DEAE-52層析 柱中，用0.0、0.1、0.3、0.5111 〇1/1^&(：1溶液梯度洗脫，并采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量，分 別收集不同的洗脫峰，減壓濃縮，透析，最后將透析液真空冷凍干燥，獲得黃蜀葵莖葉多糖；
[0013] (3)黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解
[0014]取步驟(2)制備得到的黃蜀葵莖葉多糖，溶于酸中，攪拌水解，反應(yīng)結(jié)束后，用NaOH 調(diào)節(jié)pH至中性，將溶液置于透析袋內(nèi)透析，取透析液減壓濃縮，凍干，得黃蜀葵莖葉多糖的 酸法降解產(chǎn)物。
[0015] 作為優(yōu)選方案，以上所述的黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物的制備方法，步驟(3) 為:取步驟(2)制備得到的黃蜀葵莖葉多糖40mg，溶于20mL 0 . Olmol/L鹽酸，于50°C攪拌水 解3h，反應(yīng)結(jié)束后，用0.05mol/LNa0H調(diào)節(jié)pH至中性，將溶液置于透析袋內(nèi)透析，取透析液減 壓濃縮，凍干，得黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物。
[0016] 本發(fā)明所述的黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物在制備提高免疫力的藥物或保健 品中的應(yīng)用。
[0017] 作為優(yōu)選方案，以上所述的黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物在制備提高免疫力的 藥物或保健品中的應(yīng)用，把黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物和藥學(xué)上可接受的載體制成片 劑、膠囊劑、顆粒劑或微囊劑型的藥物。
[0018] 本發(fā)明在制成片劑時(shí)，將黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物和載體乳糖或玉米淀粉 混合均勻，需要時(shí)加入潤滑劑硬脂酸鎂，混合均勻，然后壓片制成片劑。
[0019] 在制成膠囊劑時(shí)，將黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物和載體乳糖或玉米淀粉混合 均勻，整粒，然后裝膠囊制成膠囊劑。
[0020] 本發(fā)明在制成顆粒劑時(shí)，把黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物和稀釋劑乳糖或玉米 淀粉混合均勾，整粒，干燥，制成顆粒劑。
[0021] 有益效果:本發(fā)明提供的具有提高免疫活性的黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物和 現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0022] 1、本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)選提取分離工藝，首先采用水提醇沉法得到粗多糖，再 脫除蛋白，然后采用DEAE-52纖維素樹脂進(jìn)行純化，制得純度高的黃蜀葵莖葉多糖，然后再 酸進(jìn)行水解，然后純化，得到黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物。
[0023] 本發(fā)明充分利用廢棄的黃蜀葵莖葉資源，變廢為寶，制備得到可提高免疫活性的 黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物，可實(shí)現(xiàn)中藥資源的可持續(xù)化應(yīng)用，具有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值 和生態(tài)環(huán)境的保護(hù)意義。
[0024] 2、本發(fā)明經(jīng)過體外小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖活性試驗(yàn)表明，黃蜀葵莖葉多糖并無明 顯的免疫調(diào)節(jié)活性，但是經(jīng)酸法降解產(chǎn)物，在25~200yg/mL劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出顯著的免疫 調(diào)節(jié)活性，在50yg/mL時(shí)具有最高的增殖作用，增值率為1.291，25yg/mL的增殖作用最低，為 1.206,而修飾前的最高刺激指數(shù)僅為1.078。取得了非常好的預(yù)料不到的技術(shù)效果。
【附圖說明】
[0025]圖1為黃蜀葵莖葉多糖及其酸法降解產(chǎn)物的脾細(xì)胞增殖活性柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限 制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0027]實(shí)施例1黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物的制備方法，包括以下步驟：
