重組減毒炭疽芽胞桿菌及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了重組減毒炭疽芽胞桿菌及其應用。本發(fā)明提供了重組菌，為降低和/或抑制炭疽芽胞桿菌AP429 CGMCCNO.4912中mntA蛋白和nos蛋白活性得到的菌。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431 CGMCC NO.12321毒力較現有疫苗株A16R大降低，無抗生素抗性標記，能夠在菌體的S層表面穩(wěn)定表達保護性抗原，且該菌株能夠形成芽胞。本發(fā)明構建的菌株為新型疫苗的研究打下基礎。CGMCC NO. 1232120160330CGMCC NO.491220110526
【專利說明】
重組減毒炭疽芽胞桿菌及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及重組減毒炭疽芽胞桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)是一種G+菌，它引起的炭疽是一種烈性傳染 病，在我國列為乙類傳染病，已經列入國家的計劃免疫?，F批準使用的炭疽疫苗A16R株仍保 留有編碼毒素的大質粒PX01，具有一定的殘留毒性。因此研究更加安全有效的新型炭疽桿 菌疫苗就顯得非常有必要。
[0003] 減毒炭疽桿菌作為宿主進行保護性抗原表達是研究新型炭疽桿菌疫苗的一種重 要策略，相關研究也已有報道，但由于其培養(yǎng)過程中要求使用抗生素而限制了其使用。因 此，利用減毒炭疽桿菌為宿主，通過基礎重組技術，采用靶基因整合到染色體實現目標基因 穩(wěn)定表達構建新型的疫苗候選株。其次，采用表面呈現的方法進行抗原表達一直被認為是 一種比較理想的外源抗原表達，利于其免疫后機體相關免疫進行抗原提呈。另外考慮到重 組菌作為疫苗安全性問題，對菌株的毒力相關基因進行缺失突變也是構建活載體疫苗一種 常用的方法。總之，通過一系列基因操作，構建和研究一種新型的炭疽芽胞桿菌疫苗。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明一個目的是提供了一種重組減毒炭疽芽胞桿菌。
[0005] 本發(fā)明提供的重組菌，為降低和/或抑制炭疽芽胞桿菌4?429 061〇：^).4912中 mntA蛋白和nos蛋白活性得到的菌。
[0006] 上述重組菌中，所述降低和/或抑制炭疽芽胞桿菌六?429 061〇：勵.4912中111拉八蛋 白和nos蛋白活性為沉默炭疽芽胞桿菌AP429 CGMCC N0.4912中mntA蛋白編碼基因和nos蛋 白編碼基因的表達。
[0007] 上述重組菌中，所述沉默炭疽芽胞桿菌AP429 CGMCC N0.4912中mntA蛋白編碼基 因和nos蛋白編碼基因的表達為敲除炭疽芽胞桿菌AP429 CGMCC N0.4912中mntA蛋白編碼 基因和nos蛋白編碼基因。
[0008] 上述重組菌中，所述敲除炭疽芽胞桿菌AP429 CGMCC N0.4912中mntA蛋白編碼基 因和nos蛋白編碼基因均采用基因組定點編輯或同源重組的方式進行。
[0009] 上述重組菌中，所述同源重組為λ-red同源重組或sacB基因介導篩選的同源重組 或自殺質粒介導的同源重組。
[0010] 所述敲除炭疽芽胞桿菌AP429 CGMCC N0.4912中mntA蛋白編碼基因和nos蛋白編 碼基因包括如下步驟：
[0011] 1)將質粒PSS4332導入宿主菌中，得到表達質粒pSS4332的宿主菌；
[0012] 2)將表達mntA蛋白編碼基因上游同源臂、mntA蛋白編碼基因的下游同源臂、壯觀 霉素和I-Scel識別位點的重組載體A導入表達質粒pSS4332的宿主菌中，得到中間菌A;質粒 PSS4332表達的歸巢內切酶I-scel將轉化入細胞內的的帶I-scel酶切位點的重組載體A進 行切割，促進重組載體A與基因組的同源重組；
[0013] 3)將中間菌A進行不加卡那霉素傳代培養(yǎng)，使質粒pSS4332丟失，得到敲除mntA蛋 白編碼基因的重組菌A;
[0014] 4)將質粒PSS4332導入重組菌A中，得到表達PSS4332的重組菌A;
[0015] 5)將表達nos蛋白編碼基因上游同源臂、nos蛋白編碼基因的下游同源臂、壯觀霉 素和I-Scel識別位點的重組載體B導入表達pSS4332的重組菌A中，得到中間菌B;質粒 PSS4332表達的歸巢內切酶I-scel將轉化入細胞內的的帶I-scel酶切位點的重組載體B進 行切割，促進重組載體B與基因組的同源重組；
[0016] 6)將所述中間菌B進行不加卡那霉素傳代培養(yǎng)，使質粒PSS4332丟失，得到敲除 mntA和nos蛋白編碼基因的重組菌Bacillus anthracis AP429AmntAAnos〇
[0017] 上述重組菌中，所述敲除炭疽芽胞桿菌AP429 CGMCCN0.4912中mntA蛋白編碼基因 采用的同源重組的mntA蛋白編碼基因上游同源臂的核苷酸序列為序列1第1-958位；
