一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法，包括以下步驟：取清洗干凈的綠豆，粉碎過篩，浸泡除脂，離心，收集殘?jiān)娓?，加入蒸餾水，離心，收集上清液并濃縮；將濃縮的上清液進(jìn)行脫蛋白處理，透析脫鹽，凍干，得綠豆粗多糖；3)綠豆粗多糖進(jìn)行陰離子交換層析，490nm紫外檢測，收集目的洗脫液；4)將目的洗脫液進(jìn)行凝膠過濾層析，206nm紫外檢測，收集洗脫峰，即為純化的綠豆多糖。本發(fā)明的方法能夠得到具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖，而且該多糖能夠刺激RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生NO、TNF?α和IL?6因子，經(jīng)過超聲處理后綠豆多糖功效更強(qiáng)。
【專利說明】
一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及植物提取技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 綠豆，屬于蝶形花科，菜豆族豇豆屬中的一個種，是溫帶、亞熱帶地區(qū)廣泛種植的 豆類之一，在中國已有兩千余年的栽培史，是重要的藥食物同源物質(zhì)，被譽(yù)為"食中要物"， "濟(jì)世糧谷"，"清熱解暑良藥"。中醫(yī)認(rèn)為:綠豆味甘，性涼，歸心經(jīng)，具有清熱解毒解暑除煩、 利水消腫、清膽?zhàn)B胃、潤腸通便、明目、降血糖、降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗過敏、保護(hù)肝臟和 心血管、增強(qiáng)免疫力、排鉛等功效，適用于暑熱煩渴、里熱、小便不利、水腫、皮疹、食物及藥 物中毒等。
[0003] 從天然成分中含有的多糖由于其潛在的生物學(xué)功能吸引了越來越多的關(guān)注，尤其 是其抗氧化和生物活性，如清除自由基，抑制脂質(zhì)氧化，促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞(NK)的細(xì)胞毒 性，激活巨噬細(xì)胞和增強(qiáng)白細(xì)胞介素等。多糖的生物活性主要取決于幾個參數(shù)，包括糖的組 成、分子量、糖苷鍵類型等。天然多糖在食品和醫(yī)藥方面的應(yīng)用，使得研究都集中在從天然 的植物、動物、微生物中分離和純化所得到的多糖。
[0004] 國內(nèi)外關(guān)于多糖的提取方法有很多，包括:溶劑提取法、酸提法、堿提法、酶解法、 超濾法、超聲法，微波法等。分離純化多糖方法包括:沉淀法、鹽析法、超濾法等。
[0005] 本發(fā)明在此基礎(chǔ)上提出一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法。該方法能 夠得到具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖，經(jīng)過DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和 凝膠過濾層析純化得到的綠豆多糖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方 法，該方法能夠得到具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖，而且該多糖能夠刺激RAW264.7小鼠巨 噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生N0、TNF-a和IL-6因子，經(jīng)過超聲處理后綠豆多糖功效更強(qiáng)。
[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法，包括以下步驟：
[0009] 1)取清洗干凈的綠豆，粉碎過篩，浸泡除脂，離心，收集殘?jiān)娓?，加入蒸餾水，離 心，收集上清液并濃縮；
[0010] 2)將步驟1)得到的濃縮的上清液進(jìn)行脫蛋白處理，透析脫鹽，凍干，得綠豆粗多 糖；
[0011] 3)將步驟2)得到的綠豆粗多糖進(jìn)行陰離子交換層析，490nm紫外檢測，收集目的洗 脫液；
