一種重組大腸桿菌菌株及用其制備番茄紅素的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)番茄紅素的方法，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。本方法所用的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為化學成分確定的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成本低廉，不含有任何有機態(tài)氮源。本方法采用菌體生長和誘導轉(zhuǎn)化期脫偶聯(lián)的生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)番茄紅素，有效保證了較快的菌體生長速度，節(jié)省了生產(chǎn)的時間成本。利用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基和方法高密度培養(yǎng)大腸桿菌，并通過誘導、轉(zhuǎn)化，以葡萄糖為底物生產(chǎn)番茄紅素，菌體密度(OD600nm)和番茄紅素產(chǎn)量分別達到200和3.2g/L發(fā)酵液，發(fā)酵周期36小時。CGMCC No.1220320160311
【專利說明】
一種重組大腸桿菌菌株及用其制備番茄紅素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
:
[0001]本發(fā)明涉及一種大腸桿菌(Escherichiacoli)的新菌株及通過高密度培養(yǎng)該菌株制備生產(chǎn)番茄紅素的方法，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
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[0002]高密度培養(yǎng)(HCDC)即高密度發(fā)酵，一般指培養(yǎng)液中工程菌的菌體干重濃度達到50g/L以上，對工程大腸桿菌而言，其OD6qqim值達到150以上。與傳統(tǒng)微生物發(fā)酵培養(yǎng)相比，高密度培養(yǎng)具有菌體密度高，產(chǎn)物的細胞水平量高，單位體積設備的生產(chǎn)能力高，生物量的分離費用低，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)效率高等優(yōu)點。但隨著菌體密度增加，也會隨之出現(xiàn)一些問題，例如培養(yǎng)物中溶氧不足;代謝產(chǎn)物乙酸的堆積對菌體生長和外源蛋白表達的抑制；工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定性下降;底物濃度對細胞增長存在的抑制性作用等。
[0003]番茄紅素(Lycopene)是一種多元不飽和碳氫化合物，屬于類胡蘿卜素家族，是一種抗氧化劑，它是構(gòu)成番茄紅色色素的主要成分。番茄紅素在醫(yī)藥、食品以及化妝品領(lǐng)域有重要的應用，比如它具有防病抗癌、增強機體免疫力和抗衰老的生理功能，可有效防止“自由基”對人體造成的傷害。番茄紅素無毒無害，可以添加到食品中，以增加食品的營養(yǎng)價值。近年來，番茄紅素相關(guān)的產(chǎn)品研發(fā)已成為國際上新藥研究的熱點。
[0004]目前國際上番茄紅素的生產(chǎn)主要有天然提取、化學合成和微生物發(fā)酵法等。番茄中番茄紅素的含量很低，利用天然提取法生產(chǎn)番茄紅素不僅產(chǎn)量低，而且價格昂貴，無法滿足市場需求;化學合成法以紫羅酮作為原料，雖價格比天然提取法低廉，但有中間產(chǎn)物殘留，其中不安全因素較多，如毒性和致癌性。而微生物發(fā)酵法具有成本低、反應條件溫和、產(chǎn)率高、易于大規(guī)模培養(yǎng)、環(huán)境友好等優(yōu)點。隨著生物工程領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素已成為目前的研究熱點之一。
[0005]微生物發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素所用的菌株分為野生微生物菌株和代謝工程菌株兩類。野生微生物菌株以三孢布拉霉(Blakeslea trispora)為主，最高產(chǎn)量約為3.7g/L，但霉菌生產(chǎn)周期較長，生產(chǎn)的時間成本較高。代謝工程菌以工程大腸桿菌(Escherichia coli)為主，利用基因工程的方法，以微生物內(nèi)源或外源的MEP途徑或者外源的MVA途徑合成IPP和DMAPP，再引入外源的CrtE、CrtB和CrtI基因，最終合成番茄紅素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明人已做過廣泛的研究，以提供一種通過發(fā)酵以工業(yè)規(guī)模實現(xiàn)制備番茄紅素的方法。
[0007]本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種大腸桿菌菌株(Escherichiacoli),該菌株生產(chǎn)周期較短，生產(chǎn)的時間成本較低。
