廈門霉素高產(chǎn)菌株及其培養(yǎng)基、用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種生物技術(shù)領(lǐng)域的廈門霉素高產(chǎn)菌株及其培養(yǎng)基、用途；具體涉及廈門霉素生物合成的高產(chǎn)基因工程菌株(Streptomyces xiamenensis)318Pls1 CGMCC No.12366的構(gòu)建及培養(yǎng)基優(yōu)化；通過(guò)生物合成基因簇的位點(diǎn)特異性整合，在廈門鏈霉菌基因組的核心區(qū)導(dǎo)入額外的廈門霉素生物合成基因簇，強(qiáng)化了廈門霉素的生物合成能力。并通過(guò)優(yōu)化的培養(yǎng)基組合，實(shí)現(xiàn)了廈門霉素產(chǎn)量的大幅提高。CGMCC NO.1236620160419CGMCC NO.4.353420070401
【專利說(shuō)明】
廈門霉素高產(chǎn)菌株及其培養(yǎng)基、用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種廈門霉素高產(chǎn)菌株及其培養(yǎng)基、用途。
【背景技術(shù)】
[0002] Streptomyces xiamenensis的模式菌株CGMCC Νο·4·3534分離自中國(guó)福建省紅樹(shù) 林環(huán)境樣本。該菌株產(chǎn)生的廈門霉素為具有氨基酸取代和異戊烯基化的苯并吡喃化合物， 具有抑制肺纖維化和瘢痕增生的生物活性，是新的抗纖維化藥物候選物。在通常采用的GYM (Glucose Yeast-extract Maltose)培養(yǎng)基中，野生型廈門鏈霉菌中廈門霉素的產(chǎn)量?jī)H為 15mg/L。為滿足進(jìn)一步的藥理活性研究和藥物開(kāi)發(fā)的需求，廈門霉素的產(chǎn)量亟待提高。
[0003] 廈門霉素的生物合成途徑已被完全解析，克隆到的生物合成基因簇包括ximA-E這 5個(gè)基因，分別負(fù)責(zé)催化由分支酸裂解形成4-羥基苯甲酸，經(jīng)過(guò)異戊烯基轉(zhuǎn)移、環(huán)化形成廈 門霉素 B，以及加載L-蘇氨酸形成終產(chǎn)物廈門霉素的過(guò)程。廈門霉素生物合成途徑相對(duì)簡(jiǎn) 單，合成所需的前體均來(lái)自于微生物普遍存在的主代謝途徑(TCA、PPP、MEP等）?；趶B門霉 素生物合成途徑對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行定向分子育種，有望快速構(gòu)建高產(chǎn)菌株。培養(yǎng)基成分和培 養(yǎng)條件是影響菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)素效率的重要因素，對(duì)相關(guān)因素進(jìn)行優(yōu)化是提高化合物產(chǎn) 量的傳統(tǒng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種廈門霉素生物合成基因簇加倍的廈門霉素高產(chǎn)菌株 及其培養(yǎng)基、用途。本發(fā)明在廈門鏈霉菌野生株基因組的核心區(qū)通過(guò)位點(diǎn)特異性整合導(dǎo)入 額外的廈門霉素生物合成基因簇，將廈門鏈霉菌中的生物合成基因簇進(jìn)行加倍，獲得了具 有高產(chǎn)性狀的基因工程菌株廈門鏈霉菌（Streptomyces xiamenensis)318Plsl CGMCC No. 12366。通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化、單因素添加和正交實(shí)驗(yàn)，確定了廈門霉素?fù)u瓶發(fā)酵的優(yōu)化培 養(yǎng)基。本發(fā)明提供的菌株和培養(yǎng)基配方具有廈門霉素產(chǎn)量大幅提高的有益效果。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 第一方面，本發(fā)明涉及一種廈門鏈霉菌的基因工程菌株，所述基因工程菌株為廈 門鏈霉菌（Streptomyces xiamenensis)318Plsl CGMCC No. 12366。
[0007] 優(yōu)選的，所述基因工程菌株是通過(guò)位點(diǎn)特異性整合將廈門霉素生物合成基因簇在 野生型廈門鏈霉菌(Streptomyces xiamenensis)CGMCC No · 4· 3534中進(jìn)行加倍而獲得的。