[0018] 所述敲除炭疽芽胞桿菌AP429 CGMCCN0.4912中mntA蛋白編碼基因采用的同源重 組的mntA蛋白編碼基因的下游同源臂的核苷酸序列為序列1第1895-2875位；
[0019] 所述敲除炭疽芽胞桿菌AP429 CGMCCN0.4912中nos蛋白編碼基因采用的同源重組 的nos蛋白編碼基因上游同源臂的核苷酸序列為序列2第1-805位；
[0020] 所述敲除炭疽芽胞桿菌AP429 CGMCCN0.4912中nos蛋白編碼基因采用的同源重組 的nos蛋白編碼基因下游同源臂的核苷酸序列為序列2第1872-2680位。
[0021] 上述重組菌中，所述重組菌保藏號為CGMCC N0.12321。
[0022] 將炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431于2016年3月30日保藏于中國微生 物菌種保藏管委理員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝陽區(qū)大屯路）， 保藏號為CGMCC N0.12321，分類命名為炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)。
[0023] 上述的重組菌在制備如下1)或2)產品中的應用也是本發(fā)明保護的范圍：
[0024] 1)、炭疽桿菌疫苗；
[0025] 2)、預防和/或治療炭疽桿菌引發(fā)的疾病的產品。
[0026] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種如下1)或2)產品。
[0027] 本發(fā)明提供的產品，其活性成分為其活性成分為A或B;
[0028] A為上述的重組菌；
[0029] B為表達mntA蛋白編碼基因上游同源臂和mntA蛋白編碼基因的下游同源臂的重組 載體和表達nos蛋白編碼基因上游同源臂和nos蛋白編碼基因的下游同源臂的重組載體；
[0030] 1)、炭疽桿菌疫苗；
[0031] 2)、預防和/或治療炭疽桿菌引發(fā)的疾病的產品。
[0032] 本發(fā)明表達保護性抗原的重組菌株可以用作炭疽桿菌疫苗，所述免疫制劑優(yōu)選為 滅活疫苗、減毒活疫苗和基因工程疫苗。
[0033] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431 CGMCC NO. 12321毒力較現有疫苗株A16R大降低，無抗生素抗性標記，能夠在菌體的S層表面穩(wěn)定表 達保護性抗原，且該菌株能夠形成芽胞。本發(fā)明構建的菌株為新型疫苗的研究打下基礎。
【附圖說明】
[0034]圖1為mntA基因敲除的過程示意圖。
[0035]圖2為mntA基因敲除株PCR鑒定結果。
[0036] 圖3為nos基因敲除株PCR鑒定結果。
[0037] 圖4為重組炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431免疫印跡分析結果。
[0038] 圖5為炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431流式細胞術分析結果。
[0039]圖6為炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431的芽胞形成能力分析結果。
[0040] 圖7為重組炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431小鼠毒力評價結果。
[0041 ] 圖8為炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431小鼠免疫評價實驗結果。
[0042] 圖9為炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431小鼠免疫保護實驗結果。
【具體實施方式】
[0043] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0044] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0045] 13.3111:11瓜(^84?429于2011年5月26日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通 微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝陽區(qū)大屯路），保藏號為CGMCC N0.4912，分 類命名為炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)。
[0046] 實施例1、減毒炭疽芽胞桿菌突變株AP431的獲得