[0008]本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種高密度培養(yǎng)方法，該方法能實現(xiàn)高菌體密度、高外源蛋白表達量、高目標產(chǎn)物產(chǎn)量。
[0009]本發(fā)明提供了一種高密度培養(yǎng)工程大腸桿菌生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)番茄紅素的方法。本方法有如下優(yōu)勢:
[0010](I)所用的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為化學成分確定的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成本低廉，不含有任何有機態(tài)氮源，如酵母浸提物、蛋白胨等。
[0011](2)本方法采用菌體生長期和誘導、轉(zhuǎn)化期脫偶聯(lián)的生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)番茄紅素，有效保證了較快的菌體生長速度，節(jié)省了生產(chǎn)的時間成本。
[0012](3)本方法在菌體生長期采用了指數(shù)補料-恒速補料相結(jié)合的分段補料方式，既保證了菌體生長所需營養(yǎng)的供給，又可根據(jù)發(fā)酵設備的自身限制最大限度地保證發(fā)酵液中氧氣的供應，菌體密度(ODeoor?)達到200。
[0013](4)利用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基和方法高密度培養(yǎng)大腸桿菌，并通過誘導、轉(zhuǎn)化，以葡萄糖為底物生產(chǎn)番茄紅素，菌體密度(OD6OOnm)和番茄紅素產(chǎn)量分別達到200和3.2g/L發(fā)酵液，發(fā)酵周期36小時。
[0014]本發(fā)明的重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)菌株Mva-10-Yk，已于2016年3月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為:CGMCCN0.12203，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
[0015]本發(fā)明的高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其中包括種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基。
[0016]所述的種子培養(yǎng)基，按g/L記，包括:檸檬酸1.1-2；磷酸二氫鉀9-15.2;磷酸氫二銨2-4；七水合硫酸鎂0.1-1.5；葡萄糖2-5;硫酸鏈霉素0.05-2；硫酸卡那霉素0.05 -1.5。
[0017]所述種子培養(yǎng)基中的七水合硫酸鎂和葡萄糖需要分別單獨滅菌后與其他成分混入口 ο
[0018]所述種子培養(yǎng)基中的硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素需分別單獨用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混合。
[0019]所述種子培養(yǎng)基在滅菌之前需用濃度為5M的氨水調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5。
[0020]所述發(fā)酵培養(yǎng)基，按g/L記，包括:檸檬酸1.1-2.0;磷酸二氫鉀9-15.2;磷酸氫二銨
2-4;七水合硫酸鎂0.1-1.5;葡萄糖10-25;以及維生素BI 3-10mg/L;微量元素I 10_20ml/1^聚醚類消泡劑0.1-21111/1。
[0021]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素I，包括:800-1000mg/L乙二胺四乙酸二鈉，100-25011^/1六水合氯化鈷，1500-250011^/1四水合氯化亞錳，90-15011^/1二水合氯化銅，200-500mg/L硼酸，250-400mg/L 二水合鉬酸鈉，1000-2500mg/L 二水合乙酸鋅，5-10g/L檸檬酸鐵。
[0022]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的七水合硫酸鎂和葡萄糖需要分別單獨滅菌后與其他成分混入口 ο
[0023]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的維生素BI，微量元素I，需分別單獨用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混合。
[0024]所述補料培養(yǎng)基中，包括:葡萄糖400-600g/L;七水合硫酸鎂1.0-2.0g/L;微量元素 II 10-20ml/Lo
[0025]所述補料培養(yǎng)基中的微量元素II，包括:900-1200mg//L乙二胺四乙酸二鈉，400-eoomg/l六水合氯化鈷，1200 - 2400mg/L四水合氯化亞錳，100 - 300mg/L二水合氯化銅，200 -500mg/L硼酸，300 - 250mg/L二水合鉬酸鈉，1500 - 2500mg/L二水合乙酸鋅，1- 4g/L檸檬酸鐵。
