一種含兩性離子的多重酸敏感抗腫瘤載藥膠束及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種含兩性離子的多重酸敏感抗腫瘤載藥膠束及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物材料領(lǐng)域。所述含兩性離子的多重酸敏感抗腫瘤載藥膠束包括兩性離子的親水外殼，含兩個(gè)酸敏感鍵的疏水內(nèi)核。所述方法利用醇交換法將丙烯酸羥乙酯和2，2?二甲氧基丙烷脫甲醇，合成2,2?二（丙烯酰氧基?1?乙氧基）丙烷；利用開(kāi)環(huán)β?丙內(nèi)酯連接2?(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯合成羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯；利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法，得到羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯單體聚合物；利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法和邁克爾加成一鍋法，合成了三嵌段的兩親性聚合物，再采用超聲滴入法及透析法制備納米載藥膠束。所述載藥膠束可提高化療藥物的抗腫瘤效果。
【專利說(shuō)明】
一種含兩性離子的多重酸敏感抗腫瘤載藥膠束及其制備方法 和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，特別涉及一種含兩性離子的多重酸敏感抗腫瘤載藥膠 束及其制備方法和應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 據(jù)2013年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，腫瘤目前已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病之一。 當(dāng)前化療是臨床用于治療腫瘤最常用且最有效而的手段之一，但由于化療藥物缺乏在腫瘤 細(xì)胞及正常細(xì)胞之間的特異性選擇，同時(shí)具有較強(qiáng)毒性，導(dǎo)致了治療過(guò)程中嚴(yán)重的毒副作 用。納米載藥系統(tǒng)的出現(xiàn)很好的解決了這些問(wèn)題。一定粒徑范圍內(nèi)的納米粒子利用腫瘤部 位增強(qiáng)的滲透與滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng)），可以通過(guò)被動(dòng)靶向作用可以實(shí)體瘤部位的富集;同時(shí) 納米載體表面可以進(jìn)行各種功能化修飾，提高了化療藥物的抗腫瘤效果，同時(shí)明顯減少了 治療過(guò)程中的毒副作用。膠束是一種由兩親性的材料在水中由于親疏水作用形成的納米載 體，其疏水核部分為疏水性的藥物提供了巨大的包載空間，使膠束具有相較其他納米粒子 較高的載藥量；同時(shí)親水的外殼部分可以進(jìn)行各種功能化修飾。這些優(yōu)良的特性使納米膠 束在臨床上有巨大的應(yīng)用潛力。
[0003] 隨著納米載體的不斷發(fā)展，有研究表明納米粒子在血液循環(huán)過(guò)程中會(huì)被蛋白質(zhì)或 者細(xì)胞粘附，導(dǎo)致人體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)將其清除，不能發(fā)揮應(yīng)有的作用。因此，抵抗生物分子 的吸附作用，提高納米粒子在循環(huán)中的穩(wěn)定性是一項(xiàng)急需解決的難題。目前研究及臨床運(yùn) 用較多且有效的策略是在粒子外圍修飾親水性的PEG或者PEG化，可以實(shí)現(xiàn)較好的抗蛋白吸 附效果。然而，Ishida等的研究表明，PEG在多次運(yùn)用之后，人體會(huì)對(duì)其產(chǎn)生明顯的體液免疫 反應(yīng)，產(chǎn)生anti-PEG IgM，加速對(duì)PEG的清除作用(ABC效應(yīng)）；同時(shí)二次注射進(jìn)入體內(nèi)的PEG 化納米粒子會(huì)成為anti-PEG IgM的免疫原性抗原表位和結(jié)合位點(diǎn)，加速被清除速率。所以 發(fā)展一種可替代PEG的物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)納米粒子的抗非特異性蛋白吸附非常有必要且有重要意 義。