[0047] 一、mntA基因的敲除 [0048] 1、通用質粒改造
[0049] 設計帶有兩個LoxP位點及BamHI、SalI、HindIII、MluI、EcoRI、I-Scel和Ncol等酶 切位點的DNA序列，交由蘇州金唯智生物科技有限公司進行基因合成和克隆到質粒pUC57， 最后得到的質粒命名為pUC-Scel。具體序列如下：
[0050] GGATCCCGCGTCGACGCATGCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGCTTATAACTTC GTATAGCATACATTATACGAAGTTATGCATGCACGCGTCGGAATTCTAGGGATAACAGGGTAATCCATGG
[0051] 以質粒 pSET4s(Daisuke Takamatsu ,Makoto Osaki , and Tsutomu Sekizaki.Thermosensitive Suicide Vectors for Gene Replacement in Streptococcus suis .Plasmid,200,146,140-148，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工 程研究所已保存)為模板，以引物spcF和spcR擴增出兩端均為Hindlll切點的spc抗性元件。 該片段用Hindlll單切后純化回收，再與同樣經Hindlll單切的質粒pUC-Scel連接轉化 E.coli DH5,并在含壯觀霉素的LB平板上進行篩選，得到的陽性克隆即為連接正確的克隆， 將鑒定表明正確的重組質粒命名為pSpc-Scel。其中，引物spcF和spcR的序列為：
[0052] spcF:CCCAAGCTTGTTCGTGAATACATGTTATA
[0053] spcR:CCCAAGCTTGTTTTCTAAAATCTGAT
[0054] 質粒pSpc-Scel用BamHI和EcoRI雙酶切，切膠回收1500bp左右的片段。質粒pMAD (Arnaud M,Chastanet A,and De7 barbouille M.New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable,low-GC-content, gram-positive bacteria.Appl Environ Microb,2004,70( 11):6887~6891，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科 學院生物工程研究所已保存）同樣用BamHI和Ncol雙酶切，純化回收。上述兩個片段經T4連 接酶連接后轉化接轉化E. coli DH5，并在含壯觀霉素的LB平板上進行篩選連接正確的克 隆，最后將鑒定表明正確的重組質粒命名為pMAD-Spc-Scel。
[0055] pMAD-Spc-Scel為將序列表中序列3所不的DNA分子插入質粒pMAD的BamHI和EcoRI 酶切位點間得到的載體。
[0056] 序列表中序列3所示的DNA分子包括Spc基因（序列3第62-1191位)和1-3〇〇1識別位 點（序列3第1252-1269位）。
[0057] 2、打靶質粒構建
[0058] 根據GenBank登錄的Bacillus anthracis sterne株mntA序列及其上下游序列，其 中序列號為BAS2964，設計兩對特異性引物mn t AuF&mn t AuR和mn t AdF&mn t AdR。
[0063] 以Bacillus anthracis A16R株(董梅，莊漢瀾，王希良，炭疽芽孢桿菌A16R株無菌 培養(yǎng)濾液的蛋白質組學分析，軍事醫(yī)學科學院院刊2009年2月第33卷第1期，6-9頁。中國人 民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所已保存)基因組DNA為模板，用mntAuF/mntAuR和 mntAdF/mntAdR分別擴增，得到約95Obp mntA基因上游同源臂(序列1第1 -958位核苷酸）和 約980bp mntA基因下游同源臂(序列1第1895-2875位核苷酸）。
[0064] 用BamHI和Sail雙酶切mntA基因上游同源臂和pMAD-Spc-Scel質粒，然后在22°C條 件下連接后再轉化DH5a，取連接正確的中間質粒進行測序;再用Mlul和Ecorl雙酶切測序正 確的中間質粒和mntA基因下游同源臂后，在22°C條件下連接后再轉化DH5a，取連接正確的 重組質粒進行測序。得到的重組質粒再電轉化E.coli SCS110。從SCS110中提取質粒得到去 甲基化的打靶用質粒，命名為pMAD-mnt A。
[0065] 重組質粒pMAD-mntA為將序列1第1-958位所示的mntA基因上游同源臂插入pMAD-Spc-Scel載體的BamHI和Sail酶切位點間，且將序列1第1895-2875位所示的mntA基因下游 同源臂插入pMAD-Spc-Scel載體的Mlul和Ecorl的酶切位點間得到的載體。