[0012] 4)將步驟3)得到的目的洗脫峰進(jìn)行凝膠過濾層析，206nm紫外檢測，收集洗脫峰， 即為純化的綠豆多糖。
[0013] 優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述制備方法包括以下步驟：
[0014] 1)取清洗干凈的綠豆，粉碎過60目篩，95 %乙醇浸泡3d除脂，離心，收集殘?jiān)娓桑?加入蒸餾水，離心，收集上清液并濃縮；
[0015] 2)將步驟1)得到的濃縮的上清液用Sevag法進(jìn)行脫蛋白處理，再裝入透析袋4°C過 夜透析脫鹽，凍干，得綠豆粗多糖；
[0016] 3)將步驟2)得到的綠豆粗多糖用蒸餾水溶解，13000r/min離心20min，上清液進(jìn)行 陰離子交換層析，梯度洗脫后，490nm紫外檢測，合并收集洗脫液，收集得到兩個主峰；
[0017] 4)將步驟3)得到的目的洗脫液分別進(jìn)行凝膠過濾層析，等度洗脫后，在206nm紫外 檢測，分別收集得到兩個目的洗脫峰，即純化的綠豆多糖。
[0018] 優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述制備方法還包括：
[0019] 5)將步驟2)得到的綠豆粗多糖、步驟4)得到的純化的綠豆多糖進(jìn)行超聲改性處 理，得到目的綠豆多糖。
[0020] 優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟1)具體為：
[0021] 11)取清洗干凈的綠豆，粉碎，過60目篩，按固液比1:2加入95%乙醇，浸泡3d除脂；
[0022] 12)離心收集殘?jiān)?，烘干，按料液?:4-1:10，在溫度為60-90°C條件下，持續(xù)攪拌 l-4h，離心，收集上清液并濃縮。
[0023]優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟2)采用的Sevag法進(jìn)行脫蛋白處理具體為:將 濃縮的上清液與Sevage試劑按5:1混合，振蕩，離心，去蛋白；所述Sevage試劑為氯仿和正 丁醇按體積比5:1混合形成。
[0024]優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟3)具體為：
[0025]將步驟2)得到的綠豆粗多糖用蒸餾水溶解，離心，上清液上DEAE-瓊脂糖凝膠FF填 料柱，用超純水平衡過夜，梯度洗脫，洗脫液為0-2M NaCl溶液，洗脫流速4ml/min，以8ml/管 速度自動收集，在490nm紫外檢測，收集目的洗脫液，凍干。
[0026]優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟4)具體為：
[0027]將步驟3)得到的目的洗脫液上丙烯葡聚糖凝膠s-300填料柱，等度洗脫，洗脫液為 0.15M NaCl溶液，洗脫流速為0.5ml/min，自動收集，在206nm紫外檢測，收集得到兩個目的 洗脫峰，即純化的綠豆多糖。
[0028]優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟5)的超聲改性處理的反應(yīng)為:將綠豆粗多糖、 純化的綠豆多糖分別用一定蒸餾水溶液溶解在l〇ml燒杯中，溫度在0°C恒溫中，將超聲波反 應(yīng)器的超聲波探頭浸入溶液15-20毫米，設(shè)定頻率在30-50kHz，500-700W，超聲過程中總超 聲時間lmin，其中連續(xù)超聲1 Os則中間需間隔3s。
[0029]優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述步驟12)的按料液比1:8;提取溫度為90°C;提取時 間4h;離心條件：3500r、lOmin;烘干溫度為60°C。
[0030] 10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法，其特征在 于，所述超聲改性條件為:超聲頻率為50kHz，700W。
[0031] 優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，透析過夜的時間為8-12h，所述透析袋4°C過夜透析脫鹽 需要進(jìn)行流水透析。