[0008] 優(yōu)選地，所述廈門霉素生物合成基因簇位于整合型質(zhì)粒PLM009404上，將該質(zhì)粒通 過(guò)大腸桿菌-鏈霉菌之間的接合轉(zhuǎn)移，可實(shí)現(xiàn)廈門霉素生物合成基因簇在野生型廈門鏈霉 菌中的加倍，獲得高產(chǎn)廈門霉素的基因工程菌株（Streptomyces xiamenensis)318P1 si CGMCC No.12366。
[0009] 更優(yōu)選的，人工導(dǎo)入的廈門霉素生物合成基因簇位于基因組的核心區(qū)，并同時(shí)保 留了基因組臂區(qū)的原始生物合成基因簇。
[0010] 第二方面，本發(fā)明涉及前述的廈門鏈霉菌的基因工程菌株的培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基 中含有葡萄糖20g、KN〇3lg、酵母浸膏10g、麥芽浸膏15g。
[0011]第三方面，本發(fā)明涉及一種前述的廈門鏈霉菌的基因工程菌株在生產(chǎn)廈門霉素中 的用途。
[0012]優(yōu)選的，所述基因工程菌株選用上述的培養(yǎng)基，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得廈門霉素。
[0013] 優(yōu)選的，所述基因工程菌株采用搖瓶培養(yǎng)生產(chǎn)廈門霉素;所述搖瓶培養(yǎng)生產(chǎn)條件 為：
[0014] 種子活化:在固體培養(yǎng)基SFM(豆餅粉20g/L，甘露醇20g/L，瓊脂20g/L)平板上挑取 產(chǎn)孢良好的單菌落，接種于500mL三角瓶?jī)?nèi)100mL種子活化培養(yǎng)基TSB(Tryptone Soya Broth 30. lg/L)中，3(TC，220r/min，培養(yǎng)48h;
[0015] 發(fā)酵培養(yǎng):500ml三角瓶，裝液量100mL，按5%接種量(V/V)接種于如權(quán)利要求4所 述的發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，220r/min旋轉(zhuǎn)式搖床震蕩培養(yǎng)7天。
[0016] 本發(fā)明中，所述產(chǎn)生菌-廈門鏈霉菌（Streptomyces xiamenensis)318Plsl已于 2016年4月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址 為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏編號(hào)為CGMCC No.12366。
[0017] 野生型廈門鏈霉菌（Streptomyces xiamenensis)已于2007年4月保藏于中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院 3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏編號(hào)為CGMCC No.4.3534。
[0018] 本發(fā)明具有的有益效果為:通過(guò)提供一種廈門霉素生物合成基因簇加倍的高產(chǎn)基 因工程菌株及其優(yōu)選的培養(yǎng)基配方和搖瓶培養(yǎng)條件，廈門霉素的產(chǎn)量獲得了大幅提高。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0020] 圖1為廈門霉素生物合成基因簇加倍菌株318P1S1的PCR驗(yàn)證;其中，A為整合位點(diǎn) attL的PCR鑒定，B為pLM009404上x(chóng)im基因上游重組序列的PCR鑒定，C為pLM009404上x(chóng)im基 因下游重組序列的PCR鑒定，M:lKb DNAmaker;l:318: :pSET152的PCR產(chǎn)物；2:318Plsl的PCR 產(chǎn)物;3:318WT陰性對(duì)照；
[0021] 圖2為基因簇加倍菌株318P1S1培養(yǎng)基優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)中廈門霉素產(chǎn)量；
[0022]圖3為廈門霉素 HPLC檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0023]圖4為基因簇加倍菌株318P1 s 1的廈門霉素產(chǎn)量(圖4A)和HPLC譜圖（圖4B)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域 的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照 制造廠商所建議的條件。
[0025] 實(shí)施例1、廈門霉素生物合成基因簇加倍菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證
