一株具有耐鉛能力的棘孢木霉的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及到了一株從重金屬污染土壤中分離得到的一株對重金屬鉛具有耐受能力的菌株，對其從形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)角度進行鑒定后，確定其為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，并將其命名為ZZY，于2016年01月14日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC No.12071，保藏單位地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。除此以外，還用固體發(fā)酵的方法對菌株進行固體發(fā)酵，得到發(fā)酵產(chǎn)物后，利用發(fā)酵產(chǎn)物對其降低植物中重金屬鉛含量的功能進行了研究。CGMCC No.1207120160114
【專利說明】
一株具有耐鉛能力的棘孢木霉
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及到了一株從重金屬污染土壤中分離得到的一株 對重金屬鉛具有耐受能力的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，并研究了其修復(fù)鉛污染 土壤、降低植物中鉛含量的功能。
【背景技術(shù)】
[0002] 鉛是重金屬污染土壤中分布較廣、具強蓄積性的環(huán)境污染物。土壤中鉛的天然來 源是風(fēng)化巖石中的礦物。多年來，盡管人們對三廢(廢氣、廢水、廢渣）的排放已采取嚴格的 控制措施，然而，由于頻繁的人類活動，隨著礦山開采、金屬冶煉加工、IT制造、生活污水排 放、污水灌溉、污泥使用以及含鉛汽油的使用，鉛已成為土壤污染的主要元素之一。目前，已 有許多學(xué)者對鉛污染狀況進行了多年研究。我國各個地區(qū)均有不同程度的鉛污染現(xiàn)象，鉛 中毒事件也頻頻發(fā)生。大氣、水體和土壤等環(huán)境要素中均存在鉛污染的情況，但相比于大氣 和水體而言，土壤中鉛污染現(xiàn)象更為普遍。全國土壤背景值基本統(tǒng)計量的結(jié)果表明，我國土 壤鉛含量最高可達1143yg/g，最低為0.68yg/g，平均可達到26yg/g。進入土壤中的鉛大多存 在于表土層，幾乎不向下移動。鉛在土壤中易與有機物結(jié)合，極不易溶解。過量的鉛會阻滯 作物生長發(fā)育，主要表現(xiàn)為葉綠素下降，阻礙植物的呼吸及光合作用，從而降低產(chǎn)量和質(zhì) 量。鉛具有強累積性，通過食物鏈的富集，人體中的鉛能與多種酶結(jié)合從而干擾有機體多方 面的生理活動，嚴重損害人的神經(jīng)、消化、免疫和生殖系統(tǒng)，對人類健康造成威脅。研究表 明，人體中約80%的鉛來自飲食吸收。在甲田善生的重金屬毒性表中，鉛排在常見的具有潛 在毒性元素的第三位。此外，鉛還可能是一種致癌物質(zhì)。根據(jù)對鉛致癌性的動物實驗和人群 研究，美國環(huán)保局認為鉛是"可能的人類致癌物"。土壤鉛污染具有隱蔽性、長期性和不可逆 性等特點，已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，鉛污染土壤的高效修復(fù)技術(shù)一直是研究的熱點與難點。土壤 鉛污染具有隱蔽性、長期性和不可逆性等特點，已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，鉛污染土壤的高效修復(fù) 技術(shù)一直是研究的熱點與難點。目前，鉛污染土壤的修復(fù)技術(shù)大體可分為兩類:物理化學(xué)修 復(fù)技術(shù)和生物修復(fù)技術(shù)。生物修復(fù)又可分為微生物修復(fù)法和植物修復(fù)法。利用微生物來減 輕或消除重金屬污染，國內(nèi)外已有許多相關(guān)報道。鉛污染土壤的微生物修復(fù)是利用微生物 對鉛的吸附、沉淀、氧化和還原等作用，降低土壤中鉛的毒性。