[0032]本發(fā)明上述技術(shù)方案，具有如下有益效果：
[0033]本發(fā)明的方法能夠得到具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖，而且該多糖能夠刺激 RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生NO、TNF-a和IL-6因子，經(jīng)過超聲處理后綠豆多糖功效更 強(qiáng)。本方法具有綠豆多糖篩選、純化等作用，最終得到綠豆多糖MWP-1和MWP-2。同時，本發(fā)明 還具有以下有有益效果：
[0034] 1.水提取，水做溶劑，安全，污染，價格低廉。
[0035] 2.對綠豆多糖進(jìn)行提取并進(jìn)行純化工藝。
[0036] 3.經(jīng)過系統(tǒng)提取純化研究，綠豆水提多糖MWP-1和MWP-2。
[0037] 4.水提取粗多糖提取工藝簡單，對企業(yè)的技術(shù)要求低，可適應(yīng)與大范圍的推廣。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述，以便于進(jìn)一步理解本發(fā)明。
[0039] 以下實(shí)施例中所有使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0040] 以下實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可通過商業(yè)途徑獲得。
[00411實(shí)施例1綠豆粗多糖的制備
[0042] 分別研究提取溫度、提取時間以及料液比對綠豆多糖得率的影響。
[0043] (1)提取溫度、提取時間以及料液比對綠豆蛋白得率的影響。
[0044] 準(zhǔn)確稱取100g的綠豆粉碎，過60目篩后，將樣品與95%乙醇按固液比1: 2浸泡3天 除脂，離心收集殘?jiān)娓?。將烘干后的殘?jiān)湃?00mL三角瓶中，加入蒸餾水，按照一定的 料液比、在一定提取溫度下、攪拌提取一定時間后，離心收集上清液，將上清液濃縮，脫蛋 白、脫鹽，凍干，得綠ii粗多糖(命名:MWP)。
[0045] 分別考察料液比1:4、1:6、1:8、1:10,攪拌提取時間lh、2h、3h、4h;以及提取時間60 °C、70°C、80°C、90°C，為考察因素和指標(biāo)，建立起正交分析表。
[0046]單因素試驗(yàn)結(jié)果如下：
[0047] 設(shè)定綠豆樣品為100g。
[0048] 其中，固液比設(shè)為1:6,攪拌時間為2h，實(shí)驗(yàn)分析提取溫度對多糖得率的影響，結(jié)果 如表1所示：
[0049] 表1:固液比1:6，攪拌時間2h，提取溫度對多糖得率的影響。
[0051]其中，固液比設(shè)為1:6,提取溫度為90°C，實(shí)驗(yàn)分析提取時間對多糖得率的影響，結(jié) 果如表2所示：
[0052] 表2:固液比1:6，提取溫度90°C，提取時間對多糖得率的影響。

[0055]其中，提取溫度為90°C，攪拌時間為2h，實(shí)驗(yàn)分析固液比對多糖得率的影響，結(jié)果 如表3所示：
[0056] 表3:提取溫度90°C，攪拌時間2h，固液比對多糖得率的影響。
[0058]結(jié)果表明（如表1-表3所示）：在料液比1:8，提取時間4h，提取溫度90°C效果較好， 得到的粗多糖溶液，經(jīng)過透析凍干后，多糖得率達(dá)到5.11 %。
[0059]實(shí)施例2綠豆粗多糖的純化 [0060] (1)第一次純化處理：陰離子交換層析
[0061 ]使用JiKTAexPlorel〇〇儀器，將綠豆粗多糖樣品用蒸餾水溶解，離心（轉(zhuǎn)速 13000r/min，20min)后，上清液裝上DEAE-瓊脂糖凝膠FF(GE公司生產(chǎn)，貨號17-0709-01)柱， 用超純水平衡過夜，梯度洗脫，洗脫液為0-2M NaCl，洗脫流速4ml/min，以8ml/管速度自動 收集，490nm紫外檢測，分別收集目的洗脫液，凍干。
[0062] (2)第二次純化處理:丙烯葡聚糖凝膠s-300凝膠過濾層析
[0063] 將上述得到的目的洗脫液分別進(jìn)一步的進(jìn)行凝膠過濾層析，填料為丙烯葡聚糖凝 膠s-300，等度洗脫。洗脫液為0.15M NaCl溶液，流速為0.5ml/min。