[0066] 其中，序列1所示的DNA分子由mntA基因上游同源臂（序列1第1-958位）、mntA基因 (序列1第959-1894位)和mntA基因下游同源臂(序列1第1895-2875位)組成。
[0067] 2、mntA基因的無痕敲除
[0068] mntA基因敲除的大致過程如圖1所示。
[0069] 從-70°C保存的B.anthracisAP429菌種中劃線分離單菌落，接種于5mL BHIG(HBI 培養(yǎng)基加〇. 5%甘油)培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物按1 %的比例接種到100mL新 的BHIG培養(yǎng)基（Bacto? Brain Heart Infusion，BHI，BD公司，貨號237500,使用時添加 0.5 %甘油）中，37 °C劇烈振蕩培養(yǎng)。當0D600值達到0.5-0.6時(約2小時），從搖床中取出，離 心收集菌體，用10%甘油洗三次，最后用1/10體積10%甘油重懸菌體，分裝得到電轉化感受 ??τ 〇
[0070] 每40yL感受態(tài)細胞加5yL(約 1 · 5yg)質粒pSS4332 (Plaut RD and St ibi tz S. Improvements to a Markerless Allelic Exchange System for Bacillus.PLoS ONE 10(12) :e0142758.中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所已保存），混合后于 0.1cm電擊杯中冰浴5分鐘，然后用Bio-Rad電轉儀進行電轉化，條件為：1.8kV、200Q和25μ F。電擊完畢后立即加入lmL冰冷的LB培養(yǎng)基，30度孵育2.5小時。分別取200和800yL涂布于 含卡那霉素（50yg/mL)的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)。得到轉化子AP429/pSS4332。由于質粒 PSS4332能夠表達歸巢內切酶I-scel，所以菌株AP429/pSS4332能夠將轉化入細胞內的的帶 I-scel酶切位點的質粒進行切割，從而在一定程度上促進相關的打靶質粒與基因組的同源 重組。質粒PSS4332在傳代過程中如果不加卡那霉素，極易丟失。
[0071] 取轉化子AP429/PSS4332接種于5mL BHIG含卡那霉素 (50yg/mL)培養(yǎng)基，37°C過夜 培養(yǎng)。然后按上述方法制備感受態(tài)。
[0072] 質粒pMAD-mntA按上述方法電轉化入AP429/pSS4332中，最后取200yL涂布于含壯 觀霉素（300yg/mL)和卡那霉素（50yg/mL)的LB平板上，30°C過夜培養(yǎng)，得到轉化子。挑取轉 化子一個菌落，接種到5mL含卡那霉素(50yg/mL)LB培養(yǎng)基中，42°C培養(yǎng)，然后每12小時按1: 100的比例轉接一次，連續(xù)傳代4-5次后，取5yL培養(yǎng)物梯度稀釋，取10- 2和ΚΓ3稀釋液各100μ L涂布于含壯觀霉素(300yg/mL)的LB平板上，42 °C過夜培養(yǎng)。
[0073] 選50-100個菌落，每個菌落均一一對應點種到含壯觀霉素(300yg/mL)和紅霉素(5 yg/mL)的LB平板上，42 °C過夜培養(yǎng)。選只在壯觀霉素平板上生長的菌落為Bacillus anthracis AP429AmntA: :spc(壯觀霉素抗性基因替代了mntA基因）。
[0074] 用PCR的方法鑒定Bacillus anthracis AP429 AmntA: :spc，上下游引物分別為 MntAiF和MntAiR。對PCR產物連接到T載體后進行測序鑒定。
[0075] MntAiF:TATGGGGAAGTACGACAAGTG
[0076] MntAiR:GATAACCACCATCTAATAAAACCAT
[0077] 上步鑒定發(fā)生重組的菌Bacillus anthracis AP429 Δ mntA: : spc在無抗生素存在 的條件下傳5代，通過抗生素抗性分析證明不再有紅霉素抗性和卡那霉素抗性后，按照前述 方法制備感受態(tài)，轉入質粒pHY-Cre(王艷春.炭疽桿菌芽胞疫苗載體的探索性研究.[博士 學位論文].北京:軍事醫(yī)學科學院，2009，表達Cre重組酶，通過Cre重組酶識別spc元件兩端 的LoxP位點，去除抗性標記），方法同樣采用電轉化，條件同前述。電擊完畢后立即加入lmL 冰冷的BHIG培養(yǎng)基，30度孵育2.5小時.取50yL涂布于含紅霉素（5yg/mL)的LB平板上，30°C 過夜培養(yǎng)。