[0026] 步驟一、大腸桿菌與鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移
[0027] 將E.coli ET12567(pUZ8002)單菌落在 10mL LB(加 Chl，Kana)培養(yǎng)基中37°C振 蕩培養(yǎng)過(guò)夜；
[0028] 取100yL過(guò)夜培養(yǎng)物接種至10mL新鮮的LB(加 Chl，Kana)培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)4~ 6h，至 0D600 = 0.4;
[0029] 用10mL新鮮LB培養(yǎng)基洗滌上述菌體2次以除去抗生素，將剩余的菌體懸浮于lmL LB培養(yǎng)基中；
[0030] 同時(shí)，取lmL(10-8)鏈霉菌孢子（No.4.3534)至5mLTES緩沖液中，50°C熱激 10min，冷卻；加入5mL 2XYT broth，37°C，200rpm培養(yǎng)2h;
[0031] 將lmL E.coli ET12567(pUZ8002)細(xì)胞和萌發(fā)后的鏈霉菌孢子混合，簡(jiǎn)單離心， 棄去大部分上清，將剩余約50yL液體懸浮沉淀；
[0032] 依次稀釋至ΠΓ1~10_3倍，每個(gè)稀釋度取100yL涂布于SFM固體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng) 16~20h;
[0033] 用lmL含有25mg/mL萘啶酮酸和30mg/mL阿泊拉抗生素的無(wú)菌水覆蓋平板，30°C 繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落；
[0034] 將平板上長(zhǎng)出的單菌落每板挑取10個(gè)劃線于SFM(Apr)平板上轉(zhuǎn)接兩次培養(yǎng)，進(jìn) 行PCR驗(yàn)證，選出轉(zhuǎn)化成功的重組子。
[0035] 步驟二、對(duì)阿泊拉霉素抗性的整合子純化后進(jìn)行PCR驗(yàn)證
[0036] 首先用引物Pls-attF/R擴(kuò)增整合位點(diǎn)attL的序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與目標(biāo)條 帶1Kb相符，證實(shí)PSET152質(zhì)粒成功整合進(jìn)318染色體中（圖1-A)。其次，分別用引物Pls-M13A-F/R和PI s-Ml 3E-F/R，擴(kuò)增重組質(zhì)粒pLM009404中xim基因簇前后端的重組序列，PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物大小與預(yù)期的目標(biāo)條帶2.2Kb和2.3Kb相符，證實(shí)質(zhì)粒攜帶的第二個(gè)xim基因簇成功 整合進(jìn)318染色體中（圖1-B，1-C)。
[0037] PCR反應(yīng)體系： 薇 DMA ( 100ng/'uL.) 0·5() μL」 2x PCR Mix (生工生物） 12.5pL
[0038] 正向及反向引物 0,50 μL DMSO 0.75 μL d.d.H20 up to 25 [iL
[0039] PCR反應(yīng)程序：
[0041 ] 用于檢測(cè)接合轉(zhuǎn)移突變株ET12567/pSET152中導(dǎo)入的整合型質(zhì)粒pSET152上 Apramycin抗性基因的引物：
[0044]用于檢測(cè)廈門霉素基因簇(xim)加倍菌株318Plsl及整合空載質(zhì)粒的菌株318:: PSET152上游重組位點(diǎn)attL的引物：
[0047]用于檢測(cè)廈門霉素基因簇(xim)加倍菌株318Plsl基因組上整合質(zhì)粒pLM009404攜 帶xim基因簇的引物：
[0052] 步驟三、電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物：120V，電泳30min后，用新鮮Gel Red染液染色40min， 紫外檢測(cè)目標(biāo)條帶，圖1。
[0053] 步驟四、對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行膠回收，連接至PMD-18T載體中，送公司測(cè)序，序列比對(duì) 后篩選出構(gòu)建成功的重組菌株。