[0028] (1)黃蜀葵莖葉粗多糖的制備
[0029]取黃蜀葵莖葉粗粉100g，加入30倍量水，100 °C水浴回流提取3次，每次lh。過濾，合 并濾液，減壓濃縮。Sevag法除蛋白，離心(4000r/min，lOmin)，取上清液，加入四倍體積的無 水乙醇，醇沉過夜，抽濾，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌三次，50°C烘干，即得黃蜀葵 莖葉粗多糖。
[0030] (2)黃蜀葵莖葉粗多糖的分級
[0031]稱取粗多糖3g，加適量蒸餾水溶解，配制質(zhì)量濃度為30mg/mL的多糖溶液，加樣于 0￡八￡-52層析柱中。用0.0、0.1、0.3、0.5111〇1/〇^(：1溶液梯度洗脫，流速1.011117111111(10111111/ 管），采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量，分別收集不同的洗脫峰，減壓濃縮，透析，最后將透析 液真空冷凍干燥，獲得黃蜀葵莖葉多糖。
[0032] (3)黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解
[0033] 取步驟(2)制備得到的黃蜀葵莖葉多糖，采用稀鹽酸進(jìn)行降解。準(zhǔn)確稱取黃蜀葵莖 葉多糖40mg，溶于20mL 0.01mol/L鹽酸于50°C攪拌水解3h，反應(yīng)結(jié)束后，用0.05mol/LNa0H 調(diào)節(jié)pH至中性，將溶液置于透析袋內(nèi)透析3天，減壓濃縮，凍干，得黃蜀葵莖葉多糖的酸法降 解產(chǎn)物。
[0034] 實(shí)施例2黃蜀葵莖葉多糖及其酸法降解產(chǎn)物的總糖以及糖醛酸含量的測定
[0035] 1、實(shí)驗(yàn)方法：以D-無水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測定硫酸化修飾前后黃 蜀葵莖葉多糖的總糖含量;采用間羥聯(lián)苯法測定糖醛酸含量，以D-葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品。 [0036] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：黃蜀葵莖葉多糖的總糖含量99.76%，降解產(chǎn)物的總糖含量有所下 降，為80.68% ;黃蜀葵莖葉多糖在降解前不含糖醛酸，降解后亦不含糖醛酸，這與單糖組成 的結(jié)果是一致的。
[0037]實(shí)施例3黃蜀葵莖葉多糖及其酸法降解產(chǎn)物單糖組成分析 [0038] 1、實(shí)驗(yàn)方法:采用三氟乙酸水解多糖樣品，以混合單糖為標(biāo)準(zhǔn)品，PMP衍生多糖樣 品以及混標(biāo)，利用高效液相色譜法根據(jù)出峰時(shí)間確定單糖的組成，根據(jù)峰面積繪制各單糖 的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品的單糖含量。
[0039] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:單糖組成分析，如表1所示：
[0040] 表1黃蜀葵莖葉多糖及其酸法降解產(chǎn)物的單糖組成摩爾比
[0042] 黃蜀葵莖葉多糖及酸解產(chǎn)物的單糖組成的摩爾比如表1所示，黃蜀葵莖葉多糖由 甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖組成，其中葡萄糖的含量最多，其它三種糖的含量較 少。酸法降解后，降解產(chǎn)物的葡萄糖比例有所降低，降解成功。
[0043] 實(shí)施例4黃蜀葵莖葉多糖及其酸法降解產(chǎn)物分子量的測定
[0044] 1、實(shí)驗(yàn)方法:采用HPGPC-ELSD法測定黃蜀葵莖葉多糖酸降解前后的分子量，以葡 聚糖T系列為標(biāo)準(zhǔn)分子量制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0045] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果:黃蜀葵莖葉多糖在鹽酸降解前的分子量為760.24kDa，黃蜀葵莖葉多 糖降解后的分子量為715.17kDa。
[0046]實(shí)施例5黃蜀葵莖葉多糖及其酸法降解產(chǎn)物對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) [0047] 1、實(shí)驗(yàn)方法:無菌取脾，制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為6 X 106個(gè)/mL， 于96孔板接種1 OOyL/孔，再分別加入培養(yǎng)液(空白對照）、1 Oyg/mL ConA(刀豆球蛋白A，陽性 對照)及不同濃度的本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的黃蜀葵莖葉多糖及其酸法降解產(chǎn)物溶液各 100此/孔，每個(gè)濃度均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，混合均勻后置于37 °C、5 % C02培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每 孔加入MTT(5mg/mL) 10yL，于上述條件中繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心棄上清，加入lOOyL DMS0，充分震 蕩后用酶標(biāo)儀測定波長570nm的吸光值。
