表達h9亞型禽流感病毒截短ha蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達H9亞型禽流感病毒截短HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法，所述的耐熱疫苗株分類命名為rTS?HA1/H9，于2016年4月19日保藏于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:V201631。該疫苗株具有顯著的耐熱特性，可極大降低對冷鏈系統(tǒng)的依賴，節(jié)省保存運輸成本和提高疫苗熱穩(wěn)定性。該疫苗株表達的不是完整的HA蛋白，只選取了HA蛋白中具有強免疫原性的HA1區(qū)域(1?1041nt)，可針對性地增強疫苗的免疫保護效果?？捎糜谥苽銱9禽流感、新城疫二聯(lián)耐熱活疫苗。CCTCC NO: V20163120160419
【專利說明】
表達H9亞型禽流感病毒截短HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株 及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，具體涉及一種表達H9亞型禽流感病毒截短HA蛋白的 重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] H9亞型禽流感是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的一個重要的禽流感病毒亞型，屬低致病性禽流 感。由于其致病力較低，不直接引發(fā)禽群的大量死亡而易被人們所忽視。但該亞型禽流感病 毒可破壞雞群的免疫系統(tǒng)，嚴重時可導致免疫抑制，繼而引發(fā)大腸桿菌等其它病原的感染， 從而造成較高的死亡率，感染H9亞型禽流感病毒的產(chǎn)蛋雞死亡率約為10%，產(chǎn)蛋率下降 20%左右，造成較大的經(jīng)濟損失。預防接種滅活疫苗是我國當前防控H9亞型禽流感的主要 手段。傳統(tǒng)的滅活疫苗制備比較簡單，儲存運輸方便，免疫效果持久，在禽流感防控中發(fā)揮 了重要作用。但滅活疫苗也有一些不足之處，如需肌肉注射，費工費時，免疫成本高。滅活疫 苗的使用在一定程度上增加了臨床上區(qū)分野毒感染與疫苗免疫的難度，且存在散毒風險。 因此，研發(fā)廉價、安全、高效的H9亞型禽流感疫苗具有重要的現(xiàn)實意義。
[0003] 隨著分子生物學技術(shù)的不斷進步，新型基因工程疫苗的研發(fā)不斷取得突破，其中 基于新城疫病毒載體的新型多聯(lián)活疫苗是研發(fā)熱點之一，許多病原的免疫原性基因已經(jīng)在 新城疫載體內(nèi)成功表達，并取得了較好的免疫保護效果，如傳染性法氏囊病毒的VP2蛋白、 H5亞型禽流感病毒的HA蛋白、狂犬病毒的G糖蛋白、嚴重急性呼吸綜合征病毒的CoV蛋白、人 類免疫缺陷病毒的Gag蛋白等。此類疫苗具有可誘導全身性免疫(體液免疫、細胞免疫和粘 膜免疫）、高雞胚生長特性、生產(chǎn)成本低廉、免疫方式簡便(飲水、氣霧、點眼/滴鼻等方式）、 安全(毒株間發(fā)生重組及毒力返強可能性極小)等優(yōu)點。但現(xiàn)有的新城疫病毒載體疫苗均是 以非耐熱型新城疫病毒為骨架構(gòu)建的。
[0004] 現(xiàn)有已經(jīng)上市的H9禽流感、新城疫二聯(lián)疫苗均是將H9亞型禽流感病毒株和新城疫 病毒株滅活后制備而成的，其主要原因是由于H9亞型禽流感病毒具有一定的致病性，不能 用于制備活疫苗。此類疫苗的缺點是需肌肉注射，費工費時，免疫成本高。滅活疫苗的使用 在一定程度上增加了臨床上區(qū)分野毒感染與疫苗免疫的難度，且存在散毒風險。
[0005] 因此，如何提供一種具有耐熱、穩(wěn)定性強、冷藏條件要求低的表達H9亞型禽流感病 毒截短HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問 題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明進行了深入研究，提供了一種表達H9亞型禽流感 病毒截短HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法。
[0007] 本發(fā)明一方面涉及一種表達H9亞型禽流感病毒截短HA蛋白的重組新城疫耐熱疫 苗株，其特征在于所述的耐熱疫苗株分類命名為rTS-HAl/H9,于2016年4月19日保藏于武漢 大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC N0:V201631。
[0008] 本發(fā)明另一方面還涉及表達H9亞型禽流感病毒截短HA蛋白的重組新城疫耐熱疫 苗株的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
[0009] 1. 1H9亞型禽流感病毒HA1基因的PCR擴增
[0010] 將H9N2禽流感病毒A/Chicken/Hubei/Cl/2007株在9-11日齡雞胚上進行增殖，接 種5天后收獲雞胚尿囊液。將收獲的尿囊液進行HA1基因的RT-PCR擴增，擴增引物為:上游引 物S'-CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGC-3'，下游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATCCTCTACTTGATCTAGCAG -3'，對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠回收純化后，測定DNA濃度，待進行克隆連接；
