一種植酸酶突變體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種新型植酸酶突變體，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該突變體在耐溫性及酶活等方面均表現(xiàn)出良好的特性，具有較好的應(yīng)用前景。該突變體經(jīng)甲醇誘導(dǎo)96h發(fā)酵液酶活可達(dá)28000U/mL，較原始植酸酶提高180％；植酸酶經(jīng)75℃處理后存留酶活保留在90％以上；突變體耐受85℃制粒溫度，存留酶活達(dá)到85％以上，適應(yīng)顆粒飼料生產(chǎn)要求。
【專利說明】
一種植酸酶突變體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植酸酶突變體及其在飼料技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 植酸酶，也稱肌醇六磷酸水解酶，是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸或磷酸 鹽的一類酶的總稱，屬磷酸單酯水解酶，它實際上包括植酸酶和酸性磷酸酶兩種酶。植酸酶 主要應(yīng)用于豬、雞、鴨等單胃動物以及一些魚類水產(chǎn)動物的飼料添加劑，使植酸或植酸鹽分 子釋放無機(jī)磷，從而被動物利用，以緩解或消除植食性飼料中植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，以提高生 物機(jī)體對礦物質(zhì)元素、蛋白質(zhì)及微量元素的利用率，促進(jìn)其生長發(fā)育，提高動植物的生產(chǎn)能 力，能夠減少磷向環(huán)境中排量達(dá)50%之多，進(jìn)而降低由于磷的富集造成的環(huán)境污染問題。
[0003] 植酸酶在自然界中分布廣泛，在植物、動物及微生物中都有發(fā)現(xiàn)，其中以來源于微 生物，包括細(xì)菌、酵母菌及霉菌的植酸酶居多。產(chǎn)植酸酶的細(xì)菌以枯草芽孢桿菌、大腸桿菌 以及克雷伯菌為主。植酸酶的來源不同，它的最適溫度和最適pH差異也較大，植物來源的植 酸酶最適pH為4.0-7.5，因此不適合單胃畜牧類的酸性胃環(huán)境，而微生物來源的植酸酶最適 pH有2個，即5.5和2.5，范圍較寬，比較適合單胃動物，也因此微生物來源的植酸酶被廣泛應(yīng) 用。通常微生物來源的植酸酶活性溫度一般在45-57Γ，超過65°C活性就降低超過一半。
[0004] 然而，植酸酶在生產(chǎn)上的主要用途就是作為飼料添加劑以提高磷的利用率。飼用 酶在造粒的過程中需要經(jīng)過一個75-93Γ的短暫高溫過程，而很多植酸酶在這個過程中將 會降低酶活，甚至喪失酶活。于是，選擇具有高熱穩(wěn)定性、且能夠在動物胃腸道環(huán)境中保持 高活性的植酸酶作為飼料添加劑就顯得尤為重要。如何選擇具有種這樣要求的植酸酶就成 為目前植酸酶應(yīng)用研究的熱點(diǎn)。
[0005] 隨著基因工程和蛋白質(zhì)工程的發(fā)展，人們把目光轉(zhuǎn)向人為制造催化效率高、抗蛋 白酶水解且熱穩(wěn)定性好的植酸酶。比如中國專利200810201709.2,公布了一種植酸酶突變 體，該植酸酶突變體為單氨基酸位點(diǎn)突變體APPA-S22T，其最適pH值為4.5,比活性最高為 1321U/mg蛋白質(zhì)，在最適pH，突變體最高比活是野生型的3倍；中國專利201010602210.X，公 開了一種在酸性范圍的催化能力和比活性提高的植酸酶APPA-M及其基因和應(yīng)用，突變位點(diǎn) 為M216C和N306D，經(jīng)過優(yōu)化改良的植酸酶APPA-M其在酸性范圍pH 2到5的催化活性得到了 很大的提高，可在應(yīng)用中顯示出巨大的應(yīng)用潛力；中國發(fā)明專利201310125275.3,利用定點(diǎn) 突變技術(shù)對基因的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得突變基因 Appa-M2，該突變體耐熱性能好， 85°C保溫10分鐘，殘余酶活可達(dá)到60%，在飼料和食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景。
[0006] 上述植酸酶的不同突變體在最適PH、溫度、酶活及耐溫性等方面均表現(xiàn)出不同的 特性，本