[0078]得到的重組菌在含紅霉素(5yg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中30°C傳兩代后，再在無抗生 素存在的條件下37°C傳三代，再用PCR的方法鑒定抗性基因去除情況，結果。最終通過一系 列實驗，得到不含質粒的mntA基因敲除的菌株，命名為Bacillus anthracis AP429 AmntA。
[0079] Bacillus anthracis AP429 AmntA進行PCR鑒定（引物為MntAiF和MntAiR)，結果 如圖2所示，泳道M為分子量Marker，泳道1為Bacillus anthracisAP429擴增結果，泳道2為 Bacillus anthracis AP429AmntA::spc擴增結果，泳道3為Bacillus anthracis ΑΡ429Δ mntA擴增結果;從PCR結果看，重組菌株Bacillus anthracis AP429 Δ mntA的mntA基因敲除 成功。
[0080] 重組菌Bacillus anthracis ΑΡ429ΔmntA為將Bacillus anthracis AP429基因 組中的mntA基因敲除得到的菌。
[0081] 二、nos基因的敲除 [0082]與mntA基因敲除方法相同。
[0083] 1、打靶質粒構建
[0084] 根據GenBank登錄的Baci 1 lus anthracissterne株nos基因的序列，序列號為 BAS5299，設計兩對特異性引物 nosuF&nosuR 和 nosdF&nosdR。
[0091 ] 以Bacillus anthracis A16R株(董梅，莊漢瀾，王希良，炭疽芽孢桿菌A16R株無菌 培養(yǎng)濾液的蛋白質組學分析，軍事醫(yī)學科學院院刊2009年2月第33卷第1期，6-9頁。中國人 民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所已保存）基因組DNA為模板，用nosuF/nosuR和 nosdF/nosdR分別擴增，得到約800bp nos基因上游同源臂（序列2第1-805位核苷酸）和約 800bp nosA基因下游同源臂(序列2第1872-2679位核苷酸）。
[0092] 用BamHI和Sail雙酶切上游同源臂和質粒pMAD-Spc-Scel質粒，然后在22°C條件下 連接后再轉化DH5a，取連接正確的中間質粒進行測序;再用Mlul和Ecorl雙酶切測序正確的 中間質粒和下游同源臂后，在22°C條件下連接后再轉化DH5a，取連接正確的重組質粒進行 測序。得到的重組質粒再電轉化E.coli SCS110。從SCS110中提取質粒得到去甲基化的打靶 用質粒，命名為pMAD-nos。
[0093] 重組質粒pMAD-nos為將序列2第1-805位所示的nos基因上游同源臂片段插入質粒 pMAD-Spc-Scel的BamHI和Sail酶切位點，且將序列2第1872-2680位nos基因下游同源臂片 段插入質粒pMAD-Spc-Scel的Mlul和Ecorl的酶切位點間得到的載體。
[0094] 序列2所示的DNA分子由nos基因上游同源臂片段(序列2第1-805位）、nos基因（序 列2第801-1871位)和nos基因下游同源臂片段(序列2第1872-2679位)組成。
[0095] 2、nos基因的無痕敲除
[0096] nos基因敲除的過程與上述mntA基因敲除的過程基本相同，不同的是出發(fā)菌株是 Bacillus anthracisAP429 AmntA，具體如下：
[0097] 將質粒pSS4332轉入出發(fā)菌株Bacillus anthracisAP429 Δ mntA中，得到轉化子 AP429AmntA/pSS4332。
[0098] 將質粒pMAD-nos轉入AP429AmntA/pSS4332中，選只在壯觀霉素平板上生長的菌 落為AP429 Δ mntA/nos: : spc。
[00"] 重組的菌AP429 Δ mntA/nos : : spc在無抗生素存在的條件下傳5代，通過抗生素抗 性分析證明不再有紅霉素抗性后，按照前述方法制備感受態(tài)，轉入質粒pHY-Cre。電擊完畢 后立即加入lmL冰冷的BHIG培養(yǎng)基，30度孵育2.5小時.取50yL涂布于含紅霉素（5yg/mL)的 LB平板上，30 °C過夜培養(yǎng)。得到的重組菌在含紅霉素（5yg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中30 °C傳兩 代后，再在無抗生素存在的條件下37°C傳三代，再用PCR的方法鑒定抗性基因去除情況，結 果。最終通過一系列實驗，得到不含質粒的mntA基因敲除的菌株，命名為Bacillus anthracis AP429ΔmntAΔnos〇