[0004]當(dāng)載藥納米膠束經(jīng)過(guò)穩(wěn)定長(zhǎng)循環(huán)后經(jīng)被動(dòng)靶向作用富集于腫瘤部位，能否被腫瘤 細(xì)胞攝取，以及進(jìn)入細(xì)胞之后能否快速的將藥物釋放出來(lái)發(fā)揮藥效，是載藥納米膠束發(fā)揮 抗腫瘤效果的重要前提。目前研究者們通過(guò)利用腫瘤部位與正常組織的差異，使納米粒子 實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤部位特異性的響應(yīng)性，如利用腫瘤部位相對(duì)較低的pH值、較高濃度的谷胱甘肽、 較高濃度的某些蛋白酶等設(shè)計(jì)成pH敏感、氧化還原敏感、酶敏感的納米粒子等。目前大部分 納米材料中僅有一個(gè)敏感鍵，納米粒子在腫瘤微環(huán)境中不能高敏感的快速響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)藥物 突釋，難以達(dá)到藥物治療濃度，實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種含兩性離子的多重酸敏感的抗腫瘤納米膠束載 藥系統(tǒng)，其生物相容性好;可以在血液中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定長(zhǎng)循環(huán)；同時(shí)具有對(duì)腫瘤部位的被動(dòng)靶向 性(EPR效應(yīng)）；載藥量高;在進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后可以高敏感的快速釋放藥物，提高化療藥物的 抗腫瘤效果，同時(shí)降低對(duì)正常組織的毒副作用。
[0006] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)： 一種含兩性離子的多重酸敏感兩親性分子，包括含兩性離子(如聚羧基甜菜堿甲基丙 烯酸酯PCBMA、聚甲基丙稀酰氧基乙基磷酰膽堿pMPC、聚磺基甜菜堿甲基丙烯酸酯pSBMA， 等）的親水端和含兩個(gè)酸敏感鍵的疏水端。兩性離子化合物不僅具備抗非特異性蛋白吸附 能力，同時(shí)還具有良好的生物相容性，避免PEG的諸多弊端。由于兩性離子具有較強(qiáng)的親水 性，可以通過(guò)與水的溶劑化作用在粒子的外圍形成一層較為穩(wěn)定的水化膜，降低粒子表面 的界面能，從而可以有效抵抗蛋白吸附；同時(shí)，由于兩性離子與水之間的氫鍵作用，也使其 具有超低污染的性質(zhì)，達(dá)到抗蛋白吸附的效果，有利于實(shí)現(xiàn)所述兩親性分子自組裝形成的 納米粒子在血液中的長(zhǎng)循環(huán)。
[0007] 作為可選方式，在上述兩親性分子中，所述親水部分的兩性離子為中間含季胺、末 端為羧基的物質(zhì)。在偏酸性的環(huán)境中，羧基中不帶電，季胺部分帶正電，使整個(gè)納米粒子外 圍呈正電性;在偏堿性環(huán)境中，外圍的羧基電離帶負(fù)電荷，使整個(gè)納米粒子外圍呈負(fù)電性。 且外圍為羧基時(shí)有利于進(jìn)一步化學(xué)修飾。
[0008] 作為可選方式，在上述兩親性分子中，所述兩性離子為羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯 單體聚合物。
[0009] 作為可選方式，在上述兩親性分子中，所述兩個(gè)酸敏感鍵的具有梯度酸敏感特性， 其中一個(gè)可在pH 6.8左右發(fā)生斷裂，另一個(gè)可在pH 4.5-6.0環(huán)境下發(fā)生斷裂。進(jìn)一步的，所 述酸敏感鍵分別為縮酮鍵或叔胺鍵。