[0064] 在206nm紫外檢測總糖含量并結(jié)合苯酚-硫酸法進(jìn)行糖含量的定量的分析，最終在 206nm產(chǎn)生的兩個主要峰。將兩個主要峰分別收集命名為MWP-1和MWP-2。
[0065] 將這兩個峰分別凍干，得純化后的綠豆多糖(簡稱:MWP_1和MWP-2)。
[0066]實(shí)施例3超聲對綠豆多糖免疫活性的影響
[0067] 使用depu92-ii超聲波反應(yīng)器研究不同超聲頻率和不同超聲功率對綠豆多糖免疫 活性的影響。通過N0因子含量變化來確認(rèn)對免疫活性的影響。其中，N0含量越高說明免疫活 性增強(qiáng)能力越大。
[0068]將綠豆粗多糖用一定蒸餾水溶液溶解在10ml燒杯中，溫度在0°C恒溫中，超聲波 探頭浸入溶液約20毫米，設(shè)定頻率在30-50kHz，500-700W，超聲過程中總超聲時間lmin，其 中連續(xù)超聲l〇s中間間隔3s，防止超聲過程中產(chǎn)生過多的熱量對多糖結(jié)果產(chǎn)生影響。
[0069] 設(shè)定相同的多糖濃度，超聲功率為500w，超聲頻率為30、40、50紐2，實(shí)驗(yàn)分析超聲 頻率對綠多糖免疫活性的影響，結(jié)果如表4所不：
[0070] 表4:相同的多糖濃度，超聲功率為500w，超聲頻率為30、40、50kHz，超聲頻率對綠 豆多糖免疫活性的影響。

[0072] 設(shè)定相同的多糖濃度，超聲頻率為50kHz，超聲功率為500、600、700W，實(shí)驗(yàn)分析超 聲功率對綠豆多糖免疫活性的影響，結(jié)果如表5所示：
[0073] 表5:相同的多糖濃度，超聲頻率為50kHz，超聲功率為500、600、700W，超聲功率對 綠豆多糖免疫活性的影響。
[0075]結(jié)果表明（如表4-表5所示）：超聲頻率為50kHz、700W，所得到的超聲多糖的免疫活 性最強(qiáng)。
[0076] 實(shí)施例4超聲前后的各種多糖的免疫活性作用
[0077] 超聲前的多糖包括:粗多糖(MWP)、分離純化后得到的純化多糖(MWP-1和MWP-2)。 [0078]將上述各組多糖溶于水中，通過實(shí)施例3的方法超聲處理得：超聲后粗多糖 (MWP'）、超聲后純化多糖(MWP-r和MWP-2'）。
[0079] 實(shí)驗(yàn)同時設(shè)定對照組(未添加多糖組）。
[0080] 測定上述各組多糖的對RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞N0的含量變化，進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)測定 N0因子含量變化，從而證明綠豆多糖的免疫活性作用。
[0081] 表6:超聲前后的各種多糖的免疫活性作用結(jié)果。
[0083]結(jié)果表明（如表6所示）：超聲后的綠豆多糖均比超聲前的N0濃度明顯提高，其中純 化后的兩種綠多糖提尚最多，可達(dá)51.14%和42.41%。
[0084] 本發(fā)明的方法能夠得到具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖，而且該多糖能夠刺激 RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生N0、TNF-a和IL-6因子，經(jīng)過超聲處理后綠豆多糖功效更 強(qiáng)。本方法具有綠豆多糖篩選、純化等作用，最終得到綠豆多糖MWP-1和MWP-2。
[0085] 雖然本發(fā)明已以實(shí)施例公開如上，然其并非用于限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，均可作各種不同的選擇和修改，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法，包括以下步驟： 1) 取清洗干凈的綠豆，粉碎過篩，浸泡除脂，離心，收集殘?jiān)娓?，加入蒸餾水，離心，收 集上清液并濃縮； 2) 將步驟1)得到的濃縮的上清液進(jìn)行脫蛋白處理，透析脫鹽，凍干，得綠豆粗多糖； 3) 將步驟2)得到的綠豆粗多糖進(jìn)行陰離子交換層析，490nm紫外檢測，收集目的洗脫 液； 4) 將步驟3)得到的目的洗脫峰進(jìn)行凝膠過濾層析，206nm紫外檢測，收集洗脫峰，即為 純化的綠?