[0026]所述補料培養(yǎng)基中的葡萄糖和七水合硫酸鎂需要分別單獨滅菌后與其他成分混口 O
[0027]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素II，需單獨用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混入口 O
[0028]本發(fā)明提供的一種應用所述培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)重組大腸桿菌生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)番茄紅素的方法。
[0029]所述的高密度培養(yǎng)，是指菌體增長階段與誘導、轉(zhuǎn)化階段脫偶聯(lián)的培養(yǎng)方式，具體地，該方法包括種子培養(yǎng)階段，菌體增長階段，誘導轉(zhuǎn)化階段。
[0030]所述高密度培養(yǎng)中的種子培養(yǎng)階段，是指將凍存的菌種以1- 5 %的接種量，接種到裝有20-1OOml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶；于搖床30-39°C，180-280rpm的條件下培養(yǎng)5-12小時得到一級種子;再將一級種子以2-10%的接種量，接種到裝有20-1OOml種子培養(yǎng)基的5001111三角瓶;于搖床30-39°(:，180-280印111的條件下培養(yǎng)5-12小時得到二級種子，二級種子的00600咖為1.5-4.00
[0031]所述高密度培養(yǎng)中的菌體增長階段，是指將二級種子以2%-10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為30-60%的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐通氣量為1-5vvm，轉(zhuǎn)速為200-1200rpm，溶氧控制在15- 35 %，溶氧偶聯(lián)轉(zhuǎn)速，pH為6.5-7.5，以濃度為5-1OM氨水控制pH，培養(yǎng)溫度為29-39 °C；發(fā)酵時間為5 - 8h時，發(fā)酵液中初始葡萄糖耗盡，立即啟動補料培養(yǎng)基的補料，補料速率分布在7-28ml/(L.h )，從補料起始時間開始，每2 - 5h取出少量發(fā)酵液，測量其0D600nm，直至發(fā)酵時間為18 - 25h，發(fā)酵液0D600nm的增長速率減慢，該時間點0D600nm為160-185。
[0032]所述菌體增長階段的補料速率是指采用指數(shù)補料-恒速補料相結(jié)合的方式，具體地，以7-10ml/(L.h)起始，并以每小時1.05-1.35的倍率增長，模擬指數(shù)補料;直至發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和通氣量達到上限時，補料速率不再增加，并維持該時刻補料速率不變，進行恒速補料。
[0033]所述的誘導轉(zhuǎn)化階段，是指菌體增長階段結(jié)束后，向發(fā)酵液中加入終濃度為
0.002-0.2%的L-阿拉伯糖，調(diào)整補料速率，誘導生產(chǎn)番茄紅素的相關(guān)酶表達，并以補料培養(yǎng)基中的葡萄糖為底物，生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生番茄紅素。
[0034]所述誘導轉(zhuǎn)化階段的的調(diào)整補料速率，包括將補料速率調(diào)整至15_30ml/(L.h)，進入誘導轉(zhuǎn)化期6小時后，番茄紅素產(chǎn)量明顯增加，補料速率按每小時0.4-0.9倍的倍率減慢，直至發(fā)酵時間達到36小時放罐。
[0035]產(chǎn)物番茄紅素的檢測方法:
[0036]發(fā)酵過程中可留取發(fā)酵液樣品于-20°C保存，用于產(chǎn)物檢測。
[0037]樣品化凍后搖勻，取發(fā)酵液樣品離心8000rpm，5min后棄上清，將沉淀震蕩散開，向沉淀中加入等體積丙酮，充分萃取SOminc3I^OOOrpm離心5min，測定其474nm吸光值。
[0038]番茄紅素濃度與A474nm的標準曲線如圖1所示。
[0039]利用本方法，發(fā)酵結(jié)束時菌體密度(0D6QQnm)和番茄紅素產(chǎn)量分別達到150-200和2.4-3.2g/L發(fā)酵液，發(fā)酵周期36小時。其生物量和產(chǎn)物體積產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的變化曲線如圖2所示。
【附圖說明】
:
[0040]圖1番茄紅素標準曲線圖
[0041]圖2生長曲線及產(chǎn)物曲線圖
【具體實施方式】
:
[0042]實施例1
[0043]重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基制備
[0044]種子培養(yǎng)基，按g/L記，包括:檸檬酸1.7;磷酸二氫鉀13;磷酸氫二銨4;七水合硫酸鎂1.0;葡萄糖5;硫酸鏈霉素0.05;硫酸卡那霉素0.05。
[0045]所述種子培養(yǎng)基中的七水合硫酸鎂和葡萄糖需要分別單獨滅菌后與其他成分混入口 ο