[0048]淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)=樣品組吸光值/空白對照組吸光值 [0049] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0050] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，圖1中a表示與對照組相比，增強(qiáng)作用差異顯著(p<0.05) ;b 表示與對照組相比，增強(qiáng)作用差異極顯著(P<〇.01) ;c表示與對照組相比，增強(qiáng)作用差異極 其顯著(p<0.001) ;d表示與黃蜀葵莖葉多糖組相比，增強(qiáng)作用差異顯著(p<0.05) ;e表示 與黃蜀葵莖葉多糖組相比，增強(qiáng)作用差異極顯著(P<〇.01)。對照組的增殖指數(shù)為1.001，陽 性組為1.656。
[00511由圖1結(jié)果表明：與對照組相比，黃蜀葵莖葉多糖在25~200yg/mL濃度范圍內(nèi)不能 刺激脾淋巴細(xì)胞的增殖，而黃蜀葵莖葉多糖酸降解產(chǎn)物具有顯著的促增殖作用。黃蜀葵莖 葉多糖酸降解產(chǎn)物在各劑量的增殖指數(shù)相差不大，在50yg/mL時(shí)具有最高的增殖作用，增值 率為1.291，25yg/mL的增殖作用最低，為1.206,而修飾前的最高刺激指數(shù)僅為1.078,取得 了非常好的技術(shù)效果。
[0052]以上實(shí)施方式只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的 人了解本
【發(fā)明內(nèi)容】
并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí) 質(zhì)所做的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物，其特征在于，黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn) 物由摩爾比為0.33:17.03:1.00:0.41的甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成;黃蜀葵莖 葉多糖的酸法降解產(chǎn)物分子量為715.17kDa。2. 權(quán)利要求1所述的黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 取黃蜀葵莖葉乙醇提取后的藥渣，加入藥渣重量10~30倍體積的水，回流提取2~3 次，每次1~2小時(shí)，過濾，合并濾液，減壓濃縮;Sevag法除蛋白，離心，取上清液，加入無水乙 醇，醇沉過夜，抽濾，取沉淀，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，烘干，得黃蜀葵莖葉粗多糖； (2) 黃蜀葵莖葉粗多糖的分級 稱取步驟（1)制備得到的黃蜀葵莖葉粗多糖，加蒸餾水溶解，加樣于DEAE-52層析柱中， 用0.0、0.1、0.3、0.5mol/LNaCl溶液梯度洗脫，并采用苯酚-硫酸法檢測多糖含量，分別收集 不同的洗脫峰，減壓濃縮，透析，最后將透析液真空冷凍干燥，獲得黃蜀葵莖葉多糖； (3) 黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解 取步驟⑵制備得到的黃蜀葵莖葉多糖，溶于酸中，攪拌水解，反應(yīng)結(jié)束后，用NaOH調(diào)節(jié) pH至中性，將溶液置于透析袋內(nèi)透析，取透析液減壓濃縮，凍干，得黃蜀葵莖葉多糖的酸法 降解產(chǎn)物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，步 驟(3)為:取步驟(2)制備得到的黃蜀葵莖葉多糖40mg，溶于20mL 0.01 mo 1 /L鹽酸，于50°C攪 拌水解3h，反應(yīng)結(jié)束后，用0.05mol/LNa0H調(diào)節(jié)pH至中性，將溶液置于透析袋內(nèi)透析，取透析 液減壓濃縮，凍干，得黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物。4. 權(quán)利要求1所述的黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物在制備提高免疫力的藥物或保健 品中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物在制備提高免疫力的藥物或 保健品中的應(yīng)用，其特征在于，把黃蜀葵莖葉多糖的酸法降解產(chǎn)物和藥學(xué)上可接受的載體 制成片劑、膠囊劑、顆粒劑或微囊劑型的藥物。
【文檔編號(hào)】A61K36/185GK105968221SQ201610490642
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月28日
【發(fā)明人】江曙, 潘欣欣, 段金廒, 朱悅, 錢大瑋, 嚴(yán)輝
【申請人】南京中醫(yī)藥大學(xué)