多糖。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法，其特征在于，所述 制備方法包括以下步驟： 1) 取清洗干凈的綠豆，粉碎過60目篩，95%乙醇浸泡3d除脂，離心，收集殘?jiān)娓?，加?蒸餾水，離心，收集上清液并濃縮； 2) 將步驟1)得到的濃縮的上清液用Sevag法進(jìn)行脫蛋白處理，再裝入透析袋4 °C過夜透 析脫鹽，凍干，得綠豆粗多糖； 3) 將步驟2)得到的綠豆粗多糖用蒸餾水溶解，13000r/min離心20min，上清液進(jìn)行陰離 子交換層析，梯度洗脫后，490nm紫外檢測，合并收集洗脫液，收集得到兩個主峰； 4) 將步驟3)得到的目的洗脫液分別進(jìn)行凝膠過濾層析，等度洗脫后，在206nm紫外檢 測，分別收集得到兩個目的洗脫峰，即純化的綠豆多糖。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法，其特征在于， 所述制備方法還包括： 5) 將步驟2)得到的綠豆粗多糖、步驟4)得到的純化的綠豆多糖進(jìn)行超聲改性處理，得 到目的綠豆多糖。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法，其特征在于， 所述步驟1)具體為： 11) 取清洗干凈的綠豆，粉碎，過60目篩，按固液比1:2加入95%乙醇，浸泡3d除脂； 12) 離心收集殘?jiān)?，烘干，按料液?:4-1:10，在溫度為60-90°C條件下，持續(xù)攪拌l_4h， 離心，收集上清液并濃縮。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法，其特征在于， 所述步驟2)采用的Sevag法進(jìn)行脫蛋白處理具體為:將濃縮的上清液與Sevage試劑按5:1混 合，振蕩，離心，去蛋白；所述Sevage試劑為氯仿和正丁醇按體積比5:1混合形成。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法，其特征在于， 所述步驟3)具體為： 將步驟2)得到的綠豆粗多糖用蒸餾水溶解，離心，上清液上DEAE-瓊脂糖凝膠FF填料 柱，用超純水平衡過夜，梯度洗脫，洗脫液為0-2M NaCl溶液，洗脫流速4ml/min，以8ml/管速 度自動收集，在490nm紫外檢測，收集目的洗脫液，分別凍干。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法，其特征在于， 所述步驟4)具體為： 將步驟3)得到的目的洗脫液分別上丙烯葡聚糖凝膠s-300填料柱，等度洗脫，洗脫液為 0.15M NaCl溶液，洗脫流速為0.5ml/min，自動收集，在206nm紫外檢測，收集得到兩個目的 洗脫峰，即純化的綠豆多糖。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法，其特征在于，所述 步驟5)的超聲改性處理的反應(yīng)為:將綠豆粗多糖、純化的綠豆多糖分別用一定蒸餾水溶液 溶解在10ml燒杯中，溫度在0°C恒溫中，將超聲波反應(yīng)器的超聲波探頭浸入溶液15-20毫米， 設(shè)定頻率在30-50kHz，500-700W，超聲過程中總超聲時間lmin，其中連續(xù)超聲10s則中間需 間隔3s。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法，其特征在于，所述 步驟12)的按料液比1:8;提取溫度為90°C ;提取時間4h;離心條件：3500r、lOmin;烘干溫度 為 60。。。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的具有免疫調(diào)節(jié)活性的綠豆多糖的制備方法，其特征在于，所 述超聲改性條件為:超聲頻率為50kHz，700W。
【文檔編號】A61P37/02GK105968223SQ201610524332
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】任貴興, 么楊, 桑偉
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所