[0100] Bacillus anthracis AP429 Δ mntA Δ nos進行PCR鑒定（引物為nosiF和nosiR)，結 果如圖3所示，泳道M為分子量Marker，泳道1為Bacillus anthracis AP429 Δ mntA擴增結 果，泳道2為Bacillus anthracis AP429 Δ mntA Δ nos擴增結果;從PCR結果看，重組菌株nos 基因敲除成功。
[0101] 重組菌Bacillus anthracis AP429 Δ mntA Δ nos為將Bacillus anthracis AP429 基因組中的mntA基因和nos基因敲除得到的菌，為mntA和nos兩個基因都缺失的突變株，再 次命名為Bacillus antrhacis AP431。
[0102] 將炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431于2016年3月30日保藏于中國微生 物菌種保藏管委理員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝陽區(qū)大屯路）， 保藏號為CGMCC N0.12321，分類命名為炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)。
[0103] 實施例2、重組菌炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431生物特性分析
[0104] 1、AP431菌株PA蛋白表達情況的免疫印跡分析
[0105]挑取實施例1獲得的AP431和A16R新鮮菌落，分別接種到5mL的BHIG液體培養(yǎng)基中， 37°C搖菌。培養(yǎng)12h后，以1%。比例轉接到200mL的LB液體培養(yǎng)基中，搖床225rpm，過夜培養(yǎng)。 將新鮮菌液離心，收集培養(yǎng)上清，4°C保存。然后將菌體用PBS洗滌3次后相同體積重懸，冰浴 超聲破碎。設定超聲破碎儀參數，超聲強度為35 %，超聲30min，每超聲5sec暫停5sec，重復 進行。超聲結束后，4°C下離心10min，分離上清和沉淀，則細胞內容物主要在超聲裂解物上 清中，S層蛋白主要在超聲裂解物沉淀中。分別將培養(yǎng)上清、超聲裂解物上清和超聲裂解物 沉淀按照實驗手冊制樣，用12 %凝膠進行SDS-PAGE電泳，然后轉移到NC膜上。NC膜用5 %脫 脂奶粉室溫封閉2小時；與羊抗PA多抗(SC-17424，購自SANTA CRUZ公司，1:200稀釋)37 °C共 孵育2小時；然后膜用PBST洗滌3次，每次5分鐘，再與相應的HRP標記的兔抗羊IgG抗體（1: 5000稀釋)共孵育1小時，最后將膜用PBST洗干凈，利用凝膠成像系統ECL發(fā)光顯影?；瘜W發(fā) 光底物試劑盒中的A液和B液，以1:1比例充分混合配制，并均勻地加在NC膜上，放入化學發(fā) 光成像儀中，發(fā)生反應并拍照記錄。
[0106]結果如圖4所示。圖中泳道Μ為蛋白分子量Marker，泳道1，2.培養(yǎng)基上清;泳道3,4. 超聲裂解物上清；泳道5，6 .超聲裂解物沉淀；其中泳道1，3，5對應A16R;泳道2，4，6對應 AP431。從結果可以看出，在培養(yǎng)基上清、胞內和細胞S層三個位置中，AP431的PA蛋白均有良 好表達，而A16R的PA蛋白僅在其培養(yǎng)基上清中少量表達，胞質和細胞外壁中沒有表達。這可 以說明，在相同培養(yǎng)條件下，PA蛋白在突變株AP431中高效表達，與A16R相比有明顯的優(yōu)勢。 [0107] 2、芽胞形成能力分析
[0108] 菌株炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431接種于LB培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)5天 后取樣涂片進行芽胞染色，觀察芽胞形成情況。
[0109] 結果如圖5所示，炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431仍具有很好的芽胞形 成能力。
[0110] 3、抗氧化能力分析
[0111] 菌株炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431接種于BHIG培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)6 小時到對數生長期，加入不同濃度的H2〇 2(2.5、5、10、25和50mM)，37度振蕩孵育30分鐘，稀釋 涂平板計數。與此同時，以A16R作為對照。
[0112] 結果如圖6所示，隨著過氧化氫的濃度增大，兩組細菌的存活率分別下降。在過氧 化氫濃度為5〇1]11]1〇1/1時，經過3〇11^11作用后兩組細菌被完全殺滅。在過氧化氫濃度為5、10和 25mmol/L時，AP431組的存活率均低于A16R組。方差分析結果表明，AP431比A16R對于過氧化 氫更敏感(P〈〇.〇5)。