[0010] 作為可選方式，在上述兩親性分子中，所述親水端包括含縮酮鍵的2,2_二(丙烯酰 氧基-1-乙氧基)丙烷和含叔胺鍵的4,4_丙基哌啶基哌啶。為了使通過(guò)被動(dòng)靶向作用富集于 腫瘤部位的載藥納米膠束，被攝取進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后可以將包裹的藥物高選擇的較快速釋放 出來(lái)，本發(fā)明利用了腫瘤微環(huán)境的酸度(pH 6.8)與正常體液(pH 7.4-7.2)的微小差異，同 時(shí)利用胞內(nèi)溶酶體較強(qiáng)的酸性(pH 4.5-6.0)，在聚合物中加入多重酸敏感片段，使載藥膠 束可以對(duì)腫瘤環(huán)境更加敏感，在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)藥物突釋，有效發(fā)揮藥效。在疏水內(nèi)核片段中運(yùn) 用兩種具有酸敏感鍵的物質(zhì)，包括含縮酮鍵的2,2_二(丙烯酰氧基-1-乙氧基)丙烷和含叔 胺鍵的4，4-丙基哌啶基哌啶。當(dāng)通過(guò)EPR效應(yīng)進(jìn)入腫瘤部位后(pH 6.8)，膠束由于外圍的羧 酸甜菜堿甲基丙烯酸酯末端羧基的水解作用，使膠束表面發(fā)生電荷翻轉(zhuǎn)，由之前的電負(fù)性 變成電正性，增強(qiáng)與電負(fù)性的腫瘤細(xì)胞膜相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的攝取;載藥膠束進(jìn)入溶 酶體后，在強(qiáng)酸性條件下，疏水部分ADA的縮酮鍵發(fā)生斷裂，破壞載藥膠束；同時(shí)4，4-丙基哌 啶基哌啶的叔胺發(fā)生質(zhì)子化作用，其由疏水性轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性，促使更多的酸性液體進(jìn)入膠 束內(nèi)部，加速膠束的解體，實(shí)現(xiàn)膠束的溶酶體逃逸，快速釋放藥物。
[0011] 作為可選方式，上述兩親性分子結(jié)構(gòu)式為：
其中n、m為聚合度。作為可選，在上述兩親性分子中最終合成的該聚合物分子量為15 KD。作為優(yōu)選，所述n: m=2:3。
[0012]本發(fā)明還提供了一種制備上述的含兩性離子的多重酸敏感兩親性分子的方法，其 特征在于，包括以下制備步驟： (1) 利用醇交換法制備2,2_二(丙烯酰氧基-1-乙氧基)丙烷(ADA)
(2) 利用2-(二甲氨基）甲基丙烯酸乙酯和丙內(nèi)酯開(kāi)環(huán)反應(yīng)制備羧酸甜菜堿甲基丙烯 酸酯(CBMA)
(3) 利用步驟(2)所制備的羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯，經(jīng)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法合成羧 酸甜菜堿甲基丙烯酸酯單體聚合物(PCBMA)
(4) 利用步驟(3)所制備的單體聚合物(pCBMA)、步驟(1)所制備的2,2_二(丙烯酰氧基-1-乙氧基）丙烷(ADA)和4,4一丙基哌啶基哌啶(TMDP)，經(jīng)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法和邁克爾 加成一鍋法合成兩親性的聚合物pCBMA-p(ADA-TMDP)
[0013] 作為可選方式，在上述制備方法中，步驟（1)中醇交換后產(chǎn)生的甲醇-苯共沸物應(yīng) 及時(shí)蒸出。
[0014] 作為可選方式，在上述制備方法中，步驟(4)中所合成的聚合物中，其組成成分羧 酸甜菜堿甲基丙烯酸酯單體聚合物、2,2_二(丙烯酰氧基-1-乙氧基)丙烷、4,4一丙基哌啶 基哌啶的摩爾比例約為2:3:3。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種含兩性離子的多重酸敏感抗腫瘤載藥膠束，由上述任意一種 兩親性分子自組裝形成納米載藥膠束，包括含兩性離子的親水外殼和含兩個(gè)酸敏感鍵的疏 水內(nèi)核，所述疏水內(nèi)核中包載有藥物。所述載藥膠束中外圍是親水性的兩性離子，可以有效 抗非特異性蛋白吸附，使載藥膠束在血液中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定長(zhǎng)循環(huán);具有較高的載藥量;在腫瘤進(jìn) 入腫瘤微環(huán)境后發(fā)生電荷翻轉(zhuǎn)，促進(jìn)入胞;對(duì)酸性環(huán)境的高敏感響應(yīng)性，腫瘤細(xì)胞內(nèi)高選擇 性的快速釋藥;抗腫瘤效率高，對(duì)正常組織毒副作用小。