[0003] 木霉菌在生物防治和環(huán)境保護領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景，對多種病原微生物引起 的病害具有很好的防治效果，是目前研究較多、應(yīng)用較廣泛的生防菌之一。其中棘孢木霉是 一株在生物防治功能方面研究較多的一種菌。公開號CN 102911878 A的發(fā)明公開了一株 對辣椒疫霉菌具有顯著拮抗作用的棘孢木霉，該菌株可以明顯寄生于辣椒疫霉菌，能有效 降解辣椒疫霉菌的菌絲體，用該菌制備得到的生防制劑，可有效防治辣椒疫病。公開號CN 102888350 A的發(fā)明公開了一株拮抗土傳病害的棘孢木霉，用它生產(chǎn)生物農(nóng)藥，能夠有效防 治土傳病害，保證農(nóng)作物、蔬菜產(chǎn)量的穩(wěn)定生長。除了生物防治功能以外，棘孢木霉還具有 其他方面的功能。公開號為CN 104450530 A的發(fā)明，涉及一株高產(chǎn)復(fù)合纖維素降解酶的棘 孢木霉，該菌株生長速度快，產(chǎn)孢能力強，可以以多種纖維素類材料為底物，將其應(yīng)用于有 機垃圾中可減少垃圾堆肥產(chǎn)生的滲透壓，提高垃圾中纖維素類物質(zhì)的降解效率，提高垃圾 堆肥產(chǎn)品的質(zhì)量。公開號CN 102191180 A的公布了一株從砷污染土壤樣品中分離得到的一 株耐砷的棘孢木霉，這一菌株制成微生物制劑，應(yīng)用于污染土壤和環(huán)境中后，可以通過菌株 的富集和揮發(fā)作用，能在一定程度上降低土壤中砷的含量。但是目前為止，對于棘孢木霉對 重金屬鉛有耐受能力的發(fā)明還鮮有公開。
[0004] 本發(fā)明主要涉及一株對重金屬鉛具有耐受能力的棘孢木霉，這一菌株分離湖南省 懷化市洪江區(qū)被重金屬污染的土壤，且所用土壤是由赤紅壤發(fā)育而來的菜地土壤。所分離 的菌株對重金屬鉛具有優(yōu)良的耐受和吸附能力，可以降低植物中鉛的含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是對從重金屬污染的土壤中分離得到的一株對重金屬鉛有耐受能 力的菌株進行了生物學(xué)鑒定，并對其修復(fù)鉛污染土壤并減少植物中鉛含量方面的應(yīng)用進行 了研究。
[0006] 本發(fā)明涉及的菌株，對重金屬鉛具有耐受性。該菌株具有以下性質(zhì):PDA培養(yǎng)基上 28-30 °C培養(yǎng)4d，菌落直徑30-40mm，菌落稍隆起，菌落中心綠色，邊緣白色，質(zhì)地絮狀，邊緣 不整齊，有明顯的放射狀皺紋，表面無滲出液，反面與正面同色，培養(yǎng)7d，菌落直經(jīng)50-55mm， 菌落中心綠色，邊緣淺綠色，邊緣不整齊，質(zhì)地絮狀，表面無滲出液，反面與正面同色孢子以 彈射的方式向外擴散，在培養(yǎng)基上形成同心環(huán)。光學(xué)顯微鏡下顯示其營養(yǎng)菌絲壁光滑，直徑 1.5-3. Ιμπι，菌絲有隔和分枝，分生孢子梗光滑，基部膨大，頂部錐形變細，分生孢子自頂向 下呈圓形或橢圓形，（2.0-2.3)μπιΧ (1.6-2.7)μπι; ITS序列進化分析顯示該菌株為棘孢木霉 (Trichoderma asperellum)，因此將其命名為棘孢木霉ZZY，于2016年01月14日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 12071，保藏單位 地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0007] 用上述棘孢木霉ZZY，經(jīng)固體發(fā)酵得到固體發(fā)酵產(chǎn)物，將發(fā)酵產(chǎn)物混合于鉛污染土 壤中，并在其中種植小白菜，收獲小白菜后分別檢測小白菜地下根部及地上可食部分的干 重和鉛含量。實驗結(jié)果得出棘孢木霉ZZY不僅可以提高鉛污染土壤中所種植植物的生物 量，而且還可以降低植物中的鉛含量。
【附圖說明】
[0008] 圖1是具有耐鉛能力的棘孢木霉的菌落形態(tài)。
【具體實施方式】
[0009] 實施例1:棘孢木霉的分離與鑒定
[0010] PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200.00g，蔗糖20 ·00g，瓊脂15·00-20 ·00g，蒸餾水1000mL， pH自然，121°C高壓滅菌20min。瞭涼后分裝于平皿中，待用。
[0011] Pb(N03)2溶液:采用分析純Pb(N03)2試劑，準確稱取48.0000g的硝酸鉛粉末，用去 離子水定容至30.0000g/L的硝酸鉛母液，然后過0.22um的濾膜，于4°C箱保存?zhèn)溆茫巳芤?用于加入PDA固體培養(yǎng)基中制備不同Pb2+濃度的含鉛培養(yǎng)基。
[0012] 1)篩選和馴化微生物