[0054] 本發(fā)明將廈門霉素基因簇加倍構(gòu)建過(guò)表達(dá)菌株（Streptomyces xiamenensis) 318?181061〇：如.12366的目的是提高廈門霉素產(chǎn)量，以得到高產(chǎn)的廈門霉素突變株。此 外，由于廈門霉素基因簇位于318染色體左臂區(qū)的一個(gè)基因島上，存在遺傳不穩(wěn)定性，其基 因組核心區(qū)序列中帶有0C31噬菌體特異性整合位點(diǎn)attB，通過(guò)特異性位點(diǎn)整合將另一個(gè) 廈門霉素基因簇引入到核心區(qū)，增加了基因簇拷貝數(shù)的同時(shí)也增加了遺傳穩(wěn)定性，有利于 在此菌株的基礎(chǔ)上后續(xù)基因工程菌株(加強(qiáng)啟動(dòng)子、刪除負(fù)調(diào)控等)的構(gòu)建。
[0055] 實(shí)施例2、廈門鏈霉菌發(fā)酵條件優(yōu)化
[0056] 步驟一，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，分別就發(fā)酵過(guò)程中，搖瓶?jī)?nèi)是否加彈簧、消泡劑，培養(yǎng) 溫度：30°C、37 °C，搖床轉(zhuǎn)速：180r/min、220r/min、300r/min，種子活化時(shí)間：24h、36h、48h， 接種量2%、5%、10%，進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)；
[0057] 步驟二，觀察發(fā)酵7天內(nèi)，菌株生長(zhǎng)情況、菌絲體斷裂情況、搖瓶狀態(tài)，并記錄；
[0058] 步驟三，發(fā)酵7天后，收菌，提取廈門霉素并進(jìn)行HPLC檢測(cè)，三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，取 平均值；
[0059] 步驟四，綜合菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)素結(jié)果，總結(jié)最適培養(yǎng)條件為：
[0060] _a.種子活化:500mL三角瓶，裝液量100mL，挑取產(chǎn)孢良好的單菌落，接種于種子 活化培養(yǎng)基TSB(Tryptone Soya Broth 30.1 g/L，pH 7.2)中，30°C，220r/min，培養(yǎng)48h; [00611 _b.發(fā)酵培養(yǎng):500mL三角瓶，裝液量100mL，以5%接種量(V/V)接種于GYM發(fā)酵培 養(yǎng)基（葡萄糖4g/L，酵母浸膏4g/L，麥芽浸膏10g/L，pH 7.2)，30 °C，220r/min旋轉(zhuǎn)式搖床震 蕩培養(yǎng)7天，搖瓶中需加彈簧，不加消泡劑。
[0062]實(shí)施例3、廈門霉素生物合成培養(yǎng)基優(yōu)化
[0063] 步驟一，使用L9(34)表進(jìn)行4因素 3水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1)，通過(guò)調(diào)整GYM培 養(yǎng)基中4種原料的配比，得到9種培養(yǎng)基的配方(表2);
[0064] 步驟二，采用上述優(yōu)化后的培養(yǎng)方法對(duì)318Plsl菌株進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 篩選，以廈門霉素終產(chǎn)量為研究指標(biāo)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)三次；
[0065] 步驟三，對(duì)抽提后的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)合極差和方差分析法 評(píng)價(jià)發(fā)酵條件優(yōu)化組合和顯著性水平(圖2);
[0066] 步驟四，優(yōu)選出廈門霉素高產(chǎn)培養(yǎng)基GYM-9(葡萄糖20g/L，酵母浸膏10g/L，麥芽 浸膏15g/L，KN03lg/L，pH 7.2)，其廈門霉素產(chǎn)量可達(dá)76mg/L。比較318野生株、空載菌株和 加倍菌株318Plsl在GYM培養(yǎng)基和優(yōu)選出的GYM-9中的產(chǎn)量，3菌株在GYM-9中產(chǎn)量均提高2倍 多（圖4)。此外，基因簇加倍菌株318P1 s 1無(wú)論在GYM培養(yǎng)基還是在優(yōu)選出的GYM-9培養(yǎng)基中， 廈門霉素產(chǎn)量都相較野生株增加2.5倍左右。
[0069] 實(shí)施例4、廈門霉素產(chǎn)量的HPLC定量分析方法
[0070] 步驟一，廈門霉素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將廈門霉素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成7個(gè)濃度梯 度，進(jìn)行HPLC進(jìn)樣檢測(cè)，各濃度對(duì)應(yīng)峰面積數(shù)據(jù)如下：