[0046]所述種子培養(yǎng)基中的硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素需分別單獨用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混合。
[0047]所述種子培養(yǎng)基在滅菌之前需用濃度為5M的氨水調(diào)節(jié)pH至7.0。
[0048]發(fā)酵培養(yǎng)基，按g/L記，包括:檸檬酸1.7;磷酸二氫鉀15;磷酸氫二銨4;七水合硫酸鎂0.9;葡萄糖20;以及維生素BI 5mg/L;微量元素I 10ml/L;聚醚類消泡劑0.5ml/L。
[0049]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素I，包括:800mg/L乙二胺四乙酸二鈉，100mg/L六水合氯化鈷，1500mg/L四水合氯化亞猛，90mg/L 二水合氯化銅，200mg/L硼酸，250mg/L 二水合鉬酸鈉，1000mg/L 二水合乙酸鋅，5g/L檸檬酸鐵。
[0050]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的七水合硫酸鎂和葡萄糖需要分別單獨滅菌后與其他成分混入口 ο
[0051]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的維生素BI，微量元素I，需分別單獨用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混合。
[0052]所述補料培養(yǎng)基中，包括:葡萄糖600g/L;七水合硫酸鎂1.0g/L;微量元素II10ml/Lo
[0053]所述補料培養(yǎng)基中的微量元素II，包括:900mg/L乙二胺四乙酸二鈉，400mg/L六水合氯化鈷，1200mg/L四水合氯化亞猛，100mg/L 二水合氯化銅，200mg/L硼酸，300mg/L 二水合鉬酸鈉，1500mg/L二水合乙酸鋅，I g/L檸檬酸鐵。
[0054]所述補料培養(yǎng)基中的葡萄糖和七水合硫酸鎂需要分別單獨滅菌后與其他成分混入口 ο
[0055]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素II，需單獨用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混入口 O
[0056]實施例2
[0057]重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)的種子液制備
[0058]重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)菌株Mva-10_Yk，已于2016年3月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為:CGMCC N0.12203。
[0059]高密度培養(yǎng)中的種子培養(yǎng)階段，是指將凍存的菌種以I%的接種量，接種到裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶;于搖床37°C，280rpm的條件下培養(yǎng)8小時得到一級種子;再將一級種子以4%的接種量，接種到裝有10ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶；于搖床37°C，280印111的條件下培養(yǎng)6小時得到二級種子，二級種子的0060011111為1.5-2.5。
[0060]實施例2中所述的種子培養(yǎng)為:
[0061 ]種子培養(yǎng)基，按g/L記，包括:檸檬酸1.7;磷酸二氫鉀13;磷酸氫二銨4;七水合硫酸鎂1.0;葡萄糖5;硫酸鏈霉素0.05;硫酸卡那霉素0.05。
[0062]所述種子培養(yǎng)基中的七水合硫酸鎂和葡萄糖需要分別單獨滅菌后與其他成分混入口 ο
[0063]所述種子培養(yǎng)基中的硫酸鏈霉素和硫酸卡那霉素需分別單獨用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混合。
[0064]所述種子培養(yǎng)基在滅菌之前需用濃度為5M的氨水調(diào)節(jié)pH至7.0。
[0065]發(fā)酵培養(yǎng)基，按g/L記，包括:檸檬酸1.7;磷酸二氫鉀15;磷酸氫二銨4;七水合硫酸鎂0.9;葡萄糖20;以及維生素BI 5mg/L;微量元素I 10ml/L;聚醚類消泡劑0.5ml/L。
[0066]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素I，包括:800mg/L乙二胺四乙酸二鈉，100mg/L六水合氯化鈷，1500mg/L四水合氯化亞猛，90mg/L二水合氯化銅，200mg/L硼酸，250mg/L二水合鉬酸鈉，1000mg/L 二水合乙酸鋅，5g/L檸檬酸鐵。
[0067]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的七水合硫酸鎂和葡萄糖需要分別單獨滅菌后與其他成分混入口 ο
[0068]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的維生素BI，微量元素I，需分別單獨用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混合。