[0013] 準確稱取10g被重金屬污染的土樣加入到90mL加有玻璃珠的無菌水中，150r/min 充分振蕩lOmin，待孢子分散后，靜置5min取上清液，經(jīng)過梯度稀釋后分別涂布到含Pb2+質(zhì)量 濃度為200mg/L的PDA固體培養(yǎng)基中，每個平板做三個平行。培養(yǎng)溫度為28-30°C，培養(yǎng)3-5d。 菌種經(jīng)過培養(yǎng)后再依次接種于含Pb 2+質(zhì)量濃度更高的固體培養(yǎng)基中（400mg/L、600mg/L、 800mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、2500mg/L、3000mg/L 和 3500mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)。如此 通過不斷提高培養(yǎng)基中的Pb2+質(zhì)量濃度，從而對土壤中的耐受重金屬的菌株進行逐級馴化。
[0014] 2)菌株的分離與純化
[0015] 采用對Pb2+耐受性最高的菌株，在無菌操作條件下，挑取單個菌落的邊緣在無重金 屬的固體培養(yǎng)基上劃線分離，培養(yǎng)5d后，觀察菌落形態(tài)。為了使菌株更加純化，用平板培養(yǎng) 基再轉(zhuǎn)接分離3次。
[0016] 3)微生物的富集培養(yǎng)與保存
[0017] 為了使菌株能更好更長久地保持活性，取平板上分散的單菌落，在無菌操作下，用 接種環(huán)挑取少量菌種接種在PDA試管斜面富集培養(yǎng)基中，置于28-30°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d 后，保存在4°C冰箱中，以備后續(xù)研究使用。
[0018] 4)菌株的鑒定
[0019]在光學(xué)顯微鏡下，對純化的菌株進行形態(tài)觀察。用ITS鑒定法對其從分子學(xué)角度進 行鑒定。
[0020] 菌株P(guān)DA培養(yǎng)基上28-30°C培養(yǎng)4d，菌落直徑30-40mm，菌落稍隆起，菌落中心綠色， 邊緣白色，質(zhì)地絮狀，邊緣不整齊，有明顯的放射狀皺紋，表面無滲出液，反面與正面同色， 培養(yǎng)7d，菌落直經(jīng)50-55_，菌落中心綠色，邊緣淺綠色，邊緣不整齊，質(zhì)地絮狀，表面無滲出 液，反面與正面同色孢子以彈射的方式向外擴散，在培養(yǎng)基上形成同心環(huán)。光學(xué)顯微鏡下顯 示其營養(yǎng)菌絲壁光滑，直徑1.5-3. Ιμπι，菌絲有隔和分枝，分生孢子梗光滑，基部膨大，頂部 錐形變細，分生孢子自頂向下呈圓形或橢圓形，（2 · 0-2 · 3 )μπι X (1 · 6-2 · 7 )μπι; ITS序列為：
[0021 ] 經(jīng)過鑒定，確定該菌株為棘孢木霉（Trichoderma asperellum)，命名為ΖΖΥ， GenBank 的登錄號為 KU375549。
[0022] 5)菌株的保藏
[0023]棘孢木霉ZZY的保藏：該菌株于2016年01月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No.12071。
[0024] 實施例2:棘孢木霉ZZY的固體發(fā)酵
[0025] PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 · 00g，蔗糖20 · 00g，瓊脂15 · 00-20 · 00g，蒸餾水1000mL， pH自然，分裝于試管中。
[0026] PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 · OOg，蔗糖20 · OOg，蒸餾水lOOOmL，pH自然，以每瓶 100mL的裝瓶量分裝于250mL三角瓶中。
[0027]固體培養(yǎng)基:稻糠20.0(^，葡萄糖2.0(^，蒸餾水1011^，？!1自然，放置于2501^三角瓶 中。
[0028] 所有培養(yǎng)基121Γ高壓滅菌20min。
[0029] 將本發(fā)明使用的菌種棘孢木霉ZZY接種在PDA固體培養(yǎng)基斜面上，于28-30°C下恒 溫培養(yǎng)4-6d，成熟后，用無菌水制成孢子懸浮液，調(diào)節(jié)孢子懸液濃度為10 7-108個/mL，待用。
[0030] 將上述孢子懸液以0.5%-1.5%的接種量接種到roA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為： 溫度28-30 °C，轉(zhuǎn)速150-180r/min，培養(yǎng)時間4-6d。得到種子液，待用。