[0072] 得出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3)公式:y=14831812.72x-39728.96，R2 = l，y峰面積，x 廈門 霉素濃度；
[0073] 步驟二，廈門霉素產(chǎn)物提取方法:將100mL發(fā)酵液用等體積乙酸乙酯浸泡過(guò)夜， 重復(fù)萃取3次，上層有機(jī)相合并蒸干，浸膏溶于6mL甲醇；
[0074] 步驟三，HPLC檢測(cè)方法:將上述甲醇溶解浸膏稀釋3倍后，按照進(jìn)樣量10yL進(jìn)行 高效液相色譜(HPLC)分析，檢測(cè)條件為:C18反相柱(Agilent Extend-C18,4.6 X 150mm，5y m);流動(dòng)相為分別加入0.5%三氟乙酸的甲醇和水(20%-80%梯度洗脫）；流速lmL/min;柱 溫為40°C ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm;
[0075] 步驟四，廈門霉素產(chǎn)量分析方法:采用標(biāo)準(zhǔn)廈門霉素濃度曲線公式，將檢測(cè)出的 峰面積，換算成相應(yīng)廈門霉素濃度，乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算出廈門霉素產(chǎn)量。
[0076] 以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上 述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不 影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種廈門鏈霉菌的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株為廈門鏈霉菌 (Streptomyces xiamenensis)318Plsl CGMCC No.12366。2. 如權(quán)利要求1所述的廈門鏈霉菌的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株是 通過(guò)位點(diǎn)特異性整合將廈門霉素生物合成基因簇在野生型廈門鏈霉菌（Streptomyces xiamenensis)CGMCC No.4.3534中進(jìn)行加倍而獲得的。3. 如權(quán)利要求2所述的廈門鏈霉菌的基因工程菌株，其特征在于，人工導(dǎo)入的廈門霉素 生物合成基因簇位于基因組的核心區(qū)，并同時(shí)保留了基因組臂區(qū)的原始生物合成基因簇。4. 一種如權(quán)利要求1所述的廈門鏈霉菌的基因工程菌株的培養(yǎng)基，其特征在于，每升培 養(yǎng)基中含有葡萄糖20g、KN〇3 lg、酵母浸膏10g、麥芽浸膏15g。5. -種如權(quán)利要求1所述的廈門鏈霉菌的基因工程菌株在生產(chǎn)廈門霉素中的用途。6. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述基因工程菌株選用如權(quán)利要求4所述的 培養(yǎng)基，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得廈門霉素。7. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述基因工程菌株采用搖瓶培養(yǎng)生產(chǎn)廈門霉 素;所述搖瓶培養(yǎng)生產(chǎn)條件為： 種子活化：在固體培養(yǎng)基SFM平板上挑取產(chǎn)孢良好的單菌落，接種于500mL三角瓶?jī)?nèi) 100mL種子活化培養(yǎng)基TSB中，30°C，220r/min，培養(yǎng)48h; 發(fā)酵培養(yǎng):500mL三角瓶，裝液量100mL，按體積比5 %的接種量接種于如權(quán)利要求4所述 的發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C，220r/min旋轉(zhuǎn)式搖床震蕩培養(yǎng)7天。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK105969714SQ201610362606
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】徐俊, 胡曉艷, 徐岷涓, 步緒亮, 余河霖
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)