[0011] 1.2新城疫病毒耐熱載體片段的PCR擴增
[0012] 以超長片段PCR的方法獲得新城疫病毒載體序列，擴增引物為：上游引物5Y-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTC-3 7，下游引 物57-TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGCGCGATC-37，擴增模板為新城疫病毒耐熱株質(zhì)粒pTS09_ C，對PCR產(chǎn)物進行回收純化，測定其濃度，待克隆連接；
[0013] 1.3重組質(zhì)粒pTS-HAl/H9的克隆連接
[0014]采用In-fusion克隆連接技術(shù)，將純化好的HA1基因片段和耐熱載體片段進行克隆 連接(連接序列為CAGCTATATTAAGGA和TCGGAGTGCCCCGAT);連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞， 轉(zhuǎn)化后的細胞在LB平皿上培養(yǎng)16小時后挑單菌落進行液體培養(yǎng)，對菌液進行HA1基因的PCR 鑒定，鑒定為陽性的菌液進彳丁質(zhì)粒提取；
[0015] 1.4重組病毒rTS-HAl/H9的拯救恢復
[0016] 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pT S-HA1 /H9與三個分別表達NP、P和L蛋 白的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染ΒΗΚ-21細胞;轉(zhuǎn)染后72小時，反復凍融收獲細胞液，接種9-11日齡SPF 雞胚。接種后5天，收獲雞胚尿囊液，分離得到表達Η9亞型禽流感病毒截短ΗΑ蛋白的重組新 城疫耐熱疫苗株。
[0017] 本發(fā)明還涉及上述表達Η9亞型禽流感病毒截短ΗΑ蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株 在制備重組病毒中的應用。
[0018] 本發(fā)明還涉及上述表達Η9亞型禽流感病毒截短ΗΑ蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株 在制備Η5禽流感、新城疫二聯(lián)耐熱活疫苗中的應用。
[0019] 本申請公開了一種可表達Η9亞型禽流感病毒截短ΗΑ蛋白的重組新城疫病毒耐熱 株。該疫苗株具有顯著的耐熱特性，可極大降低對冷鏈系統(tǒng)的依賴，節(jié)省保存運輸成本和提 高疫苗熱穩(wěn)定性。該疫苗株表達的不是完整的ΗΑ蛋白，只選取了ΗΑ蛋白中具有強免疫原性 的ΗΑ1區(qū)域（l-1017nt)，可針對性地增強疫苗的免疫保護效果?？捎糜谥苽洇?禽流感、新城 疫二聯(lián)耐熱活疫苗。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明表達H9亞型禽流感病毒截短HA蛋白的重組耐熱新城疫病毒全長質(zhì)粒 的構(gòu)建示意圖。其中rTS09-C為親本株的基因組結(jié)構(gòu)，rTS-HAl/H9為在rTS09-C基因組中插 入了截短HA蛋白后的結(jié)構(gòu)，詳細標注了插入序列的整體序列組成。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實質(zhì)對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0022] 實施例1
[0023] 第一步、重組全長質(zhì)粒pTS-HAl/H9的構(gòu)建與鑒定
[0024] 1. 1H9亞型禽流感病毒HA1基因的PCR擴增
[0025] 將H9N2禽流感病毒A/Chicken/Hubei/Cl/2007株在9-11日齡雞胚上進行增殖，接 種5天后收獲雞胚尿囊液。將收獲的尿囊液進行HA1基因的RT-PCR擴增，擴增引物為:上游引 物S'-CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGC-3'，下游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATCCTCTACTTGATCTAGCAG -31下劃線部分為用于In-fusion克隆連接的互補序列）。瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶約 l.lkb，與預期的1108bp相符(HA1基因長度為1017bp，分別在HA1基因前端和后端引入了基 因起始序列和基因終止序列，同時在HA1基因前端引入了Kozak序列）。對PCR產(chǎn)物進行瓊脂 糖凝膠回收純化后，測定DNA濃度，待進行克隆連接。
[0026] 1.2新城疫病毒耐熱載體片段的PCR擴增