[0031 ] 將種子液以5%-15%的接種量，接種到固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8-15d，在40-60°C下干 燥至恒重，得到固體發(fā)酵產(chǎn)物。
[0032]實施例3:棘孢木霉修復(fù)鉛污染土壤，降低植物中含鉛量
[0033]將采自湖南省懷化市洪江區(qū)被重金屬污染的土壤(鉛含量為124.5mg/kg)，采用高 溫滅菌的方式將其滅菌，121°C高壓滅菌20min。實驗組將實施例2所得的固體發(fā)酵產(chǎn)物以 0.2%的比例與滅菌土壤混合;對照組不加入任何物質(zhì)。分別以2kg/盆的裝盆量將兩組土壤 裝入花盆中，播種小白菜種子"上海青"，每組設(shè)置三個平行，放入18-20°C的溫室中培養(yǎng)。在 培養(yǎng)過程中，定期澆水，并利用0.5%-0.6%的尿素水進行追肥。長出菜苗后，進行間苗，每 盆留下一定數(shù)量的植株大小、健壯程度相似的菜苗，其余菜苗全部拔出。培養(yǎng)20d后終止培 養(yǎng)。分別將實驗組和對照組的小白菜地上可食部分和地下根部收集烘干至恒重，并記錄;兩 組土壤烘干至恒重。分別測定實驗組和對照組小白菜地上可食部分和地下根部的重金屬含 量。
[0034] 土壤中重金屬鉛的含量利用文獻"火焰原子吸收分光光度法測定污染土壤中5種 重金屬"中火焰原子吸收分光光度計法測定。
[0035]植物中重金屬鉛含量利用"GB 5009.12-2010食品中鉛的測定"中火焰原子吸收光 譜法測定。
[0036]實驗結(jié)果如表1所示。結(jié)果得出添加棘孢木霉ZZY固體發(fā)酵產(chǎn)物后的實驗組的各項 指標與對照組相比都有顯著差異，證明棘孢木霉ZZY不僅可以提高鉛污染土壤中所種植植 物的生物量，而且還可以降低植物中的鉛含量。
[0037]表1小白菜種植實驗結(jié)果
[0038]
【主權(quán)項】
1. 一株具有耐鉛能力的木霉菌株，其特征在于：所述木霉菌株為棘孢木霉 (Trichoderma asperellum)ZZY，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， CGMCC No.12071。2. 如權(quán)利要求1所述的具有耐鉛能力的棘孢木霉ZZY，其形態(tài)特征是:PDA培養(yǎng)基上28-30°C培養(yǎng)4d，菌落直徑30-40mm，菌落稍隆起，菌落中心綠色，邊緣白色，質(zhì)地絮狀，邊緣不整 齊，有明顯的放射狀皺紋，表面無滲出液，反面與正面同色，培養(yǎng)7d，菌落直經(jīng)50-55mm，菌落 中心綠色，邊緣淺綠色，邊緣不整齊，質(zhì)地絮狀，表面無滲出液，反面與正面同色孢子以彈射 的方式向外擴散，在培養(yǎng)基上形成同心環(huán)。光學(xué)顯微鏡下顯不其營養(yǎng)菌絲壁光滑，直徑1.5-3. Ιμπι，菌絲有隔和分枝，分生孢子梗光滑，基部膨大，頂部錐形變細，分生孢子自頂向下呈 圓形或橢圓形，（2.0-2.3)μπιΧ( 1.6-2.7)μπι。3. 如權(quán)利要求1所述的具有耐鉛能力的棘孢木霉ΖΖΥ，其ITS序列為： AATTGGTTTGGAAACGGTTTAACCAAATCTTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCG GAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAG CAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC GATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCG GGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACAC GGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGA GCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAA CTTAAGCATATCAATAAGCGGAGG 〇4. 如權(quán)利要求1所述的具有耐鉛能力的棘孢木霉ZZY在鉛污染土壤治理及降低鉛在作 物及農(nóng)產(chǎn)品中積累方面的應(yīng)用。
【文檔編號】B09C1/10GK105969668SQ201610058943
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年1月26日
【發(fā)明人】朱振元, 孫會輕, 李啟祥, 董海燕, 宋巧英
【申請人】天津科技大學(xué)