[0016] 作為可選方式，所述納米載藥膠束粒徑為50-100納米。粒徑在EPR效應(yīng)范圍內(nèi)，可 實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向。
[0017] 作為可選方式，在上述納米載藥膠束中，所述疏水內(nèi)核中包載的藥物為疏水性抗 腫瘤藥物、光敏劑、熒光分子中的一種或其組合。優(yōu)選為阿霉素或紫杉醇。
[0018] 作為可選方式，在上述納米載藥膠束中，其載藥量范圍為12%-16%。
[0019] 本發(fā)明還提供了上述含兩性離子的多重酸敏感抗腫瘤載藥膠束的制備方法： 取本發(fā)明所述的至少一種兩親性分子與疏水藥物混合，采用超聲滴入法及透析法制備 納米載藥膠束。
[0020] 作為可選方式，所述方法具體為將該兩親性聚合物和抗腫瘤藥阿霉素同時(shí)溶于 DMF溶液中，在超聲條件下緩慢滴入水中，裝入透析袋用去離子水透析，得到載藥膠束。
[0021] 本發(fā)明還提供了上述兩親性分子的應(yīng)用，將其用于包載抗腫瘤藥物。
[0022] 本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的所有特征，或公開(kāi)的所有方法或過(guò)程中的步驟，除了互相排斥 的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。
[0023]本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明所述的載藥膠束粒徑在EPR效應(yīng)范圍內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向；外圍是親水性的兩性 離子，可以有效抗非特異性蛋白吸附，使載藥膠束在血液中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定長(zhǎng)循環(huán);具有較高的載 藥量;在腫瘤進(jìn)入腫瘤微環(huán)境后發(fā)生電荷翻轉(zhuǎn)，促進(jìn)入胞;對(duì)酸性環(huán)境的高敏感響應(yīng)性，月中 瘤細(xì)胞內(nèi)高選擇性的快速釋藥;抗腫瘤效率高，對(duì)正常組織毒副作用小。
[0024]
【附圖說(shuō)明】： 圖1為本發(fā)明高分子膠束載體的iH-NMI^CDCh)。
[0025] 圖2為本發(fā)明載藥膠束示意圖。
[0026] 圖3為本發(fā)明包載和不包載抗腫瘤藥物阿霉素形成膠束后的粒徑分布圖。
[0027] 圖4為本發(fā)明載藥膠束的透射電鏡照片。
[0028] 圖5為本發(fā)明空白膠束在不同pH的緩沖溶液中放置4 h后的粒徑分布圖。
[0029] 圖6為本發(fā)明空白膠束在不同pH的緩沖溶液中放置4 h后的電位變化圖。
[0030] 圖7為本發(fā)明空白膠束在pH 7.4緩沖溶液中對(duì)胎牛血清蛋白的吸附圖。
[0031] 圖8為本發(fā)明載藥膠束在不同pH緩沖溶液中的藥物釋放曲線。
[0032] 圖9為本發(fā)明空白膠束對(duì)人源肝腫瘤細(xì)胞及小鼠成纖維細(xì)胞的毒性作用。
[0033]圖10為本發(fā)明載藥膠束抑制人源的肝腫瘤細(xì)胞及小鼠成纖維細(xì)胞的存活率圖。
[0034] 圖11為本發(fā)明載藥膠束體外細(xì)胞攝取及胞內(nèi)釋放藥物入核實(shí)驗(yàn)的激光共聚焦照 片。
[0035] 圖12為本發(fā)明載藥膠束體外細(xì)胞攝取及胞內(nèi)載藥膠束溶酶體逃逸實(shí)驗(yàn)的激光共 聚焦照片。
[0036]【具體實(shí)施方式】： 以下通過(guò)實(shí)施例的【具體實(shí)施方式】再對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理 解，此處所描述的具體實(shí)例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。在不脫離本發(fā)明的 精神和原則之內(nèi)做的任何修改，以及根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段做出的等同替換 或者改進(jìn)，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0037]實(shí)施例1:2,2-二(丙烯酰氧基-1_乙氧基)丙烷的制備 首先將丙烯酸羥乙酯、2,2_二甲氧基丙烷按摩爾比例2:1混合，加入苯和對(duì)甲基苯磺 酸，在58°C的反應(yīng)條件下，將苯-甲醇共沸物蒸出，得到初產(chǎn)物。將得到的初產(chǎn)物用硅膠柱色 譜法進(jìn)行純化，以正己烷和二氯乙烷（1:1)的混合溶劑進(jìn)行洗脫，旋蒸除掉洗脫劑，得到無(wú) 色的油狀液體，為純化后的產(chǎn)物ADA。