[0027]以超長片段PCR的方法獲得新城疫病毒載體序列，擴增引物為：上游引物5Y-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTC-3 7，下游引 物57-TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGCGCGATC-37 (下劃線部分為用于 In_fusion克隆連接的 互補序列）。擴增模板為新城疫病毒耐熱株質(zhì)粒PTS09-C。瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶約 18kb，與預期的17.8kb大小相符。對PCR產(chǎn)物進行回收純化，測定其濃度，待克隆連接。
[0028] 1 · 3重組質(zhì)粒pTS-HAl/H9的克隆連接
[0029]按照圖1所示的方式，采用In-fusion克隆連接技術(shù)，將純化好的HA1基因片段和耐 熱載體片段進行克隆連接(連接序列為CAGCTATATTAAGGA和TCGGAGTGCCCCGAT)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化DH5a感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后的細胞在LB平皿上培養(yǎng)16小時后挑單菌落進行液體培養(yǎng)。對菌 液進行HA1基因的PCR鑒定。鑒定為陽性的菌液進行質(zhì)粒提取，待酶切和測序鑒定。
[0030] 1 · 4重組質(zhì)粒PTS-HA1/H9的酶切與測序鑒定
[0031]分別以BamHI和Mlul內(nèi)切酶對全長重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，均得到了與預期相符 的酶切圖譜。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒PTS-HA1/H9送至測序公司進行序列測定，結(jié)果表 明H9亞型禽流感的HA1基因插入到了新城疫病毒耐熱載體的P和Μ基因之間，且所有序列與 預期完全一致，重組質(zhì)粒PTS-HA1/H9構(gòu)建成功。
[0032] 第二步、重組病毒rTS-HAl/H9拯救恢復與鑒定
[0033] 2.1重組病毒rTS-HAl/H9的拯救恢復
[0034]采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pT S-HA1 /H9與三個分別表達NP、P和L蛋 白的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染ΒΗΚ-21細胞(已預感染表達T7RNA聚合酶的痘苗病毒）。轉(zhuǎn)染后72小時， 反復凍融收獲細胞液，接種9-11日齡SPF雞胚。接種后5天，收獲雞胚尿囊液，待進行新城疫 病毒檢測。
[0035] 2.2重組病毒的血凝效價和熒光定量PCR檢測
[0036] 以血凝試驗和熒光定量PCR的方法，對收獲雞胚尿囊液進行檢測，結(jié)果均為新城疫 陽性。初步表明重組病毒rTS-HAl/H9拯救成功。
[0037] 2.3重組病毒HA1基因的PCR擴增與測序
[0038] 應用H9亞型禽流感病毒HA1基因的特異性擴增引物，對重組病毒rTS-HAl/H9的HA1 基因進行RT-PCR擴增，對PCR擴增產(chǎn)物進行序列測定分析，得到1108bp長的HA1基因序列 (SEQ ID No. 1)，從5'到3'端，依次包含了P基因的部分非編碼區(qū)序列(UTR)、P基因的基因終 止序列(GE)、中間序列（IG)、HA1基因的基因起始序列(GS)、Kozak序列、HA1基因序列、HA1基 因的雙重終止密碼子、HA1基因的GE序列、IG序列、Μ基因的GS序列和Μ基因的UTR序列。與預 期序列100 %-致。
[0039] 第三步、Η9亞型禽流感病毒截短ΗΑ蛋白在重組病毒rTS-HAl /Η9中的表達驗證
[0040] 3.1間接免疫熒光法檢測截短HA蛋白的表達
[0041 ] 將重組病毒rTS-HAl/H9和rTS09-C(對照）分別以0.01M0I感染BHK-21細胞，24h后 進行間接免疫熒光檢測，一抗為NDV陽性雞血清或H9亞型禽流感陽性血清。檢測結(jié)果表明， 重組病毒rTS-HAl/H9感染的細胞內(nèi)，使用NDV陽性雞血清或H9亞型禽流感陽性血清作為一 抗時均能檢測到綠色熒光，而rTS09-C株感染的細胞只在NDV陽性血清作用下檢測到熒光。
[0042] 3.2Western Blot法檢測截短HA蛋白的表達
[0043] 將重組病毒rTS-HAl/H9和rTS09-C(對照）分別以0.01M0I感染BHK-21細胞，24h后 收集細胞裂解液，以H9亞型禽流感陽性雞血清為一抗進行Western Blot檢測。檢測結(jié)果表 明，在40KDa附近出現(xiàn)一條明顯的目的條帶，與預期的37.7KDa大小相近。表明HA1蛋白在重 組病毒感染的細胞內(nèi)正確表達。
[0044] 第四步、重組病毒rTS-HAl/H9的生物學特性鑒定
[0045] 4.1重組病毒的增殖特性測定
[0046] 為比較重組病毒rTS-HAl/H9株與親本rTS09-C株的生長增殖情況，將兩株病毒分 別以100TCID5q接種BHK-21細胞，接種后24h、48h、72h、96h取上清500μ1，測定病毒TCID 5q，繪 制病毒的生長曲線。結(jié)果表明，重組病毒rTS-HAl/H9株和親本rTS09-C株在BHK-21細胞的生 長曲線相似，增殖滴度相近，約為10 7· WciDso/ml。
[0047] 4.2重組病毒的致病性測定