【申請人】在研究實驗的過程中也通過突變的方法獲得了一種新型植酸酶突變體，該 突變體在耐溫性及酶活等方面均表現(xiàn)出良好的特性，具有較好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 在本發(fā)明中采用如下定義：
[0008] 1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
[0009] 使用氨基酸殘基的公認(rèn)IUPAC命名法，用三字母代碼形式。DNA核酸序列采用公認(rèn) IUPAC命名法。
[0010] 2、植酸酶突變體的標(biāo)識
[0011] 采用"原始氨基酸位置替換的氨基酸"來表示植酸酶突變體中突變的氨基酸。如 Vall9Gly，表示位置19的氨基酸由原始植酸酶的Val替換成Gly，位置的編號對應(yīng)于SEQ ID No:4中植酸酶的氨基酸序列編號。同樣采用"原始核苷酸位置替換的核苷酸"來表示突變的 核苷酸，位置的編號對應(yīng)于SEQ ID N〇:2中植酸酶的核苷酸序列編號。
[0012] 本發(fā)明將提供一種大腸桿菌植酸酶APPA的突變體APPAml，其編碼基因 APPAml的核 苷酸序列如序列表SEQ ID No.l所示，所述突變體APPAml的表達(dá)基因 appAml基因是在原始 appA基因（如序列表SEQ ID No.2所示）的基礎(chǔ)上突變獲得。
[0013] 本發(fā)明還提供上述植酸酶突變體APPAml的氨基酸序列，如SEQ ID No.3所示。與原 始植酸酶（氨基酸序列如序列表SEQ ID No . 4所示）相比，突變體APPAml在第19，43，177， 187，289位發(fā)生突變，具體見下表：
[0015] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二為:將上述突變體基因重新構(gòu)建重組載體，并在畢赤 酵母GS115中的高效表達(dá)，得到重組菌株，通過發(fā)酵、提取等技術(shù)獲得新型植酸酶。
[0016] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三為:突變體APPAml在飼料領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明的實驗步驟具體如下：
[0018] 1、將突變體APPAml的編碼基因 appAml進(jìn)行酶切，連接至表達(dá)載體pPIC 9K，得到重 組載體；
[0019] 2、將重組載體轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115中，得到新型植酸酶的生產(chǎn)菌株GS115/PPIC 9K-APPAml；
[0020] 3、以GS115/pPIC 9K-APPAml為生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶，具體步驟如下：
[0021] 1)菌株培養(yǎng)：菌株經(jīng)過二級種子培養(yǎng)后，將二級種子液按5%接種量接入發(fā)酵罐 中，調(diào)節(jié)溫度至30°C，用氨水維持pH在5.0,加入PTM1微量鹽溶液，通氣攪拌培養(yǎng)約18-24h， 直到將發(fā)酵罐中甘油耗盡；
[0022] 2)甘油促生長:補(bǔ)加初始發(fā)酵液50 %甘油，持續(xù)5h;
[0023] 3)甲醇誘導(dǎo)：用氨水調(diào)節(jié)pH至5.0，流加100%甲醇，持續(xù)96h。
[0024] 有益效果：
[0025] 1、本發(fā)明公布了一種全新的植酸酶突變體，該突變體具有酶活高，熱穩(wěn)定性好的 特點(diǎn)。該突變體經(jīng)甲醇誘導(dǎo)96h發(fā)酵液酶活可達(dá)28000U/mL，較原始植酸酶提高180% ;
[0026] 2、本發(fā)明獲得的植酸酶經(jīng)75 °C處理后存留酶活保留在90 %以上。而原始植酸酶經(jīng) 75°C熱處理5分鐘酶活存留在30%左右;85°C處理后突變體APPAml的殘余率為80%以上，而 原始酶僅為12%，本發(fā)明獲得的植酸酶耐溫性較原始植酸酶有明顯提高；
[0027] 3、本發(fā)明所提供的突變體耐受85 °C制粒溫度，存留酶活達(dá)到85 %以上，適應(yīng)顆粒 飼料生產(chǎn)要求。
[0028] 說明書附圖：
[0029]圖1突變體APPAml和原始植酸酶的耐溫曲線。