[0038] 實(shí)施例2:羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯(CBMA)的制備 將0.11 mmol的2-(二甲氨基）甲基丙烯酸乙酯在劇烈攪拌下溶于50 mL無(wú)水丙酮，在 氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將0.14 mmol 丙內(nèi)酯的10 mL無(wú)水丙酮溶液緩慢的滴加到上述溶液中。在氮 氣保護(hù)下，該反應(yīng)在4°C反應(yīng)5h，得到白色粉末。之后將得到的白色粉末依次用無(wú)水丙酮和 無(wú)水乙醚洗滌，在真空干燥箱中干燥，得到白色粉末狀產(chǎn)物。
[0039] 實(shí)施例3:聚羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯(pCBMA)的制備 運(yùn)用ATRP法(原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法)反應(yīng)來(lái)制備聚羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯，以實(shí)施 例2中合成所得產(chǎn)物作為反應(yīng)單體，以2-溴代異丁酸乙酯為引發(fā)劑，以1，1，4,7，10，10-六甲 基三亞乙基四胺為配體，以單體：引發(fā)劑:配體=16.6:1:2的摩爾比投入干燥的支口瓶中， 做三個(gè)真空-氮?dú)獾难h(huán)來(lái)保證反應(yīng)體系的無(wú)氧環(huán)境。將甲醇:N，N-二甲基甲酰胺（1:1)為 溶劑用注射器注入反應(yīng)體系中，在三個(gè)真空_氮?dú)獾难h(huán)后加入溴化亞銅。將反應(yīng)體系密 封，在60°C反應(yīng)24 h。反應(yīng)體系與空氣連通，終止反應(yīng)。得到的反應(yīng)初產(chǎn)物，用500-1000截留 分子量的透析袋在中性水中透析除去未反應(yīng)的單體、引發(fā)劑、配體、溴化銅、反應(yīng)溶劑等小 分析物質(zhì)。凍干后得到產(chǎn)物聚羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯。
[0040]實(shí)施例 4: pCBMA-p (ADA-TMDP)的制備 本發(fā)明的兩親性的高分子材料是利用ATRP和邁克爾加成反應(yīng)一鍋法合成。將實(shí)施例3 中合成的聚羧酸甜菜堿甲基丙稀酸酯(0.057 mmol)、實(shí)施例1中合成的ADA(1.476 mmol)投 入到20 ml的甲醇:N，N-二甲基甲酰胺（1:1)溶劑中攪拌溶解。經(jīng)過(guò)三個(gè)真空-氮?dú)獾难h(huán)后 加入溴化亞銅(〇. 1 mmol)和4,4一丙基哌啶基哌啶（1.476 mmol)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70°C反應(yīng) 48，與空氣連通以結(jié)束反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到3500截留分子量的透析袋中進(jìn)行透析，除 去未反應(yīng)的單體以及溶劑等小分子物質(zhì)。之后將透析后的產(chǎn)物在1000轉(zhuǎn)/分鐘下離心，除去 不溶于水的組分。最后冷凍干燥得到產(chǎn)物。
[0041 ] 將得到的高分子材料pCBMA-p(ADA-TMDP)溶于氘代⑶Cl3中，做600 MHz氫譜掃 描，核磁圖譜如圖1所示。