[0048] 測定重組病毒對雞胚的最小致死劑量的平均致死時間（MDT/MLD)，結(jié)果顯示不同 稀釋度（ΠΓ1至ΠΓ9)的病毒接種雞胚后的120h內(nèi)均不會對雞胚致死，重組病毒rTS-HAl/H9 的MDT/MLD大于120h，表明重組病毒保持了親本株的低毒特性，外源基因的插入并未改變重 組病毒的致病性。
[0049] 4.3重組病毒的耐熱特性測定
[0050] 測定重組病毒在56 °C環(huán)境下的HA耐熱特性，同時設(shè)置非耐熱株LaSota株和耐熱株 rTS09-C株為對照。如表1所示，非耐熱株LaSota在56°C耐熱處理9min后，HA效價降為0,親本 株rTS09-C和重組病毒rTS-HAl/H9在56°C耐熱處理150min后仍具有血凝活性。表明重組病 毒rTS-HAl/H9的耐熱特性與親本株一致，均為耐熱株(該病毒株已經(jīng)保藏，保藏在武漢大學 中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO: V201631)。
[00511表1.重組病毒的HA耐熱特性測定結(jié)果
[0053] a表示病毒具有血凝活性，|3表示病毒沒有血凝活性
[0054]以上所述實施例只是本發(fā)明的較佳實例，而沒有限制本發(fā)明的實施范圍。因此，凡 是根據(jù)本
【發(fā)明內(nèi)容】
的實質(zhì)所作出的等效修改，都應屬于在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 表達H9亞型禽流感病毒截短HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株，其特征在于所述的耐 熱疫苗株分類命名為rTS-HAl/H9，于2016年4月19日保藏于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏 中心，保藏號為CCTCC N0:V201631。2. 表達H9亞型禽流感病毒截短HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株的制備方法，其特征在 于包括如下步驟： 1.1 H9亞型禽流感病毒HA1基因的PCR擴增 將H9N2禽流感病毒A/Chicken/Hubei/Cl/2007株在9-11日齡雞胚上進行增殖，接種5天 后收獲雞胚尿囊液。將收獲的尿囊液進行HA1基因的RT-PCR擴增，擴增引物為:上游引物5'-CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGC-3'，下 游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATCCTCTACTTGATCTAGCAG-3'， 對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠回收純化后，測定DNA濃度，待進行克隆連接； 1.2新城疫病毒耐熱載體片段的PCR擴增 以超長片段PCR的方法獲得新城疫病毒載體序列，擴增引物為：上游引物5'-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTC-3 7，下游引物57 -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGCGCGATC-3'，擴增模板為新城疫病毒耐熱株質(zhì)粒pTS09-C，對PCR產(chǎn)物進行回收純化，測定其濃度，待克隆連接； 1.3重組質(zhì)粒pTS-HAl/H9的克隆連接 采用In-fusion克隆連接技術(shù)，將純化好的HA1基因片段和耐熱載體片段進行克隆連 接，連接序列為CAGCTATATTAAGGA和TCGGAGTGCCCCGAT;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化 后的細胞在LB平皿上培養(yǎng)16小時后挑單菌落進行液體培養(yǎng)，對菌液進行HA1基因的PCR鑒 定，鑒定為陽性的菌液進彳丁質(zhì)粒提??； 1.4重組病毒rTS-HAl/H9的拯救恢復 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒PTS-HA1/H9與三個分別表達NP、P和L蛋白的 輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細胞;轉(zhuǎn)染后72小時，反復凍融收獲細胞液，接種9-11日齡SPF雞胚。 接種后5天，收獲雞胚尿囊液，分離得到表達H9亞型禽流感病毒截短HA蛋白的重組新城疫耐 熱疫苗株。3. 權(quán)利要求1所述的表達H9亞型禽流感病毒截短HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株在制 備重組病毒中的應用。4. 權(quán)利要求1所述的表達H9亞型禽流感病毒截短HA蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株在制 備H9禽流感、新城疫二聯(lián)耐熱活疫苗中的應用。
【文檔編號】C12N7/01GK105969740SQ201610424929
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】邵華斌, 溫國元, 羅玲, 羅青平, 胡瀟, 王紅琳, 張騰飛, 汪宏才, 張蓉蓉, 盧琴, 艾地云
【申請人】湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所