[0069]所述補料培養(yǎng)基中，包括:葡萄糖600g/L;七水合硫酸鎂1.0g/L;微量元素II10ml/Lo
[0070]所述補料培養(yǎng)基中的微量元素II，包括:900mg/L乙二胺四乙酸二鈉，400mg/L六水合氯化鈷，1200mg/L四水合氯化亞猛，100mg/L 二水合氯化銅，200mg/L硼酸，300mg/L 二水合鉬酸鈉，1500mg/L二水合乙酸鋅，I g/L檸檬酸鐵。
[0071]所述補料培養(yǎng)基中的葡萄糖和七水合硫酸鎂需要分別單獨滅菌后與其他成分混入口 ο
[0072]所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素II，需單獨用無菌濾膜過濾滅菌后與其他成分混入口 O
[0073]實施例3
[0074]重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)的菌體增長階段調(diào)控方法
[0075]高密度培養(yǎng)中的菌體增長階段，是指將二級種子以10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為40%的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐通氣量為1-3vvm，轉(zhuǎn)速為300-1200rpm，溶氧控制在20-30 %，溶氧偶聯(lián)轉(zhuǎn)速，pH為6.8 - 7.2，以濃度為5M氨水控制pH，培養(yǎng)溫度為37 V ;當發(fā)酵時間為Sh時，發(fā)酵液溶氧瞬間上升，即發(fā)酵液中初始葡萄糖耗盡，立即啟動補料培養(yǎng)基的補料，補料速率從8ml/(L.h)起始，隨之以指數(shù)補料-恒速補料相結(jié)合的方式調(diào)控。，從補料起始時間開始，每2 - 5h取出少量發(fā)酵液，測量其0D600nm，直至發(fā)酵時間為2 Ih，發(fā)酵液0D600nm的增長速率減慢，該時間點0060011111為180。
[0076]所述菌體增長階段的補料速率是指采用指數(shù)補料-恒速補料相結(jié)合的方式，具體地，以8ml/(L.h)起始，并以每小時1.2的倍率增長，模擬指數(shù)補料;直至發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和通氣量達到上限時，補料速率不再增加，并維持該時刻補料速率不變，進行恒速補料。
[0077]實施例4
[0078]重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)番茄紅素的誘導轉(zhuǎn)化階段
[0079]以實施例3所描述的方法，菌體增長階段結(jié)束后，向發(fā)酵液中加入終濃度為0.02%的L-阿拉伯糖，調(diào)整補料速率，誘導生產(chǎn)番茄紅素的相關(guān)酶表達，并以補料培養(yǎng)基中的葡萄糖為底物，生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生番茄紅素。
[0080]所述誘導轉(zhuǎn)化階段的的調(diào)整補料速率，是將補料速率調(diào)整至25ml/(L.h)，進入誘導轉(zhuǎn)化期6小時后，番茄紅素產(chǎn)量明顯增加，補料速率按每小時0.7倍的倍率減慢，直至發(fā)酵時間達到36小時放罐。
[0081 ]產(chǎn)物番茄紅素的檢測方法:
[0082]發(fā)酵過程中可留取發(fā)酵液樣品于-20°C保存，用于產(chǎn)物檢測。
[0083]樣品化凍后搖勻，取發(fā)酵液樣品離心8000rpm，5min后棄上清，將沉淀震蕩散開，向沉淀中加入等體積丙酮，充分萃取SOminc3I^OOOrpm離心5min，測定其474nm吸光值。
[0084]發(fā)酵結(jié)束時菌體密度(0D600nm)和番茄紅素產(chǎn)量分別達到200和3.2g/L發(fā)酵液，發(fā)酵周期36小時。
【主權(quán)項】
1.一種重組大腸桿菌(Escherichia coli)菌株Mva-10-Yk，該菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號CGMCC N0.12203。2.—種用重組大腸桿菌菌株制備番茄紅素的方法，其特征在于，在高密度培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組大腸桿菌的種子培養(yǎng)階段、菌體增長階段和誘導轉(zhuǎn)化階段。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高密度培養(yǎng)基，其特征包括:種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、補料培養(yǎng)基。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的種子培養(yǎng)基，其特征包括:檸檬酸1.1-2g/L;磷酸二氫鉀9-15.2g/L;磷酸氫二銨2-4g/L;七水合硫酸鎂0.1-1.5g/L;葡萄糖2-5g/L;硫酸鏈霉素0.05-2g/L ;硫酸卡那霉素0.05-1.5g/L。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的種子培養(yǎng)基，其特征在于:在滅菌之前需用濃度為5M的氨水調(diào)節(jié)pH至6.5-7.5。