[0042]實(shí)施例5:空白膠束以及載藥膠束的制備 將1 mg兩親性材料pCBMA-p(ADA-TMDP)與0.2 mg阿霉素共同溶解于0.5 mL的DMF溶 液中，在超聲條件下將其緩慢滴加到水中。兩親性材料通過(guò)親疏水作用進(jìn)行自組裝，形成中 間疏水，外圍親水的球狀納米膠束。同時(shí)，疏水性的抗腫瘤藥物被穩(wěn)定包裹于膠束疏水的內(nèi) 腔，形成載藥膠束。之后用透析法除去有機(jī)溶劑及未包載的游離藥物，冷凍干燥后備用。 [0043]通過(guò)馬爾文激光粒度儀測(cè)定其粒徑大小及分布，圖3顯示空白膠束的粒徑為69土 20納米，載藥膠束的粒徑為77± 19納米。同時(shí)用透射電子顯微鏡觀察載藥粒子的尺寸及形 態(tài)，如圖4所示，載藥粒子呈現(xiàn)較規(guī)則的球形，粒徑分布為75 ±13納米。所得載藥膠束的載 藥量為12%-16% 實(shí)施例6:在不同pH的緩沖溶液中粒徑分布及表面電位的變化 將該納米膠束分別分散于pH 7.4、6.8、6.0、5.0的緩沖溶液中，靜置4 h，通過(guò)馬爾文激 光粒度儀分別測(cè)定其粒徑分布及表面電位。如圖5所示，在類生理?xiàng)l件的pH下，膠束粒徑分 布較窄且均一；當(dāng)在pH 6.8(腫瘤微環(huán)境的pH)時(shí)，粒徑保持均一，但分布變寬；當(dāng)pH繼續(xù)降 低到6.0時(shí)，粒徑分布開(kāi)始不均一，出現(xiàn)兩個(gè)峰;pH 5.0時(shí)(接近溶酶體酸度），粒徑分布的兩 個(gè)峰更加明顯。這一結(jié)果驗(yàn)證了該納米膠束的pH響應(yīng)性。
[0044]同時(shí)，不同pH緩沖液中膠束表面點(diǎn)位的變化趨勢(shì)（如圖6所示）也與理論相符。在 PH7.4時(shí)，表面呈現(xiàn)輕微負(fù)電性(-2.4 mV)，是由于兩性粒子部分的羧基離子化，有利于膠束 在循環(huán)的過(guò)程中減少蛋白質(zhì)吸附，保持穩(wěn)定，增加長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間；在pH 6.8時(shí)，由于兩性離子 的膠束表面發(fā)生了電荷翻轉(zhuǎn)，呈現(xiàn)輕微電正性(+4.41 mV)，有利于膠束離子與電負(fù)性的腫 瘤細(xì)胞膜接觸，促進(jìn)膠束入胞;pH 6.0-5.0,電正性明顯增強(qiáng)，證明了膠束的酸響應(yīng)性。 [0045]實(shí)施例7:抗非特異性蛋白吸附能力 以胎牛血清為模型蛋白來(lái)研究該多重酸敏感的兩性粒子膠束抗蛋白吸附能力。將納米 膠束與胎牛血清溶液共孵育，在pH 7.4條件下共孵育不同時(shí)間，在13000 g的轉(zhuǎn)速下離心除 去被膠束吸附的蛋白，取上清，用BCA法檢測(cè)未被吸附的蛋白含量。如圖7所示，在pH 7.4時(shí)， 2 h內(nèi)，僅有10.0%的蛋白被吸附；隨著時(shí)間的增加，在4h時(shí)，僅有15.6%吸附量，吸附量沒(méi)有 明顯增加。證明外圍為兩性離子的納米膠束確實(shí)可以抗非特異性蛋白吸附，在長(zhǎng)循環(huán)過(guò)程 中保持穩(wěn)定。
[0046]實(shí)施例8:載藥量及不同pH條件下的藥物釋放曲線 通過(guò)熒光色譜法檢測(cè)載藥膠束的載藥量。稱取適量實(shí)施例5中的凍干載藥膠束，重新溶 解于二甲基亞砜，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定阿霉素的包載量。測(cè)量結(jié)果顯示，有35.0%的藥物被包 封在納米膠束中，其中藥物質(zhì)量占載藥粒子總質(zhì)量的14.0%。
[0047]稱取包載有0.5 mg阿霉素的載藥膠束，溶于lmL水中，轉(zhuǎn)移至截留分子量500-1000 的透析袋中，分別將透析袋浸沒(méi)在25 mL不同pH值的緩沖溶液，將其置于37°C恒溫?fù)u床水浴 中。每隔一段時(shí)間，取出1 mL透析袋外部的溶液用于測(cè)量時(shí)間點(diǎn)處藥物的釋放量，同時(shí)補(bǔ)充 lmL相同pH值的新鮮緩沖溶液。每個(gè)pH條件重復(fù)三個(gè)平行樣，測(cè)定并計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積 釋放的藥物量，繪制釋放曲線。如圖8所示，在pH 5.0條件下，剛開(kāi)始藥物迅速釋放，之后釋 藥速率逐漸變緩，最終基本達(dá)到穩(wěn)定，在96 h內(nèi)，有72.7%的藥物釋放。而在pH 7.4和6.8的 條件下，96 h時(shí)釋藥量均不足28%。說(shuō)明該載藥膠束可以高選擇性的在較低pH條件下迅速釋 放包載的藥物，具有較敏感的pH響應(yīng)性。