【具體實施方式】：
[0030] 實施例1:構(gòu)建appAml基因重組菌 [0031] 1.表達(dá)載體pPIC9K-appAml的構(gòu)建
[0032]通過全基因合成技術(shù)獲得SEQ ID No. 1所示的appAml基因，并將其與畢赤酵母表 達(dá)載體pPIC 9K經(jīng)過EcoRI和Notl雙酶切，隨后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞 中，選擇Amp1的陽性轉(zhuǎn)化子，菌落培養(yǎng)后提質(zhì)粒，酶切驗證成功，即得到重組表達(dá)載體pPIC 9K_appAml〇
[0033] 2 ·構(gòu)建重組菌株
[0034] (1)質(zhì)粒DNA的線性化
[0035] 在轉(zhuǎn)化畢赤酵母之前，分別用SacI和Sail限制性內(nèi)切酶對重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC 9K-appAml進(jìn)行線性化酶切。
[0036] (2)線性化質(zhì)粒pPIC 9K_appAml電轉(zhuǎn)至畢赤酵母
[0037] ①將感受態(tài)細(xì)胞與線性化質(zhì)粒pPIC 9K-appAml加入到1.5mL預(yù)冷的離心管中，吹 打混勻，隨后加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中；
[0038] ②對轉(zhuǎn)化杯冰浴lOmin，隨后電轉(zhuǎn)化；
[0039] ③電擊后，立即加入lmL預(yù)冷的lmo 1/L的山梨醇溶液于電轉(zhuǎn)杯中，并將電轉(zhuǎn)液轉(zhuǎn)移 到新的1.5mL|^;L·、官中；
[0040] ④30°C靜置培養(yǎng)1-2h，吸取畢赤酵母GS115電轉(zhuǎn)液200yL涂布在MD培養(yǎng)基上。
[0041] (3)陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定及植酸酶高產(chǎn)菌株的篩選 [0042]①涂有電轉(zhuǎn)液的MD平板在30°C培養(yǎng)2-3d;
[0043] ②挑取轉(zhuǎn)化子，提取酵母基因組，稀釋100倍后作為模板進(jìn)行PCR。另以轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒 pPIC 9K的畢赤酵母GS115/pPIC 9K作為對照，確定陽性轉(zhuǎn)化子。
[0044] ③確定陽性轉(zhuǎn)化子后，先挑取在含不同濃度遺傳霉素抗性平板上單菌落比較大的 高遺傳霉素抗性轉(zhuǎn)化子，隨后分別測定挑選出的轉(zhuǎn)化子的植酸酶酶活，從而得到植酸酶的 高產(chǎn)菌株GS115/pPIC 9K-appAml。以上述同樣方法制備原始基因?qū)φ站闓S115/pPIC 9K-appA〇
[0045] 實施例2突變體APPAml及原始植酸酶的制備
[0046] 分別以GS115/pPIC 9K-appAml和對照菌株GS115/pPIC 9K-appA為生產(chǎn)菌株進(jìn)行 實驗：
[0047] 1、培養(yǎng)基
[0048] (1)斜面培養(yǎng)基:葡萄糖2 %，蛋白胨2 %，酵母提取物1 %，瓊脂2%，pH5.0; 121°C滅 菌20min;
[0049] (2)種子培養(yǎng)基：葡萄糖 3%，蛋白胨 2%，KC1 0.05%，MgS(k 0.05%，MnS〇4 0 · 03 %，F(xiàn)eS〇4 0 · 05 %，pH5 · 0; 121Γ 滅菌20min;
[0050] (3)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3%，蛋白胨1%，酵母提取物1%，KC1 0.05%，MgS〇4 0.05%，MnS〇4 0.03%,FeS〇4 0.03%，ρΗ5·0;12Γ(：滅菌20min;
[0051] 2、植酸酶制備
[0052] 1)菌株培養(yǎng):新鮮斜面上挑取1環(huán)生產(chǎn)菌接種到50mL種子培養(yǎng)基中，30°C，200rpm 培養(yǎng)18h作為一級種子液;按10%接種量接入200mL種子培養(yǎng)基中，30°C，200rpm培養(yǎng)20h得 二級種子液;將二級種子液按5%接種量接入到裝有5L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)溫度至 30°C，用氨水維持pH在5.0,加入PTMl(5mL/L)，通氣攪拌培養(yǎng)約18-24h，直到將發(fā)酵罐中甘 油耗盡，表現(xiàn)為溶氧突然上升；