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征包括:檸檬酸1.1-2.0g/L;磷酸二氫鉀9 -15.2g/L;磷酸氫二銨2- 4g/L;七水合硫酸鎂0.1-1.5g/L;葡萄糖10- 25g/L;以及維生素BI3- 10mg/L;微量元素I 10-20ml/L;聚醚類消泡劑0.1_2ml/L。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微量元素I，其特征包括:800-1000mg/L乙二胺四乙酸二鈉，100-25011^/1六水合氯化鈷，1500-250011^/1四水合氯化亞錳，90-15011^/1二水合氯化銅，200 - 500mg/L硼酸，250 - 400mg/L二水合鉬酸鈉，1000 - 2500mg/L二水合乙酸鋅，5 -10g/L檸檬酸鐵。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的補料培養(yǎng)基，其特征在于:葡萄糖400-600g/L;七水合硫酸鎂1.0-2.0g/L;微量元素 II 10-20ml/Lo9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微量元素II，其特征在于:900-1200mg/L乙二胺四乙酸二鈉，400 - 600mg/L六水合氯化鈷，1200 - 2400mg/L四水合氯化亞錳，100 - SOOmg/!二水合氯化銅，200-500mg/L硼酸，300-250mg/L二水合鉬酸鈉，1500-2500mg/L二水合乙酸鋅，1-4g/L檸檬酸鐵。10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的種子培養(yǎng)階段，其特征在于:將凍存的菌種以1-5%的接種量，接種到裝有20-1OOml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶;于搖床30-39 °C，180-280rpm的條件下培養(yǎng)5-12小時得到一級種子;再將一級種子以2-10%的接種量，接種到裝有20-1OOml種子培養(yǎng)基的5001111三角瓶;于搖床30-39°(:，180-280印111的條件下培養(yǎng)5-12小時得到二級種子，二級種子的0D6QQnm為1.5-4.0。11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌體增長階段，其特征在于:將二級種子以2%-10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為30 - 60 %的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐通氣量為1- 5vvm，轉(zhuǎn)速為200 -1200rpm，溶氧控制在15- 35 %，溶氧偶聯(lián)轉(zhuǎn)速，pH為6.5- 7.5，以濃度為5-1OM氨水控制pH，培養(yǎng)溫度為29 - 39 °C ;發(fā)酵時間為5- 8h時，發(fā)酵液中初始葡萄糖耗盡，立即啟動補料培養(yǎng)基的補料，補料速率分布在7-28ml/(L.h)，采用指數(shù)補料-恒速補料相結(jié)合的方式進行;從補料起始時間開始，每2-5h取出少量發(fā)酵液，測量其OD6QQnm，直至發(fā)酵時間為18-25h，發(fā)酵液0D_■的增長速率下降，該時間點OD6qq■為160 -185 012.根據(jù)權(quán)利要求11所述的指數(shù)補料-恒速補料相結(jié)合的方式補料，其特征在于:以7-10ml/(L.h)起始，并以每小時1.05-1.35的倍率增長，模擬指數(shù)補料;直至發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速和通氣量達到上限時，補料速率不再增加，并維持該時刻補料速率不變，進行恒速補料。13.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導轉(zhuǎn)化階段，其特征在于:菌體增長階段結(jié)束后，向發(fā)酵液中加入終濃度為0.002-0.2 %的L-阿拉伯糖，調(diào)整補料速率，誘導生產(chǎn)番茄紅素的相關(guān)酶表達，并以補料培養(yǎng)基中的葡萄糖為底物，生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生番茄紅素。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的調(diào)整補料速率，其特征在于:將補料速率調(diào)整至15-30ml/(L.h)，進入誘導轉(zhuǎn)化期6小時后，番茄紅素產(chǎn)量明顯增加，補料速率按每小時0.4-0.9倍的倍率減慢，直至發(fā)酵時間達到36小時放罐。
【文檔編號】C12P5/02GK105969709SQ201610292894
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】陳浩, 陳浪, 周衛(wèi)強, 張莎莎, 胡開蕾, 晏禮明, 陶勇, 劉偉豐
【申請人】中國科學院微生物研究所