[0048] 實(shí)施例8:生物學(xué)評(píng)價(jià) 通過(guò)CCK-8法測(cè)定本發(fā)明中納米膠束的體外毒性。將肝腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以一定 數(shù)量分別接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的空白膠束，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h， 棄去含有膠束的培養(yǎng)基，用roS緩沖溶液(pH 7.4)沖洗三遍，加入CCK-8(每孔10此），在37 °C下避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5個(gè) 平行樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，空白膠束無(wú)論是對(duì)腫瘤細(xì)胞還是對(duì)正常細(xì)胞，都無(wú)明顯毒性， 證明其具有良好的生物相容性。
[0049] 以上述同樣的方法將不同濃度載藥膠束，鹽酸阿霉素分別與肝腫瘤細(xì)胞和成纖維 細(xì)胞共孵育36 h后，用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率。結(jié)果如圖10所示，與鹽酸阿霉素相比，載藥 膠束的IC5Q值有輕微增加，是由于載藥膠束對(duì)藥物的包封作用，減緩了藥物進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮 作用的速率。
[0050] 細(xì)胞攝取及胞內(nèi)溶酶體逃逸實(shí)驗(yàn)。將肝腫瘤細(xì)胞按適當(dāng)濃度在玻底皿中培養(yǎng)，控 制阿霉素的濃度在5 mg/mL，將載藥膠束與細(xì)胞共培養(yǎng)不同的時(shí)間。用DAPI將細(xì)胞核染色標(biāo) 記(藍(lán)色焚光），用lysotracker green將酸性的溶酶體標(biāo)記染色(綠色），用激光共聚焦觀察 細(xì)胞攝取載藥膠束后在細(xì)胞內(nèi)的分布和變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著共孵育時(shí)間的延長(zhǎng)， 載藥膠束被細(xì)胞攝取的量不斷增加，且藥物逐漸釋放進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用（如圖11所示）， 同時(shí)可以很好的實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸(如圖12所示），證明了載藥膠束良好的的pH敏感解體釋 藥。
[00511動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。選取BALB/c雌性裸鼠（3周，18-20 g)建立皮下腫瘤模型，待 腫瘤長(zhǎng)至150cm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分組，每組5只。將載藥膠束或鹽酸阿霉素分散于生理鹽水 中，控制藥物阿霉素的濃度進(jìn)行尾靜脈注射，以生理鹽水作空白對(duì)照，每只200此，每隔三天 或四天給藥一次，共給藥七次，同時(shí)監(jiān)測(cè)裸鼠的腫瘤大小及體重的變化，觀察期為35天。在 第35天將裸鼠解剖，收集各組腫瘤及各臟器(心、肝、脾、肺、腎），制成HE染色的病理切片。結(jié) 果表明，載藥膠束組裸鼠腫瘤體積相對(duì)生理鹽水組明顯減小，有明顯的治療效果，同時(shí)與鹽 酸阿霉素組相比，不僅抗腫瘤效果更明顯，體重及精神狀態(tài)良好，而且臟器的病理切片顯示 了較阿霉素更低的毒性。證明這種多重酸敏感的兩性離子載藥膠束非常良好的生物相容性 以及有效的抗腫瘤效果。