[0113] 4、毒力評價
[0114] 不同劑量的炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431芽胞以肌肉注射或腹腔注 射的方式接種C57小鼠（軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心），每天觀察并記錄死亡情況，劑量依 次為2*10 8CFU/只與2*107CFU/只。以現有疫苗株炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)A16R 作為對照。實驗結束后用Graphpad 5.0軟件統計分析相應數據。
[0115] 結果如圖7所示，炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431安全性優(yōu)于現有疫苗 株A16R〇
[0116] 實施例3、減毒炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431的免疫效果驗證
[0117] 將35只BALB/c小鼠隨機分成5組，每組7只。分別設置為陰性對照組、炭疽芽胞桿菌 (Bacillus anthracis)AP431高劑量免疫組和低劑量免疫組、炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)A16R高劑量免疫組和低劑量免疫組。AP431高劑量免疫組接種劑量為2X 108CFU/只；AP431低劑量免疫組接種劑量為2 X 107CFU/只；A16R高劑量免疫組接種劑量為2 X 107CFU/只;A16R低劑量免疫組接種劑量為2 X 106CFU/只；陰性對照組不作處理。接種方式 為皮下注射，每2周加強免疫1次，共免疫3次，每次免疫劑量和免疫途徑不變。
[0118] 免疫程序結束后第10d，采集BALB/c小鼠血液樣本，采用眼球摘除法。將采集的血 液放入37 °C靜置lh，然后放入4°C冰箱過夜，使血清充分析出。2000g冷凍離心10min，吸收上 清，血清稀釋100倍后測定抗PA抗體。
[0119] 測定方法如下：
[0120] (1)抗原PA的包被。用包被液與PA蛋白（購自默克密理博公司，貨號176905)稀釋為 lyg/mL。將抗原稀釋液加入96孔酶標板，每孔100yL。設定A1、A2孔為空白對照（即不加包被 抗原，僅加包被液l〇〇yL)，設定陰性對照。將96孔酶標板置于干凈的濕盒中，保持反應環(huán)境 濕潤，4°C下過夜靜置反應。
[0121 ] (2)洗滌。棄去包被液，向96孔酶標板中加入洗滌液PBST，每孔100yL，放入微孔板 振蕩器洗滌5min，甩干。重復洗滌3次。
[0122] (3)封閉。每孔加入200yL的5 %的脫脂奶粉PBST溶液200yL，37 °C孵育1 -2h。
[0123] (4)加入一抗。棄去封閉液，用洗滌液PBST洗滌反應孔3次，洗滌方法同步驟(2)。將 待測血清用保溫液（1%的脫脂奶粉PBST溶液)稀釋100倍，加入反應孔，每孔100yL。將酶標 板放回濕盒中，37°C下靜置結合2h。
[0124] (5)洗滌。洗滌方法同步驟(2 )，重復洗滌3次。
[0125] (6)加入二抗。用10mL保溫液將HRP標記的山羊抗鼠二抗（（購自SIGMA-ALDRICH公 司，貨號91618)稀釋5000倍，取100yL加到各反應孔。
[0126] (7)洗滌。洗滌方法同步驟(2 )，重復3次。
[0127] (8)顯色。酶標板甩干后加入顯色底物TMB溶液(購自天根生化科技有限公司，貨號 PA107-01)，每孔100yL，室溫下靜置，避光顯色lOmin。
[0128] (9)終止反應。待顯色完全后，每孔加入反應終止液50yL，反應立即終止。
[0129] (10)測定0D值。用多功能酶標儀于450nm波長檢測每個反應孔的光密度值，記錄檢 測結果。
[0130]結果如圖8,該試驗同時進行了 AP431芽胞免疫和A16R芽胞免疫，均采用了皮下注 射的免疫接種方式。并且，每種芽胞疫苗均設置了兩個免疫劑量，由于在安全性評價中發(fā) 現，AP431的安全性顯著高于A16R，將AP431芽胞免疫劑量分別比A16R芽胞免疫劑量提高一 個數量級。其中，AP431高劑量免疫組抗體水平和A16R高劑量免疫組相當，小鼠的血清抗體 D45〇平均值都超過了 0.6; AP431低劑量免疫組抗體水平比A16R低劑量免疫組水平略高。上述 結果表明，菌株AP31都能夠激發(fā)小鼠顯著的免疫應答。
[0131] 實施例4、減毒炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431的保護效果驗證
[0132] 將24只小鼠隨機分成5組，每組6只。分別設置為陰性對照組、AP431高劑量免疫組、 AP431中劑量免疫組和AP431低劑量免疫組。