[0053] 2)甘油促生長，補(bǔ)加初始發(fā)酵液50%甘油(含有PTM1，10mL/L)，補(bǔ)料速度為20mL/ L · h，持續(xù)5h;
[0054] 3)甲醇誘導(dǎo)，用氨水調(diào)節(jié)pH至5.0,流加100%甲醇（含有PTMl，10mL/L)，流速從 lmL/L · h經(jīng) 12hr升至4mL/L · h，持續(xù)96h。
[0055] 發(fā)酵結(jié)束后，8000rpm離心20min即得粗酶液。經(jīng)檢測知突變體APPAml發(fā)酵結(jié)束最 終平均發(fā)酵酶活達(dá)到28000U/mL，而原始植酸酶僅為10000U/mL。
[0056] 實施例3酶活及耐熱性測定
[0057] 酶活定義:在溫度37°C、pH5.5條件下，每分鐘從濃度為5.0mm〇l/L植酸鈉溶液中釋 放lumol/L無機(jī)磷，即為一個植酸酶活性單位，以U表示。
[0058] 酶活測定方法:GB/T 18634-2009。
[0059] 1、最適pH及溫度測定
[0060] 將實施例2所得植酸酶粗酶液在不同pH(l-7)及不同溫度(30-90°C)條件下進(jìn)行酶 促反應(yīng)以測定其最適pH和最適溫度，可知突變體APPAml最適作用pH為4.0，最適溫度為55 Γ。
[00611 2、熱穩(wěn)定性測定
[0062] 熱處理:將實施例2所得植酸酶粗酶液在恒溫60-90°C水浴處理5min后，冰水混合 物速冷待測。并以殘余率，即各自熱處理后的酶活與熱處理前的酶活比值，表示耐熱性。突 變體APPAml和原始植酸酶的耐溫曲線如圖1所示。
[0063] 如圖1所示，本發(fā)明獲得的植酸酶經(jīng)75°C處理后存留酶活保留在90%以上。而原始 植酸酶經(jīng)75°C熱處理5分鐘酶活存留在30 %左右；85°C處理后突變體APPAml的殘余率為 80%，而原始酶僅為12%，本發(fā)明獲得的植酸酶耐溫性較原始植酸酶有明顯提高。
[0064] 3、制粒后酶活
[0065] 將實施例2所得粗酶液8000rpm離心40min，將上清用80 %硫酸銨沉淀，離心去除上 清，再用40mM pH4.5乙酸鈉緩沖液溶解，使用相同緩沖液透析三天，使用陽離子樹脂純化， 得到純度98%的植酸酶，再經(jīng)把口代。26/10(168311:;[1^脫去洗脫緩沖液中的氯化鈉得到純 酶。
[0066]突變體APPAml純酶添加到飼料中，在飼料加工過程中分別取混合制粒前和制粒后 樣品各10個，測定酶活并計算收率。調(diào)質(zhì)溫度:85°C;調(diào)質(zhì)時間：35s，調(diào)質(zhì)蒸汽壓力：0.43- Ο · 46Mpa，水分含量:15-17 %。
[0067] 結(jié)果表明突變體APPAml耐受85°C制粒溫度，平均酶活存留率達(dá)到85%，適應(yīng)顆粒 飼料生產(chǎn)要求。
【主權(quán)項】
1. 一種植酸酶突變體，其特征在于，所述突變體為APPAml，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No .3所示。2. 權(quán)利要求1所述植酸酶突變體的編碼基因。3. 權(quán)利要求2所述的植酸酶突變體的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因如序列表 SEQ ID No.l所示。4. 權(quán)利要求1所述植酸酶突變體或權(quán)利要求2所述的基因的用途，其特征在于，用于飼 料制備領(lǐng)域。5. -種包含權(quán)利要求3所述的基因的表達(dá)載體或宿主細(xì)胞。6. 如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體或宿主細(xì)胞，其特征在于，所述表達(dá)載體為pPIC 9K，宿 主細(xì)胞為畢赤酵母GS115。
【文檔編號】C12R1/84GK105969750SQ201610467505
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】趙麗芳, 郭寶林, 蘇俊兵, 黃麗麗
【申請人】北京昕大洋科技發(fā)展有限公司