[0052]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明而言，僅僅是說(shuō)明性的，而非限制性 的；本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明專利要求所限定的范圍內(nèi)，可對(duì)其進(jìn)行許多改變、 修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種含兩性離子的多重酸敏感兩親性分子，其特征在于，包括含兩性離子的親水端 和含兩個(gè)酸敏感鍵的疏水端。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩親性分子，其特征在于，所述兩性離子為中間含季胺、末端 為簇基的物質(zhì);作為優(yōu)選，所述兩性離子為簇酸甜菜堿甲基丙締酸醋單體聚合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩親性分子，其特征在于，所述酸敏感鍵分別為縮酬鍵或叔胺 鍵;作為優(yōu)選，所述親水端包括含縮酬鍵的2,2-二(丙締酷氧基-1-乙氧基)丙烷和含叔胺鍵 的4,4-丙基贓晚基贓晚。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩親性分子，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式為：5. -種如權(quán)利要求1所述的含兩性離子的多重酸敏感兩親性分子的制備方法，其特征 在于，包括W下制備步驟： (1) 利用醇交換法制備2,2-二(丙締酷氧基-1-乙氧基)丙烷； (2) 利用2-(二甲氨基）甲基丙締酸乙醋和β-丙內(nèi)醋開(kāi)環(huán)反應(yīng)制備簇酸甜菜堿甲基丙締 酸醋； (3) 利用步驟(2)所制備的簇酸甜菜堿甲基丙締酸醋，經(jīng)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法合成簇 酸甜菜堿甲基丙締酸醋單體聚合物； (4) 利用步驟(3)所制備的單體聚合物、步驟（1)所制備的2,2-二（丙締酷氧基-1-乙氧 基)丙烷和4，4-丙基贓晚基贓晚，經(jīng)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法和邁克爾加成一鍋法合成兩親 性的聚合物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中醇交換后產(chǎn)生的甲醇-苯共 沸物應(yīng)及時(shí)蒸出。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所合成的聚合物中，其組成 成分簇酸甜菜堿甲基丙締酸醋單體聚合物、2,2-二(丙締酷氧基-1-乙氧基)丙烷、4,4一丙 基贓晚基贓晚的摩爾比例約為2:3:3。8. -種含兩性離子的多重酸敏感抗腫瘤載藥膠束，其特征在于，由權(quán)利要求1-4中任意 一個(gè)所述的兩親性分子自組裝形成納米載藥膠束，包括含兩性離子的親水外殼和含兩個(gè)酸 敏感鍵的疏水內(nèi)核，所述疏水內(nèi)核中包載有藥物。9. 一種如權(quán)利要求8所述含兩性離子的多重酸敏感抗腫瘤載藥膠束的制備方法，其特 征在于，包括W下制備步驟： (1) 利用醇交換法制備2,2-二(丙締酷氧基-1-乙氧基)丙烷； (2) 利用2-(二甲氨基）甲基丙締酸乙醋和β-丙內(nèi)醋開(kāi)環(huán)反應(yīng)制備簇酸甜菜堿甲基丙締 酸醋； (3) 利用步驟(2)所制備的簇酸甜菜堿甲基丙締酸醋，經(jīng)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法合成簇 酸甜菜堿甲基丙締酸醋單體聚合物； (4) 利用步驟(3)所制備的單體聚合物、步驟（1)所制備的2,2-二（丙締酷氧基-1-乙氧 基)丙烷和4，4-丙基贓晚基贓晚，經(jīng)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法和邁克爾加成一鍋法合成兩親 性的聚合物； (5) 采用超聲滴入法及透析法制備納米載藥膠束。10. -種如權(quán)利要1所述的兩親性分子的應(yīng)用，其特征在于，將其用于制備抗腫瘤藥物。
【文檔編號(hào)】C08G81/02GK105968373SQ201610320480
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】顧忠偉, 馬瑾, 易強(qiáng)英, 康珂
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)