[0133] AP431高劑量免疫組:減毒炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431接種劑量為 5X108cfu/只，
[0134] AP431中劑量免疫組:減毒炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431接種劑量為 lX108cfu/只，
[0135] AP431低劑量免疫組:減毒炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)AP431接種劑量為 5X107cfu/只，
[0136] 陰性對照組不作處理。
[0137] 接種方式為肌肉注射，每2周加強免疫1次，共加強免疫2次，每次免疫劑量和免疫 途徑不變。
[0138] 免疫結束后10天，用炭疽芽胞桿菌Sterne株（Sterne，Max · Variation in Bacillus anthracis.Onderstepoort Journal of Veterinary Science and Animal Industry. 1937，8:271-348.中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所已保存)芽胞 腹腔注射攻毒，劑量為5 X106cfu/只，該劑量為絕對致死劑量。攻毒方式為腹腔注射。對各 組小鼠進行全天候觀察，記錄小鼠的存活情況，試驗觀察期為攻毒后的14天。
[0139] 結果如圖9所示，其中，5X108cfu免疫劑量組小鼠的保護率為83%，陰性對照組的 小鼠在2d后就全部死亡。從結果可以看出，采用5 X108cfu的免疫劑量進行肌肉注射免疫， 可以達到較高的免疫保護率。
【主權項】
1. 重組菌，為降低和/或抑制炭疽芽胞桿菌AP429CGMCC NO. 4912中mntA蛋白和nos蛋白 活性得到的菌。2. 根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于：所述降低和/或抑制炭疽芽胞桿菌 AP429CGMCCN0.4912中mntA蛋白和nos蛋白活性為沉默炭疽芽胞桿菌AP429CGMCCN0.4912中 mntA蛋白編碼基因和nos蛋白編碼基因的表達。3. 根據權利要求2所述的重組菌，其特征在于：所述沉默炭疽芽胞桿菌 AP429CGMCCN0.4912中mntA蛋白編碼基因和nos蛋白編碼基因的表達為敲除炭疽芽胞桿菌 AP429CGMCCN0.4912中mntA蛋白編碼基因和nos蛋白編碼基因。4. 根據權利要求3所述的重組菌，其特征在于：所述敲除炭疽芽胞桿菌 AP429CGMCCN0.4912中mntA蛋白編碼基因和nos蛋白編碼基因均采用基因組定點編輯或同 源重組的方式進行。5. 根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于:所述同源重組為λ-red同源重組或sacB 基因介導篩選的同源重組或自殺質粒介導的同源重組。6. 根據權利要求1-5中任一所述的重組菌，其特征在于： 所述敲除炭疽芽胞桿菌AP429CGMCCN0.4912中mntA蛋白編碼基因采用的同源重組的 mntA蛋白編碼基因上游同源臂的核苷酸序列為序列1第1-958位； 所述敲除炭疽芽胞桿菌AP429CGMCCN0.4912中mntA蛋白編碼基因采用的同源重組的 mntA蛋白編碼基因的下游同源臂的核苷酸序列為序列1第1895-2875位； 所述敲除炭疽芽胞桿菌AP429CGMCCN0.4912中nos蛋白編碼基因采用的同源重組的nos 蛋白編碼基因上游同源臂的核苷酸序列為序列2第1-805位； 所述敲除炭疽芽胞桿菌AP429CGMCCN0.4912中nos蛋白編碼基因采用的同源重組的nos 蛋白編碼基因下游同源臂的核苷酸序列為序列2第1872-2680位。7. 根據權利要求1-6中任一所述的重組菌，其特征在于： 所述重組菌保藏號為CGMCC NO. 12321。8. 權利要求1-7中任一所述的重組菌在制備如下1)或2)產品中的應用。 1) 、炭疽桿菌疫苗； 2) 、預防和/或治療炭疽桿菌引發(fā)的疾病的產品。9. 一種如下1)或2)產品，其活性成分為A或B; A為權利要求1-6中任一所述的重組菌； B為表達mntA蛋白編碼基因上游同源臂和mntA蛋白編碼基因的下游同源臂的重組載體 和表達nos蛋白編碼基因上游同源臂和nos蛋白編碼基因的下游同源臂的重組載體； 1) 、炭疽桿菌疫苗； 2) 、預防和/或治療炭疽桿菌引發(fā)的疾病的產品。
【文檔編號】C12N15/75GK105969711SQ201610298152
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月6日
【發(fā)明人】王艷春, 劉純杰, 袁盛凌, 陶好霞
【申請人】中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所